Wuolah Free 4 Cultivoinvitrovegetal

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biotec99
Mejora Genética
3º Grado en Biotecnología
Facultad de Ciencias
Universidad de Cádiz
Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
Tema 4: Cultivo in vitro vegetal
1 INTRODUCCIÓN
El cultivo vegetal in vitro involucra diferentes técnicas de cultivo de material vegetal para obtener
plantas libres de microbios en un medio nutritivo aséptico, en condiciones ambientales controladas,
a partir de un segmento inicial denominado explanto.
Los explantos más usados son protoplastos, células y tejidos, órganos y plantas completas. Este
explanto se coloca en un medio gelificado con una serie de nutrientes para conseguir su desarrollo
por organogénesis directa o indirecta.
 Aplicaciones generales del cultivo vegetal in vitro
1. La propagación masiva de plantas, es decir, se pueden producir grandes cantidades de
plantas independientemente de la estación de tiempo

2. Clonación de individuos
3. Obtención de plantas libres de virus
4. Producción de semillas sintéticas
5. Conservación de germoplasma
6. Mejora genética
7. Obtención de metabolitos secundarios
8. Estudios fisiológicos diversos
El éxito de un cultivo in vitro se basa en la capacidad del explanto de volver a poseer la
totipotencialidad celular. Esta característica es la capacidad que tendrán las células del individuo
vegetal para producir de novo un individuo completo o ciertas partes de este sin que haya fusión
de células o intervengan gametas.
La totipotencialidad celular se consigue devolviendo a la planta sus características meristemáticas,
que tienen la capacidad totipotente de crear todos los tipos de células de la planta.
Esto depende de la capacidad de la planta, pero también del medio en el que se cultive, ya que
podemos aportar hormonas o factores que ayuden a las células a recuperar la totipotencia.
Esto se consigue realizando una desdiferenciación celular, para que así se recupere esta
característica. Este proceso se llama organogénesis indirecta.
2 MEDIOS DE CULTIVO
Aunque actualmente se cuenta con una literatura detallada de técnicas de cultivos vegetales in
vitro, los protocolos y los medios de cultivo utilizados en muchas especies vegetales, presentan
serias dificultades en algunas especies en las cuales las fases de establecimiento, multiplicación
y/o enraizamiento de los cultivos es dificultoso y por tanto es necesaria una intensa tarea
experimental para lograr su micropropagación o para obtener callos o suspensiones capaces de
producir los metabolitos deseados.
Cultivo de tejidos : los medios de cultivo constan de los siguientes componentes comunes
-Macronutrientes: N, P, S, Ca, K, Mg
-Micronutrientes: Fe, Cu, I, B, Zn
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-Vitaminas: Las plantas son auxótrofas, sin embargo, es conveniente el uso de vitaminas
en las primeras etapas de cultivo para que estas crezcan. Las más utilizadas son la
vitamina B, la tiamina y el ácido nicotínico.
-Aminoácidos: El papel de estos en un cultivo es complejo, ya que cada tejido responde
de forma diferente a estos suplementos. Los aminoácidos más usados son estereoisómeros
y corresponden con la forma D que actúan como inhibidores, y la forma L que actúan
beneficiosamente.
-Azúcares: A pesar de que las plantas son auxótrofas, son heterótrofas respecto a las
fuentes de C, por lo que deben aportarse azúcares al medio, siendo la más usada la
sacarosa.
3 REGULADORES DE CRECIMIENTO
Son moléculas orgánicas que modulan procesos de crecimiento y desarrollo de las plantas, siendo
eficaces a bajas concentraciones internas.
→ Auxinas
Son capaces de regular el crecimiento y la división celular, además, su función principal es la
diferenciación de raíces en los cultivo in vitro.
→ Citoquininas

