Evaluación de capacidad bioinoculante mediante bacterias aisladas de muestra de

suelo.

Stephanie Godoy1, Rodrigo Mejicanos2, Oscar de la Parra3

Manipulación de Células para Aplicación Industrial, Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias y

Humanidades, Universidad del Valle de Guatemala.

1
god18314@uvg.edu.gt, 2mej18088@uvg.edu.gt, 3dela17284@uvg.edu.gt

Resumen
Un microbioma es una comunidad microbiana que se encuentra asociada con sus huéspedes y que posee la
capacidad de promover el crecimiento de las plantas, la absorción de nutrientes, la fijación y solubilización de
componentes esenciales y la producción de enzimas. Es por esto que en la presente práctica se buscó evaluar la
capacidad fijadora de nitrógeno de bacterias aisladas de muestra de suelo y observar sus capacidades para
producir fitohormonas, enzimas y amonio. Haciendo uso de tubos de ensayo se inocularon los medios selectivos
para la evaluación de dichos aspectos, de igual forma, se adicionaron reactivos para lograr realizar las
evaluaciones. Al analizar los resultados se logró evidenciar que la mayoría de las colonias analizadas no poseía la
capacidad para la fijación biológica del nitrógeno a excepción de la colonia 6, que además poseía la capacidad
para producir amonio y producir ácido indolacético (IAA). Por otro lado, la colonia 2 fue la que obtuvo un mejor
resultado para la producción de amonio, sin embargo, no logró la fijación biológica del nitrógeno y obtuvo una
concentración baja de IAA. Se lograron identificar cinco bacterias amonificadoras, tres productoras de celulasa y
una fijadora de nitrógeno. Para futuras investigaciones se recomienda observar los resultados de coloración y
turbidez en un lugar que se cuente con la cantidad de luz adecuada para evidenciar los posibles cambios.

Palabras clave: Fijación biológica de nitrógeno, Producción de enzimas, fitohormonas, Bioinoculante

