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MICROMETRIA micrómetro ocular con el centro de la línea de la
INTRODUCCION
El tamaño es una de las características morfológicas más
importantes para la identificación de los parásitos. Un cálculo
aproximado puede obtenerse comparando el parásito con el
tamaño de una estructura conocida contenida en la misma
preparación que se observa, ejemplo: glóbulo rojo que sabemos
mide 7,5a 8 micras. Sin embargo, si un organismo debe medirse
en forma más exacta es aconsejable utilizar un Micrómetro
Ocular calibrado. El tipo más empleado es un disco provisto de
una escala lineal dividida en 50 espacios o unidades
micrométricas oculares, que se coloca dentro del ocular del
microscopio.
Teniendo en cuenta que las unidades del micrómetro ocular son
arbitrarias y que el valor exacto de cada una varía con los
diferentes objetivos y microscopios, es necesario calibrarlo para
cada combinación de lentes con objetivo seco y de inmersión,
para lo cual se comparan las unidades micrométricas oculares
con una escala de dimensiones conocidas; esto se lleva a cabo
superponiendo la imagen de la escala ocular desconocida sobre
la escala conocida de una lámina portaobjetos micrométrica,
que se encuentra dividida en segmentos de 0.1 mm.,
subdivididos en 10 porciones de 0.01mm.
TECNICA DE MICROMETRIA
El procedimiento de calibración es el siguiente:
● -Destornillar el lente superior del ocular 10X y colocar el
disco micrométrico sobre el diafragma con la parte grabada
hacia abajo. Atornillar la lente superior e insertar el ocular
en el microscopio. Girar el ocular hasta que la escala ocupe
el diámetro transversal.
● -Colocar la lámina micrométrica sobre la platina, enfocar
con el objetivo que se desea calibrar y examinar la escala
grabada para distinguir entre las divisiones de mayor
tamaño (0,1 mm) y las más pequeñas de 0,01 mm.
● -Desplazar el campo hasta que el extremo inferior de la
línea 0 del micrómetro ocular quede exactamente
superpuesta sobre el extremo superior de la línea O de la
lámina micrométrica.
● -Sin mover la lámina micrométrica, hallar otro punto hacia
la derecha en donde otras dos líneas coincidan
exactamente; este segundo punto de referencia debe estar
lo más alejado posible de la línea 0.
● -Sabiendo el valor de cada una de las divisiones de la
lámina micrométrica, determinar la distancia total en mm.
entre los dos puntos de superposición y el número de
unidades oculares que abarcan la misma distancia.
Ahora bien, las medidas de los protozoarios, otros organismos y
estructuras pequeñas se expresan generalmente en micras, el
resultado anterior puede convertirse en micras, multiplicando
por 1.000 (número de micras que existen en 1,0 mm). En el
ejemplo anterior 0.00666 mm.corresponden a: 6,6 micras.
Para los otros objetivos (40X y 100X) se realiza la calibración de
la misma manera, las líneas del micrómetro ocular no
varían, pero en la lámina micrométrica aumentan de
grosor con el objetivo de mayor aumento e inmersión;
en estos casos se debe hacer coincidir la división del
lámina micrométrica.
Una vez calibrado el micrómetro ocular para cada objetivo,
sustituir la lámina micrométrica por la preparación que
deseamos estudiar y proceder a su medición.
Para medir las formas evolutivas de los parásitos, por ejemplo:
huevo de Trichuristrichiura, se gira el ocular hasta que la escala
del micrómetro ocular quede superpuesta al eje longitudinal o
transversal que se desea medir, se hace coincidir uno de los
extremos del huevo con el cero de la escala ocular, se cuenta el
número de divisiones oculares hasta el otro extremo del huevo
y se multiplica por el factor del objetivo utilizado.
LA MUESTRA FECAL
1.- LA MUESTRA FECAL
El estudio de una muestra fecal, podemos dividirlo en el
denominado Examen físico o Macroscópico y el Examen
Microscópico. En este material veremos solamente lo referente
a los exámenes macroscópicos y microscópicos necesarios para
poder identificar aquellos elementos, tanto normales como
patológicos, de naturaleza no parasitaria.
2.- EXAMEN MACROSCÓPICO
Con este tipo de reconocimiento nos referimos al simple
examen visual directo de las heces, mediante el cual,
registramos una serie de datos importantes conocidos con el
nombre de Caracteres físico químicos. Pudiendo además,
detectar aquellos elementos más o menos grandes (de carácter
parasitario o no), que por no estar incluidos o cubiertos por la
materia fecal pueden observarse a simple vista.
2.1.-Caracteres Físico Químicos:
Tienen singular importancia e interés diagnóstico porque con la
suma de ellos puede formarse una idea bastante exacta de los
síndromes coprológicos. Una descripción concisa, pero lo
suficientemente explícita, al anotar todo lo que se juzgue de
interés puede prestar ayuda al clínico, quien no ha tenido
oportunidad de examinar las heces del paciente.
Respecto a la cantidad diaria de heces eliminadas
normalmente, se estima entre 80 a150 gramos, con una media
de 100 gramos, para un adulto sano y una dieta mixta. La
cantidad depende de los residuos alimenticios provenientes de
la comida, según su contenido en celulosa, y de la existencia de
estreñimiento o diarrea. Con régimen vegetariano, se llega a
unos 370 gramos o más, mientras que con una dieta a base de
carne se excretan sólo unos 60 gramos diarios de heces. Hay
aumentos excesivos en enfermos con esteatorrea de cualquier
origen (pancreática, disabsortiva, etc.) en la aceleración del
tránsito intestinal, así como en los defectos de absorción y en
los síndromes de hipersecreción, por ser causas de diarreas, o lo
que es igual, de fluidificación de las heces. Hay disminución en
el estreñimiento, en los tumores del intestino grueso y recto
que cursan con el estrechamiento de la luz intestinal.
Es importante anotar, entonces, en el informe de laboratorio,
los caracteres siguientes:
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Consistencia, Aspecto, Color, Olor y reacción de la muestra en
estudio, así como la presencia macroscópica de productos
patológicos (sangre, moco, pus), restos alimenticios (lientería),
cuerpos extraños, parásitos adultos, etc.
Consistencia. Normalmente las heces deben ser sólidas y
formadas, o lo que es lo mismo, cilíndricas y consistentes para
mantener esta forma después de excretadas. No son viscosas ni
adherentes. Todo depende de su contenido acuoso y en líneas
generales se pueden agrupar como: duras, formadas, blandas,
pastosas y liquidas, existiendo estadios intermedios difíciles de
precisar. En caso de estreñimiento, las deposiciones son
pequeñas, duras con escibalos unidos entre sí. Las falsas
diarreas de los constipados presentan una deposición mixta,
siendo compacta la primera parte y pastosa al final. Las heces
de las melenas son generalmente pegajosas y oscuras. Pastosas,
esponjadas y espumosas, son las heces de la llamada dispepsia
de fermentación.
Aspecto. Varía en relación a la forma, consistencia y
homogeneidad de las materias fecales. Generalmente, son
homogéneas, y esta característica está en relación al estado de
disgregación más o menos uniforme de sus componentes.
Normalmente, ésta es fina y regular, siendo en ciertas heces
patológicas, irregular, acompañándose con la presencia de
partículas de tamaño y consistencia variable. Son apreciables
los restos groseros de alimentos en la lientería por tránsito
rápido, especialmente en la insuficiencia gástrica. En estos
casos, se habla de heces heterogéneas
ColorNormalmente, y con una dieta mixta, la deposición es de
color pardo o marrón en el adulto. Esto se debe casi
exclusivamente al pigmento biliar, es decir, que éste se
encuentra, normalmente, en el estado de estercobilina. Las
diferentes coloraciones pueden obedecer a las siguientes
causas: 1) a la cantidad de pigmento biliar y al estado en que
éste se encuentra; 2) a productos patológicos aportados por las
paredes intestinales; 3) diversos alimentos; sustancias de origen
medicamentoso.
Pigmento Biliar: Sabemos que la bilirrubina que llega al
duodeno con la bilis no sufre modificación en el intestino
delgado, pero al llegar a nivel de la válvula íleo cecal sufre una
reducción por acción de ciertas bacterias y pasa al estado de
estercobilinógeno. Luego, durante, el período, en el cual, la
masa fecal se mantiene en la bolsa cecal, por oxidación, ese
estercobilinógeno se transforma en estercobilina, que es el
estado final al cual llega la bilirrubina que ha ingresado al
intestino delgado del adulto, si el proceso digestivo ha sido
normal. Sin embargo, el pigmento biliar (bilirrubina), puede que
no sufra ninguna transformación en el ciego en vez de su
normal reducción, por lo que aparecerá como bilirrubina sin
transformar y se observará unas heces de color amarillo oro, el
cual, pasa a verde en contacto con el aire (por oxidación),
llamándose biliverdina. Esto indica una deposición del intestino
delgado, anormal en el adulto y fisiológico en el niño de pecho.
Si en cambio, la reducciónes excesiva, en lugar de una
reducción normal, sobre a bilirrubina en el ciego, ésta pasa al
estado de leucoestercobilina, que es un pigmento incoloro y
las heces se presentarán blanquecinas. Si en lugar, de la normal
reducción sobre la bilirrubina lo que ocurre es directamente,
una oxidación, se produce, entonces, biliverdina, la cual, tiñe de
color verde las heces y es muy raro en los adultos, pudiéndose
dar por acción de medicamentos.
Cuanto está ausente la bilis las heces presentan un color
blanquecino grisáceo reluciente estable al contacto con el aire,
indicando que no llega bilis al intestino, por obstrucción
coledoco o falta de secreción biliar (esto último excepcional), y
por lo tanto, no llega bilirrubina. Las heces son acólicas, es decir,
sin pigmento (no hay pigmento biliar y hay ictericia). En cambio,
cuando la bilirrubina ha sido transformada en
leucoestercobilina, por reducción excesiva, hay una pseudo
acolia (hay pigmento biliar y no hay ictericia), oscureciéndose
las heces al contacto con el aire.
Productos patológicos. Entre los productos patológicos
aportados por el tracto digestivo tenemos la sangre, moco y
pus. La primera produce una coloración variable en las heces,
según sea la cantidad y el grado de transformación que haya
sufrido. En caso de que se produzca en niveles altos del tracto
intestinal, pero que es evacuada rápidamente, le produce a las
heces su color rojo característico. Pero, si por el contrario, el
foco hemorrágico es alto en el colón, permaneciendo bastante
tiempo sin ser evacuada, una coloración oscura es lo
característico, dando lugar a una coloración como alquitrán que
se denomina melena, calculándose que este tipo de deposición
puede contener hasta un 50% de sangre.
En el caso de pus si es abundante y a la vez es poco el material
fecal, toda la masa o parte de las mismas heces toma coloración
blanquecina. Para que el pus intervenga en la coloración, es
necesario que provenga de un lugar próximo al ano ó bien que
haya tránsito acelerado.
Alimentos. Puede que algunos alimentos le confieran un
determinado color a las heces, así la remolacha y otros
vegetales con pigmentación roja pueden simular sangre, el vino
tinto y el chocolate en exceso dan tonalidades oscuras. Si hay
predominio de carne en la dieta, el color será oscuro, y en caso
de régimen lácteo será amarillo claro.
Medicamentos. Algunos medicamentos ocasionan también,
cambios de color, como sucede con el hierro y el bismuto que
aportan coloración oscura, la sulfofenoftaleína da color
amarillento, en caso de heces ácidas y rojo si son alcalinas; el
azul de metileno hace aparecer un color verdoso azulado, el
caolín y sales de bario blanquean las heces.
Olor. Las heces del adulto tienen el característico olor fecal, el
cual, se debe a ciertos productos de descomposición originados
a partir de los procesos de fermentación y putrefacción sobre
carbohidratos y prótidos, por la acción de la flora intestinal.
Entre esos productos están el indol, escatol, ácidos grasos,
ácido sulfhídrico, metano, etc. La mayor o menor intensidad
depende de la dieta, de allí que un régimen abundante en
carne confiera a las heces un grado más intenso, que cuando
la alimentación es rica en vegetales. No es muy marcado el olor
en las heces del niño de pecho, las heces de la insuficiencia
biliar, las heces duras y las de las diarreas producidas por
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antibióticos y diarreas de naturaleza nerviosa. Un olor ácido
penetrante ó agrio lo presentan las heces de fermentación pura.
El Llamado olor pútrido es signo de procesos de/
descomposición en los catarros Intestinales crónicos. En la
disentería amibiana se dice que el color recuerda el de la cola
de carpintero, mientras que otras diarreas disenteriformes son
de putrefacción típica. El meconio (heces del recién nacido) no
tiene olor y está constituido por una masa viscosa, adherente,
pardo-verdosa y formado por elementos celulares, grasa y sales.
No contiene flora bacteriana y no forma gases.
La Reacción. En las heces podemos encontrar diversos ácidos y
álcalis provenientes de diferentes fuentes tales como la
alimentación, secreciones producidas por acción microbiana,
sobre todo hidratos de carbono y prótidos. Las heces
fisiológicas tienen, sin embargo, una reacción neutra al papel
tornasol, ó bien débilmente ácida o alcalina, con un pH que
puede estar comprendido entre 6.9 y 7.2. La acidez en cambio
es regla en el recién nacido. Para determinar la reacción,
podemos utilizar el papel tornasol azul y rojo, ya que este
indicador tiene un punto medio de viraje de pH 7. El papel azul
cambiará al rojo en presencia de medio ácido, mientras que el
rojo permanece inalterado, en cambio el rojo cambia a azul en
presencia de medio alcalino. Las heces normales (reacción
neutra o débilmente ácida o alcalina), no modifican el color de
los papeles o lo hacen poco. Para determinar la reacción se
puede utilizar papel indicador del mismo y compararlo con la
escala que suele acompañarlos.
3.- EXAMEN MICROSCÓPICO
Se le utiliza para comprobar e identificar los elementos
encontrados en el examen macroscópico y para observar lo que
por su tamaño y naturaleza no pueden verse sino mediante el
microscopio. El estudio microscópico de las heces nos
proporciona elementos de juicio importante para la clínica, al
revelar:
a) Trastornos de la digestión.
b) Alteraciones patológicas del tracto digestivo.
c) Existencia de parásitos y diversos agentes productores de
enfermedades.
Interesa, por lo tanto, comprobar la presencia de: restos
alimenticios, productos provenientes de las paredes
intestinales y otros elementos. Es por ello, que identificaremos
tanto los elementos normales como los patológicos no
parasitarios presentes en el examen microscópico. La sola
identificación de las diferentes especies de parásitos,
corresponde al Examen Parasitológico o Coproparasitoscópico.
a. Dentro de los restos alimenticios comúnmente
encontrados tenemos: fibras musculares, tejido conjuntivo,
grasa neutra, ácidos grasos, jabones y almidón, así como
restos celulósicos indigeridos.
b. Dentro de los productos provenientes de las paredes
intestinales podemos identificar: hematíes, leucocitos,
piocitos, moco y células epiteliales.
c. Dentro de lo que se consideran como otros elementos
pueden verse bacterias, cristales, levaduras, parásitos, etc.
Veamos en primer término la técnica que se utiliza para realizar
este examen microscópico; las características con las cuales, se
presentan los diferentes elementos y su significado diagnóstico
(fisiológico ó patológico). Cuando la finalidad del examen es
conocer solamente cómo se cumplen los procesos
gastrointestinales, en condiciones fisiológicas o no, y establecer
a su vez si hay procesos inflamatorios en el tracto digestivo, o la
intervención de diversas causas perturbadoras, el examen de
heces se hará estando el paciente sometido a su régimen
alimenticio habitual, o como lo recomiendan otros, a través de
una dieta especial por tres días y enviando las heces al cuarto
día para su estudio.
Los alimentos que suelen emplearse corrientemente son la
carne semicruda, la cual, contiene tejido conjuntivo (para la
evaluación de la digestión gástrica) y fibras musculares (para la
digestión pancreática); papas en forma de puré (para la
evaluación de la celulosa digerible y el almidón), grasas
provenientes de manteca, aceite o leche (para evaluar la
digestión biliar y pancreática).
4.- TÉCNICA PARA REALIZAR EL EXAMEN AL FRESCO DE UNA
MUESTRA FECAL
Para proceder al examen macroscópico, la técnica es preparar
una suspensión más o menos espesa, desmenuzando una
porción (aprox. 1 mg) de heces con solución salina al 0.85%,
para obtener así una mezcla uniforme, cuyas características
sean más representativas que las que proporcionan pequeñas
cantidades o porciones de heces tomadas al azar. De esa
suspensión se hacen tres preparaciones: una pura, añadiendo
solución salina, otra tratada con yodo (lugol) y una tercera con
reactivo de Saathof (Sudan III).
La preparación pura sirve para la comprobación de todos
los elementos presentes, pero primordialmente se emplea para
el reconocimiento de las fibras musculares y otros elementos
que se aprecian mejor sin coloración y no tratados con
reactivos.
En los preparados teñidos con lugol se verá la acción del yodo
sobre el almidón contenido en los alimentos feculentos, y si el
mismo ha sido transformado o no por la acción de los
fermentos amilolípticos. En los preparados tratados con
reactivo de Saathoff se investiga la cantidad de grasa contenida
en las heces, pero sólo en forma cualitativa de normalidad o
aumento sin especificar si se trata de rasa desdoblada o sin
desdoblar.
En cambio, la que se le hace con reactivo de Saathoff después
de cubrirla con la laminilla se calienta hasta cerca de la
ebullición y se efectúa la observación microscópica. De rutina,
toda muestra fecal debe realizársele un examen al fresco que
incluya dos preparados húmedos: uno con solución salina
fisiológica y otro con lugol, se pueden realizar en una misma
lámina porta objetos ambas suspensiones fecales (preparados
húmedos, o emulsiones) o en láminas separadas. Por lo general
las suspensiones fecales con el reactivo de Shaatoff, solo se
realiza cuando el médico lo solicite. Los posibles elementos que
podemos observar en las diferentes preparaciones son:
4.2.-Preparados con solución salina al 0.85%
4.2.1.- Restos alimenticios:
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Fibras musculares. Las fibras musculares intactas (sin digerir).
Conservan sus características histológicas, pero no se ven sus
núcleos. Su longitud es variable y pueden presentarse en
acumules o aisladas. Se denominan indigeridas por no haber
sufrido el ataque de los fermentos en el intestino delgado
(tripsina del jugo pancreático) y se caracterizan por presentar
sus bordes netos, con ángulos rectos en sus extremos y las
estriaciones longitudinales y transversales bien visibles. Se tiñen
con el pigmento biliar, por lo cual, son amarillas o anaranjado
mate. Toda la fibra muscular que logre franquear la válvula íleo
cecal y llegue al ciego ya no puede ser atacada (digerida), y por
lo tanto aparece en las heces, de allí que la presencia de fibras
musculares no digeridas indican en principio insuficiencia
pancreática. Las fibras musculares en digestión, aparecen con
sus ángulos ya redondeados y la forma pasa de rectangular
hasta la ovoidea, redondeada, y luego desaparecen. Sus estrías
también se van perdiendo comenzando por las transversales
(menos profundas). Generalmente, se presentan aisladas y con
su coloración amarilla típica. Al final del proceso quedan como
simples escamas amarillas confundiéndose con jabones
alcalinos térreos cuando éstos adoptan dicha forma
Tejido conjuntivo. No suele encontrarse con frecuencia al
examen microscópico sino se le extrae previamente mediante
dilución o al examen macroscópico. Sin embargo, la
identificación es mejor hacerla al microscopio, ya que puede
confundirse con moco o restos celulósicos, apareciendo como
largos filamentos en fascículos claros y con bordes netos. El
moco se ve fibroso, pero menos visible y de límites menos
precisos. Por acción de unas gotas de ácido acético al 30%, la
estructura del tejido conjuntivo desaparece mientras que el
moco destaca más su aspecto fibroso. Puede vérsele también
acompañado con restos de fibras musculares lo que indica la
naturaleza conjuntiva del elemento examinado.Cuando el tejido
conjuntivo es ingerido cocido es digerido en el estómago por
acción del jugo gástrico ya que llega gelificado, y por lo tanto, se
licúa e hidroliza. Al llegar crudo sólo es atacado por el jugo
gástrico si éste contiene ácido clorhídrico en concentración
normal, por eso su comprobación en las heces es signo de
insuficiencia gástrica, de evacuación rápida del estómago o