En varias especies, permite la formación del callo, aunque principalmente induce que regiones
meristemáticas multicelulares se diferencien. También inhibe la formación de raíces y estimula la
proliferación de la parte aérea.
**Relación auxina/citoquina**
La relación entre el uso de estos dos componentes regula la organogénesis o la desdiferenciación.
En general, cuando esta relación es alta se forman brotes y cuando es baja se producen raíces,
mientras que con relaciones cercanas a 1, se producen callos.
→ Giberelinas
Participan en la germinación de las semillas, la elongación de los tallos, el desarrollo de las raíces
y la floración.
→ Ácido abscísico
Participa en el cierre de estromas y la producción de proteínas protectoras.
→ Etileno
Es un hormona de maduración de frutos, por lo que participa en la germinación de las semillas, la
senescencia y la producción de callos.
Estas son las más utilizadas en el cultivo in vitro.
En los últimos años, se han descrito otros grupos de compuestos químicos producidos por las plantas,
que afectan su crecimiento y desarrollo y cuya acción in vitro se ha ensayado, especialmente, en
la producción de metabolitos. Entre ellos cabe mencionar a las poliaminas, los jasmonatos, los
brasinoesteroides y el ácido salicílico.
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RESUMEN: HORMONAS VEGETALES
4 CONDICIONES AMBIENTALES DE CULTIVO
Además de conocer perfectamente la composición que tendrá nuestro medio de cultivo, es muy
importante mantener las condiciones ambientales idóneas y en cualquier caso lo más parecidas a
la que la planta tiene en su medio natural.

La luz, la temperatura y la humedad relativa son los principales factores del ambiente que inciden
sobre los cultivos. Además, también tenemos que tener en cuenta el pH del cultivo.
El comportamiento y el éxito de muchos cultivos, depende del tipo de luz y la intensidad y duración
del fotoperiodo. Lo ideal es utilizar luz blanca y el fotoperiodo utilizado de forma más común es
16h de luz y 8h de oscuridad, aunque esto puede variar en función de las necesidades del cultivo,
la etapa de desarrollo en la que nos encontremos o el tipo de especie cultivada.
La temperatura de las cámaras de cultivo se regula en general entre 22 y 28ºC, permitiendo así
el desarrollo tanto de especies de climas templados como de plantas tropicales. La velocidad de
síntesis y de degradación de distintos compuestos, y, por lo tanto, el nivel de producción y
acumulación de metabolitos también es influenciado por la temperatura
El pH inicial de los medios de cultivo se regula, en general, entre pH 5,5 y 6,0, dado que afecta
tanto el crecimiento como la producción
5 ELEMENTOS NECESARIOS PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

Para llevar adelante el cultivo de tejidos vegetales, se necesitan equipamientos que generen las
condiciones necesarias de esterilidad, como las cabinas de flujos laminares, que son estaciones de
trabajo que hacen circular aire filtrado y estéril, protegiendo así a la muestra con la que se desea
trabajar.
Además, se necesita un soporte para el explanto, que puede ser sólido o líquido, y que está
conformado por algún agente gelificante inerte (agar). Una vez que conocemos las condiciones a
las que vamos a hacer nuestro cultivo y el tipo de medio que vamos a utilizar, vamos a ver cómo
se desarrolla el proceso de propagación clonal

6 ETAPAS DEL PROCESO DE PROPAGACIÓN CLONAL
1) Elección de la planta y/o tejido donante de explantos
2) Establecimiento: Consiste en la desinfección de los explantos generalmente con hipoclorito
de Na, y su posterior adaptación al medio artificial en modo de inducir callo, brote, raíz
o embrión somático según se desee.
3) Multiplicación: Para generar una masa vegetal suficiente para la regeneración del número
de plantas necesarias.
4) Enraizamiento: En la que se busca la formación de raíces con el fin de convertir los brotes
o embriones somáticos en plántulas completas.
5) Rusticación: Es la aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a las condiciones
ambientales ex vitro (suelo o algún sustrato inerte) El éxito de la técnica depende de
muchos factores, entre ellos la edad de la planta (a mayor edad, menor potencial de
regeneración), el genotipo y las condiciones ambientales.
6.1 ELECCIÓN DE LA PLANTA Y/O TEJIDO DONANTE DE EXPLANTOS

