REPORTE DE LABORATORIO

Actividad Metabólica

Asignatura: BIO-003

Nombre de los autores:

González, Pablo
Silva, Felipe
Nombre de los docentes:
Cancino, Robert
Bordeñon, Diego
Fecha de Realización:
26.05.2023
 Introducción:
Los organismos vivos necesitan energía para cumplir con las necesidades básicas
para sobrevivir. Esta energía esta proporcionada gracias a nuestro metabolismo, el
cual corresponde a diversas reacciones y procesos bioquímicos. El metabolismo
funciona gracias a 2 procesos principales, el catabolismo y anabolismo. Uno de los
procesos catabólicos más importantes es la Glicolisis, para la oxidación de glucosa
a piruvato, obteniéndose ATP y electrones, los cuales son captados por coenzimas,
para estimular el proceso de fosforilación oxidativa. En situaciones anaeróbicas, el
NADH formado no puede ser re oxidado a NAD+, por lo que no ocurre un proceso
de deshidrogenación en la Glicolisis, deteniendo este proceso y estimulándose el
de fermentación, para compensar la falta de NAD+ necesaria para la correcta
función de la Glicolisis.[1]

Es por esto que, en este practico, se realizó un experimento enfocado en la

fermentación alcohólica, por la utilización de una suspensión de levadura junto a
distintos sacáridos y temperaturas, midiéndose su pH y absorbancia, viéndose poca
variación de estas, y como se fermentan o no se fermentan algunos sacáridos.

Esto con el objetivo de ver como la levadura actúa en un medio anaeróbico, y como
esta se comporta junto a diferentes sacáridos, y como el pH y la temperatura afecta
a las enzimas presentes en el proceso de fermentación.
 Metodología:

1. Se comenzó realizando un rotulo de 10 tubos de ensayo, numerados del 1 al

5, en 2 grupos distintos, A y B, en los cuales se le agregaron sus medidas
correspondientes de reactivos. A los todos se les agrego 2 mL de suspensión de
levadura, y del tubo 2 al 5, se les agregaron 2 mL de, glucosa, sacarosa, galactosa
y fructosa, respectivamente, además, al tubo 1 se le agrego 3 mL de agua, y a los
tubos 2 a 5, 1 mL de agua.

2. Una vez agregados los reactivos, se homogenizaron y se les midió el pH

utilizando papel pH.

3. Luego, en otros 10 tubos, se les agregaron 3 mL de agua y 5 gotas de azul

de bromotimol. Para luego ser homogenizados, y uno de estos tubos fue llevado a
un espectrofotómetro a 405 nm.

4. Posterior a obtener la absorbancia, se procedió a colocarles un tubo de

anaerobiosis a todos los tubos A y B, y a manguera se insertó en los tubos con azul
de bromotimol. Tanto el tapón como la manguera de anaerobiosis fueron
aseguradas con papel film.

5. Luego, estos tubos fueron llevados a un baño termorregulador por 20

minutos, de estos, los tubos A fueron incubados a 37º C y los tubos B a 70º C.

6. Pasados los 20 minutos, se les removió las mangueras de anaerobiosis para

volver a medir el pH de los tubos con la suspensión de levadura, y medir la
absorbancia de los tubos con azul de bromotimol.
 Resultados:

Los resultados obtenidos del experimento realizado se encuentran a continuación

en la tabla n°2:

Tabla n°2: Resultados de tomas de pH y Absorbancias a 405nm.

Abs Abs
pH pH final pH inicial pH final
Tubos 37°C 405nm Tubos 405nm
inicial mezcla mezcla mezcla
tubos 70°C tubos
mezcla
AB AB
Final Final
1 5 4 0,412 5 4 0,562
1

5 4 0,550 5 4 0,531
2 2

4 4 0,577 4 4 0,548
3 3

4 5 5 0,604 5 4 0,508
4

4 4 0,617 4 4 0,460
5 5

Después de ser incubados a sus respectivas temperaturas, todos los tubos

obtuvieron una coloración verde claro/amarilla, teniendo una mínima variación de
colores, esto también se pudo visualizar en los resultados del pH:

