Técnicas Laboratoriais em Imunologia Prof* Juliana Possatto Fernandes Takahashi 2. Reagées sorolégicas = O diagnostico de certeza de um processo infeccioso é a demonstracgdo do patégeno ou de seus produtos nos tecidos ou fluidos bioldgicos do hospedeiro;Aplicagao dos testes soroldgicos 1 — Diagnéstico presuntivo e diferencial; 2.- Diferenciagao de fases da doenga; 3-Diagnéstico de alergias; 4 — Diagndstico de doengas autoimunes; 5 —Diagnéstico de imunodeficiéncias congénitas; 6 - Selecdo de doadores de sangue; 7 ~Selegao de doadores de érgaos para enxertos; 8 — Dosagens hormonais; 9 - Prognéstico da doenga: 10 — Avaliagao da eficacia da terapéutica instituida 11 — Avaliago da imunidade especifica (vacinagao); 12 - Pesquisa de antigenos em células ou tecidos; 13 — Pesquisas epidemiolégicas: 14 - Pesquisa basica e aplicada; Conceitos que devem ser levados em consideragao p/ boa execugao de um teste imunoldgico = Dependéncia de eletrolitos: de gde importancia p/ realizagao do teste (Na, Ca, K, Cl e outros); = Tempo e temperatura: tempo de incubacao e t° diferentes podem condicionar resultados deficientes; = PH: as forcas de atragao que ligam Ag-ac sao fracas e ambiente acido (pH | 4) e alcalinos (pH{ 10). O pH geralmente deve ser neutro; = Qualidade de reagentes: presenca de residuos de gas estranhos pode conduzir ao aparecimento de reatividades p/outros acs que fi sao aqueles q se pretendem detectar. Acs monoclonais tem uma especificidade unica;ee Métodos = Reagentes nao marcados: detectam e quantificam as consequéncias da ligagao ag-ac); = Reagdo de precipitagao; = Reagao de aglutinagao; = Reagentes marcados: detectam e quantificam diretamente a ligagao ag-ac); =@RIA; mw ELISA; = Imunofluorescéncia; = Citometria de fluxo; = Imunoblotting (Western Blott);: Reagoes de precipitagao m= Reagao q depende de ligagao de ag-ac conhecidos nas proporgées corretas p/ a formacao de um produto visivel ou reagao c/ outros componentes e numa fase final assinalar quese se formaram os complexos ag-ac; Antibody-excess Equivalence Antigensexcess Antigen added— = Acs em excesso (prozona); = Ags em excesso (pds zona); = Diluigdes de soro eliminam as reagées de prozona; Utiliza uma matriz de agar Ag Ac# linha de precipitacao visivel (Método de Mancini) aes + Ag ow Ac fixos + Dosagem de proteinas séricas + Identidade de Ags = Ac de reatividade conhecida————_— 7 eas Reagao de Mancini === Cs MADHEDORETINS.— Reagao de floculagao Placa de Kline Pee oc) e Controle de Infeccao. ‘ARTGO ORGINAL Efeito prozona no diagnostico desfiis pelo método VDRL: ‘expetiéncia de um servico de referéncia no sul do Brasil ‘Prozoneeffectin the diagnosis of syphils using the vd method: ‘experience ofa reference service in southem Brazil ess ng, an Bsr Dag Pte ane“ Ensaios imunocromatograficos = A imunocromatografia é uma técnica que comegou a ser desenvolvida nos anos 60, sendo primeiro criada para o estudo das proteinas séricas; = Atualmente para a deteccdo de muitas doengas infecciosas: Dengue, malaria, amebiase, peste bub6nica, brucelose, giardiase, leishmaniose visceral, hepatite B, infeccdo por HIV, cinomose, parvovirose, Helicobacter pylori, Streptococcus pneumoniae, entre outras; De grande valor em situagdes nas quais os profissionais de saude necessitem tomar decis6es e assumir condutas imediatas; Caracteristicas do teste = Qualitativos; = Teste de triagem; = Rapido; = Econémico; = Facil interpretagao; = Leitura é feita a olho nu; . Apresenta sensibilidade e especificidade similares ao ELISA de terceira geragao;Principio do teste = Utilizada uma matriz de membrana de nitrocelulose ligada a uma tira de acetato transparente; = Para detectar antigeno, emprega-se um anticorpo de captura, ligado a matriz e um anticorpo marcado especifico ao antigeno pesquisado; = Para detectar anticorpo, utiliza-se um antigeno especifico ligado a matriz e um anticorpo anti- imunoglobulina marcado; Validacao do teste imunocromatografico rapido IT-LEISH® para o diagnéstico da leishmaniose visceral humana* Validation