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METODOS DE ESTUDIOS EN BIOLOGA CELULAR

Como se estudian las clulas


Las clulas pueden estudiarse : Mtodos de observacin directa de clulas vivas Mtodos de anlisis de clulas muertas preservadas Mtodos de aislamiento de clulas vivas por centrifugacin

Cultivo celular primario y secundario

Preparacin e investigacin para tejidos muertos


Fijacin Inclusin y corte Coloracin

Preparacin e investigacin para tejidos muertos


Fijacin : detiene los procesos celulares y permite mantener la estructura celular con mnimas modificaciones.Se utilizan fijadores como el formaldehdo,glutaraldehdo, tetrxido de osmio

Inclusin y corte
Inclusin : el tejido se incluye generalmente en parafina lquida y luego se deja enfriar para formar los tacos que facilitaran el corte Corte : se requiere que los preparados tengan un espesor de 5 -10 um para lo que se requiere un micrtomo

Micrtomo

Corte por congelamiento


Es una tcnica muy rpida y puede ser :
Congelacin desecacin: se intenta qu ela variacin estructural y enzimatica sean las minimas posibles se congela rapidamente la muestra, sela coloca al vaco y se deshidrata Congelacin por sustitucin: se hace un tratamiento previo de fijacin y luego un congelamiento y deshidratacin a -85 C en metanol puro

Coloracin
Puede hacerse con colorante cidos o bsicos dependiendo si las estructuras a teir son acidfilas o basfilas Algunas coloraciones : hematoxilina eosina, coloracin tricrmica de Mallory

Tincin de hematoxilina eosina

Acidofilia y basofilia

Tincin selectiva
Coloracin tricromica: se utilizan varios colorantes cidos Una tcnica para el estudio del tejido conjuntivo. Los cortes se tien con fucsina cida, solucin de azul-naranja G de anilina y cido fosfotungstico. Las fibras de colgeno aparecen en azul, la fibroglia, neuroglia y fibras musculares aparecen en rojo y las fibrillas de elastina en naranja. Tambin llamada tincin tricrmica de Mallory

Metacromasa

Mtodos citoqumicos
Reaccin de Schiff para grupos aldehdos
Mtodo del cido peryodico Schiff (PAS): pemite determinar la presencia de macromoleculas ricas en carbohidratos como el glucgeno y glucoprotenas Mtodo de Feulgen es especfico para la determinacin de ADN, se eliminan los grupos purinicos mediante una hidrlisis y se colorean los grupos aldehdos de la desoxirribosa

Mtodo de PAS

Mtodo de Feulgen

Deteminacin citoquimica de lipidos

METODOS INMUNOHISTOQUIMICOS
Se basa en la condicin del organismo de formar anticuerpos especficos ante sustancias extraas antgenos que actan como tales protenas y polisacaridos. Los anticuerpos se marcan mediante una sustancia que puede transformarse en visible Se puede emplear la tcnica anticuerpo fluorescente, marcando el anticuerpo con fluoresecena o se puede adosar a la enzima peroxidasa, mediante la tcnica enzimohistoquimica de la peroxidasa Se puede acoplar el anticuerpo a la protena electrodensa ferritina o a partculas de oro

Mtodos inmunohistoquimicos

Mtodos inmunohistoquimicos

Fraccionamiento celular

Separacin celular por centrifugacin Fraccin nuclear Fraccin mitocondrial Fraccin membranosa Fraccin ribosomal

Criofractura

El microscopio
Poder resolutivo: capacidad del microscopio de poder visualizar a dos puntos como separados en el objeto Limite de resolucin: es la distancia mnima que debe existir entre dos puntos del objeto para que se visualicen como separados A menor limite de resolucin mayor poder resolutivo La claridad y riqueza de detalles dependen del poder resolutivo

Poder resolutivo
El poder resolutivo depende de la longitud de onda de la luz utilizada y la apertura numrica Limite de resolucin (d) =0.61x NA

El microscopio
Indice de refraccin :es una medida de la velocidad de dispersin de una onda luminosa a travs del medio

Apertura numrica
Medida de la capacidad del microscopio de agrupar las refracciones de la luz producidas por los detalles finos del objeto. Expresa el tamao del haz de luz que es captado por el objetivo despus de haber atravesado el objeto. Se expresa como NA = n x sen u. Donde n es el ndice de refraccin del medio que separa el cubreobjeto de la lente del objetivo y u es la mitad del ngulo superior del haz de luz captado por el objetivo

