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P09 - Cromatografía en Columna
P09 - Cromatografía en Columna
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE QUIMICA
COORDINACIÓN LABORATORIOS QUÍMICA ORGÁNICA
LABORATORIO DE QUÍMICA ORGÁNICA IA
PRÁCTICA Nº 09
CROMATOGRAFíA EN COLUMNA
INTRODUCCIÓN.
En este experimento se aislará licopeno, el pigmento rojo del tomate y ß-caroteno, el pigmento amarillo de
la zanahoria. Estas sustancias son carotenoides, que a su vez constituyen pigmentos que existen en muchas
plantas y grasas animales. El ß-caroteno funciona como precursor de la vitamina A. En el hígado el ß-caroteno se
convierte en vitamina A, la cual es convertida posteriormente en 11-cis-retinal en el ojo. El mecanismo de la
visión involucra la isomerización fotoquímica catalizada por enzimas del 11-cis-retinal hasta el más estable trans-
retinal acompañado por el envío de una señal visual como un impulso nervioso. El licopeno es un carotenoide
C40 formado por ocho (8) unidades de isopreno. El ß-caroteno, pigmento amarillo de la zanahoria, es un isómero
del licopeno, en el cual los dobles enlaces en C1 y C2 y C1-C2 se han sustituido por enlaces entre C1 y C6 y C´1 y
C´6 para formar anillos. El cromóforo en cada caso es un sistema de 11 dobles enlaces conjugados en posición
trans al cerrarse los dos anillos de ß-caroteno, que es menos coloreado que el licopeno.
-Caroteno
Licopeno
El procedimiento de deshidratación de los vegetales que se sigue para extraer los pigmentos, se efectúa
por tratamiento de una mezcla de pasta de tomate y de zanahoria rallada con alcohol etílico y extracción en
cloruro de metileno. La deshidratación inicial, remueve agua de los tejidos del tomate y de la zanahoria, de tal
manera que la extracción con diclorometano pueda ser más eficiente. El diclorometano es un solvente insoluble
en agua, y por lo tanto, no extraerá en forma efectiva los pigmentos de los tejidos, hasta que el agua haya sido
totalmente removida. La purificación de estos compuestos, utilizando cromatografía de columna ilustra una
técnica de separación extremadamente importante. El procedimiento de separación conduce a cantidades de
pigmento que no se pueden pesar excepto si se emplea una microbalanza, pero es más que suficiente para los
experimentos de capa fina, que se han de desarrollar, después de llevar a cabo la separación de los respectivos
pigmentos.
Los tomates frescos, contienen alrededor de 6% de agua y en 1907, Willsttater aisló 20 mg de licopeno por
kilogramo de fruta a partir de esta fuente. Hoy en día, la pasta de tomate comercial, de la cual se han eliminado
tanto semillas como la piel del fruto, representa una fuente más conveniente, para aislar licopeno. En ella el
contenido de agua de los tomates, ha sido reducido por evaporación al vacío hasta el punto en que el material
sólido representa aproximadamente el 26% del peso total, separándose entonces tanto como 150 mg por Kg de
pasta. El rendimiento esperado, en el presente experimento es alrededor de 0,75 mg. Por otra parte, la zanahoria
rallada, deshidratada y liofilizada, es una fuente conveniente de ß-caroteno. Originalmente, Willsttater separó 1
gramo de ß-caroteno por Kg de zanahoria deshidratada, de un contenido de agua no determinado.
Debido al gran número de dobles enlaces conjugados que presentan estos carotenoides en su estructura,
absorben radiación en la región visible del espectro electromagnético, razón por la cual exhiben su color
característico. Tanto el licopeno como el beta caroteno, se caracterizan por espectrofotometría UV-
vis, obteniendo sus espectros en el rango de 300-700nm. En los siguientes gráficos se presentan los espectros
teóricos de licopeno y beta caroteno
Espectro teórico UV-Vis del licopeno Espectro teórico UV-Vis del licopeno
PARTE EXPERIMENTAL.