1. Preparación de la planta madre
Primero se prepara la planta madre, teniendo en cuenta que, para poder establecer el cultivo en
condiciones de asepsia, se deben obtener explantos con un alto nivel nutricional y un alto grado
de desarrollo.
Para ello, es recomendable mantener a las plantas madre, es decir, la planta donadora de yemas

u hojas, durante un tiempo que pueden ser semanas o meses, en un invernadero bajo condiciones
controladas.
En este ambiente, la planta madre se cultiva en condiciones sanitarias óptimas y con un control de
la nutrición y riego adecuadas para permitir un crecimiento vigoroso y libre de enfermedades.
2. Desinfección del material vegetal
Antes de extraer los explantos se desinfectan los fragmentos de planta madre para eliminar los
contaminantes externos. Los contaminantes más comunes son los hongos y las bacterias que habitan
en forma natural en el ambiente.
La desinfección del material se hace sumergiendo los explantos en hipoclorito de sodio (agua
clorada comercial), pura o diluida durante un período de 5 a 15 minutos, seguido por 3 a 4
enjuagues en agua esterilizada
6.2 ESTABLECIMIENTO
→ Introducción del material in vitro
Después de la desinfección superficial, las semillas o las yemas dependiendo del material
seleccionado, se ponen en medio de cultivo estéril.
En un período de una semana o quince días, comienza el proceso de germinación o regeneración
de nuevos tejidos vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro.
6.3 MULTIPLICACIÓN DE LOS BROTES

Durante esta fase se espera que los explantos que sobrevivieron originen brotes (de procedencia
axilar o adventicia) con varias hojas. En la base de cada hoja hay una yema que se desarrollará
después de ser puesta en contacto con el medio de cultivo.
Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y
resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados, por el agotamiento de los nutrientes
y la falta de espacio por crecimiento de los nuevos brotes.

Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar o en un lugar aislado que nos permita
mantener las condiciones de asepsia. De esta forma aumenta el número de plantas en cada
repique o división de las plantas.
El número de plantas que se obtiene dependerá de la especie vegetal y de las condiciones del
medio de cultivo.
Por la vía de la micropropagación el número de plantas obtenidas permite alcanzar incrementos
exponenciales, considerando que todos los factores que afectan el crecimiento hayan sido
optimizados.
6.4 ENRAIZAMIENTO
→ Elección de un medio de enraizamiento de los explantos
Los brotes resultantes de la fase de multiplicación se pasan a un medio libre de reguladores de
crecimiento o que solo contenga hormonas del tipo auxinas.

Algunas especies de plantas no necesitan pasar por esta etapa y emiten sus raíces en el mismo
medio de cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por lo que el proceso de multiplicación y
enraizamiento ocurren de forma simultánea.
Para enraizar los explantos se utilizan principalmente plantines individuales de un tamaño
aproximado de 2 centímetros.
6.5 RUSTICACIÓN O ACLIMATACIÓN DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOS

Los explantos recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el
éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación.
En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán su adaptación a vivir
en condiciones naturales.
En el momento en que se extraen los explantos o plantines enraizados de los frascos, están poco
adaptados a crecer en un invernadero, ya que estos explantos han enraizado y crecido en
ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas (estructuras
responsables de regular la transpiración y pérdida de agua en la planta) que no son
completamente funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado
lentos para evitar la desecación del explanto.
Por otra parte, crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula
con cera bien desarrollada, que representa la barrera física para evitar la pérdida de agua a
lo largo de toda la superficie de la planta.
El éxito de la técnica depende de muchos factores, entre ellos la edad de la planta (a mayor
edad, menor potencial de regeneración), el genotipo y las condiciones ambientales.
Entre las ventajas del cultivo in vitro de material vegetal, se pueden incluir los tiempos más cortos,
y la posibilidad de ocupar un espacio mucho más pequeño que si se desea propagar material en
tierra.
7 TIPOS DE CULTIVO
La producción de plantas y de metabolitos puede realizarse mediante cultivos de tejidos vegetales
diferenciados o indiferenciados:
 Cultivos diferenciados: raíces, tallos, embriones, raíces y tallos transformados
 Cultivos indiferenciados: callos y suspensiones
7.1 CULTIVOS DIFERENCIADOS
Los métodos de regeneración de plantas por cultivo in vitro incluyen la embriogénesis somática y
la organogénesis.
 Embriogénesis somática
La embriogénesis consiste en la formación de un embrión a partir de una sola célula o de un
pequeño grupo de células somáticas. Los embriones que no resultan de la fusión de gametos se
definen como embriones somáticos, asexuales o adventicios. El proceso se denomina también
embrionía adventicia.
Existen dos tipos de embriogénesis somática in vitro, la embriogénesis somática directa y la
indirecta.0
La forma indirecta implica la necesidad de una inducción para que las células sigan la vía
embriogénica, tras pasar por una fase proliferativa (callo) y cambiar su competencia a la
expresión de embriogénesis.
La forma directa implica la existencia de células somáticas predeterminadas a seguir la vía
embriogénica de desarrollo y las células del explanto primario se desarrollan para formar
embriones.
Las características morfológicas y anatómicas del embrión somático son las siguientes:
-Es de origen unicelular

