Vinculacién Tecnoldgica Juan Carlos Belmonte Ana Malizia SSECRETARIA Dé POLITICAS UNIVERSITARIAS Con la colaboracién de Jorge Méndez D e Recopilacién y Edicién: f Biodiversidad y Medio Ambiente zn INVESTIGACION Y DESARROLLO :: Aplicacin de hongos para la degradacion de soluciones acuosas de Fenol RESUMEN En el presente trabajo se estudié la degradacién de solucio- nes acuosas de fenol utilizando un aislamiento de Penicillium chrysogenum, proveniente de suelos agricolas del sudeste de la provinciade Buenos Aires. La degradacién defenol sellevé a caboa 25°C, en cultivos discontinuos esté- ticos con 6, 30, 60, 200, 350 and 400 mg/l de fenol inicial como Unica fuente de carbono y energia. El hongo ha demostrado ser capaz de degradar todas las concentracio- nes iniciales de fenol y el tiempo requerido para completar la degradacién de fenol aumento con las concentraciones iniciales del mismo. Ademés, los productos de la degrada- cién de fenol por P. chrysogenum no fueron fitotoxicos para semillas de trigo. Los datos experimentales obtenidos se ajustaron a modelos cinéticos, para ser utilizados a posteriori como herramienta en la biorremediacién directa de suelos contaminados con elfin de obtener una alternativa econémica y eficiente para su tratamiento. ABSTRACT In this work phenol degradation was studied using a Penicillium chrysogenum strain, isolated from crop soils in the southeastern of Buenos Aires province. Degradation was carried out at 25°C, in batch cultures in resting myce- lium conditions, at 6, 30, 60, 200, 350 and 400 mg.! * of phe- Autores Ignacio Durruty Patricia M, Haure Jorge F. Gonzalez Erika A. Wolski Unidad Ejecutora Grupo de Ingenieria Bioquimica, Fac, Ingenieria, UNMDP Exmail ewolski@mdp.edu.ar Entidad Adoptante Industrias relacionadas con la pro- duccién de resinas poliméricas, refi- nacién de aceite, petréleo, ras, plaguicidas, preservacién qui- mica de la madera e industria text nol as the only source of carbon and energy. The fungi degrade all phenol concentrations tested and the time required for complete degradation of phenol increased with the different initial phenol concentrations. In addition, products of phenol degradation were not phytotoxic for wheat. The experimental data were fitted to a kinetic model to be used in the future as a new tool in the direct bioremediation of contaminated soils, to finally obtain an economic and efficient alternative method for its treatment. Pagina 15Biodiversidad y Medio Ambiente #: INVESTIGACION Y DESARROLLO DESCRIPCION INTRODUCCION Elfenol esun contaminante usualmente pre- sente en efluentes liquidos de muchos pro- cesos industriales (refinerias, plantas petro- quimicas, industrias de resinas fendlicas, etc]. Su descarga a los cuerpos de aguanatu- rales 0 suelos puede causar dajios severos, incluso a bajas concentraciones de fenol como 5-25 mg/l (Yan et al 2005). Por tanto, la remocidn de este contaminante o su bio- tremediacion in situ, son de suma impor- tancia para la proteccién del medioambien- te, Se encuentran disponibles numerosas téc- nicas fisicoquimicas de descontaminacién para efluentes con elevada carga orgénica, incluyendo extraccién con solventes, sepa- racién por membranas, sorcién, sonicacién, oxidacién catalitica, oxidacién electroqui- mica y ozonizacién (Leitéo 2009). Sin ‘embargo, si bien algunas de estas técnicas han mostrado ser efectivas, la gran mayoria son costosas y/o pueden generar compues- tos toxicos secundarios 0 requerir condicio- nes de operacidn extremas (altas tempera- turas, oxidantes fuertes, etc) (Yang et al., 2005; Leitéo, 2009). Por ello, el uso de microorganismos (hongos y bacterias) para bioremediacién es una alternativa viable ya que permite degradar los contaminantes hasta productos inocuos como CO, y H,0 de manera econémica. En particular, los hongos filamentosos jue- gan un rol importante en la degradacion de compuestos aromaticos. Especimenes del género Fusarium, Graphium, Aspergillus han sido estudiados por su potencial para degradar fenol (Santos & Linardi 2004; Stoilova et al 2006). Algunos aislamientos del genero Penicillium han demostrado ser muy buenos asimiladores de compuestos hidrocarbonados, transformando com- puestos xenobidticos en productos menos