FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

PROGRAMA ACADÉMICO DE MEDICINA

PRÁCTICA N° 7. DETERMINACIÓN DEL PERFIL LIPÍDICO

I. OBJETIVOS
Evaluar la concentración sérica de colesterol, triglicéridos, colesterol LDL por el
método enzimático y la determinación de HDL, previa precipitación de las otras
lipoproteínas.

II. MATERIALES
Material de vidrio: tubos de ensayo, pipetas milimétricas.
Equipo de extracción de muestra: guantes, alcohol, algodón, agujas N° 20, jeringas x 5
cc.(POR CADA MESA)
Equipos: centrífuga, baño maría, espectrofotómetro.
Micropipetas x 10 ul 1 POR LABORATORIO,
Kit para Colesterol Wiener Lab.:
Sol. Estándar: solución de colesterol = 200 mg/dl (2 g/l).
Reactivo A: solución conteniendo colesterol esterasa (CHE), colesterol oxidasa (CHOD),
peroxidasa (POD), 4aminofenazona (4-AF) y buffer Good (conteniendo fenol y colato de
sodio).
Kit para Triglicéridos Wiener Lab.:
Sol. Estándar: solución de glicerol 2.26 mmol/l (equivale a 2 g/l de trioleína).
Reactivo A: solución conteniendo buffer Good (pH 6.8), clorofenol, lipoproteinlipasa
(LPL), glicerol kinasa (GK), glicerol fosfato oxidasa (GPO), peroxidasa (POD), adenosina
trifosfato (ATP) y 4-aminofenazona (4-AF).

III. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

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Determinación de Colesterol Total

La secuencia de reacciones que se emplean en esta determinación es la siguiente:
Colesterol
Esteres de Colesterol esterasa
Colesterol + ácidos grasos;

Colesterol
Colesterol + O2 oxidasa
Colesten-3-ona + H2O2

POD
H2O2 + 4-AF + aceptor _______ quinonimina roja

1) Extracción de muestras: previa limpieza de la zona con alcohol, se extraerá 5 cc de

sangre de la flexura del codo con jeringa hipodérmica de 5 cc y aguja N° 20, de dos
pacientes en ayunas.
2) Una vez obtenidas las muestras, colocarlas en tubos de ensayo y dejarlas reposar
durante 10 minutos.
3) Terminado el reposo, contrapesar los tubos conteniendo las muestras y centrifugarlos a
3000 RPM durante 10 minutos.
4) Finalizado el centrifugado separar el suero para trabajar la determinación.
5) Para la determinación de colesterol total: En 3 tubos de ensayo marcados con B (Blanco),
S (estándar) y D (Desconocido), se debe colocar:
COMPONENTES TUBOS DE ENSAYO

B S D

Muestra (suero / ul) -- -- 10

Estándar (ul) -- 10 --

Reactivo A (ml) 1.0 1.0 1.0

Mezclar e incubar por 5 minutos a 37 °C o 20 minutos a temperatura

ambiente (18 a 25 °C). Leer en espectrofotómetro a 505 nm llevando el
aparato a cero con el Blanco.

6) Cálculos de resultados:
Cálculo del factor:
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𝟐 𝒈/𝒍
𝑭=
𝑺

Cálculo de la concentración de Colesterol. (de cada una de las muestras).

Colesterol (g/l) = D x F
Conversión: Colesterol (g/l) = 0,01 x Colesterol (mg/dl)
7) Interpretación de los resultados.
Valores Referenciales: [ATP III, NCEP]
● Deseable: < 2,0 g/l
● Moderadamente alto: 2,00 a 2,39 g/l
● Alto: ≥ 2,40 g/l
Determinación de Triglicéridos.
La técnica empleada en la determinación de triglicéridos en sangre, es una técnica
enzimática basada en la siguiente reacción:

Lipoprotein
Triglicéridos glicerol + ácidos grasos;
lipasa

Glicerol kinasa
glicerol + ATP glicerol-1-P + ADP;

Glicerolfosfato
Glicerol-1-P + O2 oxidasa
H2O2 + dihidroxiacetonafosfato;

POD
2 H2O2 + 4-AF + clorofenol quinonimina roja

1) Para la determinación de triglicéridos: En 3 tubos de ensayo marcados con B (Blanco), S

(estándar) y D (Desconocido), se debe colocar:
COMPONENTES TUBOS DE ENSAYO

B S D
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Muestra (suero / ul) -- -- 10

Estándar (ul) -- 10 --

Reactivo A (ml) 1.0 1.0 1.0

Mezclar e incubar por 5 minutos a 37 °C o 20 minutos a temperatura

ambiente (18 a 25 °C). Leer en espectrofotómetro a 505 nm llevando el
aparato a cero con agua destilada.

2) Cálculos de resultados:
Cálculo del factor:
𝟐 𝒈/𝒍
𝑭=
𝑺

Cálculo de la concentración de Triglicéridos. (de cada una de las muestras).