A.-. PREPARACION DE LOS EXTRACTOS
A.1.-. PREPARACION DEL EXTRACTO DE SALSA DE TOMATE
Pese 2 gramos de pasta de tomate, en un vaso de precipitados pequeño y adicione 20 mL de etanol al 95%
y mezcle completamente por agitación circular manual por algunos minutos. Este proceso extrae el contenido
de agua de la salsa de tomate. Filtre a través de un pequeño pedazo de algodón colocado en un embudo de tallo
corto. Coloque un pedazo de de papel de filtro sobre la pasta que permanece en el embudo y presiónela con los
dedos para exprimir y remover el etanol adsorbido. Adicione un exceso de unos pocos mililitros de etanol.
Coloque la pasta residual sobre un papel de filtro limpio, remueva y deseche el algodón y el primer papel de
filtro. Envuelva la pasta en el papel y presiónelo para lograr secarla lo más posible. Coloque la pasta resultante
en un vaso de precipitados de 50 mL añada 20 mL de diclorometano. Agite completamente para extraer los
pigmentos. Separe por decantación la solución orgánica de la paste de tomate y filtre por gravedad usando como
recipiente colector un pequeño vaso de precipitados limpio y seco. Concentre, calentando en un baño de vapor
hasta obtener un volumen de 1-2 mL.
A.2.-. PREPARACIÓN DEL EXTRACTO DE ZANAHORIA RALLADA:
El extracto de zanahoria rallada se obtiene siguiendo los siguientes pasos. En un vaso de precipitados de 50
mL de capacidad pese 2 gramos de zanahoria rallada y deshidratada en un horno de micro-ondas y adicione 10
mL de diclorometano. Agite y macere la mezcla con la espátula, hasta que desaparezcan los grumos de la pasta.
Después, filtre por gravedad a través de un embudo tallo corto, al cual se le ha colocado un pequeño pedazo de
algodón en el cuello del mismo, lo suficientemente suelto, para que no se atore en el tallo bloqueando la salida
de líquido filtrado. Recoja el filtrado en una fiola de 50 mL de capacidad limpia y seca. Evapore la solución
calentándola en un baño de vapor hasta unos pocos mililitros.
no deben golpearse tan fuertemente. Manteniendo la llave abierta de la bureta, permita que parte del solvente
drene, recogiéndolo en una fiola de 125 mL de capacidad que se encuentre limpia y seca. Arrastre, la alúmina
que se haya quedado adherida en las paredes de la bureta, haciendo uso de la varilla de vidrio o con algunos mL
de ligroína. Repita este proceso tantas veces como sea necesario. Durante este procedimiento, puede ser
beneficioso golpear suavemente las paredes de la bureta con los dedos ó con un pedazo de manguera de goma,
para tratar de compactar la columna de alúmina que se forma. No permita que la columna se seque durante el
proceso de empaquetamiento, es decir el nivel del líquido siempre debe estar por encima de la superficie de la
alúmina dentro de la bureta. Este procedimiento, permite eliminar burbujas de aire, de la superficie de la
alúmina. Añada otra porción de arena de mar aproximadamente 2 mm de espesor, en la superficie de la capa de
la arena. Drene ele exceso de solvente, hasta que este alcance el nivel superior de la arena. Cierre la llave de
drenaje.
del solvente de elución, hasta que eluya con acetato de etilo puro. Reúna en un tubo las fracciones amarillentas
y en otro las fracciones de color rojo. Evapore separadamente ambas fracciones hasta casi sequedad y realice los
experimentos de Uv-Vis de cada carotenoide. Compare el espectro experimental con el reportado en la literatura
y exponga sus propias conclusiones.
POST-LABORATORIO
Discuta sobre los siguientes puntos en su informe:
Separación de los pigmentos: colores observados, posición en la columna
Con que solvente o con qué proporción se observó una mejor separación de los pigmentos
Resultados de la capa fina
Resultado de los espectros UV y comparación con los espectros teóricos: longitudes de máxima
absorción, similitudes y diferencias en con los espectros teóricos
BIBLIOGRAFIA
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