CÓDIGO: FO-DOC-112

UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS

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PROCESO GESTION DE APOYO A LA ACADEMIA FECHA: 02/09/2016
FORMATO GUÍA PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO VIGENCIA: 2016

UNIDAD
ACADEMICA: PROGRAMA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
CURSO: MICROBIOLOGÍA
PRACTICA Nº 4: TECNICAS DE MUESTREO Y SIEMBRA DE MUESTRAS

El propósito de esta práctica radica en el desarrollo de la competencia para la aplicación de técnicas

de identificación de microorganismos.

1. OBJETIVOS

• Adquirir conocimientos sobre los distintos métodos de siembra.

• Adquirir criterio en la elección de los distintos medios de cultivo.
• Utilizar factores físicos y químicos como herramienta microbiológica para estimular o inhibir el
desarrollo microbiano.

2. CONSULTA PREVIA.
-Realice un cuadro comparativo donde mencione los equipos y procedimiento de las siguientes
técnicas para determinar la calidad microbiológica del aire:

• Sedimentación en placa de Petri

• Placas de contacto RODAC
• Hisopo.

- La carga microbiológica del ambiente que información me suministra

3. FUNDAMENTO TEORICO

La técnica más usada en el laboratorio de microbiología es probablemente la transferencia de

microorganismos de un ambiente a otro con el propósito de cultivarlos. Una vez que el medio de
cultivo está debidamente preparado se procede a inocular la muestra deseada.

Si se desea aislar o separar los diferentes tipos microbianos que se encuentran en una muestra
(agua, materias primas, alimentos, etc.) se pueden utilizar distintas técnicas de siembra. Sembrar o
inocular es introducir artificialmente una porción de la muestra (inóculo) en un medio de cultivo
adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano; y se realizan diferentes metodologías de acuerdo
con el fin que se persiga. Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura
adecuada para el crecimiento.

Dependiendo del estado físico del medio de cultivo (líquido, sólido o semisólido) la siembra se puede
realizar con: ansa en anillo, ansa en punta, varilla de vidrio (espátula de Drigalsky), hisopo o pipeta
estéril o exposición al ambiente.

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El ansa de siembra consta de un filamento de platino, que puede ser recto o en anillo. Para facilitar
el manejo, este filamento está sujeto a un mango aislante.

Siembra con espátula de Drigalsky

Se pipetea un volumen de inóculo (generalmente 0,1 ml) y se deposita sobre la superficie de la placa
de Petri que contiene el medio de cultivo solidificado. Con una espátula de Drigalsky estéril
(previamente embebida en alcohol, flameada y enfriada) se disemina la muestra por toda la
superficie, efectuando movimientos de rotación hasta su completa absorción.

Esta técnica permite sembrar inóculos sobre superficies grandes, para obtener un crecimiento
confluente que nos permite estudiar el efecto de antimicrobianos (antibióticos, antisépticos,
desinfectantes, etc.). También se utiliza para realizar recuento de colonias; para cumplir con este
último objetivo, previamente se deben realizar diluciones seriadas de la muestra.

Siembra en placa vertida

Se lleva un volumen de inóculo (generalmente 1 ml) a un tubo que contiene agar fundido y se vierte el
contenido en una placa de Petri vacía y estéril. Se homogeneiza el contenido de la placa efectuando
movimientos rotatorios en ambas direcciones para distribuir su contenido y se deja solidificar. Esta
técnica puede presentar modificaciones en relación al tubo ya que es posible agregar el inoculo a la
caja y luego verter el medio sobre el inoculo el cual corresponde a 1 mL

Una vez incubada a la temperatura adecuada, se observarán colonias en profundidad (inmersas en el

medio) y en la superficie. Esta técnica permite el desarrollo de microorganismos aerobios, aerobios
facultativos y microaerófilos.

Recuento en placa
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Luego de la incubación en las condiciones apropiadas para cada microorganismo, la

concentración de UFC presentes en una suspensión se calcula multiplicando el número de
colonias por placa, promedio de varias placas, por la inversa de la dilución de la suspensión, y
dividiendo por el volumen sembrado:

4. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

Equipos Materiales Sustancias y/o Reactivos
- Cajas Petri con agar PDA
-Cajas Petri con agar Nutriente.
- Cajas Petri con agar King B.
Cajas Petri con agar EMB
De cada una 8 caja
-Tubos de ensayo con 9 ml de agua peptonada
0,1% estéril .
-
-Erlenmeyer con 90 ml de agua peptonada 0,1% -Agar PDA para 250 ml
Balanza
estéril. -Agar Nutriente para 250 ml
-Pipetas Pasteur plásticas, estériles. -Agar King B para 250 ml
-Pipetas de vidrio de 1ml. -Peptona universal 0,5 gr
-Asas redondas. -Agar EMB para 250 ml
-Aguja de disección recta.
-Gradillas.
-Pipeteadores. -Glicerina de acuerdo al requerimiento
- Perlas de vidrio. para el agar King B

5. ROCEDIMIENTO O METODOLOGÍA

Actividad de inicio: Cada grupo se le asignara una muestra la cual deben sembrar.