ofthe Rapid immunochromatographic Test IT-LEISH® forthe Diagnosis of Human Visceral Leishmaniasis LONGO/REVSTABRASLERA DE CRMINAUSTIA V1 M1621 GOT) Avaliagdio comparativa de teste imunocromatogrifico para identificagdo forense de sangue humano P.Longo*; C.R. Dias Filho", MPO. Valadares‘ E.C. Alonso’, .PS. Gongalves E ‘Auler-Btencourt *—————— Detecgao de Acs contra dengue INTERPRETAGAO lly beeateste ‘rea Conte Ao — a Lina Tete Una Conele fuséncade Presegade nha 7 a 7 conReacées de Aglutinacao Ac + Ag particulado aglutininas Eritrécitos | Bactérias Agregacio visivel de particulas } Fungos latex + Efeito pro-zona Células ou particulas insoliveis + Ac = Aglutinacao + Deteccao Acs especificos + Quantificacéo Tipagem ABO el ell elle) Testes confirmatérios para sifilis Aalutinacdo bacteriana Presenga de infec¢do Diferenciacao de espécies: Aglutinagao direta — tipagem ABO Tipo de Sangue A BAB ao a yA “it €2)B = 8 te: AB eee: oO . *Uso de microparticulas inertes que nao interferem no teste (ex: latex); ‘Aglutinago om latex- ‘Salmonella spp.saio Imunoadsorvente Ligado a Enzima - ELISA En: ot + Ag + substrato = COR (incolor) W Fostataseatcalina Peroxidase Begalactosidase > Direto = Ag Qualitativos % Indireto = Ac ~ Quantitativos a Ger ELSA Be _ al bases ee] _ Fe ‘sien Adaspeciic ——Addeneyme- Add subtrate) coustwcl —autbosyiobe —conhpied = “an mesure cmucd pe coor sub? (b) Sandwich ELISA. al ies el sad [eal his ina Antboxy. sideayme Add atte Geeks omar scconiafambody “oar coated wellTT > Aplicagées do ELISA: Testes de rotina em Laboratorios Clinicos e de Pesquisa > Vantagens: «Teste de alta sensibilidade * Permite quantificar Ag ou Ac das amostras * Seguros e de baixo custo T: Toxicology & Chemical Food Safety ‘Food Science | ‘Commercial Milk Enzyme-Linked Immunosorbent ie asesl Assay (ELISA) Kit Reactivities to Purified Milk Proteins eeceee and Milk-Derived Ingredients cocoon Katherine O..vens, Joseph L. Baumert, Steve L. Taylor woe Biologicals = Validation of high throughput screening of human sera for detection of anti-PA IgG by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) as an emergency response to an anthrax incident te o-~ Development of Rapid Enzyme-Linked Immunosorbent Assays for Detection of Antibodies to Burkholderia peendomale Journal of Voli! Me ; ee eee Establishment and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay for IgG antibody against ‘ylomegelovirus based on pp150 antigenImunofluorescéncia | Jomesane Flugresesin Isathiocyenete ‘Uy tgnt 490 am Fitter Fiter —————— Isotiocianato de fluoresceina (FITC) ——* VERDE Ficoeritrina (FE) VERMELHA——— = ® ee eee ee ee FLUORESCEIN ‘aNmiBODY IN PLASMA CELL Método imunofiuorescéncia ——— + Identificar subpopulacées de linfécitos; + Identificar espécies bacterianas; + localizacao de horménios; + Detecc4o complexos ag-ac em doencas auto: -Deteccao anticorpos anti-DNA; + Teste qualitativo; unes; Photo Creat: HO.A Lindquist 8. EPA Imunofluorescéncia - Cryptosporidium spp. Conttraste de fase - Cryptosporidium spp.=— ‘@ IMUNOFLUORESCENCIA DO SEDIMENTO URINARIO Sanam at gofleury LEGIONELLA PNEUMOPHILA, PESQUISA DE ANTIGENOS, URINA CHLAMYDIA TRACHOMATIS, EXAME DIRETO PARA, VARIOS MATERIAIS a Diagnostic Microbiology and Infectious Disease fisevier oa arastlory Comparison of sensitivity and specificity of 4 methods for detection of @, Giardia duodenalis in feces: immunofluorescence and PCR are superior to microscopy of concentrated iodine-stained samples elle Cotfred-Rasmssen Marianne Lund, Hei. Enemark Mogens Elansen ©, Esl Petersen * Muttilabel immunofluorescence and antigen reprobing on formalin-fixed paraffin-embedded sections: novel applications for precision pathology diagnosis Comelia Thos 58, Aleixo Muise?*, Herman Yager! and Emost Cutz?