Triglicéridos (g/l) = D x F
Conversión: Triglicéridos (g/l) = 0,01 x Triglicéridos (mg/dl)
3) Interpretación de los resultados.
▪ Valores Referenciales: [ATP III, NCEP]
● Normal: < 1,5 g/l
● Límite alto de normalidad: 1,50 a 1,99 g/l
● Elevados: 2,00 a 4,99 g/l (Hipertrigliceridemia moderada)
● Muy elevados: ≥ 5,00 g/l (Hipertrigliceridemia severa)

Determinación de HDL-Colesterol
Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) se separan precipitando selectivamente las
lipoproteínas de baja y muy baja densidad (LDL y VLDL) mediante el agregado de sulfato
de dextrán de PM 50.000 en presencia de iones Mg++. En el sobrenadante separado por
centrifugación, quedan las HDL y se realiza la determinación del colesterol ligado a las
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mismas, empleando el sistema enzimático Colesterol oxidasa/Peroxidasa con

colorimetría según Trinder (Fenol/4- Ami-nofenazona)

1) Para la determinación de HDL-Colesterol se realizará lo siguiente:

En un tubo de vidrio colocar:

Muestra (suero / ul) 500

Reactivo Precipitante (ul) 50

Homogeneizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos.

Dejar 30 a 40 minutos en refrigerador (2-10 °C) o 15 minutos en baño de agua a la

misma temperatura. No colocar en el congelador.

Centrifugar 15 minutos a 3000 r.p.m. Usar el sobrenadante límpido como muestra.

En 3 tubos marcados B, S y D; armar lo siguiente:

COMPONENTES TUBOS DE ENSAYO

B S D

Sobrenadante (ul) -- -- 100

Estándar (ul) -- 20 --

Reactivo de Trabajo (ml) 2.0 2.0 2.0

Mezclar e incubar por 5 minutos a 37°C si se usa el reactivo de trabajo de Colestat

enzimático AA/líquida o 15 minutos a 37°C cuando se usa el Colestat enzimático.
Retirar del baño y enfriar. Leer a 505 nm en espectrofotómetro, llevando a cero con
el blanco.

2) Cálculos de resultados:
Cálculo del factor:
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𝟎. 𝟒𝟓𝟕 𝒈/𝒍
𝑭=
𝑺

Cálculo de la concentración de HDL-Colesterol. (de cada una de las muestras).

HDL-Colesterol (g/l) = D x F
Conversión: HDL-Colesterol (g/l) = 0,01 x HDL-Colesterol (mg/dl)
3) Interpretación de los resultados.
Valores Referenciales:
● Normal: 0,40 a 0,6 g/l
● Bajo o de Riesgo: < 0,40 g/l
● Protector: ≥ 0,60 g/l

Determinación de HDL-Colesterol
Las lipoproteínas de baja densidad (LDL o β­lipoproteínas) se separa del suero
precipitándolas selectivamente mediante el agregado de polímeros de alto peso
molecular. Luego de centrifugar, en el sobrenadante quedan las demás lipoproteínas
(HDL y VLDL); el colesterol ligado a las mismas se determina empleando el sistema
enzimático Colesterol oxidasa/ Peroxidasa con colorimetría según Trinder (Fenol/4-AF).
Por diferencia entre el colesterol total y el determinado en el sobrenadante, se obtiene
el colesterol unido a las LDL.

1) Para la determinación de LDL-Colesterol se realizará lo siguiente:

En un tubo de vidrio colocar:

Muestra (suero / ul) 200

Reactivo Precipitante (ul) 100

Homogeneizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos.

Dejar 15 minutos en baño de agua a 20-25°C

Centrifugar 15 minutos a 3000 r.p.m. Separar inmediatamente el

sobrenadante.

Usar el sobrenadante como muestra para el ensayo colorimétrico.

En 3 tubos marcados B, S y D; armar lo siguiente:

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COMPONENTES TUBOS DE ENSAYO

B S D

Sobrenadante (ul) -- -- 100

Estándar (ul) -- 20 --

Reactivo de Trabajo (ml) 2.0 2.0 2.0

Mezclar e incubar por 5 minutos a 37°C si se usa el reactivo de trabajo

de Colestat enzimático AA/líquida o 15 minutos a 37°C cuando se usa
el Colestat enzimático. Retirar del baño y enfriar. Leer a 505 nm en
espectrofotómetro, llevando a cero con el blanco.

2) Cálculos de resultados:
Cálculo del factor:
𝟎. 𝟔𝟐𝟒 𝒈/𝒍
𝑭=
𝑺

Cálculo de la concentración de LDL-Colesterol. (de cada una de las muestras).

LDL-Colesterol (g/l) = D x F
Conversión: LDL-Colesterol (g/l) = 0,01 x LDL-Colesterol (mg/dl)
3) Interpretación de los resultados.
Valores Referenciales:
● Deseable: < 1,00 g/l
● Casi deseable: 1,00 a 1,29 g/l
● Alto limítrofe: 1,30 a 1.59 g/l
● Alto: 1,60 a 1,89 g/dl
● Muy alto: ≥ 1,90 g/dl

IV. CONCLUSIONES
El estudiante debe plantear las conclusiones, en base al análisis de los resultados
obtenidos en el desarrollo de la práctica de laboratorio.
La conclusión es una afirmación en respuesta a los objetivos.