A - Preparación de inoculo a partir de una muestra problema.

1. Para muestras líquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en las cuales la distribución de
microorganismos es homogénea o fácilmente homogeneizable por medios mecánicos (agitación,
etc.).

2.-Para muestras congeladas de un alimento originalmente líquido o licuable, fundir por completo en
baño de agua de 40 a 45°C un tiempo máximo de 15 minutos y homogeneizar agitando
vigorosamente.

3.-Para la parte líquida de una muestra heterogénea la cual sea considerada suficientemente
representativa de la muestra total (por ejemplo, la fase acuosa de grasas animales y vegetales).

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4.- Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm

efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 ml de la muestra y diluir con 9 ml del diluyente el
cual debe encontrarse a una temperatura similar a ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el
diluyente.

5.- Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tomar alícuotas mayores, por ejemplo, volúmenes
de 10 u 11 ml, diluidos con 90 o 99 ml, de la misma forma que se describió con Anterioridad a partir
de muestras sólidas o semisólidas.

5.1.- Las muestras sólidas y semisólidas congeladas deben descongelarse en refrigeración de 4

a 8ºC durante 18 horas y no más de 24 horas antes de proceder a su análisis.

5.2.- Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa

plástica estériles de tamaño adecuado.

5.3.- Adicionar un volumen de 90 a 99 ml del diluyente llevado a una temperatura similar a la de

la muestra.

5.4.- Operar la licuadora o el homogeneizador peristáltico de 1 a 2 minutos hasta obtener una

suspensión completa y homogénea según se indique en la técnica correspondiente para cada
alimento. Aún en los equipos más lentos, este tiempo no debe exceder de 2,5 minutos.

5.5.- Permitir que las partículas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada
tomando de las capas superiores de la suspensión.

5.6.-Cuando la dilución primaria es muy viscosa o pegajosa, adicionar más diluyente, lo cual
debe tomarse en cuenta para las operaciones subsecuentes o expresión de resultados.

5.7.-El homogeneizador peristáltico (Stomacher) puede no ser adecuado para algunos

productos (por ejemplo, aquellos con partículas agudas o constituyentes que no se dispersen
fácilmente). Debe ser utilizado sólo cuando exista evidencia (publicada o por ensayos
comparativos) de que los resultados obtenidos no difieren significativamente con aquellos
obtenidos con licuadora.

B- Preparación de las diluciones decimales adicionales.

1.- Transferir 1 ml o un múltiplo, por ejemplo, 10 u 11 ml de la dilución primaria 1 + 9 (10-1), en otro

recipiente conteniendo nueve veces el volumen del diluyente estéril a la temperatura apropiada,
evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.

2.- Mezclar cuidadosamente cada botella de diluyente siempre de la misma manera que se describe
en inciso A numeral 4.

3.- La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular,
dependen del número esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de
análisis previos y de la información que se obtenga del personal de inspección que la haya colectado.
En ausencia total de información, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta.

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4.- Utilizar pipetas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas que se hayan
seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la
pipeta.

5.- Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de líquido equivalente a su capacidad total,

escurrir aplicando la punta de la pipeta una sola vez en un área de la caja Petri sin líquido.

6.- Mientras se afora el líquido de la pipeta, la punta de ésta debe apoyarse en el interior del cuello
del frasco y mantenerla en posición vertical, para lo cual este último debe inclinarse lo necesario.

7.-En estudios donde se busca la presencia o ausencia de una determinada especie de

microorganismos en 0,1 ml o 0,1 g, no es necesario preparar diluciones mayores.

8.-El criterio para seleccionar las diluciones a preparar de acuerdo con el número de microorganismos
esperado y a la clase de muestra.

B- Duración del procedimiento.

En general, las diluciones de la muestra deben ser preparadas inmediatamente antes del análisis y
éstas deben ser usadas para inocular el medio de cultivo dentro de los 20 minutos posteriores a su
preparación.

Preparación de soluciones en Agua peptona estéril.

La siembra se realizará en agar EMB para coliformes, PDA para mohos y levaduras, PCA para
aerobios mesófilo.