déficit de secreción gástrica.
Grasa neutra (grasa sin desdoblar). Se presenta como gotas o
glóbulos rojosrefringentes coloreados por la bilis si hay este
pigmento. Si son abundantes forman lagunas oleosas como
mapas e indican posible insuficiencia pancreática, aunque debe
complementarse el estudio con otras pruebas químicas.
Ácidos grasos. Generalmente, se presentan como agujas largas,
finas de extremos afilados, o bien, como masas o placas difíciles
de diferenciar. En los preparados sin reactivo y sin teñir sólo
puede hacerse el diagnóstico si se presentan agujas. Por
calentamiento se transforma en gotas como la grasa neutra.
Jabones. Resultan de la unión de ácidos grasos con sales de
calcio o magnesio y se presentan como agujas o cristales más
cortos que los ácidos grasos y con puntas toscas, también
pueden aparecer formando figuras como el corte transversal de
un árbol seco y agrietado (jabones magnesiano),
frecuentemente, como masas o placas irregulares agrietadas
parecidas a fibras musculares o digeridas y amarillentas por la
bilis. Sólo son identificados al presentarse como agujas o con la
forma de los magnesianos. Los ácidos grasos en la insuficiencia
biliar son abundantes, mientras que los jabones se deben a la
presencia en el intestino de calcio o magnesio que fijaron ácidos
grasos.
Almidón. Cuando es cocido amorfo sólo se identifica en las
preparaciones con lugol, presentándose como regueros o
manchas azuladas. El almidón puede estar cocidocontenido en
células de papa. Estas células están aisladas o en acúmulos y sus
bordes son netos y a veces como doble membrana de
hemicelulosa o celulosa digerible por acción bacteriana.
Cuando las células de papa contienen almidón está en forma de
masas o gránulos. Al estar vacías tienen el mismo tamaño, pero
falta en ellas, el almidón en su interior
El almidón crudo se presenta como corpúsculos elípticos y
refringentes con un núcleo de menos densidad que provienen
generalmente del pan y los cambures
Celulosa. La celulosa digerible más estudiada es la de los
alimentos feculentos y su aspecto como ya se dijo es
redondeado y con tabicamientos interiores de disposición
irregular como células de papa, etc.
Celulosa indigeribleesta representada por numerosos restos
vegetales presentes en casi todas las heces. Estos pueden ser:
los vasos vegetales, son formaciones tubulares por donde
circula la savia. La estructura de estos vasos está compuesta por
celulosa y ofrece la forma de espirales o de anillos aislados.Con
la misma frecuencia se pueden encontrar en las heces pelos de
la epidermis de las plantas, caracterizados por semejarse a
cabellos, con intensa refringencia y un estrecho canal central
que se dilata en la base. Pueden ser confundidos con larvas de
algunos helmintos.También hay que incluir entre las
formaciones de celulosa de observación más frecuente las
llamadas "células en empalizadas", presentes en la cutícula de
las semillas de las leguminosas (caráotas, lentejas etc.) y
llamadas así por agruparse en cúmulos paralelos. Las
denominadas células esclerosas o pétreas son otras
formaciones muy duras contenidas en la pulpa de las peras, las
cuales son de frecuente aparición y dan a los preparados una
sensación de arenilla
Pueden hallarse también granos de polen de diversa
naturaleza, los cuales se presentan como cuerpos redondeados
u ovoides de color oscuro con superficie reticular o espinosa.
Las células de la epidermis de diversos alimentos de origen
vegetal suelen verse como trocitos de tejidos en forma de
mosaico, de estructura esponjosa y forma irregular. De las
células parenquimatosas de la remolacha sólo se encuentra la
carotina, de color rojizo y aspecto granuloso. El parénquima de
las naranjas consta de pequeñas vesículas alargadas y agudas en
sus extremos, lo cual, puede inducir a error al creerlas
pequeños helmintos
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4.2.2.- Elementos patológicos provenientes del tubo digestivo.
Ya se ha dicho a que motivado a diversos procesos patológicos
puede encontrarse en las heces, durante la exploración
macroscópica, sangre, pus y moco.
Sangre: La sangre intacta sin modificar, al no estar íntimamente
mezclada con las heces y en cantidad apreciable es fácilmente
identificable, en cambio, al encontrarse en pequeña proporción
o íntimamente mezclada con la masa fecal escapa a la
observación macroscópica y sólo aparece en las observaciones
microscópicas al hacerse visibles los hematíes y leucocitos,
siendo de interés diagnóstico determinar el estado en que se
encuentran y si están estos hematíes asociados a leucocitos o a
células epiteliales. Los hematíes al estar intactos presentan
forma y tamaño característicos, con su coloración rosado
amarillento, pudiéndose encontrar aislados o agrupados como
paquetes de monedas. El hallazgo con estas características
indican ulceración o erosión de la mucosa, lo cual, provoca su
aparición cercana al recto, o de lo contrario, se trata entonces
de partes altas del tracto digestivo, al ser eliminada la masa
fecal con tránsito acelerado a partir de la lesión. Si hay
permanencia prolongada de sangre en el estómago o intestino
la misma es modificada en tal forma que pierde sus
características propias.
Los leucocitos: igualmente, se presentan con sus características
morfológicas propias, si la ulceración está próxima al ano, o si
son eliminados con las heces provenientes de regiones altas con
tránsito acelerado. De no ser así, ellos pierden sus caracteres
parcial o totalmente.Cuando al leucocito se le ve intacto (en
fresco) es circular, con bordes netos, citoplasma liso o
ligeramente granuloso y con núcleo polimorfo. Cuando entra en
degeneración por acción de fermentos digestivos o por
actividad bacteriana, el leucocito se altera y constituye el
piocito o glóbulo de pus. Los leucocitos pueden observarse
mejor en preparaciones al fresco, a las cuales, se les puede
agregar un poco de ácido acético al 4 o 5% y con soluciones
acuosas de azul de metileno o violeta de genciana, con el fin de
hacer resaltar el núcleo y colorearlo. Para el efecto se procede
así: en un portaobjeto se mezcla una pequeña cantidad de
heces con unas dos gotas de colorante (puede emplearse el que
se utiliza para recuento leucocitario), cubrir con laminilla y
observar al microscopio después de transcurrido unos cinco
minutos
Células epiteliales: pueden observarse células del epitelio
pavimentoso provenientes del ano, aisladas o en acúmulos
mezclados con moco, el cual, cubre en estrías la superficie de
los cilindros fecales de consistencia dura. Son células planas,
poligonales, con un núcleo que se destaca bien y de tamaño
grande.
Diferentes son las células de la mucosa intestinal que
pertenecen al epitelio cilíndrico y observable en las heces
diarreicas, bien sea aislada o incluidas en moco.Las células en
general, también sufren la acción de las diastasas digestivas,
microbiana o la acción de cualquiera otra causa capaz de
alterarlas, por lo cual, puede encontrarse intactas o no.
Moco. Se encuentra con gran frecuencia en las deposiciones de
los enfermos con inflamación o irritación de la mucosa
intestinal. Es síntoma patológico en los adultos y aparece
normalmente en las heces de los niños de pecho durante las
primeras semanas. Puede aparecer, apreciándose a simple vista,
como masas amorfas o pseudomembranas más o menos
voluminosas, aunque su confirmación siempre debe hacerse al
microscopio. También, suele aparecer en escasa o gran
cantidad, aislado o mezclado íntimamente con las heces en
forma de pequeños copos que no se pueden apreciar a simple
vista sino con ayuda del microscopio; observándose
transparente o turbio según su riqueza en elementos celulares;
incoloros o ligeramente teñido de rojizo, o amarillo verdoso
según se trate de sangre o bilis. El moco al ser grande y estar
poco mezclado con las heces, provienen de partes bajas del
tracto digestivo. La presencia de "pseudomembranas" mucosas
retorcidas y grandes provienen de inflamaciones del colón bajo
(sigmoides) con expulsión rápida de' las heces. Si se trata de
moco íntimamente mezclado con la materia fecal, como copitos
observables en previa dilución, provienen de las partes altas del
colón.
4.2.3.-Otros Elementos
Bacterias. La primera evacuación del recién nacido, el meconio,
no contiene bacterias, pero al cabo de 10 a 24 horas comienza
la eliminación de las mismas, las cuales no proceden de la
alimentación sino del ingreso de microorganismos por las
cavidades naturales (boca, ano).
Según algunos autores la tercera o cuarta parte del extracto
seco de las heces (unos 4 a5 gramos), está formado por
bacterias, saliendo vivas del intestino sólo del 1 al 5%. La
llamada flora sacarolítica o de fermentación, entre las cuales se
encuentran bacterias que por teñirse con el yodo son
denominadas yodófilas, está presente al final del intestino
delgado y se hacen abundantes en el ciego y bolsa cecal;
disminuyen en número y ceden su puesto a la flora proteolítica
o de putrefacción, la cual abunda en la región del colón
izquierdo
Cristales. Entre los que suelen encontrarse en las heces están
los de ácidos grasos y jabones, pudiéndose hallar otros como
los de Charcot-Leyden, los cuales son octaédricos, alargados,
con doble punta agudas e incoloros. Los de oxalato de calcio se
presentan en forma de sobre e incluidos en células
denominadas de oxalato; algunos señalan su presencia, como
posible signo de insuficiencia gástrica ya que son disueltos en el
estómago. Los cristales de fosfato amónico magnésico tienen
forma de tapa de ataúd y son signo de un medio alcalino en
heces de putrefacción o por mezcla con orina. Los cristales de
bilirrubina son difíciles de ver y pueden estar englobados en el
moco amarillo verdoso de las deposiciones del intestino
delgado. Los de hematoidina son de color rojo rubí o moreno;
se les puede encontrar incluido en el moco teñido de sangre,
cristaliza en pequeñas tabletas y agujas. Además, pueden
observarse cristales de origen medicamentoso, tales como el
carbón y el bismuto, los cuales son de color negro, pero los
primeros son de forma rómbica agrupados en cruz.
Levaduras. Se consideran importantes entre los elementos
vegetales que pueden encontrarse en las heces; las levaduras
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son generalmente saprofitos, pero en determinadas
condiciones y por multiplicación exagerada, las levaduras
pueden hacerse virulentas. La transmisión de las levaduras se
hace por medio del polvo, agua de las bebidas y diversos
objetos contaminantes. Su acción patógena se considera como
irritativa, inflamatoria o alérgica, y un medio azucarado
provocado por los alimentos, debe ser suprimido puesto que
favorece su crecimiento. Abundan igualmente cuando hay
administración exagerada de antibióticos
4.3.- Cuando los preparados son con el colorante de lugol.
Ya se ha dicho que son especialmente realizadas para investigar
si hay almidón en las heces (cocido amorfo, cocido contenido en
células de papas y almidón crudo), así como para determinar la
presencia de bacterias yodófilas. El almidón cocido amorfo lo
vemos como manchas o regueros azulados, violáceos o rojizos
según haya sufrido o no la acción diastásica. El almidón
contenido en células de papa está incluido en ellas y se tiñe o
no de azul violáceo según su grado de digestión, notándose la
estructura de las células teñidas débilmente de amarillo.
4.4.- Cuando los preparados son con reactivo de Saathoff.
Al ser sometidas a la acción del calor, toda la grasa presente
(grasa neutra, ácidos grasos y jabones), se funde y forma gotas
que se colorean de anaranjado más o menos intenso por el
Sudán III
En caso de que la cantidad de grasa en las heces sea normal,
sólo se verá en el campo microscópico de 400 aumentos aprox.
2 a 3 gotas pequeñas, que se forman expensas de la poca
cantidad de jabones normalmente presente en las heces.Si hay
aumento exagerado en la cantidad de grasa (dé cualquier tipo)
el número de gotas es mayor y más grandes, ocupando casi
todos los campos.
La finalidad, entonces, de la prueba es la determinación
cualitativa para ver si la grasa está en cantidad normal o
aumentada en forma global. De estar en cantidad normal no es
necesario hacer más ensayos, pero de estar muy elevada la
cantidad, así como en heces de aspecto grasoso, se impone
entonces averiguar con pruebas químicas si el aumento
corresponde a la grasa desdoblada (ácidos grasos, jabones) o
sin desdoblar (grasa neutra).
5.- IMAGEN DE LAS HECES NORMALES.
Veremos ahora los elementos que se presentan en los
preparados cuando las heces son normales y el proceso
digestivo se realiza no estando afectado el tracto digestivo y en
base a un régimen de prueba.
En las preparaciones sin reactivo después de recorrer varios
campos microscópicos se pueden ver fibras musculares
digeridas de pequeño tamaño o apenas reconocible; escaso
jabones alcalinos térreos (magnesianos) identificables sólo en
base a su forma de rosquilla; es raro encontrar células vacías de
papa y posiblemente pueden hallarse algunos restos de celulosa
indigerible.
En los preparados con lugol no se verá ningún elemento teñido
de violeta puesto que todo el almidón ha sido transformado.
Puede haber algunas células vacías de papas teñidas de amarillo
En los preparados con reactivo de Saathoff, después de
calentados, puede observarse algunas pequeñas gotas
distribuidas en los mismos en poca cantidad (2 a 4 por campo),
lo cual es signo de cantidad normal.
6.- RECOLECCIÓN Y PRESERVACIÓN DE LA MUESTRA FECAL
6.1.- RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA FECAL
Todo individuo al cual se le solicite una muestra de heces debe
conocer las condiciones necesarias para la recolección de una
muestra de heces ya que es el mismo individuo en encargado
de tomarla. A continuación se citan las recomendaciones dadas
al paciente:
✔ Tomar la muestra en un papel limpio y seco.
✔ No contaminarla con orina, agua, arena o alguna otra
sustancia.
✔ Tomar de esta las partes más representativas, es decir
aquellas que luzcan con sangre, moco y de consistencia
heterogénea.
✔ Si se observa algún helminto macroscópico, recolectarlo en
un frasco con agua previo lavado del mismo.
✔ Colocar la muestra en recolectores para heces limpios y
secos.
✔ Rotular el recolector con el nombre, edad y sexo del
paciente.
✔ Las muestras frescas deben ser procesadas dentro de las
dos horas siguientes a su recolección, de no ser así deben
preservarse inmediatamente.
✔ Llevar la muestra lo más pronto posible al laboratorio.
✔ Si la muestra es tomada en horas de la tarde o noche y su
consistencia es formada o dura guardarla en nevera a unos
8 ºC.
✔ Las muestras blandas, pastosas liquidas y diarreicas pueden
contener formas vegetativas de protozoarios, éstas deben
ser examinadas antes de las dos horas después de su
recolección, pues estos degeneran rápidamente.
Algunas observaciones que pueden ser tomadas también
como condiciones para la recolección de la muestra fecal es la
presencia de ciertas drogas (vitaminas, laxantes, antibióticos,
etc.) que interfieren con los resultados aportados por el
laboratorio, la recolección de la muestra fecal debe en todo
caso esperar hasta que los efectos de la droga hubiesen pasado.
Las sustancias que comúnmente pudiesen interferir son:
antiácidos como el: kaolin, aceite mineral y otros materiales
oleosos; antidiarreicos no absorbibles; bario, bismuto, (de estos
dos se necesitan de 7 a 10 días para eliminar los efectos); los
agentes antimicrobianos, y los diuréticos necesitan tres
semanas para su eliminación.
Varias muestras del mismo paciente con intervalos de 2 a 3
días son recomendables cuando el primer examen no ha
revelado la presencia de alguna forma evolutiva parasitaria,
esta rutina la conocemos comúnmente como “Seriado de
Heces”.
Una vez llegada la muestra al laboratorio debe clasificarse
de acuerdo a su consistencia, es importante procesar primero
aquellas líquidas y diarreicas y así sucesivamente puesto que
éstas deben contener formas vegetativas de protozoarios que
degeneran en el transcurso de las dos primeras horas
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aproximadamente después de su recolección, de ésta manera
se enumeran en primer lugar líquidas seguidas por las
diarreicas, pastosas, blandas, formadas y en último lugar las
duras. Posteriormente se procede a realizarles el examen
macroscópico y microscópico de las heces tal como se describió
en la práctica anterior.
6.2.- PRESERVACIÓN DE LA MUESTRA FECAL
La muestra fecal debe preservarse si es examinada dentro de los
intervalos de tiempo antes descritos (dos horas máximo), esto
con la finalidad mantener la morfología intacta de las formas
vegetativas de los protozoarios para poder identificarlos
posteriormente, así como para preservar todas aquellas otras
formas evolutivas parasitarias que allí pudiesen estar presentes.
Existen en el laboratorio de parasitología diferentes sustancias
preservadoras que permiten mantener las formas diagnósticas
de los parásitos, sin embargo no existe una sola sustancia que
tenga los mismos resultados con huevos, larvas de helmintos,
trofozoitos y quistes de protozoarios.
Es importante señalar que cuando no están disponibles
sustancias preservadoras debemos guardar la muestra fecal
bajo refrigeración de 4ºC a 8ºC solo para la búsqueda posterior
de huevos y larvas de helmintos y quistes de protozoarios, la
refrigeración ayuda a mantener la morfología de estas formas
evolutivas no así los trofozoitos de protozoarios.
6.3.- PROCEDIMIENTO DE PRESERVACION
Todo muestra fecal recolectada debe dividirse en dos porciones
las cuales se guardarán en dos diferentes sustancias
preservadoras; una que permita mantener la morfología intacta
de las formas vegetativas de los protozoarios ejemplo
(Schaudinn o PVA) y otra que permita preservar los huevos y
larvas de helmintos y los quistes de los protozoarios (ejemplo:
formol salino al 7% o formol al 5%).
COLORACIONES PARA ENTEROPARÁSITOS
1.- CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS DE COLORACION
Los métodos de coloración se dividen en dos grandes grupos:
coloraciones temporales y coloraciones permanentes. Esta
clasificación está realizada de acuerdo al tiempo de
permanencia que tiene cada método sobre la muestra en la cual
queremos identificar alguna forma evolutiva parasitaria. Ambos
métodos de coloraciones tienen un objetivo común: teñir las
estructuras parasitarias sobre todo aquellos elementos internos
que puedan ayudar a la identificación del parásito. Cada
laboratorio dependiendo de sus necesidades específicas y de la
disponibilidad de reactivos deberá utilizar coloraciones
temporales y/o permanentes, las cuales serán necesarias en
muchos casos para el diagnóstico de algunas infecciones
intestinales producidas por parásitos.
2.- COLORACIONES TEMPORALES
Las técnicas de coloraciones temporales se utilizan en el mismo
momento de realizarse el examen al fresco de las muestra de
heces, tienen un tiempo limitado de duración lo que constituye
una desventaja, pero nos permite teñir en pocos minutos una
gran variedad de estructuras parasitarias.
Coloraciones Temporales más utilizadas:
a. Coloración de Lugol
b. Coloración de Azul de Metileno Amortiguado o Nair
c. Coloración de Merthiolate Iodo Formol (MIF)
2.1.- COLORACIÓN DE LUGOL
La coloración temporal de lugol es comúnmente utilizada para
la identificación de quistes de las diferentes especies de amibas,
así como quistes de otros protozoarios tales como
Giardialamblia y Chilomastixmesnili, con ésta coloración
también podemos diferenciar larvas rhabditoides de
Strongyloidesstercoralis con aquellas de Ancyloslomideos, dos
nemátodes intestinales patógenos al hombre. Las estructuras se
tiñen en tonos marrones, ocres y amarillos tenues (ver anexo nº2).
2.2.- COLORACIÓN DE AZUL DE METILENO AMORTIGUADO
(NAIR).
La coloración de Nair, conocida como coloración de Azul de
Metileno Amortiguado, es también un método temporal, es útil
en la identificación de trofozoitos del complejo
EntamoebaHistolytica/ Entamoeba dispar pudiendo también
colorear otras formas vegetativas de amibas como son las
especies E. coli,E. nana, I butschiii. Las estructuras se tiñen en
tonos azules oscuros las cuales corresponden a los elementos
internos más densos (cariosomas, hematíes fagocitados,
membrana nuclear, entre otros) y azules claros o celestes
aquellos más laxos como por ejemplo el endoplasma.
Es muy recomendable el pH 3.8 y en ésta solución se disuelve
el azul de metileno o la pironina. La cantidad del colorante que
se debe disolver en la solución amortiguadora se establece por
experiencia, dependiendo de la solubilidad del colorante en el
amortiguador a diferentes valores de pH. Se obtienen buenos
resultados con una pequeña cantidad de Azul de Metileno (0.06
g. ó 0.08 g) y guardar el colorante en frasco ámbar.
