Bol. Centr. Panam. Fiebre Aftosa 55:27-30, 1989 27 IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS DE LA LENGUA AZUL POR LA TECNICA DE INMUNODIFUSION EN GEL DE AGAR Rossana Allende S.', Gongala M. Arita?, Magnus S. Séndahl', Albino Alonso F.* RESUMEN ‘Se proparé un antigeno soluble del virus de la lengua azul (VLA) para ser utilizado en prucbas de inmunodifusién en get de agar (IDGA). Dicho antigeno es grupo especifico, y es capaz de detec- tar anticuerpos inducidos por cualquiera de los 24 serotipos del VLA, Fue producido partir del VLA ‘erotipo 4 y controlado en IDGA frente a antigenos y sueros de referencia (NVSL, Ames, EUA; LARA, Campinas, Brasil; Veterinary Diag- nostic Technology, Inc., EUA) y por la técnica in- munoenzimética (ELISA) con anticuerpo mono: clonal 3-17-A3 (IADR, Pirbright, Inglaterra). ‘Todas las pruebas mostraron una reacci6n de total identidad con los reactivos controles. INTRODUCCION La fengual azul (LA) es una enfermedad viral de los rumiantes, transmitida por artrépodos y ca racterizada por congestion, edema y hemorragia. El agente etiolégico pertenece 2 la familia Reo: viridee, enero Orbivirus, del cual se reconocen 24 sorotipos. La enfermedad esté ampliamente distribuids fen el mundo. Afecta principalmente a los ovinos, donde se observa la siguiente sintomatologia clinica: infiamacion de mucosas digestiva y respira toria anteriores que pronorciona una tonalidad azuleda a las mismas. En casos graves puede Centro Ponamericano de Fiebre Atos PANAFTOSA, HPV/OPS/OMSI, Caixa Postal 89, 20001 Rio de Jane ro, RS, Bras * Laboratério Regional de Apoio Animal (LARA), Caixa Postal 8638, 12100 Campinas, SP, Brat, evolucionar a ulceraciones. y puede observarse inflamacion en las patas y deformaciones fetales. La mortalidad es baja. En las otras especies de rumiantes, generaimente no se observan sintomas clinicos, y pueden actuar como reservorios del virus por largos perfodos (2). DIAGNosTICo El sislamiento del virus de la lengua azul (VLA) © hace por inoculaciOn intravenosa de embriones de pollo de 8-12 dias de edad con muestras de san- gre recolectadas de animales en etapa de viremia. El diagndstico serolégico (identificacion de anticuerpos en el suero) se hace por fijacién del ‘complemento (FC), inmunodifusion en gel de agar (IDGA), seroneutralizacién en células (SN) y re- cienterente también por la técnica inmunoeni mética (ELISA). Las pruebas de FC, IDGA y ELISA revelan la presencia de anticuerpos grupo especificos de LA. ‘Actualmente el movimiento de exportacion- importacion de animales entre diferentes éreas se realiza con el estudio previo de los sueros para de- tectar la presencia de anticuerpos anti-VLA. Para tal fin, una de las pruebas utilizadas es la IDGA. La prueba de IDGA detecta anticuerpos en el suero @ partir de 10 dias postinfecci6n. Los anti- cuerpos detectados son grupo especificor, es de- cir, han sido inducidos por cualquiera de los 24 tarotipos del VLA. Pueden observarse reacciones cruzadas con sueros de animales que han padecido Ia enfermedad hemorrégica epizostica del ciervo. MATERIALES Y METODOS Antigeno (Ag): Botellas rolantes con oélulas BHKz 1, Clon 13 mantenidas en estufa a 37°C fueron ‘inoculadas con VLA serotipo 4 (1) y nuevamente colocadas en estufa a 37°C. Trans-28 Bol, Centr. Panem. Fiebre Aftosa 55 curridas 72 horas se observé efecto citopatico, yy fueron tratadas con 3% de cloroformo, conge: ladas, descongeladas y clarificadas por centrifuga: cién a 10.0009 durante 30 minutos. Sequidamente fueron inactivadas con 5 mM de etilenimine bina ria a 269C durante 24 horas. ‘A continuacién la suspension de virus inactiva- da fue concentrada con filtro Amicon de 100.000 NMWL, seguido de una ultracentrifugacién duran- te 2 