Toma de muestra de ambiente

● Coloque cada una de las cajas sobre una superficie plana, en el sitio donde se va a muestrear el
aire.
● Quite la tapa de la caja cuidadosamente de cada medio de cultivo y exponga el agar durante 15
minutos.
● Ponga nuevamente la tapa. Rotule la caja con el código de uno de los integrantes del grupo y la
fecha.
● Lleve a incubar a 35°C la caja de agar nutriente durante 24 horas, la caja de PDA se incuba a
temperatura ambiente durante 3 días.
● Terminado el tiempo de incubación, cuente las colonias de cada medio y expresar los resultados
en UFC/exposición durante 15 minutos.

Siembra en placas de Petri en estrías por agotamiento

Cada subgrupo sembrará por diseminación en estrías por agotamiento una placa de cada uno de los
siguientes medios de cultivos: agar nutritivo, agar Baird Parker, Agar EMB a fin de evaluar las
características culturales de los diferentes microorganismos. Una vez sembradas las placas se
incubarán a 37ºC durante 24 – 48 h.

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Siembra en cajas de Petri con espátula de Drigalsky

Con pipeta estéril colocar 0,1 ml del inóculo sobre las placas de agar nutritivo (hacerlo por triplicado),
diseminar inmediatamente con espátula de vidrio o metálica esterilizada a la llama del mechero.
Incubar las placas a tres temperaturas diferentes: 4ºC, 37ºC y 56ºC durante 24 – 48º C a fin de
evaluar el efecto de la temperatura en las diferentes especies bacterianas sembradas.

Siembra en placas de Petri con hisopo estéril

Embeber el hisopo estéril sumergiéndolo en el inóculo, presionar sobre las paredes del tubo a fin de
sacar el excedente de inóculo. Diseminar en estrías paralelas en diferentes direcciones sobre las
placas de agar nutritivo (hacerlo por triplicado).

Estas placas de agar nutritivo sembradas serán sometidas a la acción de la luz UV, durante
diferentes intervalos de tiempo (30 s, 5 min, 30 min.), cubriendo previamente la mitad de cada placa
con papel (control). Al cabo del período de exposición a la luz UV, retirar e incubar a 37ºC durante 24
– 48 h. Se evaluará el efecto del tiempo de exposición a la luz UV en las diferentes especies
bacterianas sembradas.

Siembra en placa por el método de placa vertida

Tomar 1 ml del inóculo y colocarlo en el tubo que contiene el agar nutritivo fundido y enfriado a
aproximadamente 45ºC, agitar a fin de homogeneizar. Verter el contenido del tubo en una placa de
Petri vacía y estéril. Rotar la placa en varias direcciones para permitir su homogeneización. Incubar a
37ºC durante 24 – 48 h. Se observará crecimiento en la superficie y en el agar. Si el volumen de
inóculo es adecuado se observarán colonias aisladas.

Siembra en tubos
• agar semisólido en columna, con ansa recta y se siembra por punción. Se evaluará el
comportamiento de los microorganismos frente al oxígeno y la movilidad.
• agar sólido en pico de flauta, con ansa recta o en anillo y se siembra en estrías.
• agar sólido inclinado, con ansa recta o en anillo y se siembra en estrías.
• medio líquido, con ansa recta o en anillo y se inocula en el caldo de cultivo por
homogeneización.

Incubar todos los tubos a 37ºC durante 24 – 48 h.

Acción de distintos factores ambientales en el control del desarrollo microbiano: exponer los
medios sembrados a distintas condiciones ambientales (según se mencionan anteriormente).

a) Observar las características de desarrollo de los diferentes microorganismos en cada uno de los
medios de cultivo.

b) Analizar los resultados y formular conclusiones.

c) Comparar los resultados obtenidos con cada una de las cepas y los informados en la bibliografía.

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Tratamiento de los materiales usados:

• Una vez finalizado el trabajo de laboratorio, limpie adecuadamente las mesadas de trabajo
con alcohol al 70% o hipoclorito de sodio al 1%.
• Descarte todo material contaminado en las bolsas para residuos patógenos.

Lávese las manos con jabón.

6. RESULTADOS
Los resultados obtenidos durante la práctica se pueden expresar en tablas, gráficos, dibujos; como lo
considere necesario el docente a cargo del curso.

7. BIBLIOGRAFIA
• Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. 1997 Brock Biologia de los microorganismos. Décima edición.
Prentice Hall, New Jersey.
• Carrascal, A., Páez, A., Burbano, M.2003. Manual de laboratorio: Microbiología de alimentos. Ceja.
• Manual de medios de cultivo Merck. Editorial Merck Alemana. 1994.

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