2.3.- COLORACIÓN DE MERTHIOLATE -YODO -FORMOL (MIF)
Se puede mencionar la solución de M.I.F. que aunque es
preservadora de la muestra fecal también tiene propiedades
colorantes, es menos utilizada en los laboratorios de
diagnóstico aunque con ella se obtengan buenos resultados,
esta solución sirve para colorear huevos, larvas de helmintos y
quistes de protozoarios a partir de muestras de heces frescas así
como también a partir de aquellas que han sido preservadas.
Los resultados para esta coloración son estructuras con
citoplasmas de color amarillo verdoso, y núcleos pardos en la
fase yodada; y de color rojo o rosado en la fase llamada de
eosina. La preparación de reactivos está señalada en la práctica
de Recolección y preservación de la Muestra fecal. Las
coloraciones temporales se utilizan preferentemente en
muestras frescas.
3.- COLORACIONES PERMANENTES
Cuando se trata de infecciones intestinales producidas por
protozoarios, las coloraciones permanentes tienen como
objetivo fundamental teñir los detalles morfológicos de los
núcleos de los trofozoitos sobre todo de las amibas
permitiendo un reconocimiento seguro; sin embargo esto
también se aplica a formas quísticas. Las coloraciones
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permanentes por lo general no se utilizan de rutina en los
laboratorios clínicos para la identificación de formas evolutivas En cualquiera de las tres situaciones es imprescindible recordar:
parasitarias debido a que son más costosas y laboriosas. Es a.- El frotis debe tener una capa fina de muestra es decir, no
importante señalar que cuando con las tinciones temporales no debe ser grueso
se hubiese identificado la estructura parasitaria debe recurrirse b.- No se deja secar sino que se sumerge inmediatamente en la
a una tinción permanente para así poder dar un diagnóstico solución fijadora donde permanece durante 1 hora a 50ºC o
definitivo. una hora a temperatura ambiente, la lámina ya fijada puede
permanecer en esta solución uno o dos días máximo.
Algunas infecciones parasitarias producidas por protozoarios
necesariamente requieren obligatoriamente de la utilización de Procedimiento de coloración
coloraciones permanentes como aquellas específicas para Reactivos Tiempo
ooquistes de coccidios su utilización es indispensable para el 1. Fijador de Schaudinn 1 hora o mas
diagnóstico definitivo de estos grupos de parásitos. 2. Alcohol al 70 % Yodado 5
3. Alcohol al 50% 3
Es importante señalar que las técnicas de coloraciones 4. Agua de Chorro 3
permanentes son más complejas en su ejecución, en ellas el
5. Alumbre Férrico 4% 3a5
tiempo utilizado para teñir las estructuras parasitarias es mayor,
6. Agua de Chorro 1
requiriendo además de una batería de soluciones y reactivos
7. Hematoxilina 1 a 5 minutos
que conlleva a un proceso mas demorado, pero que al final
proporcionan frotis teñidos permanentemente que no se 8. Agua de Chorro 1
deterioran con el tiempo. Los preparados teñidos con éste tipo 9. AcidoFosfotúngstíco al 2% 2 minutos o mas
de coloraciones proporcionan al Bioanalista un archivo 10. Agua de Chorro 5
permanente de estructuras parasitarias, y sirven también para 11. Alcohol al 70% Alcalino 3
ser utilizadas en circunstancias donde se requiera consultar con 12. Alcohol al 95% 3
especialistas cuando se encuentren características morfológicas 13. Alcohol absoluto 3
inusuales de algunas estructuras parasitarias. 14. Xilol 3
15. Los frotis ya teñidos se cubren con -
Las coloraciones Permanentes más comunes que podemos un medio de montaje
utilizar son: (Histoclad, Permount etc.)
a. Coloración de Hematoxilina Férrica * Los valores numéricos indican minutos
b. Coloración Tricrómica
c. Coloración de ZielhNeelsen Modificada RESULTADO .
d. Coloración rápida de ZielhNeelsen Modificada Las estructuras se observan con citoplasma azul grisáceo y los
e. Coloración de Kinyoun cariosomas de los núcleos, cuerpos cromatoides, eritrocitos
f. Coloración Tricrómica Modificada para esporas del fagocitados, etc., de color azul oscuro muy intenso(ver anexo nº2).
PhylumMicrospora
g. Coloración de Quik-Hot-Gram-Cromotropo para 3.2.- COLORACIÓN TRICRÓMICA
esporas del PhylumMicrospora Este método diseñado por Wheatley (1951) es rápido, da
buenos resultados como técnica de rutina en un laboratorio con
3.1.- COLORACIÓN DE HEMATOXILINA FÉRRICA propósitos de diagnóstico. Este método se diferencia de la
A continuación se describe la técnica modificada por Tomkins y tinción de Hematoxilina férrica por:
Miller (1947) ya que es un procedimiento muy bueno como a.- no necesita mordiente antes de la coloración
método de rutina con propósito de diagnóstico. b.- el colorante es estable y puede utilizarse repetidamente
c.- la solución diferenciador utilizada es alcohol
Realización de los frotis:
Se realiza un frotis con la muestra fecal y sin dejar secar se Procedimiento:
sumerge inmediatamente en la solución fijadora de Shaudinn. Reactivos Tiempo
De acuerdo a la consistencia de la muestra fecal se nos pueden
1. Fijador de Schaudinn 1 hora o mas
presentar dos situaciones:
a.- Cuando las heces son de consistencia dura, es importante 2. Alcohol al 70 % Yodado 1
realizar una emulsión con solución salina fisiológica para poder 3. Alcohol al 70% 1
realizar el frotis sobre la lámina porta objeto. 4. Alcohol 70% 1
b.- Cuando las heces son de consistencia diarreica o líquida, es 5. Colorante Tricrómico 2 a 8 minutos
necesario utilizar una sustancia adherente sobre la lámina porta 6. Alcohol 90% acidificado 10 a 20
objeto que bien puede ser albúmina de huevo, suero o plasma. segundos
Estas sustancias se esparcen sobre la lámina porta objeto en 7. Alcohol 95% 1
forma de extendido, se deja secar y posteriormente colocamos
8. Alcohol al 95% 1
la muestra.
9. Alcohol absoluto 1
c.- Con heces formadas, blandas y pastosas el frotis se realiza
directamente sobre la lámina porta objeto. 10. Xilol 1
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11. Los frotis ya teñidos se cubren con - 8.- Se lava con agua de chorro
un medio de montaje
(Histoclad, Permount etc.)
* Los valores numéricos indican minutos
RESULTADO . Los ooquistes se observan de color rojo intenso sobre un fondo
Las estructuras se observan con citoplasma azul verdoso con
estructuras internas color púrpura.
3.3.- COLORACIÓN DE ZIELH NEELSEN MODIFICADA
Los ooquistes de coccidios intestinales requieren de
coloraciones permanentes especificas que corresponden a sus
propiedades estructurales (las formas diagnóstica son ácido
alcohol-resistentes). Las especies del género Cryptosporidium, y
la especie Cyclosporacayetanensis son ejemplos de ellos. Los
ooquistes presentes en la muestras de heces pueden colorearse
con tinciones permanentes tales como la coloración de
ZielhNeelsen Modificada y una variante de esta que es la
coloración rápida de ZielhNeelsen
Procedimiento:
1.- Se preparan frotis de muestras de heces
(3cm de largo por 1 cm de ancho). Se dejan secar.
2.- Se fija con metanol puro (1 a 3 minutos)
3.-Se colorea con Carbol-Fucsina (20 minutos)
4.- Se lava con agua de chorro para eliminar el exceso de
colorante
5.- Se decolora con una solución acuosa de ácido sulfúrico al 1 %
(15 a 30 seg.)
6.- Se lava con agua de chorro
7.- Se colorea con azul de metileno al 0.3 % o con verde de
malaquita al 4% (1 minuto)
8.- Se lava con agua de chorro
9.- Se deja secar
10.-Se observa con objetivo 100X (inmersión)
RESULTADO
Los ooquistes se observan de color rojo intenso sobre un fondo
azul o verde dependiendo del colorante de contraste utilizado.
Algunos ooquistes pueden contener gránulos oscuros en su
interior
3.4.- COLORACIÓN RÁPIDA DE ZIELH NEELSEN MODIFICADA
Esta técnica de coloración utiliza los mismos reactivos que la
coloración de ZielhNeelsen Modificada, solo varía en el
procedimiento de la técnica.
Procedimiento:
1.- Se preparan frotis de muestras de heces que se extiende 3cm
x 1 cm . Se deja secar.
2.- Se fija con metanol puro (1 a 3 minutos)
3.-Se colorea con Carbol - Fucsina (10 minutos)
4.- Se lava rápidamente con alcohol etílico al 50% (2 ó 3 seg.)
5.- Se lava con agua de chorro
5.- Se decolora con una solución acuosa de ácido sulfúrico al 1%
(2 minutos)
6.- Se lava con agua de chorro
7.- Se colorea con azul de metileno al 0.3 % o con verde de
malaquita al 4% (1minuto)
9.- Se deja secar
10.-Se observa con objetivo 100X (inmersión)
RESULTADO
azul o verde dependiendo del colorante de contraste utilizado.
Algunos ooquistes pueden contener gránulos oscuros en su
interior.
3.5.- COLORACIÓN DE KINYOUN
Procedimiento:
1. Realizar un frotis en una lámina porta objeto, dejar secar.
2. Fijar la lámina con metanol (1 a 3 minutos)
3. Pasar la lámina rápidamente por la llama de un mechero.
4. Colocar el colorante carbol fucsina (10 minutos)
5. Lavar la lámina con agua de chorro.
6. Decolorizar con alcohol ácido (1 minuto)
7. Lavar nuevamente la lámina con agua de chorro.
8. Colocar azul de metileno. (1 minuto)
9. Lavar con agua de chorro para eliminar el exceso de
colorante.
10. Dejar Secar y observar posteriormente con objetivo de
inmersión
RESULTADO
o Los ooquistes se observan de color rojo intenso sobre un
fondo azul, algunos pueden contener gránulos oscuros en
su interior.
o Es importante señalar que durante el proceso de
decoloración se han encontrado buenos resultados con
tiempos no superiores a 15 segundos máximos.
4.- TECNICAS PÀRA TEÑIR E IDENTIFICAR LEUCOCITOS FECALES
4.1.- IMPORTANCIA CLINICA
La determinación de leucocitos fecales o recuento diferencial de
leucocitos se solicita ante la sospecha de una diarrea aguda
invasiva inflamatoria que puede ser de tipo infecciosa o no
infecciosa. Entre las causas no infecciosas tenemos por ejemplo
los carcinomas y entre las causas infecciosas la presencia
principalmente de bacterias patógenas y eventualmente virus o
parásitos. Las bacterias mas comunes causales de diarrea
invasiva inflamatoria infecciosa son: Shigella, Salmonella,
Escherichiacolienteroinvasiva y Clostridiumdifficile. Entre los
virus los Rotavirus y Torovirus y finalmente entre los parásitos
Entamoebahistolytica y Balantidiumcoli. El resultado del
recuento diferencial de leucocitos en heces le permite al clínico
distinguir entre una infección bacteriana y una viral, debido a
que en el caso de una infección bacteriana se observa una gran
cantidad de polimorfonucleares, Ej.: Shigella, y Escherichiacoli,
así como de mononucleares y macrófagos en caso de
Salmonella typhi. Mientras que en los pacientes con
gastroenteritis vírica o parasitaria escasamente se observa
algún exudado celular en los excrementos acuosos, a menos
que se trate de una colitis ámibiana complicada donde se
pueden observar macrófagos y leucocitos (disentería ámibiana
crónica con invasión bacteriana secundaria).
Los leucocitos en heces se evidencian macroscópicamente
como grumos blanquecinos-amarillentos que pueden
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encontrarse en la superficie de la muestra o entremezclada con
la misma. Microscópicamente los leucocitos se observan en
s.s.f. y lugol como elementos pequeños redondeados de
membrana delgada y finamente granulares en su interior. En el
examen al fresco los leucocitos, especialmente los neutrófilos
polimorfonucleares, se observan mejor si se le agrega una gota
de ácido acético glacial al 10% a una gota de la emulsión de
heces. Algunos macrófagos semejan al fresco a los trofozoítos
de amibas, por tener pequeños pseudopodos; pero se
diferencian de éstas porque son más granulosos y por carecer
de las características de movilidad y morfología nuclear que
tienen las amibas.
En las preparaciones al fresco o con lugol es prácticamente
imposible distinguir la línea celular que se observa, es decir si se
trata de un leucocito polimorfonuclear o mononuclear y mucho
menos las sub-series de éstas; por lo que se hace necesario
efectuar la coloración de Giemsa, Wright, Azul de metileno,
hematoxilina férrica o Tricrómica para la visualización y contaje
de leucocitos. Es muy importante efectuar la coloración para
leucocitos fecales lo mas pronto posible después de recolectada
la muestra, ya que estas células tienden a deformarse muy
rápidamente luego que salen del organismo humano; portal
motivo se recomienda llevar la muestra lo antes posible al
laboratorio.
4.2.-TECNICAS DE COLORACION
4.2.1.-COLORACIÓN DE GIEMSA
Se utiliza basándose en el mismo fundamento de la coloración
de frotis sanguíneos, el cual permite determinar la presencia de
polimorfonucleares neutrófilos, basófilos y eosinófilos, así como
monocitos y linfocitos. Su realización es similar a la del
hemograma.
Procedimiento:
a. Utilizar un portaobjetos limpio, donde se depositará una
gota de la emulsión de heces a estudiar (si la muestra tiene
pus macroscópica debe tomarse específicamente de ese
lugar) la cual puede prepararse mezclando una parte de las
heces con dos de solución salina.
b. Con la ayuda de otro portaobjetos efectuar un extendido
fecal, colocando el portaobjetos en ángulo de ASQ en
relación al primer portaobjeto y deslizar con cuidado hasta
el final de la lámina.
c. Dejar secar muy bien el frotis y agregar metanol por espacio
de 5 minutos.
d. Agregar el colorante de Giemsa diluido en forma regular,
generalmente se utiliza una gota de colorante por ml de
agua corriente y se aplica por 45 minutos, o dos gotas de
colorante por mililitro de agua y se aplica por 30 minutos.
Las concentraciones de colorante y tiempo de coloración
pueden variar de acuerdo a la calidad del reactivo
empleado.
e. Volcar el colorante y lavar con agua. Dejar secar para
observar al microscopio con objetivo de 100x.
4.2.2.- COLORACIÓN CON AZUL DE METILENO DE LÓEFFER Ó
AZUL DE METILENO AMORTIGUADO (NAIR)
Se trata de una preparación húmeda o coloración temporal que
permite teñir de forma más clara los núcleos de los leucocitos
para poder efectuar su diferenciación, ya que el azul de
metileno es una tiacina, componente básico de los colorantes
tipos Romanowsky. Los mejores resultados se obtienen con azul
de metileno amortiguado.
Procedimiento:
a. Con un aplicador agregar una pequeña porción de heces o
material muco- purulento en la lámina portaobjetos, si la
muestra es líquida, tomar con una pipeta Pasteur.
b. Añadir 1-2 gotas de azul de metileno y mezclar bien con las
heces, colocar un cubreobjetos. Esperar de 2-5 minutos
para obtener una buena tinción nuclear.
c. Analizar la preparación con objetivo de 40x.
5.- RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS FECALES
El término "Recuento diferencial" se refiere a la distribución
porcentual de los distintos tipos de leucocitos en el frotis. En el
caso de la muestra fecal este recuento diferencial solo es
necesario para de distinguir en los leucocitos presentes las
células polimorfonucleares de aquellas mononucleares. Por lo
que solo basta revisar tantos campos como sean necesarios
para completar 100 células con la ayuda de un contador y
reportar el porcentaje obtenido de polimorfonucleares y
mononucleares respectivamente. En caso de no poderse
efectuar un recuento de las células, puede reportarse el
predominio celular existente, Ej: Si se observa una mayor
frecuencia de polimorfonucleares en relación a otro tipo de
células se reporta: Predominio de leucocitos
polimorfonucleares. La interpretación de este reporte es que
dicho resultado puede deberse a la existencia de una diarrea
invasiva bacteriana o parasitaria (menos frecuente); mientras
que si el predominio celular es de tipo monocítico o
macrofágico, puede tratarse de una fiebre tifoidea. En las
diarreas virales no se observan leucocitos en la muestra fecal.
6.- RECUENTO CUANTITATIVO DE LEUCOCITOS FECALES
Cuando solicitan un estudio cuantitativo, mas no un recuento
diferencial, puede utilizarse la tabla referida por Botero y
Restrepo, que consiste en efectuar el contaje de
aproximadamente 200 células y calcular un promedio de los
leucocitos observados por campo (sin discriminar el tipo de
leucocito), para finalmente reportarlo por cruces, lo cual
permite una referencia al clínico de cuan aumentada esta la
liberación de leucocitos a nivel del tejido intestinal. Dicha tabla
es la siguiente:
Reporte
● Positivo +: <1 leucocitos/campo,
● Positivo ++: 10-30 leucocitos/campo,
● Positivo +++: >30 leucocitos/ campo.
7.- TEST DE AGLUTINACIÓN EN LATEX PARA LACTOFERRINA
La lactoferrina es una proteína de unión al hierro que es
sintetizada por neutrófilos, células epiteliales glandulares y se
encuentra en varias secreciones tales como lágrimas y leche, lo
cual es capaz de retardar el crecimiento bacteriano y fúngico.
Esta proteina se encuentra en los granulos secundarios o
específicos (neutrófilo), que al ejercer una acción quelante en el
hierro requerido para el crecimiento microbiano, causa
bacteriostasis. El hallazgo de lactoferrina en heces es sinónimo
de presencia de leucocitos fecales y por lo tanto de proceso
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invasivo inflamatorio; por lo que se ha creado una técnica de
aglutinación en látex semicuantitativa rápida comercial para
detectarla: Leuko-test.
En vista de que la lactoferrina puede ser detectada en
polimorfonucleares intactos y lisados, la prueba es
potencialmente mas eficiente que la microscopia óptica de los
leucocitos, la cual requiere la integridad celular de estos
elementos, además de que puede efectuarse en muestras con
72 horas de refrigeración Según investigaciones recientes, la
prueba de lactoferrina fecal presenta una sensibilidad mayor
que la determinación de leucocitos fecales y sangre oculta para
detectar patógenos invasivos.
METODOS DE MANTENIMIENTO Y EVOLUCION DE LARVAS DE
NEMATODES INTESTINALES
INTRODUCCION
Cuando en un análisis coprológico se encuentran huevos de
Nemátodes que no se pueden determinar con examen
exactitud a causa de su parecido con otros géneros en cuanto a
tamaño, forma y contenido y que además se presenta en
infecciones mixtas, se debe reunir al cultivo de los huevos
donde se consiguen el desarrollo de las larvas.Las técnicas se
realizan en heces frescas y no alteradas.
Cuando se pretende mantener larvas de Nemátodes se emplea
para obtener y por lo tanto diferenciar larvas de
Ancylostomideos y de Strongyloidesstercoralis, ya que a veces
resulta difícil la identificación exacta de las larvas que podemos
encontrar en las heces (sobre todo si se trata de larvas jóvenes,
o larvas que se encuentran en heces viejas) además de la
posibilidad de que exista infestación por ambas especies.
Resulta útil entonces realizar técnicas que permitan la evolución
de larvas en estado mas avanzado (Larvas Filariformes) las
cuales resulta de mas fácil identificación.
Suele también suceder que la identificación especifica de
huevos de Ancylostomideos y de especies de vida libre
semejantes a ellos se torne difícil o imposible, por lo cual
obtener larvas evolucionadas (en estadio infectante) a partir de
huevos hace fácil la identificación.A continuación se describen
los Métodos de mantenimiento y evolución más utilizados en
los Laboratorios de investigación y docencia:
1.- METODOS PARA METODOS PARA LARVAS DE NEMÁTODES
INTESTINALES
1.1.- TECNICA DE HARADA- MORI
Este procedimiento es utilizado para para embrionar huevos y
separar larvas sobre papel de filtro, tiene como principal
utilidad el estudio de larvas de Nemátodes y también sirve para
embrionar huevos de Tremátodes y Cestódes.
El material necesario consiste en tubos de ensayo de 16 cm x 15
mm de ancho; tiras de papel de filtro grueso de 14 cm x 1 cm de
ancho, agua destilada, agua estéril por ebullición o agua
tamponada (Solución tampón de fosfatos) .
La técnica para la siembra es la siguiente:
a. Homogeneizar bien las heces por tamizaje a través de un
colador de malla fina.
b. Con la ayuda de un bajalenguas, efectuar la siembra de las
heces, untándolas en capa fina sobre el papel de filtro, en
una extensión de 10 cm y dejando libres los dos extremos
de la tira en unos 2 cm.
c. En un tubo de ensayo grande conteniendo unos 5 ml de
agua de chorro se coloca la tira de papel procurando que el
extremo inferior (el extremo limpio) de la misma quede
sumergido en el H20, pero que las heces no entren en
contacto con ella (evitar se ensucie el agua).
d. Tape el tubo con algodón o gasa y lleve a un lugar oscuro a
temperatura ambiente o incubar a 20°C en estufa. (Fig. nº
4-1)
e. Examinar después de 3 días se puede examinar el
sedimento para la identificación de las larvas
f. Observación: Como las larvas presentan movimientos
activos al obtener una gota de fondo del tubo, puede
introducirse bajo el cubre-objetos una pequeña gota de
solución de lugol o de formol para matarlas y por lo tanto
inmovilizarlas y así hacer mejor su estudio morfológico.
1.2.- TÉCNICA DE DE CARBÓN ARENA
Procedimiento:
a. Una porción grande de heces es mezclado con una cantidad
más o menos igual de arena estéril. (La cantidad de heces
puede ser del tamaño de una nuez aproximadamente)
