PHD Thesis - XXVIII

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ESCUELA DE DOCTORADO EN BIOLOGÍA
Sección: Biodiversidad y Análisis de Ecosistemas
XXVIII Ciclo – Curso Académico 2015/2016
Endocrinología reproductiva y fisiología del estrés en
iguanas terrestres de Galápagos
Endocrinologia riproduttiva e fisiologia dello stress nelle
iguane terrestri delle Galápagos
CANDIDATO Ph.D. ESTUDIANTE: Michela Onorati
TUTORES: Leonardo Vignoli, Mónica Carosi
COTUTOR: Gabriele Gentile
COORDINADOR ESCUELA DE DOCTORADO: Marco A. Bologna
Onorati M (2016). Endocrinología reproductiva y fisiología del estrés en
iguanas terrestres de Galápagos. Tesis doctoral. Departamento de Ciencias,
Universidad Roma Tre, Roma, Italia.
Michela Onorati
Departamento de Ciencias, Universidad Roma
Tre, Viale Marconi, 446, 00146 Roma, Italia. correo
electrónico: michela.onorati@uniroma3.it;
michelaonorati.mo@gmail.com
Defensa de tesis el 15 de febrero de 2016 ante el siguiente jurado:
Prof. Ferdinando Boero
(Università del Salento)
Prof. Giovanna Abbate
(Università Sapienza di Roma)
Prof. Romolo Fochetti
(Università della Tuscia)
Tu razón y tu pasión son el timón y las velas de tu alma marinera.
kahlil gibran
ÍNDICE
CAPÍTULO 1
Introducción general ………………………………………………...1
1) Multidisciplinar es la clave para la conservación………………..……. 1 2)
Endocrinología reproductiva y objetivos……………………………………..1 3) Fisiología
del estrés y objetivos…………………………………….……..3 Referencias
………………………………………………………………. 9
CAPITULO 2
Niveles plasmáticos de progesterona y estradiol y su relación con la reproducción en
iguanas terrestres de Galápagos, Conolophus marthae y Conolophus
subcristatus……………………………………………… 17
1) Introducción……………………………………………………..…...19 2) Materiales y
Métodos……………………………………………… …22 2.1) Declaración
ética………………………………………………..22 2.2)
Muestras……………………………………………………. 22 2.3) Análisis
ultrasónico…………………………………………...23 2.4) Ensayos
hormonales……………………………………………… 26 2.5) Análisis estadístico
…………………………………………….27 3)
Resultados…………………………………………………………………….27 3.1) Estado
reproductivo ………………………………………...27 3.2) Progesterona
(P4)…………………………………………..28 3.3) 17βestradiol
( E2)…………………………………………. 31 4)
Discusión…………………………………………………………... 32
Referencias………………………………………………………… ……... 37
CAPÍTULO 3
Relaciones entre los perfiles de leucocitos y la infección por hepatozoos en iguanas
terrestres de Galápagos, Conolophus marthae y Conolophus
subcristatus…………………………………………………………. 45
1) Introducción…………………………………………………….…....47
2) Materiales y Métodos……………………………………..…......50 2.1) Área de estudio
y especies……………………………………. 50 2.2) Toma de muestras y
extracción de sangre………………………….51 2.3) Fórmula leucocitaria y
detección de parásitos……… .…...51 2.4) Análisis estadístico…………………………
………………52 3) Resultados……………………………………………………………….53
3.1) Comparaciones interespecíficas (Volcán Wolf)……………… …53 3.2)
Comparaciones de sitios (C. subcristatus)…………………………...57 4)
Discusión………………………………………………………….. .58
Referencias…………………………………………………………. ..…...61
CAPÍTULO 4
Efectos de la infección y reproducción parasitarias sobre los niveles plasmáticos de
corticosterona en iguanas terrestres de Galápagos, Conolophus marthae y Conolophus
subcristatus……………………………………………… 71
1) Introducción………………………………………………………….73 2) Materiales y
Métodos……………………………………………………75 2.1 ) Declaración
ética………………………………………….…....75 2.2) Sitios de campo y sesiones
de muestreo………………………….75 2.3) Fase de campo……
…………………………………………... 76 2.4) Fase de laboratorio: análisis
hematológico………………. 77 2.5) Fase de laboratorio: análisis
hormonal……………….. …...77 2.6) Análisis
estadístico…………………………………………78 3) Resultados………………
………………………………………………….79 3.1) Corticosterona y
parasitemia………………………………79 3.2) Niveles plasmáticos de
corticosterona en mujeres……………… …..81 3.3) Niveles plasmáticos de
corticosterona y testosterona en hombres….. 84 4)
Discusión…………………………………………………………...85 Referencias…………
…………………………………………………... 89
CAPÍTULO 5
Conclusiones………………………………………………………….. 101
AGRADECIMIENTOS………………………………………….. 103
Endocrinología reproductiva y fisiología del estrés en iguanas terrestres de Galápagos 1
