Crecimiento Microbiano

Estequiometria del crecimiento microbiano

Sustrato como fuente de carbono y energía
• No hay que olvidar que la cinética biológica describe matemáticamente el
comportamiento del crecimiento de una población microbiana.
• Los microorganismos obtienen su energía de sustratos específicos mediante el
catabolismo de los mismos. El producto de este proceso es energía, compuestos
orgánicos pequeños, CO2 y H2O.
• Cuando el microorganismo crece, las células pueden ser representadas como un
producto de reacción y deben poder ser incluidas en una ecuación
estequeométrica
• Estequeometría metabólica

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Sustrato como fuente de carbono y energía
• No hay que olvidar que la cinética biológica describe matemáticamente el
comportamiento del crecimiento de una población microbiana.
• Los microorganismos obtienen su energía de sustratos específicos mediante el
catabolismo de los mismos. El producto de este proceso es energía, compuestos
orgánicos pequeños, CO2 y H2O.
• Cuando el microorganismo crece, las células pueden ser representadas como un
producto de reacción y deben poder ser incluidas en una ecuación
estequeométrica
• Estequeometría metabólica

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Sustrato como fuente de carbono y energía
• No hay que olvidar que la cinética biológica describe matemáticamente el
comportamiento del crecimiento de una población microbiana.
• Los microorganismos obtienen su energía de sustratos específicos mediante el
catabolismo de los mismos. El producto de este proceso es energía, compuestos
orgánicos pequeños, CO2 y H2O.
• Cuando el microorganismo crece, las células pueden ser representadas como un
producto de reacción y deben poder ser incluidas en una ecuación
estequeométrica
• Estequeometría metabólica

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 Fuente Fuente
Estequiometría de crecimiento carbono nitrógeno

Biomasa

• A pesar de que el crecimiento microbiano es un proceso muy

complejo, éste debe respetar la ley de conservación de masa, por lo
que si se considera la biomasa como un producto químico, sus
especies constituyentes pueden ser incluidas en una ecuación.
• En un crecimiento aeróbico, con CO2 y H2O como los únicos
productos, la ecuación siguiente simboliza el crecimiento microbiano:
CwHxOyNz + aO2 + bHgOhNi  cCHαOβNδ + dCO2 + eH2O

• Esta ecuación claramente es una simplificación de lo que sucede en

un bioreactor, pero es útil para plantear el concepto de rendimientos.
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 CwHxOyNz + aO2 + bHgOhNi  cCHαOβNδ + dCO2 + eH2O
• A, b, c, d, e: coeficientes estequeométricos
• CwHxOyNz: Fuente de carbono: comúnmente glucosa,
carbohidratos, compuestos orgánicos. Algunas veces CO2 o
carbonato
• HgOhNi : Fuente de nitrógeno: comúnmente amonio,
nitrógeno gaseoso o nitrato. También urea y nitrógeno desde
aminoácidos

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Balance elemental
• Conociendo la composición elemental de la biomasa, es posible hacer un
balance de masa en cada elemento:
• Balance de C: w=c+d
• Balance de H: x + b g = cα + 2 e
• Balance de O: y+2a+bh=cβ+2d+e
• Balance de N: z+bi=cδ
• De esta forma, podemos obtener los coeficientes estequeométricos para
completar la ecuación.
• Para poder resolver el sistema de ecuaciones anterior, es posible ocupar el
cuociente respiratorio o RQ (obtenido experimentalmente)
moles de CO2 producidos
• 𝑅𝑄 = =d/a
𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑂2 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑖𝑑𝑜𝑠

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Composición elemental de biomasa

8
9
Composición elemental de
microorganismos

10
Crecimiento por lote
Descripción matemática
Curva de crecimiento bacteriana (lote)
• Se caracteriza por tener cuatro fases
distintivas:
• Fase lag o latencia: no hay replicación
de ADN o células. Adaptación a nuevo
ambiente.
• Fase log o de crecimiento exponencial o
logarítmico: Las células se reproducen a
su máxima velocidad de crecimiento.
• Fase estacionaria: La velocidad de
crecimiento disminuye a cero por
agotamiento de nutrientes.
• Fase de muerte: Dependiendo del
microorganismo, se producen enzimas
autilíticas en condiciones de inanición