También puede utilizar carbón vegetal de grano fino.
b. Las Heces y la arena se mezcla con un baja lengua
agregando una pequeña cantidad de agua para humedecer,
pero sin mojarlo en exceso.
c. Esa mezcla se coloca sobre papel de filtro húmedo dentro
una caja de petri, donde deben mantenerse con cierta
humedad en la superficie, para lo cual pueden espaciarse
algunas gotas de H20 diariamente, pero sin poner
demasiada H20 (esto se hace con la finalidad de evitar la
desecación que mataría las larvas).
d. Dejar la mezcla a temperatura ambiente durante 3 a 7 días,
al cabo de los cuales empieza a aparecer las larvas
provenientes de los huevos. Si se ha empleado una caja de
petri en las gotas de condensación que aparecen en la
superficie de la tapa también pueden encontrarse larvas.
Las larvas filariformes emigran a la superficie de la mezcla o
a la gota de H20. Deben buscarse las larvas a partir del día
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y en caso de no encontrarlas seguir el estudio al cabo de 5 y
7 días. Mediante el examen microscópico se identifican las
larvas en base a sus caracteres morfológicos
e. En caso de que las larvas se encuentren en las gotas de H20
condensadas en la tapa se recogen con pipeta capilar y se
trasladan a un vidrio de reloj o envase limpio para su
observación microscópica.
f. Cuando se trata de separar las larvas de la mezcla de heces
y arena se utiliza el aparato de Baermann(practica nº 5
métodos de concentración fecal)
1.3.- TÉCNICA DE AGAR-PLACA (ARAKAKI) PARA LA
RECUPERACIÓN Y EL DIAGNOSTICO DE Strongyloidesstercoralis
a. Colocar de 1 a2 gramos de heces en una placa de Petri con
agar nutritivo
b. Sellar la placa con cinta engomada
c. Dejarla a temperatura ambiente (36 a35 °C) durante 24
horas*
d. Observarla luego de haberse cumplido este tiempo. Si la
placa permanece negativa, volver a incubar por 24 horas
mas, para luego reexaminarla.
Observación de las placas:
e. Destapar las placas
f. Observar al trasluz la presencia en el agar de surcos
delgados y pequeños en forma de zig-zag.
g. Para corroborar los resultados, colocar la placa en el
microscopio y observar con lupa (Objetivo de 4X) todo el
borde de la muestra de heces, en busca de larvas vivas y/o
muertas en el agar.
Observación de las larvas:
-Colocar unas gotas de solución salina fisiológica al 0,85% en el
agar.
-Rotar suavemente las placas para recuperar las larvas del
líquido.
-Con una pipeta Pasteur, recoger la solución salina fisiológica y
colocarla entre lámina y laminilla para su identificación en el
microscopio con Objetivo de 10 X. En caso de encontrar larvas
rhabditoides, agregar una gota de lugol para observar las
características morfológicas y diferenciarlas con las larvas
rhabditoides de los Ancylostomideos.
METODOS DE CONCENTRACIÓN FECAL
CLASIFICACION
Los métodos de concentración se dividen en dos grandes
grupos:
1. Los métodos físicos: por flotación, sedimentación, o por
afinidad acuosa, hidrófila, etc.
2. Los métodos difásicos: los cuales emplean dos soluciones
no miscibles.
1.- CONCENTRACION DE LOS ELEMENTOS PARASITARIOS POR
METODOS FISICOS
1.1.- TÉCNICAS DE FLOTACIÓN:
Este grupo de técnicas emplean soluciones con una mayor
densidad que los elementos parasitarios, de manera que éstos
suban a la superficie, en tanto el resto de la muestra permanece
en el fondo del tubo o envase. La flotación puede ser
espontánea o acelerada por centrifugación. Se recomienda en
este grupo de técnicas, efectuar todos los pasos (dilución,
concentración y toma de muestra para el análisis ) en forma
rápida, ya que los líquidos utilizados tienen tendencia a
impregnar las formas evolutivas parasitarias, haciendo que los
quistes de protozoarios se deformen y los huevos de helmintos
sobornen más pesados, por lo que caen al fondo del tubo en
unos pocos minutos; además, estos líquidos pueden alterar la
morfología de los parásitos, por lo que se hace necesario tener
el hábito de reconocerlos para poderlos identificar. Las técnicas
de flotación más frecuentes son: la de cloruro de sodio (Willis) y
Sulfato de Zinc (Faust)
1.1.1.- TÉCNICA DE SOLUCIÓN SATURADA DE CLORURO DE
SODIO (WILLIS).
Líquido de dilución
Solución acuosa saturada de cloruro de sodio (sal común) con
una densidad de 1.20 (Verificar con un densitómetro).
Procedimiento:
1.- En un beaker pequeño (cap. 25 ml.) colocar 2 gr. de heces
aprox.
2.- Adicionar solución de cloruro de sodio (líquido de dilución)
hasta la mitad del envase.
3.- Mezclar con la ayuda de dos aplicadores cuidadosamente,
hasta obtener una suspensión homogénea.
4.- Adicionar más líquido de dilución hasta llenar el envase,
formando un menisco saliente.
5.- Cubrir con un portaobjeto. El contacto entre la superficie de
la suspensión y el portaobjeto debe ser completo, sin que se
formen burbujas de aire, ni que se derrame la solución.
6.- Dejar entre 10 y 15 minutos. Los huevos ascienden hacia la
superficie y se adhieren al portaobjeto.
7.- Levantar rápido el portaobjeto e invertir.
8.- Cubrir con una laminilla cubreobjeto de 22 x 22 la zona que
ha estado en contacto con el líquido.
9.- Examinar microscópicamente inmediatamente.
Otra manera de obtener el material de la capa superficial, es
tomando líquido de la superficie con una pipeta Pasteur o
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gotero. Colocarla en un portaobjeto y cubrirla con un
cubreobjeto para su posterior observación. Esta metodología
sustituye los pasos del 5 al 9. En laboratorios rurales y con
deficiencia de material, puede efectuarse este método en el
mismo envase de heces que trajo el paciente.
Resultados
Esta técnica evidencia muy bien los huevos de
Ancylostomideos, aunque es útil también para otros huevos de
helmintos, tales como: Hymenolepis nana, Ascaris
lumbricoides, Trichuris trichiura y Taenia sp.
1.1.2.- TÉCNICA DE SOLUCIÓN SATURADA DE SULFATO DE ZINC
(FAUST).
Líquido de dilución
Solución acuosa al 33 % de sulfato de zinc con una densidad de
1.18 (Verificar con un densitómetro).
Procedimiento:
1.- En un beaker pequeño (cap 25 ml) colocar 2 gr. de heces
aprox.
2.- Adicionar agua de chorro hasta la mitad del envase.
3.- Mezclar la muestra con la ayuda de dos aplicadores
cuidadosamente, hasta obtener una suspensión uniforme. (a)
4.- Filtrar a través de gasa (doble capa), recogiendo el líquido
filtrado en un tubo de 13 x 100 mm. (b)
5.- Centrifugar a 2500 r.p.m. durante 1 minuto
6.- Descartar el líquido sobrenadante.
7.- Añadir la solución de sulfato de zinc (líquido de dilución)
hasta llenar el tubo a la mitad. (c)
8.- Resuspender el sedimento con la ayuda de un aplicador.
9.- Adicionar más diluente hasta 1 cm. de la boca de tubo. (d)
10. - Centrifugar a 2500 r.p.m. durante 1 minuto.
11.- Sin agitar ó derramar, colocar el tubo en una gradilla.
12.- El material de la capa superficial puede recogerse de dos
maneras:
I. elevando el nivel de líquido hasta formar un menisco en
la parte superior, adicionando cuidadosamente diluente
a través de las paredes del tubo y luego continuar de
igual forma los pasos del 5 al 9 de la técnica de Willis y
cubrir con un cubreobjeto.
II. Recogiendo parte de la película superior con asa
bacteriológica, una pipeta Pasteur o gotero. Llevar a un
portaobjeto.
13.- Examinar al microscopio para la búsqueda de huevos y
larvas de helmintos y quistes de protozoarios. En caso de
observarse quistes, adicionar el colorante de lugol por
capilaridad a la preparación húmeda.
Resultados
Esta técnica es utilizada con relativo éxito en la recuperación de
huevos livianos de helmintos y quistes de protozoarios; sin
embargo distorsiona dichas estructuras. Se ha introducido una
modificación de esta técnica (Harper) para subsanar estos
inconvenientes, sustituyendo formol al 10 % ó 7 % por agua de
chorro en el lavado inicial de la técnica (Paso 2 de la técnica).
1.1.3.- TÉCNICA DE SCHEATER.
Líquido de dilución
Solución de Scheater (500 gr. de sucrosa, 320 ml de agua
destilada y 6.5 gr de cristales de fenol).
Procedimiento:
1.- Filtrar la muestra de heces preservada en formol salino al
10% o PAF a través de gasa (una o dos capas).
2.- Colocar del filtrado 1 ó 2 ml en un tubo cónico. Completar
con la solución de Scheater hasta 1 cm. del borde del tubo.
3.- Centrifugar a 3000 rpm durante 5 a 10 minutos.
4.- Tomar con una pipeta Pasteur la película de la superficie y
colocar en un portaobjeto. Cubrir con un cubreobjeto.
5.- Examinar microscópicamente con objetivo de 40 x.
Resultado
Este método fue ideado para la recuperación de ooquistes de
Cryptosporidium sp.
1.1.4.- TÉCNICA DE ANDERSON.
Líquido de dilución
Solución de sacarosa (454 gr. de azúcar granulada, 355 ml de
agua destilada y 6.7 ml de fenol).
Procedimiento
1.- En un envase mediano (50 ml), resuspender 5 gr. de heces en
15 a 20 ml de agua de chorro.
2.- Filtrar la suspensión a través de gasa (uno ó dos capas) y
transferir a un tubo de centrifuga de 15 ml de capacidad.
3.- Centrifugar a 500 g (1) durante 10 minutos.
4.- Descartar el sobrenadante.
5.- Resuspender el sedimento en la solución de sacarosa, hasta
1 cm. Del borde del tubo.
6.- Centrifugar a 500 g. (1) durante 10 minutos. (g. es la
velocidad de la gravedad de la tierra, entonces será en este caso
500 veces la gravedad de la tierra).
7.- Tomar del menisco, con un asa de platino o pipeta Pasteur.
Colocar en un portaobjeto y cubrir con un cubreobjeto.
8.- Observar microscópicamente con objetivo seco de mayor
aumento (40x)
Resultado
Esta técnica permite recuperar ooquistes de Cryptosporidium
sp.
1.2.- TÉCNICAS DE SEDIMENTACIÓN:
En estas técnicas se emplean soluciones con una menor
densidad que los elementos parasitarios, de forma que éstos se
reúnan en el fondo del tubo o del envase. Son útiles para la
búsqueda de huevos de ciertos helmintos, tal como
Schistosoma mansoni, pero son ineficaces para poner en
evidencia protozoarios, tanto en su forma quística como
vegetativa. Estos métodos son de ejecución sencilla, aunque
requieren de largos tiempos y pocos productivos, por lo que no
se recomienda su uso de rutina.
1.2.1.- TÉCNICA DE SEDIMENTACIÓN ESPONTÁNEA.
Líquido de dilución
Agua de chorro (potable).
Procedimiento
1.- En un envase de gran capacidad (250 a 500 ml), agregar 10
gr. de heces y llenar tres cuartas partes del envase con agua de
chorro.
2.- Dejar reposar por 1 hora.
3.- Desechar el sobrenadante, teniendo cuidado de no descartar
el sedimento.
4.- Resuspender en agua. Dejar sedimentar por 45 minutos.
Desechar el sobrenadante.
5.- Repetir el paso 4, dejando sedimentar por 30 minutos.
6.- Examinar microscópicamente el material sedimentado,
haciendo tres tomas: de la superficie, a media altura y del fondo
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La toma de muestra puede hacerse con asa de platino o pipeta
Pasteur.
Resultados:
Esta técnica es poco productiva pero pone bien en evidencia los
huevos de Ascaris lumbricoides fértiles y larvas de
Strongyloides stercoralis.
1.2.2.- TÉCNICA DE FAUST E INGALLS.
Líquido de dilución
Agua glicerinada al 0,5 %. La función de la glicerina es restar la
tensión superficial.
Procedimiento
1.- En un envase de capacidad de 250 ml, adicionar 5 gr. de
heces aprox.
2.- Agregar líquido diluente hasta la cuarta parte del envase.
Mezclar con un baja lengua cuidadosamente, hasta obtener una
suspensión homogénea.
3.- Adicionar más diluente hasta llenar las tres cuartas partes
del envase.
4.- Filtrar a través de una gasa a una copa de sedimentación
(250 ml a 500 ml)
5.- Dejar la suspensión reposar 1 hora.
6.- Descartar cuidadosamente dos tercios del líquido
sobrenadante, sin dejar escapar el sedimento.
7.- Añadir líquido diluente hasta llenar las tres cuartas partes
del envase. Dejar en reposo por 45 minutos.
8.- Repetir los pasos 6 y 7, dejando en reposo sólo por 30
minutos. Descartar el sobrenadante.
9.- Tomar muestra de la capa superficial del sedimento con una
pipeta Pasteur y colocar una o dos gotas en una lámina
portaobjeto. Cubrir con un laminilla de 22 x 22.
10.- Examinar microscópicamente.
Resultados
Esta técnica es conveniente para la búsqueda de huevos
deSchistosomamansoni, aunque las larvas de Strongyloides
stercoralis y huevos infértiles de Ascaris lumbricoides también
pueden ser recuperados.
2.- CONCENTRACIÓN DE LOS ELEMENTOS PARASITARIOS
PORMÉTODOS DIFÁSICOS.
Fundamento:
Estas técnicas contienen siempre la puesta en presencia de dos
fases líquidas no miscibles, una acuosa y la otra constituida por
un solvente de los lípidos. Todas derivan del método descrito
por Telemann en 1908 que utilizaba ácido clorhídrico y éter.
Este autor pensaba que la concentración de los elementos
parasitarios se hacía gracias a la acción disolvente de los
reactivos; donde el ciclo destruía los prótidos y el éter las
grasas.
Bailenger ha demostrado que se trata de un mecanismo
secundario y que el proceso fundamental es « la puesta en
contacto de dos fases realizando un coeficiente de partición
cuyo valor esta condicionado, para cada elemento fecal, por su
balance hidrófílo-lipófílo. Es decir los elementos cuyo balance
hidrófílo-lipófílo se decantan a favor de los grupos hidrófilos se
encuentran en la fase acuosa y se depositan en el fondo del
tubo de centrífuga. Por el contrario, si el balance es a favor de
los grupos lipófílos, el elemento queda en contacto con la capa
de éter y participa en la construcción del anillo que se forma en
la interfase agua-éter. El equilibrio hidrófílo-lipófilo de cada
partícula fecal (parásitos o restos) no es fijo; aunque los
parásitos tienen generalmente afinidad acuosa.
2.1.- TÉCNICA DE FORMOL-ETER (RITCHIE).
Líquidos de dilución
Solución salina 0,85%
Formol salino al 10% ó 7 %
Eterdietílico.
Procedimiento
1.- En un envase de capacidad de 25 a 50 ml, agregar 2 gr. de
heces.
2.- Adicionar 10 ml de solución salina fisiológica ó agua.
Homogenizar con ayuda de dos aplicadores. El empleo de
solución salina en este lavado inicial es a fin de resguardar la
integridad física de las formas evolutivas de Blastocystíshominis,
que en presencia del agua se destruyen.
3.- Filtrar a través de una gasa (una o dos capas). Transferir el
filtrado a un tubo calibrado de centrífuga de capacidad 15 ml.
4.- Centrifugar a 2500 rpm. por 1 minuto. Desechar el
sobrenadante. Debe quedar en el tubo un sedimento de 1 a1.5
mi. Si el sedimento es mucho más abundante o mucho más
escaso, se ajusta hasta tener la cantidad deseada.
o Cantidad excesiva.
Se vuelve a suspender el sedimento en solución salina (ó agua)
y se desecha parte de él. Por ejemplo, si se ha obtenido dos
veces mas sedimento que el deseado, se vierte la mitad o un
poco menos de la suspensión. Se vuelve a añadir solución salina
(o agua) hasta devolver el nivel del líquido a unos 10 ml y se
centrifuga de nuevo.
o Cantidad escasa.
Se vierte el líquido sobrenadante, y se filtra otra porción de
suspensión inicial de heces en un tubo. La cantidad que se filtra
se calcula a partir del sedimento obtenido la primera vez; o sea,
si la primera centrifugación produjo aproximadamente la mitad
de la cantidad necesaria, se volverá a filtrar en el tubo otros 10
ml. Se centrífuga de nuevo.
No es necesario tener cantidad exacta de sedimento en el tubo;
pero debe encontrarse entre los límites señalados antes.
Demasiado sedimento, o escaso, producirá un método de
concentración con malos resultados.
5.- Puede repetirse el lavado en caso de muestras con
abundantes residuos.
6.- Añadir al sedimento 10 ml de formol salino al 7 %.
Resuspender el sedimento con un aplicador y dejar en reposo
por 5 minutos.
7.- Adicionar 1.5 ml de éter dietético. Tapar el tubo con tapón y
agitar fuertemente durante 30 segundos. Quitar el tapón con
cuidado.
8.- Centrifugar a 2000 rpm durante 1 min. Se forman cuatro
capas: capa de éter, tapón de restos fecales, capa de formol y
sedimento. (Fig. 5-2)
9.- El tapón de restos se desprende con la ayuda de un
aplicador. Se descartan las tres capas superiores.
10.- El sedimento restante se mezcla con la pequeña cantidad
de líquido que se resbala por las paredes del tubo. Se vuelcan
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dos gotas sobre un portaobjeto, una se cubre con un
cubreobjeto y a la otra se le agrega colorante de lugol antes de
colocarle el cubreobjeto.
11.- Examinar al microscopio.
Resultados
Este método de concentración resulta eficaz para obtener
quistes de protozoarios y huevos (livianos y pesados) y larvas de
helmintos. También permite recuperar ooquistes de
Cryptosporidium sp. Cystoisospora belli.
2.2.- TÉCNICA DE FORMOL -ETIL-ACETATO
Líquidos de dilución
Solución salina 0,85%
Formol salino al 7 ó 10%,
Etil - acetato
En cuanto al procedimiento es similar al de Ritchie
(formol-éter); sólo se diferencia por la sustitución del éter por
etil-acetato, el cual es un reactivo menos tóxico, menos volátil,
más económico y de fácil adquisición en el mercado. Recupera
huevos (livianos y pesados) y larvas de helmintos; quistes y
trofozoitos de protozoarios.
2.3.- TÉCNICA DE SCHAUDINN.
Líquidos de dilución:
o Solución salina,
o Solución de Shaudinn (2 volúmenes de una solución
saturada de bicloruro de mercurio, con un volumen de
alcohol etílico al 95%).
o Eterdietílico.
El procedimiento es similar al de Ritchie (formol éter); sólo se
diferencia por la sustitución de la solución de formol-salino al
7% por la solución de Schaudinn. Permite recuperar huevos
(livianos y pesados) y larvas de helmintos; quistes y trofozoitos
de protozoarios. La identificación de los trofozoitos se efectúa
posteriormente mediante una coloración temporal como la de
Nair o permanente como la de hematoxilina férrica.
TÉCNICAS DE RECUENTO DE HUEVOS
UTILIDAD DE LAS TECNICAS DE RECUENTOS DE HUEVOS.
Numerosas investigaciones se han realizado para determinar y
demostrar cuan importantes son estas técnicas para medir la
intensidad de la infestación geohelmíntica en un individuo o
una comunidad, medir la efectividad de los diferentes
antihelmínticos y desde el punto de vista epidemiológico, pues
permiten un mejor control quimioterapéutico.
Sin embargo, las Técnicas de Recuento de Huevos presentan
ciertas limitaciones, como por ejemplo: No existe una relación
lineal entre número de adultos y la producción de huevos,
existe variabilidad en el número de huevos por gramo de heces
entre días; todo esto debido quizás a las fluctuaciones en el
número de huevos eliminados o expulsados, a la cantidad de
heces evacuadas por día o quizás por la distribución de los
huevos en las heces.
Dentro de estas técnicas se encuentran:
- Frotis standarizado o Beaver.
- Frotis directo sin standarizar.
- Mc. Master
- Stoll
- Shore-Lynch
- Kato-Katz
- Kato-Miura.
Al final de cada técnica, para obtener el número de huevos por
gramo de heces, se multiplica el número de huevos contados
por uno o dos factores, que provienen de la misma técnica o de
la consistencia de las heces.
1.- TÉCNICA DE FROTIS ESTANDARIZADO O BEAVER.
Se fundamenta en la preparación de un examen al fresco,
exactamente con 2mg. de heces estandarizados. Para su
ejecución necesita de un fotómetro o medidor fotoeléctrico de
intensidad luminosa, el cual será utilizado para la calibración o
estandarización, conjuntamente con una suspensión de Sulfato
de Bario, como patrón a una dilución de 1 / 500.
Fórmula:
Nº DE HUEVOS X 500 = Nº TOTAL DE HUEVOS/GRAMO DE
HECES
El patrón de Sulfato de Bario se prepara de la siguiente forma: 1
parte de Cloruro de Bario más 3 partes de Sulfato de Sodio, para
obtener una dilución de 1/500.
Para obtener el número total de huevos por gramo de heces
(h.p.g.), se multiplica el total de huevos contados por 500. Esta
fórmula debe ser aplicada a cada una de las especies de
geohelmintos encontrados.
Ventajas de la Técnica:
- Los resultados son más exactos
- Utiliza poca cantidad de muestra
- No toma en cuenta la consistencia de las heces
Desventajas:
- El fotómetro requerido es costoso y difícil de conseguir en
el mercado.
- La medición es afectada por las variaciones de la
electricidad.
2.- TÉCNICA DE FROTIS DIRECTO SIN ESTANDARIZAR
Es la técnica más sencilla, aunque también la menos exacta.
Consiste en la realización de un examen al fresco con solución
salina fisiológica al 0.85% que contenga entre 1.5 — 2 mgs. de
heces. El recuento se hace recorriendo toda la preparación.
Para obtener el número total de huevos por gramo de heces
(h.p.g.), se multiplica el número total de huevos contados por
750. Esta formula debe ser aplicada a cada una de las especies
de geohelmintos encontrados.
Fórmula:
Nº DE HUEVOS X 750 = Nº TOTAL DE HUEVOS/GRAMO DE
HECES
Ventajas
- Es sencilla, rápida y económica.
- Todos los materiales son accesibles. No toma en cuenta la
consistencia de las heces
Desventajas:
- La cantidad de muestra empleada no es exacta.
- Disminuye la posibilidad de detectar la presencia de
huevos.
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3.- TÉCNICA DE MC. MASTER 6.- TÉCNICA DE KATO-KATZ.