CAPÍTULO 1
Introducción general
1) Multidisciplinar es la clave para la conservación
Durante el siglo pasado, los procesos amenazantes, como las especies invasoras y las
enfermedades patógenas, han estado trabajando sinérgicamente para la pérdida de
biodiversidad (Brook et al. 2008). Los animales de vida libre deben luchar contra una
variedad de desafíos y alteraciones mediadas por el hombre que pueden causar
condiciones de alto estrés. La interrupción del comportamiento y la fisiología reproductiva
y la alteración de la aptitud de la población se encuentran entre las consecuencias más
hostiles del estrés prolongado. Por lo tanto, es necesario comprender si las poblaciones
de vida libre amenazadas se reproducen y responden a los cambios externos y cómo lo
hacen para determinar la vulnerabilidad y establecer prioridades de conservación. En
ese sentido, el uso de un enfoque integrador y funcional, dirigido también a la
comprensión de las dinámicas fisiológicas y endocrinas individuales, puede ayudar a
caracterizar y aliviar problemas que podrían amenazar a una especie, población,
comunidad.
La fisiología de la conservación es un campo importante en evolución de la ciencia de la
conservación que aprovecha este enfoque integrador (Wikelski y Cooke 2006). Los
biólogos de la conservación están utilizando progresivamente diferentes técnicas que
van desde la endocrinología hasta la fisiología del estrés, para desarrollar y elegir
soluciones.
Esta combinación de herramientas de conservación, con conocimientos complementarios
de la biología básica de los organismos, es fundamental para la seguridad de las
poblaciones tanto en cautividad como silvestres. La multidisciplinariedad es la clave
para una resolución más eficiente de los problemas de conservación. Por ello, en esta
ocasión cito a Wildt et al. (2003) quien afirmó: “la conservación puede compararse con
un rompecabezas complejo donde las piezas del rompecabezas son problemas, partes
interesadas o las propias disciplinas científicas”.
2) Endocrinología reproductiva y objetivos
La reproducción es la base sobre la que sobrevive una especie.
Comprender las complejidades de cuándo y cómo se reproducen los individuos es
fundamental para la perpetuación de las poblaciones naturales y su gestión futura. Por
lo tanto, el conocimiento sobre la reproducción
La endocrinología de una especie puede llenar un vacío importante en nuestra
comprensión del momento y las modalidades de reproducción. La endocrinología
reproductiva ofrece la posibilidad de comprender mejor los factores que afectan la
vitalidad de las especies, e incluso puede ofrecer señales de alerta temprana de un
riesgo antes de que las tasas de supervivencia o reproducción caigan en picado.
Gran parte de nuestro conocimiento de la endocrinología reproductiva de vertebrados
se ha recopilado a partir de estudios de mamíferos. De todos modos, existen suficientes
similitudes estructurales y funcionales entre mamíferos y no mamíferos para indicar
que muchos de los mecanismos que regulan la reproducción son probablemente
comunes a todos los vertebrados (Crews y Silver 1985).
La actividad reproductiva está asociada con una variación esencial en las
concentraciones circulantes de las principales hormonas esteroides sexuales:
progesterona (P4) y 17βestradiol (E2) (Jones y Guillette 1982; Crews y Silver 1985;
Norris y Lopez 2010). La medición de los niveles plasmáticos de estas hormonas
esteroides sexuales puede ser útil para rastrear los perfiles de hormonas reproductivas
de los animales de vida libre y esto podría ser crucial para la conservación de especies,
especialmente cuando las observaciones directas en el campo están fuertemente
limitadas por restricciones logísticas y programas de cría en cautiverio ex situ . puede
llegar a ser necesario. Este es el caso de dos especies de iguanas terrestres de
Galápagos que se encuentran en Volcán Wolf (Isla Isabela): Conolophus marthae y C.
subcristatus, entre las especies más representativas de las Islas Galápagos.