nocivos (Lito, 2009) En este trabajo se estudié la degradacion di soluciones acuosas de fenol utilizando ut aislamiento de Penicillium chrysogenum proveniente de suelos agricolas del sudest bonaerense, Los ensayos se realizaron et cultivos discontinuos estaticos a 25°C, cor 6, 30, 60, 200, 350 and 400 mg/l de fenol ini cial. Los datos experimentales obtenidos s ajustaron a modelos cinéticos adecuados El conocimiento del comportamiento ciné tico de estos procesos es muy importante ya que permite predecir y planificar el desa rrollo de una biorremediacién directa de suelos, ofreciendo asf una alternativa eco. némica y eficiente. Ademés, se llevaron a cabo ensayos de fitotoxicidad para evaluat la toxicidad residual de los productos de la degradacién, DESCRIPCION La degradacién de soluciones acuosas de fenol se Hlev6 a cabo en cultivos disconti- hugs a escala laboratorio. Se utilizé medio minimo suplementado con 6, 30, 60, 200, 350 and 400 mg/l de fenol inicial, como Gnica fuente de carbono y energia. Se utilizé Penicillium chrysogenum cepa ERK 1, pro- veniente de suelos agricolas del sudeste bonaerense. Los medias se inocularon con seis discos de agar de 4 mm, conteniendo el micelio de hongo, cada 250 mi de medio de cultivo. Se incubaron a 25°C en oscuridad en condicio- nes estaticas hasta la desaparicién total de fenolenel medio de cultivo. A partir de muestras obtenidas en distintos intervalos de tiempo se determiné la con- centracién de fenol por cromatografia liqui- da de alta performance (HPLC) y el creci- miento del hongo midiendo el peso seco del mismo. Todos los ensayos se llevaron a cabo Pagina 16Biodiversidad y Medio Ambiente 2: INVESTIGACION Y DESARROLLO :: por triplicado, y los resultados muestran la media de tres experimentos independien- tes. También se determiné el efecto fitotéxico del fenol (400 mg/l) y del residuo de la degradacién de ambos compuestos sobre el indice de germinacién de semillas de trigo (Triticum aestivum), expresado como: IG=GP x La/Lc, donde GP es el numero de semillas germinadas expresadas como por- centaje del control, La es la longitud prome- dio de la raiz en la solucién de fenol y/o su residuo, y Le es la longitud promedio de la raiz en el control. Se realizaron cinco répli- casde diez semillas para cada tratamiento. RESULTADOS Elhongo degradé todas las concentraciones iniciales ensayadas (6, 30, 60, 200, 350 and 400 mg/l) (Figura 1). Fig. 1: Crecimiento fingico y degradacién de fenol por P. chrysogenum, X= peso seco por unidad de vollimen del reactor {Biomasa). Las lineas representan el niileo. EI tiempo requerido para degradar fenol varié entre 4 y 30 dias seguin la concentra- ci6n inicial utilizada. Ademds, para concen- traciones mayores a 30 mg/Ise observan cla- ramente los estados de fase exponencial y estacionaria durante la degradaci6n. En nin- giin caso se observa fase de retardo y el fenol es degradado en todas las etapas (Fi- guras1y 2), En la Figura 2 se observa cémo la velocidad de crecimiento especifico tiende a aumentara medida que la concentracién ini- cial de fenol aumenta hasta llegar a un valor maximo de 0,7634 d” para 30 mg/l. Luego disminuye, debido alla inhibicién provocada por las mayores concentraciones de sustra- to. Bs aS : eS | rs ss eee wee S, (mgt) Fig. 2: Velocidad inicial especifica de crecimiento experimental (1!) de P. chrysogenum utilizando fenol ‘como tinica fuente de carbono y velocidad de degradacidn de sustrato (Rs). Las lineas representan los modelos. La velocidad de degradacién de sustrato R, también muestra un comportamiento tipi- co de una inhibicién por sustrato: aumen- tando hasta alcanzar su maximo a 200 mg/l yluego disminuyendo. Debido a que el valor maximo para Ry uno son coincidentes, tres zonas se quedan cla- ramente definidas en la Figura 1, La Zonal, a concentraciones menares a 30 mg/l, donde ni [Lni R, son inhibidas; La Zona Il, entre 30y 200 mg/I, donde se observa inhibicién dey, pero R, no se ve inhibida; y finalmente la Pagina 177 —. OS ENYESTIGACION Y DESARROLLO: Zona Ill, a concentraciones mayores a 200 mg/l, donde ambas velocidades se ven inhi- bidas, Los datos de blomasa se utilizaron para cal- cular el coeficiente de rendimiento obser- vado (Y,,;) en cada caso. La Figura 3 muestra