Esta técnica se fundamenta en un principio de flotación es decir
que utiliza una solución de alta densidad (Cloruro de Sodio
saturada), y los huevos de los geohelmintos, que
proporcionalmente son más livianos, van a la superficie.
Ventajas:
- Emplea 2grs. de heces
- No toma en cuenta la consistencia de las heces
- Se separan detritos grandes de los huevos a través del
tamizado
Desventajas:
- La cámara de Mc. Master es difícil de conseguir
- Pasado los 20 minutos los huevos pueden sedimentar
4.- TÉCNICA DESTOLL
Esta técnica se basa en el estudio de una cantidad conocida de
heces, que se diluye en un volumen determinado, es decir que
se basa en un principio de dilución.
Nº Total de huevos (h.p.g.) = Nº de huevos x 200 x F.C
Ventajas:
- Mide la cantidad de muestra utilizada
- La dilución se realiza en un volumen constante
- El NaOH al 0.1 N saponifica las grasas y libera los huevos
Desventajas:
- La cantidad de heces requerida es grande
- Toma en cuenta la consistencia de las heces
- Los resultados se obtienen a las 24 horas
Esta es la técnica más recomendable en la actualidad y la que
prefiere la O.M.S. Es una modificación de la técnica original
descrita en Japón en 1.954 por Kato y Miura que utilizaba el
procedimiento de pesar la muestra de heces usada para el
estudio. La técnica es sencilla, rápida, económica y eficaz,
especialmente si se desean resultados rápidos y confiables. Se
basa en un principio de clarificación.
Preparada la solución de Kato tomar frasco color ámbar, boca
ancha para uso y conservación de la solución (evitar su
decoloración por acción de la luz). Sumergimos en el frasco: uno
a uno los rectángulos de celofán previamente preparados
donde permanecerán, no menos de 24 horas antes de ser
usado.
Nº Total de huevos/ g de heces (h.p.g.)= N° de huevos
contados x 23
Ventajas
- Puede ser aplicada con facilidad el cualquier medio
- No toma en cuenta la consistencia de las heces
- Es utilizada como método de concentración (cualitativo)
- Es sencilla, rápida y económica
Desventajas
- No se recomienda para muestras diarreicas
- Obtención del papel celofán
- La muestra no queda uniformemente distribuida en el
portaobjeto