Conolophus marthae, la iguana terrestre rosada de Galápagos (también conocida
simplemente como iguana rosada), se describió recientemente (Gentile y Snell 2009;
Gentile et al. 2009) y figura como En Peligro Crítico en la Lista Roja de la UICN (Gentile
2012). Los datos actuales sugieren que esta especie vive, con una población
extremadamente pequeña, exclusivamente en la cima y a lo largo de las laderas
noroeste del volcán Wolf, el pico más alto (1.707 m) del archipiélago. Solo porque se
descubrió recientemente, la información sobre su ecología se limita a observaciones
circunstanciales y la biología reproductiva es completamente desconocida. Nunca se
observaron individuos recién nacidos y juveniles de la especie.
A diferencia de la iguana rosada, la iguana común de Galápagos Conolophus
subcristatus (por conveniencia, aquí también denominada iguana amarilla) actualmente
habita en seis islas del archipiélago, incluida la isla Isabela y el volcán Wolf, donde
ocupa un área más grande que C. marthae. La iguana amarilla se encuentra catalogada
como vulnerable en la Lista Roja de la UICN y experimentó diversas perturbaciones
por contacto directo e indirecto.
actividad humana indirecta de manera que varias poblaciones se redujeron
dramáticamente en tamaño o fueron extirpadas (Snell et al. 1984).
Sobre esta especie, se produjeron algunos estudios que sostienen que el tamaño de
la nidada y la temporada de apareamiento varían entre islas (Werner 1983; Snell et al.
1984). Sin embargo, poco se sabe sobre la biología reproductiva de esta especie en
el volcán Wolf.
Para identificar los tiempos de reproducción específicos de cada especie en el volcán
y las posibles interacciones interespecíficas, examiné y expliqué los niveles basales
de esteroides de progesterona (P4) y 17βestradiol (E2) en ambas especies de
iguanas. La existencia de estudios previos sobre las hormonas esteroides sexuales
de la iguana marina de Galápagos Amblyrhynchus cristatus, el taxón hermano de
Conolophus spp. (Rassmann 1997), ofreció una oportunidad única para utilizar un
modelo de referencia apropiado para las iguanas terrestres mucho menos investigadas.
3) Fisiología del estrés y objetivos
Los animales de vida libre experimentan periódicamente una multiplicidad de desafíos
ambientales internos/externos y alteraciones mediadas por el hombre que pueden
producir condiciones de estrés.
El término “estrés” se ha vuelto popular gracias al trabajo pionero de Hans Selye
(1946), quien describió la condición de estrés como “un síndrome de adaptación
general (GAS)” en el que una reacción inicial rápida (“alarma”) fue seguida por una
reacción sostenida. secreción de glucocorticoides ("fase de resistencia") y, finalmente,
por una peligrosa debilidad cuando la producción de corticoides no puede mantenerse
("fase de agotamiento").
El estrés es un término utilizado en un amplio espectro de investigaciones científicas;
sin embargo, su definición es a menudo ambigua y, a veces, no está definida en
absoluto. Hoy en día, los biólogos distinguen entre "estresor" y "respuesta de estrés".
Estresor es cualquier estímulo nocivo (Romero 2004) o evento excepcional que altera
la homeostasis de un animal generando la llamada etapa de historia de vida de
emergencia (ELHS) (Wingfield et al. 1998; McEwen y Wingfield 2003). Los animales
de vida libre experimentan muchos factores estresantes durante su vida, incluidos
factores físicos (es decir, cambios de temperatura, oxígeno y salinidad), factores
estresantes climáticos (sequías y tormentas) y factores estresantes bióticos
(depredación, competencia y dinámica social, parasitismo) que desafían su
homeostasis. (Romero 2004; Jessop et al. 2013). Estos fenómenos de perturbación
pueden tener efectos sobre la ecología y evolución de los organismos (Hoffmann y
Hercus 2000;
Badyaev 2005; Jessop et al. 2013) y, dependiendo de su omnipresencia,
magnitud y frecuencia, pueden influir en la aptitud individual (Bonier et al. 2009;
Busch y Haiward 2009). Por lo tanto, en respuesta a un factor estresante, los
animales generan respuestas de estrés, que neutralizan los efectos del factor
estresante para regenerar la homeostasis. La respuesta al estrés está constituida
por todas las adaptaciones fisiológicas, endocrinológicas, inmunológicas y
conductuales, que pueden utilizarse simultáneamente para hacer frente a la
condición de estrés limitando las consecuencias negativas sobre la forma física
(Wingfield et al. 1998; Wikelski y Cooke 2006).