Con respecto al pH de los tubos a 37°C, se vio que 1 y 2 disminuyeron su pH de

pH5 a pH4, mientras que los tubos 3, 4 y 5, mantuvieron su pH, ya fuera pH4 o
pH5 en el caso del n°4. En la tabla se muestra la absorbancia final de cada tubo,
se debe recordar también, que la absorbancia inicial de todos los tubos es de
0,540. Una vez obtenido este dato, se pudo comprobar que, en los tubos con
temperatura a 37°C, todos, excepto el tubo 1, obtuvieron una mayor absorbancia a
la inicial. En los tubos que conservaron una temperatura de 70°C, se verificó que
los tubos 1 y 3, aumentaron su absorbancia con respecto a la inicial, mientras que
los tubos 2, 4 y 5, disminuyeron su absorbancia.
 Discusión:

Las levaduras son organismos eucariontes compuestas principalmente por

polisacáridos. Una de las levaduras más estudiadas en el mundo, y la que se utilizó
en este practico, es la Saccharomyces cerevisiae (Levadura panadera comercial) la
cual es heterótrofa por lo que es capaz de obtener energía a partir de la glucosa y,
además, presenta una elevada capacidad fermentativa. De las levaduras, hay que
tener en cuenta que, al ser sometidas a temperaturas muy altas, estas pasan por
un descenso en su biomasa, por lo que puede ocurrir una desnaturalización de sus
enzimas (proteínas) disminuyendo así su actividad fermentativa, mientras que, a
temperaturas bajas, estas no reciben suficiente energía por lo que ocurre una
latencia en la célula, deteniendo su desarrollo. Con esto, esta presenta una
temperatura optima a la cual puede trabajar, la cual es alrededor de 35º C. La
mayoría de las levaduras toleran un rango de pH entre 3 y 10 aproximadamente,
pero tienen una mayor afinidad por ambientes más ácidos, entre 4 y 5, una
alteración del pH optimo puede causar una reacción similar a la que ocurriría en las
temperaturas altas, una desnaturalización de sus enzimas.[1]

Los carbohidratos están presentes tanto como moléculas complejas (polisacáridos),

como sencillas (monosacáridos y disacáridos). Los hidratos de carbono vistos en el
practico fueron, la glucosa, sacarosa, galactosa y fructosa, que, en condiciones
anaeróbicas, pueden ser fermentada por la levadura, consiguiéndose como
productos, alcohol, CO2 y energía. Por lo que este proceso recibe e nombre de
fermentación alcohólica.[2]

La glucosa es un monosacárido de 6 carbonos, y el azúcar por excelencia para el

proceso de la fermentación de la levadura, la cual puede ser fermentada a alcohol.
Esta se encontraba en los tubos 2A (incubada a 37ºC) y 2B (a 70ºC). En el tubo 2A
se vio un aumento en la absorbancia, gracias a la formación de dióxido de carbono,
la cual acidifico más el medio. Por otro lado, en el tubo 2B no hubo cambio debido
a la temperatura en la que se encontraba presente, causando una inhibición de la
actividad fermentativa.
La sacarosa es un disacárido, conformado por 2 monosacáridos, la glucosa y
fructosa. Esta es capaz de ser fermentada gracias a la presencia de la enzima
invertasa en la levadura, la cual se encarga de separar los monosacáridos [3]. Esta
se encontraba en los tubos 3A y 3B. En el tubo 3A se vio un aumento en la
absorbancia, gracias a la formación de dióxido de carbono, la cual acidifico más el
medio. Por otro lado, el tubo 3B también presento un leve aumento, debido a que
los tubos B no fueron sumergidos correctamente, por lo que la levadura logro
fermentar por un pequeño periodo de tiempo.

La galactosa es un monosacárido de 6 carbonos, la cual puede ser fermentada por

la levadura, pero con una eficacia menor con relación a la glucosa.[4] Esta se
encontraba en el tubo 4A Y 4B. En el cual se observa una menor productividad, ya
que en el tubo 4A la absorbancia no es tan alta en comparación al tubo 2A. Por otro
lado, el tubo 4B también presento un leve aumento, debido a que los tubos B no
fueron sumergidos correctamente, por lo que la levadura logro fermentar por un
pequeño periodo de tiempo.