-2n
-Son estructuras bipolares con un eje radical-
apical
-Tienen una conexión tallo-raíz sólida
-Tienen un ápice radicular cerrado
-Las primeras hojas parecen cotiledones
La formación de un embrión somático está formada por las siguientes etapas:
1) Inducción o proliferación
2) Etapa de desarrollo
3) Maduración y germinación
1) Inducción o proliferación
Una de las características que dan lugar a la formación de proembriones es que las células deben
ser ricas en almidón y poseen una vacuola pequeña.
Además, se necesita la presencia de una auxina para la iniciación de un callo embriogénico, sin
embargo, la presencia de la auxina detiene la maduración de los embriones y la germinación por
lo que hay que utilizarla en concentraciones bajas.
La presencia de nitrógeno reducido es clave para la inducción de la embriogénesis somática y la
maduración de los embriones.
Durante esta primera etapa, se adquiere la competencia. Se produce una desdiferenciación de
las células embriológicamente competentes que, aisladas en medios ricos en auxinas, forman
grupos de células embriogénicas llamadas centros embriogénicos o PEMs.

2) Etapa de desarrollo
Durante esta etapa hay ausencia o bajos niveles de auxina. Una vez repicados los centros
embriogénicos a un medio de cultivo sin auxinas, éstas proliferan de forma lenta e indiferenciada.
Durante esta etapa hay una baja densidad celular.
3) Maduración y germinación
Se producen una serie de rápidas divisiones celulares en distintas zonas del centro embriogénico
y se conforman embriones globulares, que al crecer pasan por los estados de corazón y torpedo.
Finalmente, los embriones somáticos pasan por un proceso de microencapsulación y pueden ser
introducidos en cápsulas de alginato de calcio para su conservación y mantenimiento para ser
utilizadas como semillas artificiales.
Así es posible obtener una enorme capacidad de propagación, lo que permite que sea aplicable
industrialmente, y se obtienen en un solo proceso estructuras completas con ápice y raíz, que
pueden ser almacenadas y encapsuladas perfectamente, dando lugar a semillas sintéticas.
La respuesta embriogénica del callo depende del genotipo de la planta. Algunos cultivos pueden
responder fácilmente a un medio específico mientras otros no.
El estado de desarrollo de la planta madre afecta la respuesta morfológica del explanto; se ha
observado que los explantos tienen mejor respuesta si provienen de plantas maduras.
 Organogénesis

La organogénesis comprende el desarrollo de yemas o meristemos
radicales a partir de explantos directamente o de callos.
Los meristemoides o regiones localizadas de células en división
activa se componen de células pequeñas, isodiamétricas, con un
citoplasma denso, vacuolas pequeñas y núcleos prominentes;
usualmente contienen varios orgánulos y grandes cantidades de
almidón del cual necesitan en cantidad considerable durante su
diferenciación.
Varias partes de una planta pueden responder de forma diferente a idénticas condiciones de
cultivo y tales diferencias reflejan el estado fisiológico de la fuente del explanto.
Éste estado determina además los factores exógenos que se deben añadir o sustraerse del medio
de cultivo para inducir la respuesta morfogenética requerida. Los factores endógenos podrán
variar cuantitativamente de acuerdo con las condiciones ambientales, el genotipo, el tipo de célula,
etc.
Para que la organogénesis ocurra a partir de los callos, se deben producir cambios que conduzcan
a la organización celular. Este proceso involucra diferenciación celular, interacción celular y
reacción a señales específicas.
El término organogénesis de novo en el cultivo de tejidos se refiere a la diferenciación dentro del
explanto, por ejemplo, a partir del floema externo de segmentos del tallo del tabaco cultivado
in vitro se desarrollan meristemos primarios, mientras que en otras especies a partir de
protoxilema de raíces de explantos se desarrollan raíces y primordios de yemas.
Una función primaria de la mitosis en la organogénesis es la formación de un número crítico de
células en división activa. Éstas son capaces de responder a las señales de desarrollo.