Una característica principal de la respuesta al estrés en los vertebrados es la
liberación de glucocorticoides (es decir, cortisol y corticosterona), hormonas
esteroides cuya síntesis está regulada por el eje hipotálamopituitariosuprarrenal
(HPA). Los peces y la mayoría de los mamíferos generalmente liberan cortisol,
mientras que la mayoría de las aves, reptiles, anfibios y muchos roedores liberan
corticosterona (Johnson et al. 1992; Sapolsky 1992; Romero 2004; Romero and
Butler 2007; Crespi et al. 2013). Los glucocorticoides (GC) son el producto final
del eje HPA; estas hormonas del estrés participan en el control de la homeostasis
activando procesos inmediatos de salvamento (Romero et al. 2009). Tras la
percepción del estrés, el hipotálamo se activa para secretar arginina vasotocina
(AVT, homóloga de la arginina vasopresina de los mamíferos) y factor liberador
de corticotropina (CRF), que estimulan la glándula pituitaria para que libere
adrenocorticotropina (ACTH). Esto, a su vez, provoca la liberación de
glucocorticoides de las glándulas suprarrenales (Rich y Romero 2005). El cese
de la vía que conduce a la producción de GC se produce a través de una
retroalimentación negativa bajo el control de los propios GC.
Las concentraciones de GC inducidas por el estrés interactúan con los
receptores de glucocorticoides en el hipocampo, el hipotálamo y la glándula
pituitaria para suprimir los pasos iniciales del eje HPA (De Kloet et al. 1998). El
nivel al que se elevan los GC depende de la gravedad del factor estresante; por
lo tanto, en condiciones de estrés agudo, el mecanismo de retroalimentación
funciona de manera eficiente y el sistema vuelve rápidamente a la normalidad;
bajo condiciones de estrés crónico, las señales de retroalimentación son débiles
y el sistema permanece activado por períodos más largos (Sapolsky 1992).
En general, las liberaciones de glucocorticoides a corto plazo son útiles para los
organismos porque estimulan los mecanismos de emergencia como la
movilización de la glucosa (gluconeogénesis) y el catabolismo de las proteínas
para aumentar de inmediato la disponibilidad energética para superar el problema.
perturbación (Wingfield y Ramenofsky 1999; Wingfield y Romero 2001;
Wingfield 2013). Sin embargo, la activación crónica del eje HPA y las
concentraciones elevadas y prolongadas de GC pueden tener grandes efectos
nocivos sobre la forma física (Romero 2004; Blas et al. 2007), lo que resulta
en enfermedades relacionadas con el estrés (Sapolsky 1992; Romero et al.
2009). De hecho, la activación a largo plazo de la respuesta al estrés puede
exponer al individuo a una sobreestimulación a largo plazo de los mecanismos
de supervivencia con la inhibición consecutiva de muchas funciones
fundamentales, incluidas la inmunocompetencia y la reproducción (Sapolsky 1987; Wingfield et al
1997; Dhabhar 2000; Sapolsky et al. 2000; Dallman y Bhatnagar 2001;
Wingfield y Romero 2001).
En general, las concentraciones de GC se utilizan cada vez más en estudios
ecológicos y de conservación como índices del bienestar animal (Wikelski y
Cooke 2006; Busch y Hayward 2009; Sheriff et al. 2011).
La medición de estas hormonas puede ayudar a comprender cómo los factores
estresantes específicos afectan la supervivencia y el éxito reproductivo de los
animales de vida libre. Sin embargo, aunque estas hormonas se pueden medir
directamente a partir de muchas matrices biológicas como sangre, saliva,
heces y orina (Wasser et al. 1997; Sapolsky et al. 2000; Narayan et al. 2010;
Sheriff et al. 2011), midiéndolas bajo Las condiciones de campo son muy
difíciles y pueden requerir precaución.