5.- TÉCNICA DE SCHORE-LYNCH. Reporte

Tiene el mismo fundamento que la técnica de Stoll, es decir se
basa en un principio de dilución. Se recurre a esta técnica
cuando en el laboratorio se realiza la técnica de Stoll, pero la
muestra que trae el paciente es pequeña (menos de 4grs.)
- Examinar con objetivo de 10 x en forma sistemática. Contar
todos los huevos presentes identificando la especie de
geohelminto.
- Una vez realizado el contaje se aplica la siguiente formula:
Una vez realizado el Recuento de Huevos de geohelmintos por
cualquiera de las Técnicas descritas anteriormente y obtenido el
Grado de Infestación según la Tabla seleccionada, se procede a
realizar el Reporte de la siguiente forma:
Nombre de la Técnica: Técnica de Kato-Katz.
“Se contaron 180.000 huevos de Trichuristrichiura /g. de heces”.
Grado de Infestación: Severo”. Según OPS. 1998 (publicado en
Botero y Restrepo)

Nº total de huevos / g. de heces (h.p.g.) = Nº de huevos TABLA PARA CALCULAR EL GRADO DE INFESTACIÓN
contados x 200 x FC Especie Leve Mediano Intenso
h.p.g h.p.g h.p.g.
Para realizar los cálculos se toma en cuenta la consistencia de la Ascarislumbricoides <5.000 5.001 > 50.000
muestra fecal al igual que para la técnica de Stoll los valores -50.000
son: Trichuristrichiura <1.000 1.001-10.0 > 10.000
- 1: Consistencia dura 00
- 2: Consistencia Formada
Ancylostomideos <2.000 2.001- > 4.000
- 3: Consistencia Blanda y Pastosa
4.000
- 4: Consistencia Liquida