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Cinética biológica
• Cuando el microorganismo crece, las células pueden ser representadas
como un producto de reacción y deben poder ser incluidas en una
ecuación estequeométrica
• Desde un punto de vista químico, se puede describir la cinética biológica
como una reacción homogénea autocatalítica, donde la biomasa se denota
como como 𝑋 y donde hay un sustrato 𝐴 y un producto 𝑃
𝐴 + 𝑋 → 2𝑋 + 𝑃
•O
𝑋
𝐴→𝑋 +𝑃
• Dependiendo del proceso, se requerirá favorecer la conversión de 𝐴
(bioremediación, tratamiento de residuos) o la producción de 𝑋 o 𝑃

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Fase exponencial
• Denotando a la velocidad específica de crecimiento como 𝜇, se puede
representar el crecimiento de la biomasa como
𝑑𝑋
= 𝜇𝑋
𝑑𝑡
En fase exponencial, 𝜇 es constante, y corresponde a la pendiente de la curva
de crecimiento expresada como logaritmo
1 𝑑𝑋 𝑑𝑙𝑛𝑋
𝜇= =
𝑋 𝑑𝑡 𝑑𝑡
Donde integrando con 𝑋 = 𝑋0 𝑎 𝑡 = 0 se obtiene
𝑋
𝑙𝑛 = 𝜇𝑡
𝑋0 Crecimiento
𝑋 = 𝑋0 𝑒 𝜇𝑡 exponencial

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Gráfico de biomasa (X) en fase exponencial

𝑋 ln 𝑋

𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒: 𝜇

𝑡 𝑡

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Tiempo de duplicación
• Además del parámetro de velocidad específica de crecimiento, también se
puede ocupar el tiempo de duplicación como forma de expresar el
crecimiento celular.
• A partir de
𝑋 = 𝑋0 𝑒 𝜇𝑡
• Y considerando que la biomasa se duplica (𝑋 = 2𝑋0 ), el tiempo de
duplicación (𝑡𝑑 ) es
2𝑋0 = 𝑋0 𝑒 𝜇𝑡𝑑 → 2 = 𝑒 𝜇𝑡𝑑

ln 2
𝑡𝑑 =
𝜇

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Crecimiento balanceado
• En un ambiente favorable para el crecimiento, las células regulan su
metabolismo y ajustan su crecimiento hasta que se alcanza un estado
de crecimiento balanceado. Durante este estado, la composición de la
biomasa permanece constante.
• Para que esto suceda, la velocidad específica de cada uno de los
componentes del cultivo debe ser igual a la velocidad específica de
crecimiento
𝑟𝑍 = 𝜇𝑧
Donde 𝑍 es un componente celular como ADN, proteínas,
polisacáridos, etc., 𝑟𝑍 es la velocidad de producción de 𝑍 y 𝑧 es la
concentración del componente 𝑍 en el reactor.

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Influencia del sustrato
• Se ha demostrado empíricamente que la velocidad de crecimiento (μ) es
dependiente de la concentración de nutrientes, o sustratos, en el medio.
• La respuesta de μ a los sustratos es compleja y no lineal.
• μ es altamente sensible a bajas concentraciones de sustrato
• μ es poco sensible a altas concentraciones de sustrato
• Para efectos de análisis, se considera que existe un único sustrato el que
ejerce una influencia mayor en μ, el cual generalmente se llama sustrato
limitante de la velocidad del crecimiento, o simplemente sustrato
limitante.
• El sustrato limitante comúnmente es la fuente de carbono o nitrógeno,
aunque puede ser oxígeno o algún otro compuesto, según tipo de
microorganismo.
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Influencia del sustrato
• En el caso de estar en
presencia de crecimiento
balanceado (composición
constante de la biomasa),
la velocidad de crecimiento
específica se relaciona con
la concentración del
sustrato limitante S de
acuerdo a la gráfica
• Se asume que el resto de
las fuentes está presente
en exceso.
• Hay varias formas de
modelar matemáticamente
esta relación  Monod