Históricamente, la sangre es la matriz biológica tradicional utilizada para
evaluar la concentración de GC. La extracción de sangre permite la medición
del producto instantáneo y directo de la corteza suprarrenal. Además, este
método permite una recolección simultánea de componentes sanguíneos con
una evaluación integral del estado del animal, incluidos índices de condición
(hematocrito), función inmune (perfiles de leucocitos) y estado reproductivo
(hormonas reproductivas). El método más apropiado para la recolección de
sangre varía según la especie. Sin embargo, a pesar del método utilizado, la
recogida de muestras de sangre es en sí misma invasiva.
Por lo tanto, al planificar investigaciones sobre niveles basales de estrés, se
deben considerar los efectos de la recolección de muestras, ya que pueden
sesgar la respuesta hormonal de los animales examinados. Para evitar este
problema, las muestras de sangre generalmente se toman antes de que se
active la corteza suprarrenal, es decir, a los pocos minutos de la captura
(Wingfield y Romero 2001; Romero y Reed 2005). También se pueden utilizar
otros indicadores de estrés menos sensibles, como los perfiles de leucocitos o
más en detalle los heterófilos (o neutrófilos en mamíferos) y
proporción de linfocitos. De hecho, la respuesta inmune es otra parte de las
respuestas adaptativas a situaciones estresantes.
El sistema inmunológico es el principal mecanismo de defensa a través del cual el
organismo se protege de los factores estresantes representados por los patógenos.
Los leucocitos o glóbulos blancos (WBC) son mediadores fundamentales de la
respuesta inmune (Lobato et al. 2005; Davis et al. 2011); circulan continuamente
en el torrente sanguíneo y en varios órganos, destruyendo activamente los
microorganismos invasores. Esta circulación es esencial para mantener una red de
defensa inmunitaria eficaz.
La mayoría de los vertebrados tienen cinco tipos de glóbulos blancos: linfocitos,
neutrófilos, eosinófilos, basófilos y monocitos, cada uno con morfología y función
específicas. La morfología de cada tipo celular parece estar conservada en todos
los taxones, excepto en el caso de los neutrófilos; de hecho, en aves y reptiles, los
neutrófilos son reemplazados por heterófilos, que realizan la misma función
inmunológica (Hawkey y Dennett 1989; Jain 1993).
Los neutrófilos/heterófilos y los linfocitos constituyen el porcentaje más alto (es
decir, casi el 80 % combinado) en los glóbulos blancos de muchos vertebrados,
incluidos los reptiles (Eliman 1997; Fisse et al. 2004; Davis et al. 2008).
Específicamente, los neutrófilos/heterófilos son las principales células fagocitadoras
inmunitarias; ingresan a los tejidos durante la respuesta inflamatoria (Jain 1993;
Campbell 1995; Davis et al. 2008) participando activamente en la fagocitosis de
organismos y otros materiales extraños (Thrall et al. 2012). Los linfocitos participan
en diversas funciones inmunológicas, como la producción de inmunoglobulinas y la
modulación de la defensa inmunitaria (Campbell 1996). En general, el número y la
proporción de leucocitos en sangre proporcionan una representación importante de
la distribución de leucocitos en el organismo y del estado de activación del sistema
inmunitario. Los perfiles de leucocitos tienen un poder predictivo reconocido para
interpretar el estado de salud de los individuos; de hecho, las observaciones de
variaciones en el número de leucocitos son particularmente útiles en el campo de
la biología de la conservación para describir un estado de salud alterado (Wakelin
1996; Davis et al. 2004; Davis et al.
2008). Por lo general, durante una condición de estrés, se observa un aumento de
neutrófilos (N)/heterófilos (H) y una disminución de linfocitos (L) (Maxwell y
Robertson 1998; Ots et al. 1998; Davis et al. 2008).
Dado que la cantidad de células de este tipo se ve afectada por el estrés en
direcciones opuestas, la proporción relativa de neutrófilos/heterófilos a linfocitos
(NH/L) se usa comúnmente como una medida compuesta de la
respuesta al estrés (Gross y Siegel 1983; Maxwell 1993; Maxwell y Robinson
1998; Lobato et al. 2005; Davis et al. 2008; Xuereb et al.
2012; Lentfer et al. 2015). A diferencia de las mediciones de glucocorticoides,
el enfoque WBC ofrece la ventaja de que no requiere un muestreo
prohibitivamente rápido y es relativamente económico.