Introducción
El nitrógeno es un elemento esencial para los seres
vivos siendo parte estructural de las proteínas y del
ADN entre otras moléculas de importancia biológica,
así mismo es limitante del desarrollo vegetal ya que
es escaso como nutriente en los suelos, cabe
mencionar que únicamente el 2% del nitrógeno total
del suelo se encuentra en forma mineral asimilable
para las plantas. Por este motivo se utilizan
frecuentemente fertilizantes nitrogenados en la
producción agrícola. Sin embargo, su utilización
conlleva a problemas ambientales graves es por esto
que surge como alternativa el uso de
microorganismos fijadores de nitrógeno
(Bhattacharjee,2008).
La fijación biológica del nitrógeno es el proceso
mediante el cual el nitrógeno atmosférico es
convertido en amonio, constituyendo la única forma
en que los organismos pueden adquirir este
elemento directamente de la atmósfera. El
nitrógeno es el principal componente de la
atmósfera siendo la misma su mayor reservorio
ambiental. Por otro lado, es importante destacar
que el 60% del nitrógeno total incorporado cada año
al suelo se debe a la fijación biológica de nitrógeno,
mientras que un 30% se debe a procesos
industriales y un 10% a procesos no biológicos
realizados en la atmósfera (Bhattacharjee,2008).
La utilización de la vía biológica de adquisición de
nitrógeno, mediante la fijación biológica de
nitrógeno disminuye la pérdida de este elemento en
el suelo y el gasto proveniente de compuestos
orgánicos altamente energéticos como el petróleo ,
necesarios para la producción de fertilizantes
Diversos estudios de fertilidad en suelos se han
basado durante muchos años en el análisis de
microflora presente en el suelo y dejan de lado la
participación de las enzimas extracelulares
producidas por esta microflora en la degradación de
la materia orgánica y en el flujo continuo de los
elementos del suelo. Las celulasas desempeñan un
papel importante en el ciclo del carbono en el
suelo,degradando desechos vegetales que están
compuestos en su mayoría de celulosa. Esta
actividad cobra gran importancia en la agroindustria
debido a que la degradación de este polímero se
relaciona directamente con la fertilidad y calidad del
suelo (Bhattacharjee,2008).
En las últimas décadas el número de ambientes ricos
en amonio ha ido aumentando drásticamente
debido a las actividades humanas, por lo tanto, la
nitrificación se ha convertido en un proceso que
afecta al ciclo global del nitrógeno. En este proceso
las bacterias oxidantes del amoníaco (AOB) son un
componente esencial, responsables de la oxidación
del amoníaco a nitrito con hidroxilamina como
producto intermedio. Estos microorganismos
pueden degradar diversos compuestos orgánicos y
tienen un papel importante en la producción de
amonio en suelos compuestos que brinda una alta
fertilidad en suelos por su participación en la fijación
de nitrógeno(Bhattacharjee,2008).
Los bioinoculantes hacen uso de microorganismos y
compuestos biológicos que desencadenan
respuestas fisiológicas que mejoran la eficiencia
nutricional, tolerancia al estrés, estimulan el
metabolismo, favorecen el desempeño de las
plantas y la absorción de elementos indispensables
como el nitrógeno y fósforo. Los distintos agentes
bioinoculantes son variados y con diferentes
propiedades: biofijadores, biofertilizantes,
aceleradores de compost, PGPR (Plant growth
promoting Rhizobacteria), bioestimulantes y
biosolubilizadores (Richardsonl, 2011).
(Bhattacharjee,2008).
Materiales y métodos
Las colonias bacterianas estudiadas corresponden a
6 colonias aisladas previamente del suelo. Para
todas las colonias se evaluaron los 4 aspectos:
producción de fitohormonas, de amonio, de
celulasas y fijación de nitrógeno. Todos los medios
se encontraban en tubos de vidrio de 1.5 mL.
Producción de fitohormonas -auxinas
Se inocularon las colonias bacterianas en 500 µL de
caldo tripticasa de soya al 10% con 5mM de L-
triptófano y se incubaron a 30 °C durante dos
semanas. Luego, se transfirieron 300 µL del caldo
nutritivo de cada aislado a tubos de 1.5 mL. Se
agregaron 600 µL del reactivo de Tang & Banner, se
incubaron en oscuridad por 15 min y se leyó la
absorbancia en un espectrofotómetro (marca) a 530
nm. Por último, se calculó la concentración de
auxinas producidas, ácido indolacético (IAA),
utilizando la ecuación de la recta obtenida a partir
de soluciones patrón de 0 - 50 µg/mL del reactivo
comercial de IAA diluido en etanol.
Producción de amonio
Se inocularon las colonias bacterianas en 500 µL de
caldo nutritivo y se incubaron a 30 °C durante dos
semanas. Luego se transfirió el volumen de cada
aislado a tubos de 1.5 mL. Se agregaron 250 µL de
reactivo de Nessler y se observó la coloración,
siendo el color ladrillo un resultado positivo y
amarillo (sin cambio de color) un resultado negativo.
Se clasificó la producción de amonio acorde a la
intensidad de la coloración: +++ (mayor producción),
++ (producción moderada), + (producción leve) y -
(producción nula).
Producción de celulasas
Se inocularon las colonias bacterianas en 500 µL de
medio con carboximetilcelulosa (CMC) y se
incubaron a 30 °C . Luego de dos semanas se evaluó
la presencia de turbidez, como indicador de
crecimiento bacteriano en el agar y se clasificó como
positivo (presencia de turbidez) y negativo (ausencia compuestos en su mayoría de celulosa. Esta
de turbidez). actividad cobra gran importancia en la agroindustria
debido a que la degradación de este polímero se
Fijación de nitrógeno relaciona directamente con la fertilidad y calidad del
Se inocularon las colonias bacterianas en 500 µL de suelo (Bhattacharjee,2008).
medio NFB y se incubaron a 30 °C durante dos
semanas. Se evaluó la presencia de turbidez, como Lo mencionado con anterioridad mejora el
indicador de crecimiento bacteriano en el agar y se crecimiento de las plantas, la salud del suelo y
clasificó como positivo (presencia de turbidez) y permite desarrollar productos en base a estas
negativo (ausencia de turbidez). bacterias, reduciendo el uso de agroquímicos. Por
esta razón se buscó aislar, identificar y caracterizar
bacterias del suelo capaces de fijar nitrógeno y de
Resultados producir celulasas como amonio, mediante el uso de
Cuadro 1. Propiedades evaluadas para cada aislado medios selectivos y diferenciales.
bacteriano.
Al analizar los resultados se puede observar que las
colonias de la 2 a la 6 tienen producción de amonio
Colonia IAA Producción Producción Fijación
de muy alta o alta mientras que la producción de
(µg/mL) de de
amonio celulasas nitrógeno
celulosa como la fijación de nitrógeno es baja,
mientras que la colonia 1 no presenta índices de
1 54 - - - producción de amonio, celulosa y fijación de
nitrógeno. Para la colonia 6 y según los resultados
2 -8.4 +++ + -
obtenidos de su capacidad para producir amonio y
3 -4.6 ++ + - de fijar nitrógeno, se puede mencionar que se puede
tratar de un organismo diazotrofo. Es decir,
4 51 ++ - - organismo que lleva a cabo la fijación biológica de
5 61 ++ + - nitrógeno atmosférico a formas más accesibles como
el amonio.
6 50 ++ - +
Mencionar que se puede tratar de dos grupos de
Discusión bacterias, el primer grupo serían bacterias como
La búsqueda de bacterias fijadoras de nitrógeno y Rhizobium, que viven en simbiosis y forman nódulos
productoras de celulasas como de amonio es una de en las raíces de las plantas que ayudan a la fijación y
las estrategias emergentes en la agricultura, ya que obtención de nutrientes. Y el otro grupo constituido
la deficiencia de dicho compuesto promueve la por bacterias anaerobias estrictas y facultativas
utilización de fertilizantes ricos en nitrógeno que como Clostridium o Klebsiella que son organismos
contaminan al medio ambiente, es por esto que se fijadores no asociados o de vida libre . Esto debido a
utiliza la fijación biológica del nitrógeno, la cual se que el lugar donde se tomó la muestra de suelo se
define como el proceso mediante el cual el trataba de un huerto con tierra fértil y con
nitrógeno atmosférico es convertido en amonio, leguminosas.
constituyendo la única forma en que los organismos
Por último, y partiendo de los resultados obtenidos,
pueden adquirir este elemento directamente de la
cómo siguiente paso se recomienda evaluar las
atmósfera. Por otro lado, las celulasas desempeñan
capacidades bioinoculantes de las bacterias aisladas.
un papel importante en el ciclo del carbono en el
Esto mediante un ensayo in vitro con cultivos de
suelo,degradando desechos vegetales que están
interés, para llevar a cabo una inoculación con las
 bacterias aisladas y así poder evidenciar mejoras update on microbial phosphorus. Plant Physiol.
significativas en el desarrollo y crecimiento de los 156, 989–996.
cultivos.