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Ecuación de Monod
• Este comportamiento experimental se puede modelar de varias formas,
dependiendo de si el medio de cultivo presenta más complejidad.
• En el caso de una fermentación con un único sustrato limitante, la
dependencia de μ vs 𝑆 se puede representar a través de la ecuación de
Monod
𝑆
𝜇 = 𝜇𝑀
𝐾𝑆 + 𝑆
• Donde 𝜇𝑀 representa la velocidad específica máxima de crecimiento, y 𝐾𝑆
representa la constante de saturación o de sustrato. Este último indica la
afinidad entre el microorganismo y el sustrato.
• Como se aprecia, es un homólogo del comportamiento enzimático
(ecuación de Michaelis-Menten)

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Ecuación de Monod
𝑆
𝜇 = 𝜇𝑀
𝐾𝑆 + 𝑆
1/u = (Ks/S)*(1/um) + (1/um)

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Valores de 𝜇𝑀 típicos

Organismo Velocidad máxima (1/h)

Vibrio natriegens 4,24
Methylomonas methanolytica 0,53
Aspergillus nidulans 0,36
Penicillium chrysogenum 0,12
Fusarium graminearum 0,28
Células vegetales en cultivo 0,01-0,045
suspendido
Células animales 0,01-0,05

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Ejemplos de valores de KS
Microorganismo Sustrato limitante KS (mg/L)
Saccharomyces Glucosa 25
Escherichia Glucosa 4
Lactosa 20
Fosfato 1,6
Aspergillus Glucosa 5
Candida Glicerol 4,5
Oxigeno 0,42-0,045
Pseudomonas Metanol 0,7
Metano 0,4
Klebsiella CO2 0,4
Magnesio 0,56
Ecuación de Monod
• Los valores típicos de 𝐾𝑆 son muy bajos, del orden de [mg/L] para
carbohidratos y [μg/L] para otros compuestos como aminoácidos. En
un cultivo por lotes, la concentración del sustrato limitante por lo
general será mucho mayor que estos valores.
• Se puede asumir que si 𝑆 > 10 𝐾𝑆 , 𝜇 ≈ 𝜇𝑀
• Por lo tanto, en la fase exponencial se puede asumir que la velocidad
de crecimiento permanece constante y cercana a 𝜇𝑀
• Independiente del sustrato cinética de orden cero
• Cuando el sustrato cae bajo los 10 𝐾𝑆 , la velocidad de crecimiento
comienza a bajar, pero la cantidad de biomasa es muy alta y es
probable que se entre directamente a fase estacionaria.
25
Obtención de parámetros
• De la misma forma que se ocupa en cinética enzimática, es posible
obtener los parámetros de 𝜇𝑀 y 𝐾𝑆 a través de varios experimentos a
distintas concentraciones de S
• Se obtienen las velocidades iniciales a cada concentración, y se grafican
los datos obtenidos en un gráfico de doble recíproco (homólogo al
gráfico de Lineweaver-Burk para enzimas)
• A partir de
𝑆
𝜇 = 𝜇𝑀
𝐾𝑆 + 𝑆

1 𝐾𝑆 + 𝑆 𝐾𝑆 𝑆
= = +
𝜇 𝜇𝑀 𝑆 𝜇𝑀 𝑆 𝜇𝑀 𝑆

𝟏 𝐊 𝟏 𝟏
𝛍
= 𝛍𝐒 𝐒 + 𝛍 y = mx +b
𝐌 𝐌
26
Gráfico de Lineweaver-Burk
1
𝜇

𝐾𝑆
𝜇𝑀

1
𝜇𝑀
1
𝑆

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Influencia de la temperatura
• Hay tres tipos de microrganismos, según su temperatura óptima de
crecimiento:
 Psicrófilos: 0 a 15ºC
 Mesófilos: 20 a 40ºC
 Termófilos: 45ºC o más
Esto se refleja en que la velocidad específica de crecimiento para un
microrganismo dado puede relacionarse con la temperatura a través de la ley
de Arrhenius
−𝐸𝑎
𝜇= 𝐴𝑒 𝑅𝑇
El valor de energía de activación varía entre 8 a 26 kcal/mol, dependiendo
del microorganismo y del medio.

28
Influencia de la temperatura
• No obstante, no es
posible elevar la
temperatura por sobre
cierto valor debido a la Dependiente de
denaturación de Arrhenius
proteínas y
desestabilización de
estructuras celulares,
por lo que
experimentalmente se
alcanza un valor máximo
de 𝜇.