Ventajas Tabla Nº 6-1

- Mide la cantidad de muestra utilizada, la cual es pequeña
(1 g.)
- La dilución se realiza en un volumen constante
- El NaOH 0.1 N saponifica las grasas y libera los huevos
Desventajas
- Toma en cuenta la consistencia de las heces
- Los resultados pueden o no obtenerse el mismo día
Tomado de: La publicación: Serie HCT/AIEP-16. E Lineamientos
para la evaluación de la geohelmintiasis y la esquistosomiasis
a nivel de la comunidad. Guía para el manejo der los programas
de control. A Montresor, D.W.T. Crompton, et al. Organización
Panamericana de la Salud, Washinton, 1998. Publicada en el
libro: Parasitosis humanas de David Botero y Marcos Restrepo
4ª Edición 2003.
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PRUEBAS COPROCUALITATIVAS
1.- GENERALIDADES SOBRE SANGRE OCULTA EN MUESTRAS
FECALES
La sangre en las heces es de suma importancia diagnóstica;
puede ser el único signo de padecimientos ulcerativos,
neoplásicos o inflamatorios del aparato digestivo. Para que se
produzca melena (sangrado profuso del tracto gastrointestinal
superior) son necesarios 100ml o más de sangre, provenientes
del tubo digestivo. La demostración química de cantidades
menores de sangre (sangre no visible macroscópicamente)
depende de la realización de técnicas para la demostración de
hemoglobina fecal. Entre las patologías que producen sangre
detectable en la muestra fecal tenemos:
1.1.- Causas que producen el sangrado gastrointestinal:
1.1.1.- Tracto gastrointestinal superior:
● Úlceras pépticas
● Lesiones agudas en mucosa intestinal
● Várices esofágicas
● Esofagitis
● Gastritis
● Úlceras duodenales
● Úlceras anastomótica
1.1.2.-Tracto gastrointestinal inferior:
● Lesiones ano-rectales
● Lesiones neoplásicas del colon y del recto
● Colitis ulcerosa, bacteriana o isquémica
● Divertículos del colon
● Lesiones angiodisplásicas
● Pequeñas lesiones displásicas
En vista de las diferencias de origen del sangramiento, los
especialistas poseen diversas maneras de clasificar las
hemorragias gastrointestinales, entre ellas citaremos dos:
1.2.- Utilidad clínica de la prueba de Sangre Oculta:
Detectar la presencia de hemorragias gastrointestinales a través
de la muestra fecal.La mayoría de las pruebas existentes en el
mercado para detectar la presencia de sangre en heces,
presentan cierta inespecificidad, debido a que pueden dar
reacciones positivas debida a sustancias diferentes a
hemoglobina. Entre las sustancias que pueden interferir en la
determinación de sangre oculta, tenemos
1.3.- Elementos que causan falsos positivos:
● Peroxidasas de la dieta
● Medicamentos con Fe +
● Antiinflamatorios no esteroideos
● Aspirina
● Mioglobina, enzimas y hemoglobinas animales
● Sangre proveniente de cepillado de dientes
1.4.- Elementos que causan falsos negativos:
● Dieta rica en fibra
● Vitamina C
● Distribución no uniforme de sangre en las heces
En vista de la gran cantidad de sustancias que pueden interferir
en la determinación de la sangre oculta en heces, se sugieren
las siguientes recomendaciones para efectuar una correcta
recolección de las heces y así obtener resultados fidedignos en
el laboratorio.
1.5.- Recomendaciones para la recolección de la muestra fecal
a. Evitar el sangrado de las encías durante el cepillado de los
dientes (cepillado suave).
b. No se debe ingerir carnes rojas ni vegetales verdes,
remolacha, zanahoria, rábano y ciruelas pasas durante 3
días previos a la toma de la muestra. Puede consumir
carnes blancas (pollo o pescado) y alimentos tales como:
papas, queso, huevo, fideos, arroz, pan.
c. La muestra debe ser espontánea (tomada sin esfuerzo para
defecar) y no contaminada con orina o sangre menstrual.
d. No debe ingerir medicamentos con hierro, vitamina C,
antibióticos, aspirina, anti-inflamatorios, etc.
1.6.- TÉCNICAS PARA SANGRE OCULTA
1.6.1.- Técnica De Thevenon-Roland
Fundamento
El grupo Hem de la hemoglobina actúa como una peroxidasa,
desdoblando el H2O2 en H2O y O2; este último al liberarse es
capaz de oxidar una sustancia reducida (piramidón), la cual al
oxidarse produce un cambio de color a azul violeta.
Procedimiento:
1. Se emulsiona 1 mg de heces en 5 ml de agua del chorro
(suspensión de heces diluida).
2. Se distribuye en dos tubos, rotulados como Control - y
Muestra.
3. Para preparar el Control+ se adiciona una gota de sangre
en 2,5 ml de agua del chorro.
4. Agregar a todos los tubos (M, C+, C-) tres (3) gotas de ácido
acético glacial y 2,5 ml de solución alcohólica de piramidón
al 5%.
5. Al tubo Muestra y al tubo Control+, adicionar 0,5 ml de
Agua Oxigenada (H2O2) de 20 vol.
6. Mezclar suavemente.
Lectura:
Al cabo de un minuto, observar la presencia de color azul
-violeta.
Reporte:
Traza (morado claro),
Positivo (morado de variada intensidad que se puede
reportar por cruces) y
Negativo (sin cambio de color).
1.6.2.- Kits Comerciales:
Existen en el comercio una amplia variedad de kits para la
detección de sangre oculta, que tienen el mismo fundamento
de la prueba con piramidón, pero que utilizan otro reactivo
indicador, por ejemplo:
1.6.2.1.-
Hematest: Utiliza Benzidina
HemaScreen y Dencocoult: Utilizan el reactivo de Guayaco
Estas técnicas aunque son más rápidas y fáciles de realizar,
tienen la desventaja de que al poseer una fase sólida donde se
aplica la muestra, puede no existir una buena dispersión de la
hemoglobina en dicha fase y en consecuencia una escasa
reacción con el resto de los reactivos.
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1.6.2.2.- Método Inmunocromatográfico
Fundamento:
La hemoglobina humana reacciona con un conjugado formado
por partículas coloreadas de azul y cubiertas con anticuerpo
monoclonal contra la hemoglobina humana. El complejo
inmune así formado migra a la zona de la prueba donde es
capturado por un segundo anticuerpo dirigido en contra de la
hemoglobina formando una línea azul que indica la positividad
de la prueba. Las partículas azules que no reaccionan, se unen
en una segunda línea, a un anticuerpo-anticonjugado
inmovilizado.
En nuestro país se consigue comercialmente con el nombre de
HEXAGON OBTI- TEST de la casa HUMAN (se anexa separata de
dicha técnica). Esta técnica presenta la ventaja de que el
paciente no necesita hacer la dieta previa, en vista de la gran
especificidad de la prueba, además de la alta sensibilidad de la
misma.
2.- GENERALIDADES DE AZÚCARES REDUCTORES
2.1.- Metabolismo de los carbohidratos
Los almidones constituyen la principal fuente de hidratos de
carbonos para el hombre. Entre el 50 y 90% de los hidratos de
carbono que se consumen proceden de los granos, vegetales y
legumbres, tales como arroz, trigo, maíz y papas, en los que
están en forma de almidón. Otras fuentes importantes de
hidratos de carbono incluyen las frutas que tienen un alto
contenido de glucosa, fructosa y pentosas; la leche y los
productos lácteos, que contienen lactosa, y la caña de azúcar y
la remolacha que constituyen la principal fuente de sacarosa.
Estos hidratos de carbono una vez ingeridos, son transformados
todos ellos en glucosa para poder ser transportados a través de
la mucosa intestinal y llegar a la sangre y tejidos, donde se
constituye en el combustible predominante. El proceso de
transformación de los poli y disacáridos en el intestino ocurre
como sigue:
2.2.- Utilidad clínica:
La prueba de azucares reductores permite el diagnóstico de
trastornos en el metabolismo de los carbohidratos, tales como:
Trastornos enzimáticos (déficit total o parcial de alguna de las
disacaridasas intestinales)
Intolerancia a la lactosa
● Congénita
● Deficiencia primaria o secundaria
Intolerancia a la sacarosa
● Trastornos de digestión y absorción
● Mala absorción de monosacáridos
Una deficiencia hereditaria o adquirida de lactasa, sacarosa o
maltasa origina la discapacidad para degradar el disacárido
respectivo y de ahí absorción deficiente del monosacárido. La
más frecuente es la deficiencia de lactasa, manifestada por
fermentación bacteriana de lactosa no degradada y la
producción de ácido láctico y de otros ácidos orgánicos en la luz
intestinal. Estos aumentan la carga osmótica, que da por
resultado diarrea, cólico abdominal y flatulencia. Este trastorno
suele manifestarse con la ingestión de leche y sus derivados. El
control de esos estados requiere eliminar de la dieta el
disacárido que lo provoca.
Existen ciertas sustancias que interfieren en la prueba de
Benedict para azucares reductores, denominados falsos
positivos, por lo que el paciente debe evitar el consumo de
éstos antes de la realización de la prueba:
a. Ácido ascórbico (vitamina C)
b. Aminoácidos
c. Ácidos gentísico, homogentísico e hipúrico
d. Antibióticos: Cloranfenicol, Cefalosporinas, ¡soniacida,
penicilina,
e. Tetraciclina, sulfonamidas y estreptomicinas.
2.3.- Técnicas Para Azúcares Reductores
2.3.1.- Técnica de Benedict
Fundamento
Los azúcares reductores (glucosa, fructosa y galactosa) bajo la
acción del calor, reducen los iones de cobre presentes en el
reactivo de Benedict, lo cual se evidencia por un color del
reactivo hacia tonos amarillo-ladrillo.
Procedimiento
1. Preparar una suspensión de heces, adicionando 1 mg de
heces aproximadamente en 5 ml de agua destilada.
2. Centrifugar a 1000 rpm por 5 minutos.
3. Trasvasar 4 ml del sobrenadante a otro tubo.
4. Rotular 3 tubos de ensayo como Muestra, Control
Positivo y Control Negativo.
5. A cada tubo, agregar 3 ml del reactivo de Benedict.
6. En los tubos Control Negativo y Muestra agregar a cada
uno, 2 ml del sobrenadante de la centrifugación.
7. Al tubo Control Positivo, agregar 2 ml de una solución
glucosaza al10%.
8. Colocar los tubos Control Positivo y Muestra en baño de
María hirviente durante 10 minutos.
Lectura: Comparar los cambios de color observados en el tubo
muestra, con respecto a los Controles.
Reporte
-. Trazas (color amarillo-verdoso)
-. Positivo (color amarillo-ladrillo, que puede ser reportado en
cruces según la intensidad del color).
-. Negativo (sin cambio de color).
2.3.2.- Tabletas Clinitest
Fundamento
Reacción que se basa en la reducción del cobre por parte del
azúcar que se determina en forma semicuantitativa:
Niveles de azúcar en heces de 0.0%, 0.25%, 0.5%, 0.75%, 1.0%,
2.0% y mayores.
3.- DETERMINACIÓN DE pH
La reacción y pH de la muestra fecal es relativamente variable,
pues está condicionada por la naturaleza química de los
alimentos que ingerimos y otros elementos. En términos de pH
generalmente esta alrededor de 7.0-7.5. Sin embargo una
ingestión abundante de lactosa puede producir un pH bajo
(reacción ácida), en diarreas por bacterias invasivas,
generalmente es ácido (menor de 6.0); en diarreas de origen
tóxico, es neutro y en diarreas virales, siempre es ácido. Cuando
se efectúa la prueba de azucares reductores conjuntamente
debe efectuarse la prueba de pH.
3.1.- Utilidad clínica:
Permite el diagnóstico de:
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a. Acumulo de azúcares reductores
b. Dispepsias de fermentación
c. Dispepsias no ulcerosas
d. Insuficiencia gástrica
e. Esprue
f. Medicamentos (Ej: Acarbosa)
3.2.-Técnica para la determinación de pH.
3.2.1.- Prueba pHidrión.
Fundamento
La presencia de diferentes sustancias en las heces, conllevan a
una disminución o aumento del potencial de hidrogeniones en
la misma, lo cual se determina por tiras de medición de pH
produciéndose un cambio de color, que indicará los valores
aproximados de éste al comparar con una escala de valores.
Procedimiento:
Destapar la caja de heces e introducir un fragmento de la
tira de pH-idrión.
1. Tapar de nuevo.
2. Esperar 10 minutos o hasta que se humedezca la tira.
3. Remover la tira con ayuda de una pinza o leer "in situ"
el cambio de color presente en la tira.
Lectura
Comparar el color de la tira con la escala de colores del equipo
pHidrión y reportar el valor observado.
Relación con la prueba de Azúcares Reductores
La presencia de azúcares reductores en las heces generalmente
conlleva a una disminución del pH debido a producción de
ácidos por metabolismo fermentador de las bacterias
intestinales a partir de los carbohidratos; por lo cual al utilizar
una tira de medición del potencial de hidroge-iones ésta indica
valores de pH < 6.0.
4.- GENERALIDADES DE GRASAS TOTALES
La grasa en poca cantidad es un componente normal de las
heces, ya que luego de su metabolismo (se anexa esquema) se
mantienen en la luz intestinal pequeñas gotas de grasa. Debido
a ello para detectar un aumento o disminución apreciable de las
mismas deben efectuarse técnicas semi-cuantitativas o
cuantitativas especificas.
4.1.- Utilidad clínica:
Diagnóstico de las Ésteatorreas: aumento desproporcionado de
la cantidad de grasa en las heces, que le confiere a la muestra
un color blanquecino, aumento del volumen y un aspecto
espumoso.
4.2.- Tipos de Ésteatorreas:
4.2.1.- Esteatorreas patológicas:
- Insuficiencia pancreática de lipasa (Fibrosis
quística-Pancreatitis crónica)
- Insuficiencia biliar
- Alteración de la mucosa intestinal
- Hipermotilidad intestinal (provoca aumento de grasas
neutras)
- Parasitosis (giardiasis, strongiloidiasis y coccidiosis
intestinales)
- Lupus Eritematoso Sistémico
4.2.2.- Esteatorreas normales:
- Dieta rica en grasa (provoca aumento de grasas
neutras)
- Dieta casi o totalmente láctea (niños menores de seis
meses)
4.3.- Recomendaciones Para La Toma De Muestra Para
Determinación De Grasas Totales
a. Obtener la muestra de forma espontánea, sin la
utilización de enemas ni laxantes grasosos (en tal caso,
usar laxantes salinos).
b. El médico debe suministrar al paciente una dieta que
no exceda de 100 gr de grasas para la alimentación del
día anterior a la recolección de la muestra.
c. Tomar la muestra en envase limpio, exento de grasas
(Ej: envases de Vick- Vaporub).
4.4.- Técnicas Para Grasas Totales
4.4.1.- Técnica de Saathoff (Sudán III)
Fundamento: Las grasas totales (grasa neutra, ácido grado,
jabones) al reaccionar con el reactivo de Saathoff se tiñen de
color rojo brillante y adquieren la forma redondeada al fundirse
por el calor (jabones y ácidos grasos).
Procedimiento:
1. Colocar 1 gota de solución salina fisiológica en la lámina
porta-objeto.
2. Agregar de 3 a 4 gotas de reactivo de Saathoff.
3. Hacer una emulsión con 1 mg de heces.
4. Cubrir con laminilla.
5. Colocar sobre mechero hasta que emita vapores, sin dejar
secar la preparación.
Lectura: Observar con objetivo de 40x el número de gotas rojas
brillantes por campo en aproximadamente 20 campos.
Reporte:
Negativo: de 0 a 10 gotas por campo.
Positivo: más de 10 gotas por campo.
4.4.2.- Técnica de Lorish
Fundamento: Se basa en que las grasas desdobladas (ácidos
grasos y jabones) y las grasas sin desdoblar (grasas neutras) al
estar en contacto con el reactivo de Lorish (sulfato de azul de
nilo) adquieren un color característico que las diferencia a unas
de otras.
Resultado
Grasas neutras: gotas color rosado.
Ácidos grasos: gotas color azul.
Jabones: gotas color gris azulado.
5.- GENERALIDADES DE PIGMENTOS BILIARES
El color característico de la muestra fecal (marrón-pardo) se
debe a la presencia del pigmento denominado ESTERCOBILINA,
el cual se forma a nivel intestinal como producto del
metabolismo de la bilirrubina y de las bacterias intestinales (se
anexa esquema). De alli se deriva que este es el color normal
presente en la muestra fecal de todos los individuos (excepto
lactantes) y la ausencia del mismo indica alguna patología.
5.1.- Utilidad clínica:
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- Diagnóstico de obstrucción del colédoco.
- Diagnóstico de litiasis biliar.
- Descarte de contaminación fecal de fluidos biológicos.
- Diagnóstico de enfermedad hepática.
-.Caso fisiológico (presencia de otros pigmentos ej:
Leucoestercobilina).
5.2.- Determinación de Estercobilinógeno o estercobilina
(Prueba de Erlich).
Fundamento:
El estercobilinógeno presente en la muestra, reacciona en un
medio ácido con el reactivo de Erlich, produciendo un complejo
coloreado de color rojo intenso.
Procedimiento:
1. Adicionar a 2 gr de heces, de 5 a 10 ml de acetona.
Mezclar y filtrar sobre papel Whatman.
2. Adicionar más cantidad de acetona, hasta que el filtrado
salga completamente claro.
3. Extender el papel Whatman con la materia fecal sobre
papel toallín y dejar secar.
4. Trasvasar, a un tubo de ensayo, la materia fecal (seca).
5. Adicionar 6 gotas de ácido acético glacial, 6 gotas de
solución saturada de CINa y 3 ml de Éter dietílico.
6. Centrifugar a 2.500 rpm por 2 minutos.
7. Trasvasar el sobrenadante a otro tubo de ensayo.
8. Adicionar 0.5 ml de reactivo de Erlich.
9. Mezclar.
Lectura:
Observar la formación de un anillo rojo en la interfase de los
reactivos (Éter y reactivo de Erlich).
Reporte:
Presencia del anillo: Positivo.
Ausencia del anillo: Negativo
En el caso de que la prueba de Erlich dé un resultado negativo
deben emplearse las técnicas que a continuación se explican
para detectar si se trata de la presencia de un pigmento
diferente a la estercobilina o una real ausencia de pigmento en
la muestra fecal.
5.3.- Determinación de Bilirrubina, Biliverdina y Reporte:
Leucoestercobilina .
5.3.1.- Prueba de Schmidt (sublimado de Mercurio).
Fundamento:
Los pigmentos biliares reaccionan con el Bicloruro de Mercurio
produciendo complejos coloreados de diferente color,
dependiendo del pigmento presente. Se formará Bilirrubinato
de Mercurio (color verdoso) si existe Bilirrubina o Biliverdina en
la muestra; y Estercobilinato o Leucoestercobilinato de
Mercurio (color pardo) cuando esté presente la Estercobilina o
Leucoestercobilina en la muestra. En caso de Acolia (ausencia
de cualquier pigmento) no se observa formación de complejos
coloreados.
Procedimiento:
1. Preparar 15 mi de una suspensión de heces diluida (1
mg en 15 mi de agua en chorro).
2. Distribuir 7.5 ml en dos tubos: Control Negativo y
Muestra.
3. Agregar al tubo Muestra 2.5 mi de la solución saturada
de Bicloruro de Mercurio. Mezclar
4. Colocar ambos tubos en baño de María a 37° C por 10
minutos o hasta que ocurra cambio de color.
Lectura:
Observar la presencia de color pardo-rosado o verdoso en el
tubo Muestra.
Reporte:
-Color verdoso: presencia de Bilirrubina o Biliverdina.
-Color pardo: presencia de Estercobilina o Leucoestercobilina.
-Sin cambio de color: ausencia de pigmentos biliares (Acolia).
Reactivos empleados:
- Solución saturada de Bicloruro de Mercurio.
Preparación de reactivos:
- Solución saturada de Bicloruro de Mercurio:
Bicloruro de Mercurio........................ 11 gr
Agua destilada csp............................ 100 ml
Utilizar baño de agua caliente para disolver los cristales en el
agua, luego seguir agregando Bicloruro hasta que no se disuelva
más. Dejar enfriar y filtrar.
5.3.2.- Prueba de Grigaut
Fundamento
Los pigmentos biliares al reaccionar en el medio ácido con el
percloruro férrico, producen un complejo coloreado
dependiendo del pigmento presente.
Procedimiento:
1. Agregar 1 mg de heces a 10 ml de agua del chorro.
2. Rotular dos tubos de ensayo como Control y Muestra.
A cada tubo agregar 5 ml de la suspensión
anteriormente preparada.
3. Añadir 5 ml de HCI concentrado a cada tubo
4. Incubar los tubos a 50° C por 5 minutos.
5. Agregar 0.5 ml de Percloruro férrico al tubo Muestra.
Lectura:
● Observar la presencia de un color pardo-rosado o
verdoso en el tubo “Muestra”.
● Color verdoso: presencia de Bilirrubina o Biliverdina.
● Color pardo: presencia de Estercobilina o
Leucoestercobilina
● Sin cambio de color: ausencia de pigmentos biliares
(Acolia).
Reactivos empleados:
Ácido Clorhídrico concentrado.
Solución de Percloruro de Hierro 0.5%.
Preparación de reactivos:
Solución de Percloruro de Hierro al 0.5%:
Percloruro férrico............................... 5 gr
Agua destilada csp............................ 100 ml
DIAGNOSTICO DE PALUDISMO
El diagnóstico definitivo de la Malaria debe basarse en criterios
clínicos, apoyados por la confirmación de la parasitemia en el
laboratorio. Durante décadas, la observación microscópica de
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extendidos y gotas gruesas sanguíneas, fue la única
metodología utilizada en su diagnóstico.
Los métodos parasitológico directos se basan en la
demostración del agente etiológico en sangre periférica y
tejidos; en lo que se concierne al diagnóstico de Paludismo, éste
se ejecuta de la siguiente manera:
1. ANÁLISIS DE LA MUESTRA SANGUÍNEA.
1.1. Extracción de la muestra sanguínea: Se recomienda durante
el periodo febril de la enfermedad, aunque la búsqueda de
parásitos circulantes puede hacerse en cualquier momento.
Esta puede hacerse por Punción capilar o venosa.
a. En caso de punción capilar: Se recomienda pinchar el borde
del lóbulo de la oreja, de la yema de los dedos y en el caso de
los lactantes en el talón, previa desinfección con alcohol. La
punción debe ser profunda para que la sangre salga sin
compromiso. Se desecha la primera gota.
b. En caso de punción venosa: Se recomienda utilizar como
anticogulante citrato de sodio al 3.8 % y sólo para
procedimientos de concentración.
1.2. Elaboración del Extendido y Gota gruesa: El extendido
permite estudiar el parásito dentro del glóbulo rojo y establece
el diagnóstico por especie. La gota gruesa facilita el diagnóstico
de la infección malárica. Especialmente cuando los parásitos
son escasos en sangre. La gota gruesa reúne en un espado
relativamente pequeño, una mayor cantidad de sangre.
1.2.1. Confección del Extendido:
Para tal fin existen varios métodos:
a. Método del portaobjeto y cubreobjeto: Sobre un portaobjeto
limpio y desgrasado (sin rayaduras) y a distancia de 1 cm. De
uno de sus extremos, se pone una gota de sangre obtenida por
punción y sobre ella se coloca el cubreobjeto con una
inclinación de 45°, en el mismo punto donde se encuentra la
gota de sangre; esperar que esta gota corra por capilaridad a
todo lo largo del borde o arista del cubre, apoyando
suavemente de manera que la sangre se extienda en capa
delgada y uniforme por detrás del cubreobjeto. Lo esencial es
hacer correr el cubre sin detenerlo al efectuar la extensión/ la
cual deberá hacerse en un solo tiempo.
b. Método de los cubreobjetos de Ehrilich: Este método
necesita una gran práctica para obtener buenos resultados. Se
toma gotade sangre con un cubreobjeto y se le coloca con el
lado manchado hada abajo sobre otro cubre igual; si la gota no
es demasiado voluminosa y los dos cubres están perfectamente
limpios, la sangre se extiende en capas finas. En el momento en
que deja de extenderse y antes de que empiece a coagular, se
separan rápidamente los cubre tirando con fuerza de ellos en
un plano paralelo a su superficie.
c. Método de los portaobjetos: La técnica es igual a la del
método descrito en la parte a con la única diferencia de que en
vez de utilizar un cubreobjeto para hacer el extendido se utiliza
un portaobjeto. Este método es el más utilizado por la facilidad
que presenta su ejecución
No está indicado preparar un frotis sanguíneo con una muestra
de sangre recogida con oxalato. Es mejor practicar la extensión
de una gota de sangre recién extraída, y reservar la sangre
oxalatada para los otros exámenes. Si se quiere obtener buenos
resultados, es absolutamente esencial trabajar con extensiones
de sangre bien hechos.
Errores que se presentan frecuentemente en la elaboración del
Extendido:
Si la gota de sangre es muy grande, aquel llegará hasta los
bordes de la lámina y quedará muy grueso. Si la gota es muy
pequeña el extendido quedará estrecho y corto. Si el
movimiento de extensión de la sangre se realiza en forma
intermitente, el extendido quedará con partes más densas que
otras (forma en escalera). Si la lámina no esta libre de grasa,
aparecerán áreas donde no se adhiere la sangre al cristal
apareciendo los llamados "ojos".
1.2.1.1. Fijación del Extendido: Es preciso fijar los extendidos
sanguíneos antes de teñirlos para asegurar una buena
distinción. Recubrir los frotis con alcohol metálico, el cual se
dejará actuar por espado de 2 a 3 minutos; a falta de metanol,
utilizar alcohol etílico durante 20 minutos. Los colorantes que
están disueltos en alcohol metílico, combinan el fijador con el
proceso de tinción.
1.2.1.2. Coloración de Extendido: Para evitar fracasos, se
tendrán en cuenta al teñir las siguientes indicaciones: la mejor
tinción se obtiene con solución buffer ph 7.2, en un tiempo
medio. La soluciones acidas acentúan el efecto de la eosina,
pero anulan la metacromasia del azul; las alcalinas la refuerzan,
pero atenúan considerablemente la tonalidad de la eosina; para
diluir la solución colorante debe emplearse solución buffer ph
7.2 ó agua recién destilada y hervida; a menudo el agua
corriente no sirve por su contenido de sales. La neutralidad
apropiada es ph 7,2.
a. Colorante de Wright.
Técnica para la coloración:
a. Colocar el extendido ya seco en una bandeja de coloración.
b. Cubrir el extendido con el colorante sin diluir durante 1
minuto.
c. Diluir después del minuto, añadiendo igual cantidad de agua
destilada y ajustada a ph 7,2; se obtiene así una superficie de
brillo metálico.
d. Dejar actuar un tiempo variable que oscile entre 3 y 5
minutos.
e. Lavar vigorosamente con agua destilada.
f. Dejar secar y examinar microscópicamente con objetivo de
inmersión (100 x).
b. Colorante de Giemsa.
Técnica para la coloración:
a. El extendido completamente seco, se fija durante 30 minutos
con etanol absoluto, o durante 5 minutos con alcohol metílico
anhidro. Si la fijación se hace en menos de medio minuto hay
peligro de hemolisis ulterior y si tarda más de 5 minutos, la
coloración de extendido debe durar más de 45 minutos.
b. Se tíñe con una dilución recién preparada de solución de
Giemsa (1 ó 2 gotas del colorante Giemsa puro por cada mi de
solución buffer ph 7.2 ó vagua ligeramente alcalina) por espacio
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de 45 ó 30 minutos. En caso de utilizar una gota del colorante
puro para la solución de trabajo, dejar actuar 45 minutos.
Cuando se emplean dos gotas dejar 30 minutos.
d. El extendido se lava con agua corriente, se deja secar al aire y
se observa al microscopio con objetivo de inmersión (l00x).
1.2.2. Confección de la Gota Gruesa
Técnica para su elaboración:
a) Una vez realizada la punción se recibirán de 3 a 4 gotas de
sangre en el centro de la superficie de la lámina portaobjeto.
b) Unir las gotas por medio de la esquina de la otra lámina ó de
la lanceta empleada en la punción y extenderlas ligeramente,
imprimiéndole movimientos de rotación hasta que la porción de
sangre llegue al tamaño de una moneda de 250 cts.
c) Conviene festonear ligeramente los bordes de la preparación
para que la sangre se adhiera mejor al vidrio y no se desprenda
con el lavado. La preparación se dejará secar colocando la
lámina horizontalmente al abrigo del polvo y de insectos.
Esperar 1 hora como mínimo. En caso de gotas gruesas muy
densas (exceso de sangre) o no recientes (más de 18 horas) se
recomienda deshemoglobinizar.
1.2.2.1. Deshemoglobinización.
Técnica:
a) Colocar en un beaker de 100 ce, agua corriente en cantidad
suficiente para cubrir la gota gruesa.
b) Introducir en él, vertícalmente la lámina con la gota gruesa
seca, debiendo ésta quedar complemente cubierta por el agua
destilada para la deshemoglobinización. El tiempo es variable,
dependiendo del tiempo de ejecución y grosor de la gota
gruesa.
c) Sacar la lámina y dejarla secar.
1.2.2.2. Coloración de la gota gruesa
a) Con Giemsa:
1. Sin fijar la preparación, cubrirla con el colorante de Giemsa,
previamente diluido en la proporción de una gota por cada ml
de agua destilada, ó solución buffer ph 7.2. Dejar el colorante
durante 45 minutos.
2. Lavar cuidadosamente para evitar el desprendimiento de la
gota de sangre.
3. Dejar secar la preparación y examinar con lente de inmersión
(100 x).
b) Con Wright:
1. Debe deshemoglobinizarse la gota gruesa (Ver técnica de
deshemoglobinizar) pues el colorante tiene incorporado alcohol
metílico.
2. Dejar secar.
3. Cubrir la gota gruesa con el colorante puro durante 1 minuto.
4. Diluir después del minuto, añadiendo igual cantidad de agua
destilada a ph 7.2. Dejar actuar durante 3 a 5 minutos.
5. Lavar con agua cuidadosamente para evitar el
desprendimiento del material; preferiblemente sumergiendo
dos ó tres veces en un beaker que contenga agua.
6. Dejar secar y observar con objetivo de inmersión (100 x).
1.2.2.3.- Morfología de las Especies del Género Plasmodium.
(Bajo coloración de Giemsa y Microscopio óptico)
Plasmodium vivax
1. En sangre periférica se observan todas las formas de ciclo
eritrocitico: trofozoitos, esquizontes, merocitos y gametocitos.
2. Generalmente hematíes parasitados por un solo elemento.
(uniparasitado).
3. Hipertrofia del hematíe parasitado.
4. Hematíes con numerosas granulaciones rojizas
(granulaciones de Schuffner).
5. Trofozoitos ocupan 1/3 ó la 1/2 del glóbulo rojo, forma de
anillo, citoplasma azul, núcleo rojo.
6. Esquizontes ocupando casi todo el hematíe, forma irregular y
abundante pigmento en el citoplasma.
7. Merocitos con 12-24 merozoitos.
8. Microgometocito redondeado, núcleo alargado, citoplasma
azul pálido y pigmento diseminado.
9. Macrogametocito redondeado, núcleo grande y compacto,
citoplasma azul intenso; pigmento abundante y cercano al
núcleo.
Plasmodium falciparum
1. En sangre periférica se observan sólo trofozoitos jóvenes y
gametocitos.
2. Frecuentemente polipárasitismo (presencia de 2 ó 3 parásitos
en un mismo hematíe).
3. No hay hipertrofia del hematíe parasitado.
4. Escasas granulaciones de Maurer.
5. Trofozoitos ocupando 1/6 del hematíe, en forma de anillo,
citoplasma azul y núcleo rojo o violeta.
6. Esquizontes redondeados; diámetro igual al radio de un
hematíe, pigmento de granos pequeños y poco numerosos.
Estos sólo se observan en casos pre-agónicos de la enfermedad.
7. Merocitos con 18 a 24 merozoitos.
8. Microgametocitos fusiformes, citoplasma azul pálido, núcleo
grande y pigmento diseminado.
9. Macrogametocitos fusiformes, citoplasma azul violeta y
núcleo rodeado por el pigmento.
Plasmodium malarie
1. En sangre periférica se observan todas las formas del ciclo
eritrocitico.
2. Hematíes parasitados por un sólo elemento (Uniparasitismo).
3. No hay hipertrofia del hematíe.
4. Trofozoitos parecidos a los de P. vivax, mayor cantidad de
citoplasma, vacuola más pequeña y coloración más intensa.
5. Esquizontes pareados a los de P. vivax con tendencia a formar
franjas.
6. Merocitos con 6 a 12 merozoitos.
7. Microgametocitos con citoplasma azul claro, cromatína poco
abundante y pigmento diseminado.
8. Macrogametocitos con citoplasma azul intenso, cromatina
compacta y pigmento cercano al núcleo.
Plasmodium ovale
1. Hematíes parasitados ovalados y de bordes festoneados.
2. Ligera hipertrofia del hematíe parasitado.
3. Trofozoitos pareados a los de a P. vivax, con granulaciones de
Schuffner.
4. Esquizontes pareados a los de P. vivax, con granulaciones de
Schuffner.
5. Gametocitos parecidos a los de P. vivax, pero ovalados.
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1.3 Métodos de Concentración
Es posible efectuar dos técnicas de concentración. Para ambas,
como se requiere de un mayor volumen de sangre, ésta se
obtiene por venipuntura, empleando citrato de sodio al 3,8 %
como anticoagulante.
1.3.1. Técnica de Microhematocrito: La muestra se receje en
tubos capilares y se centrifuga a 2500 rpm. durante 4 minutos.
Se secciona el tubo en la interface de los glóbulos blancos y
hematíes. Se elaboran extendidos con el paquete de hematíes
de la capa superficial.
1.3.2. Técnica de Sedimentación: Se llena con la muestra de
sangre el tubo de Wintrobe y se deja sedimentar en reposo. Se
descarta por aspiración las capas de plasma y glóbulos blancos.
Se confeccionan extendidos con los hematíes de la capa
superior.
Solamente los eritrocitos parasitados por forma de trofozoitos
jóvenes no son aislados por estas técnicas, lo cual es un grave
inconveniente para el diagnóstico de P.falciparumo de las otras
especies en la fase inicial del ciclo.
1.3.3. Técnica del QBC (Cuantitativo BuffyCoatanalysis): Se basa
en la estratificación por centrifugación de las capas hemáticas y
la posterior búsqueda de los parásitos por la fluorescencia que
emiten con el colorante de acridina, el cual le da fluorescencia
al núcleo de los parásitos y de esta forma son observables al
microscopio con luz ultravioleta. (Ver secuencia anexa de la
técnica)
Procedimiento:
1. Llenar el tubo capilar con sangre obtenida por punción
capilar.
2. Colocar el tapón en un extremo del capilar e introducir el
flotador.
3. Centrifugar por 5 minutos.
4. Examinar el tubo con microscopio de fluorescencia. La
técnica de QBC no reemplaza a la técnica convencional del
extendido sanguíneo, pues no permite identificar especie pero
sirve como una prueba de descarte ya que es muy sensible.
Detecta 1 parásito por ul. Demanda menos esfuerzo que el
examen del extendido de sangre y es más rápido.
2. - INVESTIGACIÓN DE PLASMODIUM EN TEJIDOS.
Se utiliza en pacientes donde la investigación de Plasmodium en
sangre periférica resulta repetidamente infructuosa y sin
embargo persiste la sospecha clínica o epidemiológica de
Paludismo.
Los tejidos investigados son: hepático y esplénico.
La muestra se toma por punción biopsia, y con el material
obtenido se
practican frotis sobre portaobjetos que se colorean con
Giemsaó Wright
La observación microscópica pone de manifiesto el pigmento
malárico y formas evolutivas de Plasmodium.
La utilidad diagnóstica de esta prueba es pobre y en la práctica
no se recomienda ya que implica riesgo para el paciente.
3. INVESTIGACIÓN DE PLASMODIUM EN MUESTRAS DE
MÉDULA ÓSEA:
La muestra se colorea de igual forma que el extendido
sanguíneo.En la mayoría de los casos los elementos parasitarios
observados serán los mismos que se describieron en sangre. La
única particularidad, es la posibilidad de encontrar
esquizontesde P. falciparum.
4. EXTENDIDO DE SANGRE DE PLACENTA
La sangre intraplacentaria es sangre capilar profunda y contiene
por tanto la mismas formas evolutivas detectadas en sangre
periférica, además de esquizontes de P. falciparum. El interés
de este examen reside en la posibilidad de encontrar la causa
de un aborto.
5. OTROS MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO:
5.1. Investigación de Leucocitos Melaníferos
Es un método indirecto de diagnóstico.
a) Técnica: la búsqueda se hará en extensiones delgadas/ sobre
todo encías colas o sobre los bordes. Esta investigación puede
hacerse en la extensión de un concentrado leucocitario.
b) Resultado: En monocitos o macrófagos liberados del sistema
retículo- endotelial, así como en polimorfonucleares, pueden
observarse masas de pigmento castaño en partículas de tamaño
diferentes que están incluidas en pequeños vacuolas, o que
parecen mezcladas al citoplasma rechazando a veces el núcleo
hada un lado.
c) Valor diagnostico: si bien no permite afirmar con seguridad el
diagnóstico de paludismo, la presencia de leucocitos
melániferos en un individuo sospechoso de haber adquirido la
enfermedad es un buen argumento de probabilidad que incita a
proseguir las investigaciones.
5.2. Cultivo
El género Plasmodium es difícil de cultivar y hasta la fecha sólo
se ha cultivado exitosamente P. falciparum. El cultivo no se ha
utilizado con fines diagnóstico, sino para la obtención de
antígenos.
5.3.- Índices Epidemiológicos
Dos de estos índices son de gran utilidad: recuento de
gametocitos y recuento de parásitos del género Plasmodium. El
primero de éstos se efectúa básicamente para saber si el
paciente es un buen gametóforo y hay necesidad de aislarlo por
vivir en una zona endémica donde existe el transmisor. En tanto
el objetivo del recuento de parásitos es para saber si es un caso
clínico de resistencia al tratamiento. Cuando se sospecha de un
caso de P. falciparum producido por una cepa de resistencia, se
recomienda efectuar dicha técnica de recuento para hacerle
seguimiento al tratamiento.
La metodología en ambos casos se efectúa de forma similar.
5.4.- Técnica de recuento de gametocitos
1. Elaborar un extendido sanguíneo.
2. Colorear con Giemsa o Wright.
3. Contabilizar el número de gametocitos o parásitos (según sea
el caso), en los campos que ocupan 100 células blancas.
4. Efectuar un contaje de glóbulos blancos.
5. Establecer la relación por mm3 de sangre.
De igual forma se establece el número de parásitos que de
gametocitos por mm3 de sangre. El recuento de parásitos debe
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efectuarse cada 24 horas; la no variación en el recuento, tras Actualmente se está desarrollando otra técnica similar para P.
instalar el tratamiento y transcurridas 48 horas, evidencia un vivax, dictando una deshidrogenasa láctica como producto de
caso de resistencia al tratamiento. excreción.
Ahora bien, es necesario aclarar que la densidad parasitaria
depende de la especie de Plasmodium responsable y del 7. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR:
hospedero, es decir, de su estado físico (enfermedades A nivel experimental principalmente y ya en etapa de
asedadas, edad, nutrición) y de su estado de resistencia frente a evaluación de campo, se están utilizando este tipo de técnicas
la agresión parasitaria; por lo que un contaje aislado, no para el diagnóstico de la Malaria. Una de ellas utiliza sondas de
importa la cifra, no representa un caso de resistencia. DNA del parásito marcadas y producidas en el laboratorio, las
cuales se hibridizan específicamente con el DNA del parásito
P. P. vivax P. P. ovale contenido en la muestra de sangre problema. El resultado se
falciparum malarie visualiza revelando el marcador de la sonda.
Cantidad 100.000 30.000 5.000 1.000 Otra técnica empleada es la de Reacción en Cadena de la
Moderada Polimerasa (PCR), la cual permite mediante la amplificación de
Cantidad 1.860.000 96.000 114.000 100.000 cantidades pequeñas de DNA del parásito la detección de casos.
Maxima
Cuadro: 8-1 Número de parásitos por mm3 de sangre