— Citometria de Fluxo > Separacdo de células ativadas por fluorescéncia > Anticorps contra moléculas de membrana ou Antigenos do Conjunto de Diferenciacao (CD) > Cada Ac é marcado com um fluorocromo diferente > Teste qualitativo e quantitativo oa... Ag cos WS co125 = cow & @ © 80@ ee " A | — | % ® Tamanho aT Granulosidade 2 . Fluorescéncia | Ey &Determinar 0 tipo e n° de céls. sanguineas brancas cps : isolar populagées celulares distribuicao de céls de acordo com a densidade dos Ag cps © tamanho celular. p20 4 Uso de miltiplos anticorpos fluorescentes optco2r* ToateThe rel of flow cyrmeer based immunaphenctping in the diferent agnosis of pancytopenia and oftymphocyiose. A citometria de fluxo como instrumento de avaliacio da atividade imunomodulat6ria de extratos ¢ substincias isoladas de plantas medicinai Julio Machado Junior, Angela Flori’, Fernanda VR. Manana, Fabiana. Roche’, (GidA.M Santes,Almeriane M. WeffrtSents @®iinmandlogy Se Detection of HIV Env-mediated B cell S receptor aggregation on engineered B cells by flow cytometry. a Western ican —— Blotting at = Eletroforese de proteinas Diferenga de tamanho (PM) Mobilidade da proteina Detec¢ao Ag ou Ac | Label with Specific Detect Antibodymembrana de transferéncia | papel filtro tela de suporte Gel/ membrana’ filtro Separacao e deteccao RORe erent Immunoblottingi 3 Hv protons atecea J Emeioe protens Reverse ranscripiase (+ Nas {Core proten precursor Revels vamverase Trans membrane pote integrase Major core protein a As pated ‘Western Blotting - HIV—— canateem ner races marr foot ep ts trees en, "p32 (ont mace cart ts insite tonne oma nase opens io gee mes ca al ota de ep mens aL moa et ean come we tga) 0. [te rea se i pn seat ante tn oe hagas aso 4 hater em cone beni ep sn a sn fx aon srap out sd nade sans ar ae foage (chine dtnd opine epnd ans wh cn od de ‘va ear, oases etn vs tte reso im Sat wea mums se ec era ‘oe erecta pica ets ube tne ‘ts pe can mer ge It nes tf sem Bt Cae Nt owan sto en ne sf sa sic eta ‘retin nao gn nt ne nan ‘imac uo ai ri Re x ie {ove jor at pv opt vegans 303 Fev ena ew enone we ries ‘ori conn ar ot peipins, see nth ne sa ee pa {Stanmore fa eect Wma fen Comenatie 7 rei oe 268% {ian pl 162 Suna lcs gids S08. Tse leone Eon tren be ca nes cet no em Seon ric gi we big ena ino rs wef a er a ik (iets area ‘arn pe on, ree aor mies, gan tins lt fit fe psn oa MeN, (Ese arab eae dagen ses eben tegen eet fate ibm sr apa pea t,t ‘Rowse ts ems os ua een os pet ‘igo seo misono cit terme nec ot ot hea eis sta abe rence pata iy es oan aa crs nu i ish den ech {ssa mac aye ges pe en ae eto Frnt desi gS ino es so @=- seer, (Cinical and Vaccine SEES. mmunoloy Contribution of a Comparative Western Blot Method to Early Postnatal Diagnosis of Congenital Syphilis (aston anon ait Fs Maa Ga Capt Pal Nada” Ma Comp Tne Crag” Stee Fen fob Cevean™ [BMC infectious Diseases n of western blot for Histoplasma capsulatum antibody detection assay Foca APs esa Hels Saramago Pera Jost Mare, era ‘ Facute vasconctosCavnaesGhveta, Asan Gomes azo Cas LowengoTaaes de nade? Journal of immunological Methods eee 7 ter 201 Papen 7-2 Anew Wester blot assay for the detection of porcine cytomegalovirus (>CMV)Radioimunoensaio RIA + Horménio + proteinas séricas + drogas 0,001 microgramas/ mL + vitaminas Ac @ Infected serum — [1251] HBsAg — [1251] HBsAg Uninfected ° ® serum: 3 ? s vnubeca” \y \ v HBsAg ° AntiHHBsAg 51 bound M51 bound > Marcacées: O15; emite raios gama OH®: raios beta > Aplicacées: = Testes que necessitem de alta sensibilidade « Triagem virus da hepatite B em doadores de sangue » Pesquisa > Desvantagem: » Nao é um teste seguro!_ 6-3. SENSITIVITY OF VARIOUS IMMUNOASSAYS, Seastiity soy (up Aatibdye) Precipitation reaction in ids 20-200 Precipitation reactions in gels "Mancini ead immunodifusion 10-30 ‘Ouchterlony double mmunodifison 20-200 Immunodlectrophoresis 20-200 Rocket electrophoresis 2 Agghtination reactions Direct Pasaiveaggltination ‘Aggltination inhibition Radioimmunoassay Enzyme tinked immunosorbent assay (ELISA) ELISA wing chemiluminescnce Immunofhirescence Flow eytometry “Thcsnatiy Spends upon efi candy awa he cptpe dena ant een SOURCE Aap om NE Rae ta, 18 ad 97, Maa fina abot rong Aneta Sr Mr, Wahine——————— Automagao Leitor de ELISA Lavador de ELISA