horas a 200.000 9. Al sobrenadante, que cons- tituye el Ag, se ie agrege 0,02% de NaN y se ‘conserva a 4°C en fracciones de 2 ml. Previo a la titulacién, se realizan los controtes de especi ‘Ag produ- cido frente a Ags y sueros de referencia. El Ag fue controlado por IDGA con reactivos de referencia de NVSL, Ames, EUA, LARA, Campinas, Brasil, y Veterinary Diagnostic Technology, Inc., EU en ELISA frente al anticuerpo monocional espec fico 3-17-A3, segin protocolo de IADR, Piroright, Inglaterra. Una vez confirmada la especificidsd de grupo se procede a la titulacin del Ag. ‘Suero control positive (SCP): El SCP es una mezcla de sueros de bovinos dei estado de Rio de Janeiro, Brasil, positives @ LA por IDGA, los cua les fueron concentrados cuatro veces por precipita: clon de las inmunoglobulinas con sulfato de amo- nio. Después se agreg6 0,02% de NaN, conservin- dose a-209C en fracciones de 2 ml. ‘Agar al 2%: Se disuelven 20 gramos de agar pu: rificado (Difeo} en 1100 mi de aqua destilada des- rmineralizada y se esteriliza a 15 libres de presion durante 15 minutos. Sequidamente se verte en una bandeja, se deja solidificar, se corta en cubot de aproximadamente 2 cm de lado, s¢ sumergen en agua destilada y se conservan a 49C, hasta $0 uso. Tampén borato (TB): Se prepara 0,05 M de hidréxido de todio (NaOH), 0,15 M de dcido bé- Fico (Hs BOs), 1% de NaN, pH 8, Preparacién de placas con agar al 1%: agar al 29% es mezctado en partes iguales con TB y fundido por calentamiento en bafo Marfa. A continuacién te vierten 16 mi de la mezcla agar-TB en placas de Petri descartables de plistico o de vidrio de 90 mm de didmetro, las cuales se mantienen semidestapa- das a temperatura ambiente (25 2 30°C) du: rante un minimo de dos horas, para garantizar ‘una adecuada gelificaci6n del ager. Las placas que no son usadst inmediatamente pueden conservar- se en heladera a 40C durante una semana. Las cavidades en el agar son hechas con un molde que tiene siete perforadores dispuestos tuno en el contin y seis en !a periferia, de 4 mm de didmetro externo cada uno, equidistantes 2 mm entre si y del central. En cada placa pue- den hacerse siete moldes. El eyar de las cavi ddades se extrae por succién con bombs de vacio inmediatamente antes de colocar los reactivos ena placa. ‘Titulacién del Ag y det SCP: Cada partida de Ag y de SCP es titulada para determinar la dilucién 4ptima de uso. EI Ag y SCP son diluidos en base 2 (1:1 a 1:8) en TB, y cada dilucién de Ag se coloce fen las cavidades centrales de cada mode y las iciones de SCP son depositadas en cuatro cavi dades de 1a periferia. En las dos cavidades restan- tes de la periferia se coloca un SCP de referenc (Fig, 1). Al depositar los reactivos ha de tenerse ta precaucién de llenar las cavidades hasta et bord FIGURA 1. Titulacién de antigeno (Ag) y suero control positive (SCP) pers lengua azul a.b.eyd =Diluconesde Ag 1:1, 1:2, 14 1:8, 1y4 __=Suero postive de raferencie, 2,3,5 6 =Dikuciones de SOP 1:1, 1:2, 1:4 y 138 respectivamanteR. Allende S. et al. 29 Una buena distribucién de los mismos se consi que con micropipetas graduadas 0 con pipetas Pasteur. ‘Las placas se incuban por 48 horas a temperatu- ‘a ambiente en una superficie nivelada. Posterior- mente se realiza la lectura y se elige las diluciones Sptimas de uso que son aquellas que, analizadas conuntamente, proporcionan 1a reaccién més Especificidad y sensibilidad de Ag y SCP: Después de determinar Ia dilucién de uso de cada lote de Ag y SCP, ambos son analizados compars- tivamente con Ag y SCP padrones, frente a una serie de sueros positivos y negativos de varias es- pecies, con diferente intensidad de reaccion, para determinar su especificidad y sensibilidad. Andlisis de sueros: Los sueros a ser