Conclusiones
1. Se cumplió con el objetivo principal, ya que,
a partir de muestras de suelo fue posible Anexos
identificar cinco bacterias amonificadoras,
tres productoras de celulasa y una fijadora
de nitrógeno.
2. Se recomienda observar los resultados de
coloración y turbidez en un lugar que se
cuente con la cantidad de luz adecuada para
evidenciar posibles cambios.
3. Se determinó que en la colonia 6 se puede
tratar de bacterias simbióticas o bacterias de
vida libre como Rhizobium, Costridium o
Klebsiella, que poseen la capacidad de fijar
nitrógeno biológico. Figura 1. Curva de calibración de IAA obtenida a
partir de soluciones patrón.

Referencias
- Bhattacharjee,R.B.;A. Singh, and S.N.
Mukhopadhyay.(2008). Use of nitrogen-fixing
bacteria as biofertiliser for non-legumes:prospect
and challenges. Applied Microbiology and
Biotechnology.
- Rodriguez, A; Forzani, M; Soares, R; Sibov, S & Viera,
J. (2016). Isolation and selection of plant growth -
promoting bacteria associated with sugargance.
Pesquisa agropecuária tropical. 149-158.
- Ortiz, M., Hernandez, J., Valenzuela, B., de los
Santos, S. Rocha, M & Santoyo, G. (2018).
Diversidad de bacterias endófitas cultivables
asociadas a plantas de arándano. Universidad de
Michoacán de San Nicolás de Hidalgo, México.
- Richardson, A. E. & Simpson, R. J. (2011). Soil
microorganisms mediating phosphorus availability