APERTURA NUMERICA

El microscopio
Aumento: es la relacin entre el tamao de la imagen y del objeto en valores lineales El aumento no depende del poder resolutivo

oculares

revlver Objetivos platina condensador diafragma Fuente de luz Tornillo macromtrico Tornillo micromtrico

El microscopio ptico
El poder resolutivo depende de la luz utilizadas y de la apertura numrica del objetivo y del ocular El mximo poder resolutivo que puede obtenerse es de 0.2m pero los preparados de rutina rara vez excede a 0.5 m El aumento total resultante se determina mediante el producto del aumento del objetivo por el aumento del ocular

Tipos de microscopios
optico Campo oscuro De contraste de fases De interferencia De luz polarizada De fluorescencia De barrido confocal De luz ultravioleta electrnico

Microscopio de Campo Oscuro

Microscopio de campo oscuro


Se analizan partculas pequeas por debajo del poder resolutivo del microscopio El condensador especial impiden que llegue la luz directamente al objetivo Solo incide en e objetivo la luz desviada o esparcida por las partculas que se desean investigar.

Microscopio de contraste de fases y de interferencia

Microscopio de contraste de fases


Hace posible que las diferencias de refraccin entre los diferentes componentes del tejido se transformen en diferencias de intensidad que puedan ser captadas por el ojo. Permite visualizar componentes de las clulas vivas que con un microscopio comn sera imposible de visualizar

Microscopio de interferencia
Es similar al de contraste de fases ya que utiliza diferencias en la refraccin de los componentes celulares, se diferencia de ste porque adems datos cuantitativos como la cantidad de masa por superficie del preparado y en consecuencia la masa de los elementos celulares individuales

Microscopio de contraste por interferencia de Nomarski


Se aumenta el contraste y se obtiene una imagen tridimensional

Microscopio de luz polarizada


Puede identificar estructuras birrefringentes o anisotrpicas que dividen en dos componentes con diferentes velocidades a la luz polarizada, y estructuras isotrpas que no dividen en dos la luz polarizada, por lo que el ndice de refraccin es igual en todas las direcciones. Puede proporcionar datos sobre la estructura molecular Se puede utilizar tambin para observar clulas vivas

Microscopio de fluorescencia
Se ilumina el preparado con una intensa luz de la longitud de onda que es capaz de activar el color del colorante fluorescente empleado, se utiliza para ello un filtro de color que se coloca por debajo del condensador, y otro filtro por encima del objetivo de color correspondiente a la longitud de onda de la luz que emite el colorante utilizado cuando fluoresce

Microscopio de fluorescencia

Microscopio de fluorescencia

Microscopio de barrido confocal


Presenta mayor nitidez de una imagen bidimensional registrada en una pantalla de televisin. Al recoger con una computadora una serie de imgenes de distintos planos focales es posible reconstruir una imagen tridimensional.

Microscopio de luz ultravioleta


Utiliza como fuente de luz la luz ultravioleta de longitud de onda de alrededor de 250 nm, lo que duplica el poder resolutivo del microscopio El sistema ptico est constitudo por cuarzo y la imagen se registra en una pelcula fotogrfica La principal importancia es que permite detectar con facilidad los ac. Nuclecos.

Microscopio elctronico
El objeto es atravesado por electrones El haz de electrones de longitud de onda de 0,005 nm remplaza a la longitud de onda de 500nm Permite un mayor poder resolutivo y un lmite de resolucin de 0.2 nm Las lentes de vidrio son remplazadas por bobinas electromagnticas o lentes electromagnticas que permiten la modificacin del trayecto del haz de electrones

Microscopio electrnico

Microscopio electrnico de transmisin


Los electrones atraviesan el objeto La imagen obtenida se aumenta por una lente proyectora que corresponde al ocular del microscopio ptico La imagen formada se registra por proyeccin sobre una pantalla fluorescente o una pelcula fotogrfica Todo el sistema debe estar en una atmsfera al vaco

Microscopio electrnico de barrido

Microscopio electrnico de barrido


Los electrones no atraviesan el objeto La imagen se forma indirectamente Permite la captacin puntual de la superficie del preparado El preparado se cubre de una capa de metal pesado que se bombardea con un haz de electrones que barre el objeto en un patron lineal y lo copia La imagen se visualiza directamente sobre la pantalla y se registra en una fotografa o en forma digital Se logra una imagen tridimensional del objeto que no necesita ser de cortes ultrafinos

Difraccin de rayos X
Se utiliza un haz de rayos X a travs de la muestra El haz se separa y se dispersa en un patrn de difraccin que se registra en una pelcula fotogrfica. Solo se utiliza para estructuras muy ordenadas de naturaleza cristalina Permite obtener informacin sobre macromoleculas como el DNA