examina- dos, después de registrados y numerados conve: riientemente, son colocados en las placas debida- mente identificadas. La distribucién de los sueros se hace en el sentido de las agujas del reloj en los moldes y en la placa. En cada molde se colocan cuatro sueros sin diluir en cuatro cavidades de Ia Pe En las dos restantes se afiade el SCP. El ‘Ag es depositado en la cavidad central conforme el esquema indicado en la Fig. 2. Seguidamente, las placas son incubades @ temperatura ambiente en. tuna mesa nivelada. Lectura de las placas: Las placas se colocen sobre una frente de luz indirecta, con fondo oscu- ro y la lectura se hace entre 24 y 48 horas después dde haber adicfonado los reactivos en las placas. En este tiempo las lineas de precipitacién son nitidas. Lecturas realizadas después de las 48 horas son di ficiles de interpretar, debido a que las Nineas se tornan difusas. ‘A veces, cuando se trabaja con sueros muy he- molizados © que tienen altas concentraciones de ipidos u otras substancias, aparecen lineas de di- fusién no especificas, las cuales dificultan la lectu- FIGURA 2. Distribucion de sueros a ser analizados,Ag y SCP ‘en una placa de Petri y reaccién de los mismos 2. =AgySCP respoctivmente, 1828. =Sveros on endo. ‘CUADRO 1. Interpretacién de tat reac: clones proporcionadas por tot sueror w ero Rest. Rewit 1 2 6s 2 6 3 woe Os ies) 5 + io 6 pes 2 + 7 + aH a S 2 9 ” BF w= ao noe 23 7 eee 2% + es a “oof 2B = negttivo, + postivo, ‘+ positive Intenso, ? dudoso.Bol. Centr. Panam. Fiebre Aftosa 55 ra, Este inconveniente puede subsanarse lavando e! ‘agar con solucién fisiolégica 10x antes de hacer la lectura. RESULTADOS Todos los sueros# ser examinados estin cont uos al SCP, 1o que permite observar si ls Vneas Ge preciptacion orginadas mantienen la identidad con la del SCP. Ha de teneree presente que algunos sueros dan lineas 0 reacciones de no identidad © inespeciticas para el Ag de la LA, siendo aauelas aque cruzan 0 tocan la linea de precpitacién espe- Citica originada por el Ag y SCP de la LA (ver Fig. 2 y Cuadro 1) ') Suero negative (~): Son aquellos en ta lines de referencia, es decir a orisinada por el Ag Y el SSCP, entra en la cavdad del suero en estudio. ib) Suero.pesitvo (4): La linea de referencia vesenta une pequefa curvaturapréxima al suero en estudio. ) Suero postivo intenso (+4): La situacion y apariencia de la linea de preciptacién originada or el suero en estado son similares en intensided ala del SP. <) Suero dudoso (7): Los sueros que por cual cuier motive no pueden encuadrarse como —, + 0 + son reexaminados usando e! siguiente proced- miento: Repeticion de los sveros dudosos. Los sueros son analzados nuevamente por IDGA, colocan- do el SCP en tes cavidades alternadas de la pe- riferi, en dos restanes los ueros dudotos y en ta tercera un suaro negatvo, De esta manera s¢ cbserva la reaccién en las dos lineas de ree rencia contiguas y en comparacién con e suero negatvo (ver Fig. 3). La interpretacin se hace de enol apartado anterior. Con los sueros que nuevamente no permiten ser catalogados en la categoria +o — es aconsjable Tepetirla prueba con una nueva muestra de sero. ‘manera indicada FIGURA 3. Andlisis de sueros que proporcionaron resultados dudosos en 1a prueba mostrada en la Fig. 2 (suoros NO 19 y 25) a2 ov/e © 8 yb -=AgYSCP respectivamente © = Suero control negative. 19 y 25 = Suerosen estudio (13+ y 267). Pedi nuave muestra sur NO 25, REFERENCIAS 1. GROOCOCK, CAM., CAMPBELL, C.H. Isolation of an ‘exotic wrotype of bluetongue virus from imported ‘exten quarantine, Can. 5. Comp, Med, A6:160-164, 1982, 2. OBDEYN, 1M, Bluetongue. A review of the disease. Rio de Jansiro, Pan Americen FootandMouth Dit tense Canter, 1987. (Scion. Tech, Monog., 16)