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Otros
 pH: En este caso, existe un valor de pH óptimo en el cual se puede
alcanzar una velocidad máxima de crecimiento.
 Bacterias: 6 a 7,5
 Levaduras: 3,5 a 5,5
 Hongos: 3 a 7
 Potencial redox: Especialmente importante para microorganismos
quimioautótrofos que utilizan una fuente inorgánica de energía.
 Actividad termodinámica del agua: Comúnmente los
microorganismos requieren valores de 𝑎𝑤 sobre 0,9 para
desarrollarse, pero ciertos hongos y levaduras pueden crecer con
valores cercanos a 0,6.

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Crecimiento microbiano
RENDIMIENTO Y CÁLCULO DEL MEDIO DE CULTIVO
Rendimiento de sustrato en células
• Es útil definir un rendimiento de sustrato en biomasa para
formulación de medios de cultivo y para el análisis de la
fermentación, especialmente si la información disponible para el
balance del crecimiento es incompleta.
• Se define el rendimiento de biomasa como:
Δ𝑋 𝑔 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑖𝑑𝑎
𝑌𝑋/𝑆 = =
−Δ𝑆 𝑔 𝑛𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑖𝑑𝑜
Este parámetro se relaciona con la ecuación estequeométrica de
crecimiento de la siguiente forma
𝑐 (𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎)
𝑌𝑋/𝑆 =
(𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜)
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Crecimiento por lote
• A través del rendimiento es posible relacionar las velocidades de
crecimiento de biomasa y de consumo de sustrato en un reactor por
lote:
𝑑𝑋 𝑑𝑆
= −𝑌𝑋/𝑆 - Y=dx/dS -Y*dS = dx /*1/dt
𝑑𝑡 𝑑𝑡
Reemplazo dx/dt = u*x
Esto asume que el sustrato en el reactor S es utilizado exclusivamente
por el cultivo celular:
𝑑𝑆 𝜇𝑋
− =
𝑑𝑡 𝑌𝑋/𝑆

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Cálculo de medio de cultivo
• Asumiendo que el rendimiento de sustrato en biomasa puede ser
𝑐 (𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎)
𝑌𝑋/𝑆 =
(𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜)
• Se puede extrapolar que el rendimiento por elemento puede ser definido por
% 𝑒𝑙𝑒𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜
𝑌𝑋/𝑆 =
% 𝑒𝑙𝑒𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎
• Lo que puede ser calculado por
𝑌𝑋/𝑆
𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑎𝑡ó𝑚𝑖𝑐𝑜 𝑒𝑙𝑒𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 ∗ 𝑛º á𝑡𝑜𝑚𝑜𝑠 𝑒𝑛 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜/𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜
=
𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑎𝑡ó𝑚𝑖𝑐𝑜 𝑒𝑙𝑒𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 ∗ 𝑛º á𝑡𝑜𝑚𝑜𝑠 𝑒𝑛 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎/𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎

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Cálculo de medio de cultivo
• Ya que en un medio de cultivo, se busca que los compuestos adicionados al
mismo permitan alcanzar una cantidad mínima de biomasa, se necesita
calcular el rendimiento para varios sustratos, dividido por elementos (C, N,
P, K, Mg, etc).
• Eventualmente, se puede obtener la cantidad inicial del sustrato para
poder producir la biomasa requerida
Δ𝑋 Δ𝑋
𝑌𝑋/𝑆 = → −Δ𝑆 = 𝑆0 − 𝑆𝑓 =
−Δ𝑆 𝑌𝑋/𝑆
Si se asume que el sustrato al final de la fermentación se consume de forma
completa (𝑆𝑓 = 0)
Δ𝑋
𝑆0 =
𝑌𝑋/𝑆