Además, los perfiles de leucocitos son particularmente útiles en el campo de
la fisiología del estrés porque pueden estar directamente relacionados con los
niveles de la hormona del estrés (Davis et al. 2008). Muchos estudios han
descrito el cambio inducido por el estrés en la distribución de leucocitos
mediado por hormonas liberadas por la glándula suprarrenal (Dhabhar et al.
1996; Dhabhar y McEwen 1999). Los niveles de glucocorticoides crónicamente
elevados pueden causar elevaciones a largo plazo en la relación NH/L, ya que
inducen simultáneamente una reducción en el número de linfocitos circulantes,
con una redistribución del sistema circulatorio a la médula ósea. Al mismo
tiempo, provocan un aumento en el número de neutrófilos/heterófilos, al
estimular su entrada a la sangre y atenuar su salida de la sangre a otros
compartimentos (Sapolsky et al. 2000).
Por lo tanto, el tráfico y la función de las células sanguíneas se alteran
transitoriamente por los GC.
Debido a que el estrés en las poblaciones animales es un factor importante a
considerar cuando se evalúa su bienestar tanto en cautiverio como en libertad,
el uso de diferentes marcadores de estrés es fundamental para obtener una
evaluación confiable de la condición de estrés. Por eso, en esta parte del
proyecto de doctorado, utilizando perfiles hematológicos y hormonales, exploré
específicamente cómo los parásitos afectan los rasgos de vida de las iguanas
como los perfiles de leucocitos y los niveles de glucocorticoides. De hecho, las
dos poblaciones de C. marthae y C. subcristatus tienen que superar el fuerte
impacto de las garrapatas, que parecen ser más abundantes en Volcán Wolf
que en el resto del archipiélago. El sitio se caracteriza por una presencia
masiva de garrapatas Amblyomma spp., ectoparásitos ya descritos que infectan
a las iguanas marinas (Wikelski 1999). Probablemente, las garrapatas son los
principales vectores de Hepatozoon (Apicomplexa: Adeleorina) en los reptiles
de Galápagos (Bataille et al. 2012). Hepatozoon, con más de 300 especies
descritas, es el más común entre los parásitos sanguíneos intracelulares en
reptiles (Telford 1984; Smith 1996). Infectan los eritrocitos del huésped y aún
se debaten sus efectos sobre el estado físico del huésped.
En general, los ectoparásitos y endoparásitos se consideran fuentes potenciales
de estrés biótico para todos los organismos (Lozano 1998). Pueden coexistir
con sus anfitriones sin causar efectos nocivos mensurables, pero
también pueden aumentar en número y abrumar a un huésped ya debilitado
por otras formas de estrés como la desnutrición o la reproducción (Walzer y
Genta 1989). Finalmente, pueden provocar directamente respuestas
inflamatorias y enfermedades que afectan la salud individual y los rasgos
relacionados con el estado físico (Schwanz 2008). Además, los parásitos y
las hormonas glucocorticoides interactúan y afectan una multiplicidad de
procesos, como la respuesta inmune y la reproducción (Wingfield et al.
1997; Sapolsky et al. 2000). Sin embargo, la naturaleza de la relación entre
la infección parasitaria y los niveles de glucocorticoides y su posible
covariación con los perfiles hematológicos ha recibido relativamente poca
atención en animales salvajes y con resultados equívocos.
Por ello, consciente del escaso conocimiento sobre patrones de variación
natural de parámetros hematológicos y niveles de glucocorticoides y su
relación con parásitos en poblaciones de reptiles silvestres, en la segunda
parte del proyecto analicé la relación entre ecto y endoparásitos y la fisiología
del estrés de estas dos iguanas terrestres de Galápagos. Para ello utilicé: (i)
perfiles de leucocitos y específicamente la relación heterófilos/linfocitos (H/
L), comúnmente utilizada como herramienta de diagnóstico para evaluar el
estrés a largo plazo en vertebrados (Davis et al. 2008), (ii) marcadores
endocrinológicos como niveles basales de corticosterona en plasma, la
principal hormona glucocorticoide suprarrenal producida en respuesta a
eventos estresantes en reptiles (Greenberg y Wingfield, 1987).
Utilicé una población separada de C. subcristatus, que se encuentra en una
zona costera donde los ectoparásitos y hemoparásitos notoriamente están
marginalmente presentes (Bahía Urbina), como condición “en blanco” para
las comparaciones hematológicas y hormonales.