Y por último, la fructosa, la cual es un monosacárido de 6 carbonos, la

Saccharomyces cerevisiae es una levadura glucofila, está más atraída a la glucosa
que a la fructosa, la glucosa se consume a mayor velocidad que la fructosa. La
principal diferencia es la fosforilación de las hexosas, ya que ambas son fosforadas
por la hexoquinasa pero a diferente eficiencia[5]. Esta se encontraba en el tubo 5A
Y 5B. En el cual se observa una menor productividad, ya que en el tubo 5A la
absorbancia no es tan alta en comparación al tubo 2ª debido al bajo rendimiento y
afinidad que tiene la levadura con la fructosa. Por otro lado, en el tubo 5B no hubo
cambio debido a la temperatura en la que se encontraba presente, causando una
inhibición de la actividad fermentativa.

Gracias al papel pH se facilitó la identificación de la acidez de todos los tubos,

dejándonos como conclusión de que todas las soluciones contenidas eran de un
carácter ácido. Pero además, el azul de bromotimol actúa también como un
indicador de pH; Es un compuesto químico derivado del trifenilmetano. Se utiliza
para detectar el pH. A pesar de su nombre, el azul de bromotimol puede adoptar
diferentes colores. Puede ser de color amarillo o fucsia (sobre una solución ácida)
y verde o azul (en una solución básica) [6]

Se explicó también la disminución del pH gracias a la existencia de CO 2 dentro de

los tubos. La cantidad de dióxido de carbono (CO2) en la solución determina el pH
del agua. Dicho esto, la razón más común de acidez en el agua es el CO2 disuelto,
por lo que cuanto más CO2 existe en el agua, menor será el pH. Esto se debe a que
cuando el CO2 se vuelve acuoso en el agua, una pequeña cantidad se convierte en
ácido carbónico (H2CO3). [7]

Conclusión:

Gracias al práctico realizado, se efectuó la comprensión del funcionamiento de los

distintos caminos en rutas metabólicas existentes, además de los distintos
parámetros en los que la levadura puede actuar dentro de medios anaeróbicos.
También, se comprobaron las distintas funciones del papel pH, o el azul de
bromotimol como indicadores visuales de acidez dentro de las reacciones, y el cómo
la temperatura o el pH pudo haber afectado a las distintas enzimas dentro de los
procesos a las que estuvieron sometidas.
 Referencias:

1. Suárez C, et al. Levadura Saccharomyces cerevisiae y la producción de

alcohol. ICIDCA [Internet]. 2016 abr [Consultado 2023 junio 2]; 50(1): 20-28.
Disponible en: https://www.redalyc.org/pdf/2231/223148420004.pdf

2. Plaza J, et al. Los alimentos como fuente de mono y disacáridos: aspectos

Bioquímicos y metabólicos. Nutr. Hosp [Internet]. 2013 jul [Consultado 2023 mayo
31]; 28(4): 5-16. Disponible en:
https://scielo.isciii.es/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0212-
16112013001000002

3. Batista A, et al. Sucrose fermentation by Saccharomyces cerevisiae lacking

hexose transport. Karger [Internet]. 2004 sep [Consultado 2023 may 31]; 8(1): 26-
33. Disponible en: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15741738/

4. Lee K, et al. Improved galactose fermentation of Saccharomyces cerevisiae

through inverse metabolic engineering. Biotechnology Bioengineering [Internet].
2010 oct [Consultado may 31 2023]; 108(3): 621-63. Disponible en:
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21246509

5. Guillaume C, et al. Molecular Basis of Fructose Utilization by the Wine Yeast

Saccharomyces cerevisiae: a Mutated HXT3 Allele Enhances Fructose
Fermentation. Applied and Environmental Microbiology [Internet]. 2007 abr
[Consultado 2023 may 31]; 73(8):2432-2439. Disponible en:
https://journals.asm.org/doi/epub/10.1128/AEM.02269-06

6. EcuRed. Azul de bromotimol [Internet] 2019. [Consultado 2023 junio 2]

Disponible en:
https://www.ecured.cu/index.php?title=Azul_de_bromotimol&oldid=3474863

7. Blog - stories, research and info about water treatment | Orenda [Internet].
CO2 y el pH: La ley Henry; [consultado el 2 de junio de 2023]. Disponible en:
https://blog.orendatech.com/es/co2-y-ph-ley-de-
henry#:~:text=La%20cantidad%20o%20concentración%20de,CO2%20sale%20del
%20agua.