35
Cálculo de medio de cultivo
• Es importante notar que estos rendimientos asumen que todo el sustrato
es utilizado para la formación de biomasa, por lo que se refieren a
rendimientos máximos.
• Esto es seguro de asumir para fuentes de elementos menores, pero para la
fuente de carbono y energía no todo el carbono metabolizado se presenta
en la biomasa, sino que está distribuido entre la biomasa, CO2 y otros
productos rendimiento real puede calcularse.
• Para efectos de simplificación, se asume un factor 𝑓 que incluya esta
pérdida de carbono; este factor es 0,5-0,6 para metabolismo aerobio, y 0,1
para anaerobio.
% 𝑒𝑙𝑒𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜
𝑌𝑋/𝑆 = ∗𝑓
% 𝑒𝑙𝑒𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎
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• Para un buen diseño de medio de cultivo, generalmente se deja un solo sustrato
limitante, por lo que el 𝑆0 obtenido para cada elemento se multiplica por 1,5 o 2
(50 o 100% de exceso).
• En el caso de que un compuesto sea fuente de dos elementos simultáneamente
(ej. KH2PO4 como fuente de K y P) se elige la concentración 𝑆0 mayor obtenida.

37
Crecimiento Microbiano
PRODUCTOS: Rendimiento y productividades
 Producto en ecuación de crecimiento
• Si se considera la formación de un producto extracelular durante el crecimiento,
la ecuación estequeométrica de crecimiento se extiende a
• 𝐶𝑤 𝐻𝑥 𝑂𝑦 𝑁𝑧 + 𝑎𝑂2 + 𝑏𝐻𝑔 𝑂ℎ 𝑁𝑖 → 𝑐𝐶𝐻𝛼 𝑂𝛽 𝑁𝛿 + 𝑑𝐶𝑂2 + 𝑒𝐻2 𝑂 + 𝑓𝐶𝑗 𝐻𝑘 𝑂𝑙 𝑁𝑚
• Donde 𝑓 es el coeficiente estequeométrico para el producto. De la misma forma
que para el sustrato, el balance de la ecuación se puede realizar obteniendo
experimentalmente el rendimiento de sustrato en producto
Δ𝑃 𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑓 (𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜)
• 𝑌𝑃/𝑆 = = =
−Δ𝑆 𝑔 𝑛𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑖𝑑𝑜 (𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜)

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Producto según crecimiento
• Sin embargo, la ecuación anterior sólo sirve si el producto está
asociado al crecimiento: es decir, cuando el producto es producido
en conjunto con la producción de biomasa.
• Cuando el producto no está asociado al crecimiento, la ecuación
anterior de crecimiento no es válida (por razones obvias), por lo que
si se quiere modelar la generación de producto a partir de sustrato, se
requeriría una ecuación del tipo

𝐶𝑤 𝐻𝑥 𝑂𝑦 𝑁𝑧 + 𝑎𝑂2 + 𝑏𝐻𝑔 𝑂ℎ 𝑁𝑖 → 𝑓𝐶𝑗 𝐻𝑘 𝑂𝑙 𝑁𝑚

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Clasificaciones de producto

• Es posible realizar una

clasificación cinética de los
productos en un sistema
por lotes, según el
momento en el cual son
producidos:
 Tipo I: asociados al
crecimiento – producidos
en fase exponencial (ej:
etanol, glicerol)
 Tipo II: mixto
 Tipo III: no asociados al
crecimiento – producidos
en fase estacionaria

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Productividad
• Otro parámetro útil para evaluar la producción de uno o varios productos
entre fermentaciones es la productividad.
• Existen dos tipos de productividad: específica y volumétrica
• - Productividad específica: definida por la cantidad de producto generado
por una cantidad de biomasa en un tiempo dado

𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜
𝑞𝑃 =
𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 ∗ 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

1 𝑑𝑃
𝑞𝑃 =
𝑋 𝑑𝑡
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Productividad volumétrica
• Definida por la concentración de producto generado en un tiempo
dado

𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜
𝑄𝑃 =
𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 ∗ 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛

𝑑𝑃
𝑄𝑃 =
𝑑𝑡

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• La productividad específica es útil para comparar diversas cepas
según su capacidad de producción de un metabolito en particular.
• Por otro lado, la productividad volumétrica es útil para la
evaluación de procesos industriales, donde se requiere obtener
una alta cantidad de producto en un menor tiempo posible.
• Por lo tanto, la productividad volumétrica global en un cultivo por
lote se puede simbolizar como
∆𝑃
𝑄𝑃 =
∆𝑡
También se puede definir una productividad volumétrica de
biomasa, si el interés es la producción de ésta
∆𝑋
𝑄𝑋 =
∆𝑡

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