6. DIAGNÓSTICO INMUNOLÓGICO:

a) Pruebas Serológicas: Se han utilizado diversas reacciones

para demostrar la presencia de anticuerpos, sin embargo esta
metodología no se emplea en el diagnóstico de rutina, sino para
estudios epidemiológicos. Los métodos serológicos más
empleados son: emaglutinación Indirecta, Inmunofluorescencia
y Elisa. Una eacción serológica positiva por cualquiera de estas
técnicas no es indicativa de infección activa.

b) Detección de Antígenos: Con los estudios que se han

realizado sobre el genoma del parásito, se ha logrado la
producción de antígenos puros de Plasmodium y la producción
de anticuerpos monoclonales, los cuales son empleados como
metodología diagnóstica.

Los avances rédenles permiten considerar la posibilidad de

complementar la microscopía óptica con una prueba
estandarizada de detección de antígenos, que emplea métodos
de producción de alta tecnología y aplicaciones sencillas.
Este grupo de técnicas evidencia antígenos de parásitos
circulantes o bien liberados por hemolisis en una muestra de
sangre.

Actualmente en el mercado se disponen de ciertas técnicas para

detectar P. falciparum. La técnica más frecuente de detección
de la mencionada especie se basa en la detección de una
proteina rica en histidina específica del parásito (PfHRPII); ya
que esta especie sintetiza varias proteínas que contienen gran
cantidad de histidina; a través de diferentes metodologías:
- Prueba de captura rápida de antígenos con tiras
reactivas
- ParaSight
- ICT Malaria

La prueba de captura rápida en tiras reactivas es rápida y de

fácil ejecución. La especificidad y sensibilidad de esta prueba en
relación con las pruebas patrón (extendido y gota gruesa) es
generalmente de 90%.