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CAPITULO 2
Niveles plasmáticos de progesterona y estradiol y su relación con la
reproducción en iguanas terrestres de Galápagos, Conolophus marthae y
Conolophus subcristatus
Onorati M1 , Sancesario G2, Carrión J3 , bernardini s2 , lauro d2 ,

Carosí M1, Vignoli L1 , y Gentile G4 (2016).
1
Università degli Studi Roma Tre, Roma, Italia
2
Dipartimento de Medicina Interna, Università Tor Vergata, Roma,
Italia
3
Dirección del Parque Nacional Galápagos, Puerto Ayora, Isla Santa
Cruz, Islas Galápagos, Ecuador
4
Dipartimento di Biologia, Università Tor Vergata, Roma, Italia
Presentado (Ciencias de la Reproducción Animal)
1. Introducción
La endocrinología reproductiva es un recurso fundamental para los científicos
interesados en comprender diferentes aspectos de la biología reproductiva
en vertebrados. Los mecanismos endocrinológicos que controlan la biología
reproductiva se han estudiado más ampliamente en organismos mamíferos
que en reptiles (Bronson 1989) y aves (Tsutsui et al.
2000; Wilkelski et al. 2000). A pesar de esto, aunque existen diferencias que
reflejan los procesos evolutivos entre clases, varios estudios sobre
reproducción de vertebrados y procesos endocrinológicos indican una
notable homogeneidad en todo el subfilo (Nandi 1967; Bentley 1998).
La actividad reproductiva en reptiles está asociada con una variación
esencial en las concentraciones circulantes de las principales hormonas
esteroides sexuales: progesterona (P4) y 17βestradiol (E2) (Jones y Guillette
1982; Crews y Silver 1985; Wibbels et al. 1992; Edwards y Jones 2001;
Taylor et al. 2004; Norris y López 2010).
Los ritmos reproductivos, los comportamientos sexuales, los procesos
fisiológicos relacionados con la reproducción, como el apareamiento, la
gestación y la oviposición, están bajo un control endocrino complejo que
involucra la actividad y regulación del eje hipotálamopituitariogonadal
(HPG) en la producción de hormonas esteroides sexuales (Licht 1979; Crews y Plata 1985).
En reptiles, las encuestas sobre las hormonas esteroides sexuales declaran
abiertamente la importancia de la progesterona en la regulación de la
maduración de los ovocitos y en el mantenimiento de la gestación (Callard
et al. 1992; CustodiaLora y Callard 2002). La progesterona tiene un papel
en la determinación del momento de la oviposición (Norris 2007), inhibe la
contractilidad oviductal (Guillette y Jones 1985; Edwards y Jones 2001) y
retrasa el parto (Guillette et al. 1991). El patrón de producción de progesterona
durante el ciclo reproductivo difiere entre reptiles vivíparos y ovíparos (Callard
et al. 1992). Mientras que en los reptiles vivíparos la concentración más alta
se alcanza durante la mitad del embarazo, en los que ponen huevos la
progesterona muestra un aumento antes de la ovulación y al principio del
embarazo con una fuerte disminución antes de la oviposición (Crews y Silver
1985; Taylor et al. 2004). El papel de P4 en el mantenimiento del embarazo
ha sido bien estudiado, especialmente en reptiles vivíparos, donde su función
inhibiendo el desarrollo folicular y manteniendo la vascularización oviductal
está profundamente descrita (Guillette et al. 1981; Mead et al. 1981).
El 17βestradiol (E2) es la principal hormona esteroide estrogénica en los reptiles
(Norris 2007). El desarrollo ovárico y el proceso de vitelogénesis (producción de
yema) generalmente se asocian con concentraciones plasmáticas elevadas de
estradiol en escamatos (Bonnet et al. 1994), tortugas (Ho et al. 1981) y caimanes
(Guillette et al. 1997). La vitelogénesis es claramente un proceso dependiente
de estrógenos; el estradiol regula la síntesis de vitelogenina en el hígado y la
acumulación de proteína de la yema en la sangre y los ovocitos (Licht 1979; Ho
1987). Además, el estradiol juega un papel importante en la inducción de
conductas sexuales durante el período de apareamiento (Whittier y Tokarz,
1992; Rhen y Crews 2000); de hecho, se sabe que las administraciones
exógenas de estrógeno tienen un efecto estimulador sobre la receptividad
sexual femenina en algunas especies de lagartijas (Crews 1975a; Valenstein y
Crews 1977).