cémo éste permanece constante a concen- traciones no inhibitorias (Zona 1) pero dis- minuyea concentraciones mayores, 25: os. ao a0 abe S, (mgt) Fig. 3: Rendimiento en biomasa (V ,,) en funcién de ta concentracién incial de fenol (S,) Estudio cinético El conocimiento del comportamiento cing- tico de la degradacién de un contaminante es muy importante para predecir y planifi- car el desarrollo de una biorremediacién directa de suelos. Para esto es importante ajustar los procesos estudiados a modelos matematicos. En este caso, donde el fenol acttia como tinica fuente de carbono y ener- gia, se utiliz6 el modelo de Haldane para ajustar el crecimiento en biomasa, Ecuacién (2), en fa fase exponencial, mientras que la degradacién de fenol se relacioné con Ia bio- masa mediante los coeficientes de rendi- ‘miento, considerando consumo por mante- nimiento. Los datos experimentales de velo- cidades iniciales se ajustaron al modelo en fase exponencial (Figura 2). El valor de 4,., obtenido es de 1.30d“ mientras que los valo- res de K,yK fueron 9.43 mg/l y 64.9 mg/|, respectivamente. ab toss vam xy Lavariacion en Y,,,con respecto a jt fue ajus- tada al modelo de Pirt, para hallar los paré- metros Y,ym: ay tm Yes Yo ft Elcoeficiente de rendimiento real Y, se cal- culd como el coeficiente de rendimiento en la zona no inhibitoria y su valor se fijé en 2.29 d". Enel presente ‘trabajo, la variacién Gel cosficiente de mantenimiento m con pz se tuvo en cuenta para estimar los diferen- tes valores de m en las tres zonas estudia- das, Para la Zona I (no inhibitoria) m, se conside- 6 igual a 0. Por definicién, en ausencia de inhibicién Y, es igual a Y,.. Posteriormente se calcularon m, y m, ajustando a la Ecuaci6n (2) por regresién lineal R® = 0.93 y 0.97, respectivamente. Los valores obteni- dos fueron m, =0,136 d* y My, =0,651 d?, Este alto mantenimiento representa un Bran potencial de inhibicién para altas con- centraciones de fenol, En la fase estacionaria el balance de masa para la biomasa, Ecuacién (4), y la concen- tracién de fenol, Ecuacién (5) se re-escribié, resultando el valor del coeficiente de man. tenimiento en fase estacionaria = 0,0801 20,0127 d":Biodiversidad y Medio Ambiente Ht INVESTIGACION Y DESARROLLO: a XV «0 ee <* a és ae Ns / sp er oxy Sa E ated Fig, 4: Anlsis de toxcdad resicual sobre semis de trigo. Fenol 400 mg.I"(A). Productos de la Estudio de fitotoxicidad. degradacin de fenol (8) & menudo los efluentes conteniendo com- Busstos fendlicos son voleados a distintos Suerpos de agua y en muchos casos ésta es Stlzada para la agricultura, por ello es ‘mPortante determinar la fitotoxicidad de ies residuos fendlicos luego del tratamiento Sungico. EI Gl para el residuo de la degrada. Sen de fenol fue de 100% mientras que Bera as semillas tratadas con fenol fue de 92%, incluso para este caso no se observ slongacién delarate (Figura 4), Valores de Gl menores del 50% significan alta toxicidad, entre 50% y 80% toxicidad moderada y mayor a 80% indican que el material en estudio no presenta fitotoxici- dad. Ello implica que los productos de degradacién de fenol por P. chrysogenum Noresultaron fitotdxicos para trigo, CONCLUSIONES £2 este trabajo se comprobé que P. chryso- genum es capaz de degradar hasta 400 mg/I de fenol a25°Cy en reposo. Esto resulta de Eran importancia para futuras aplicaciones Précticas en la descontaminacién de suelos, ¥2 que dicho hongo fue aislado de suelo agricolas, Elmodelo cinético desarrollado, ajusté ade- cuadamente a los resultados experimenta, les. Este modelo puede ser utilizado para Predecir el comportamiento de la degrada. Ci6n de fenol catalizada por P. chrysogenum Y podrd ser dtil en la aplicacién en biorre. mediacion de suelos. Ademés los Productos de la degradacién de fenol por P. chrysoge- num noresultan fitotéxicos para semillasde trigo, demostrando que resulta una técnica viable para la descontaminacién del fenol. En su conjunto, los resultados del presente trabajo permiten contar con nuevos crite. tlos de operacién e informacién cingtica sobre los procesos de degradacién de fenol, ara ser utilizados en la bioremediacién directa de suelos, con el fin de obtener una herramienta econémica y altamente ef ciente para su tratamiento. Pagina 19