La mayoría de estos meristemoides se asemejan a meristemos verdaderos y poseen conexiones
vasculares con el callo o el tejido circundante. Bajo condiciones apropiadas de cultivo pueden
formar yemas o raíces primarias.
8 HETEROGENEIDAD Y VARIACIÓN SOMACLONAL

La variación somaclonal viene determinada porque el cultivo in vitro representa un estrés que
desencadena procesos mutagénicos en el establecimiento del explanto, la inducción del callo, la
formación de embriones y la regeneración de plantas. Ello conlleva a cambios genéticos en las
plantas regeneradas que se transfieren a la progenie
La variación somaclonal involucra cambios en las plantas regeneradas. Generalmente es
indeseable, pero a veces aparecen variantes no encontradas en la naturaleza.
Por esta vía es posible obtener variación de origen nuclear y/o citoplasmático que puede ser
usada para mejora vegetal, ya que permite recuperar la variación genética natural de una
variedad, resistencia a enfermedades, etc.
9 CULTIVO IN VITRO Y BIOTECNOLOGÍA

 Micropropagación
La micropropagación es el conjunto de técnicas y métodos de cultivo de tejidos utilizados para

multiplicar plantas asexualmente en forma rápida, eficiente y en grandes cantidades.
Se utiliza para multiplicar o propagar plantas nuevas, tales como aquellas creadas por ingeniería
genética, mutagénesis o mejoramiento genético.
Se utiliza también para obtener plantas libres de enfermedades (tales como virosis) u obtener
grandes cantidades de plantas que no se propagan eficientemente.
Ventajas de la micropropagación
 Posibilita incrementar rápidamente nuevos materiales.
 Permite controlar las condiciones ambientales.
 Permite estudiar diversos procesos fisiológicos.
 Evita el riesgo de contaminación con patógenos.
 Obtención de gran cantidad de individuos en espacios reducidos.
 Permite la obtención de individuos uniformes.
 Facilita el transporte del material.
 Cultivo de meristemos
Es una técnica de cultivo que consiste en aislar asépticamente la región meristemática con 1-3 de
los primordios foliares más jóvenes e implantarla en un medio de cultivo estéril, con el propósito
de inducir la diferenciación de células y tejidos en plantas completas, mediante la utilización de
medios de cultivos adecuados.
En la yema apical se encuentran un grupo de células que conforman el meristemo apical (tiene un
tamaño entre 0,01 y 0,3 mm), tejido embrionario que tiene la capacidad de formar todos los
tejidos de la planta. A partir de ellos se pueden regenerar plantas completas.

La técnica de cultivo in vitro de meristemos, como método de saneamiento, se fundamenta en la
distribución no uniforme de los microorganismos (virus, bacterias, micoplasmas) en los tejidos de
las plantas infectadas, y su disminución progresiva hacia el ápice del tallo.
Por tanto, son mayores las posibilidades que las células del meristemo apical se encuentren libres
de microorganismos, a diferencia de los tejidos más organizados de las plantas.
El cultivo de meristemos tiene numerosas aplicaciones, siendo una de las más importantes la
obtención de plantas libres de virus, ya que esta pequeña zona de tejido generalmente no es
afectada por estos patógenos vegetales.
 Productos farmacéuticos y alimenticios
Una vez obtenidos los callos a partir de algún explanto, los mismos pueden disgregarse para
obtener una suspensión de células.
Esta suspensión puede utilizarse para generar embriones somáticos (la base de las semillas
sintéticas), o puede directamente cultivarse para producir metabolitos secundarios, que son

compuestos químicos sintetizados por las células vegetales en determinadas condiciones, con gran
utilidad para las industrias farmacéutica y alimenticia, entre otras.
Por ejemplo, son metabolitos secundarios el mentol y las drogas anticancerígenos vincristina y
taxol, y algunos edulcorantes.
Los cultivos celulares se llevan a cabo en biorreactores, que son recipientes de distinta capacidad
(de unos pocos a miles de litros), diseñados para propiciar el crecimiento y/o la multiplicación de
distintos tipos de células y/o órganos

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