Por lo tanto, investigar los niveles circulatorios de hormonas sexuales puede
brindar mucha información sobre el estado reproductivo de los reptiles silvestres
y puede resultar muy útil cuando la conservación también es un problema,
especialmente cuando la duración de las investigaciones de campo, que
permiten observaciones directas, está fuertemente limitada por restricciones
logísticas. . Este es el caso de la iguana rosada de Galápagos (Conolophus
marthae), una especie descubierta recientemente (Gentile y Snell 2009; Gentile
et al. 2009) y catalogada como En Peligro Crítico en la Lista Roja de la UICN
(Gentile 2012). La especie se encuentra solo en la parte superior y a lo largo de
las laderas noroeste del Volcán Wolf (Isla Isabela), el pico más alto (1.707 m) y
uno de los sitios de campo más remotos y difíciles del archipiélago de Galápagos
(Fig. 1). Las amenazas incluyen un tamaño de población pequeño, distribución
extremadamente limitada, posible competencia con una población sintópica de
C. subcristatus y depredadores introducidos (Gentile et al. 2016).
A diferencia de la iguana rosada, C. subcristatus se distribuye ampliamente por
todo el archipiélago, incluida la isla Isabela y el volcán Wolf. Una tercera especie
de iguana terrestre de Galápagos, C. pallidus, se encuentra solo en la isla Santa
Fe. Poco se sabe sobre la biología reproductiva de estas especies. La
información disponible es incompleta y se refiere únicamente a C. subcristatus y
C. pallidus , para los cuales estudios previos indicaron que el tamaño de la
nidada y la temporada de apareamiento varían entre las islas (Werner 1983;
Snell et al. 1984). La información sobre la biología reproductiva y la ecología de
C. marthae se limita a observaciones circunstanciales.
Como las dos especies sintópicas del volcán Wolf pueden competir por los sitios
de anidación, comprender los tiempos y modos de reproducción es crucial para
entender si las dos poblaciones tienen temporadas reproductivas completamente
superpuestas. Los datos sensibles adicionales que se necesitan también son las
densidades de hembras reproductoras, particularmente importantes a la luz del
hecho de que el tamaño de puesta es muy diferente en las dos especies (Gentile
et al. 2016). Claramente, la información obtenida de las encuestas hormonales
puede potencialmente permitir abordar estos problemas.
Desafortunadamente, no existen estudios previos de las hormonas sexuales de
las especies de Conolophus . En cambio, los esteroides sexuales se investigaron
en la iguana marina Amblyrhynchus cristatus (Rubenstein y Wikelski 2005;
Vitousek et al. 2010; Vitousek y Romero 2013), el taxón hermano de Conolophus
(Rassmann 1997). Dichos estudios se centraron precisamente en cómo varían los
patrones de referencia de los esteroides sexuales durante la temporada de
reproducción en relación con la agresión de las hembras (Rubenstein y Wikelski
2005), la receptividad (Vitousek et al. 2010) y la selección de pareja (Vitousek y
Romero 2013). En A. cristatus , los cambios fisiológicos en las hormonas circulantes
afectan la biología reproductiva. Se informó que la progesterona y el estradiol
están asociados a diferentes procesos reproductivos y funcionan de manera
independiente, mostrando patrones distintivos durante los períodos de apareamiento
y anidación. La progesterona se elevó al comienzo del período de apareamiento
pero disminuyó hacia el final, aumentó nuevamente al comienzo del período de
anidación, relacionado con el mantenimiento de la gestación, y luego disminuyó
incesantemente durante las fases de anidación (Rubenstein y Wikelski 2005).
Además, en A. cristatus la progesterona parecía ser un inhibidor potencial de la
vitelogénesis ya que sus niveles plasmáticos aumentaban durante la atresia
folicular (Vitousek et al. 2010). Por el contrario, el estradiol aparentemente estimuló
la atracción y receptividad de las iguanas marinas hembras; la concentración
plasmática de estradiol fue extremadamente baja durante todas las fases de
anidación, pero alcanzó su punto máximo durante el período de apareamiento
cuando estimuló el proceso de vitelogénesis y moduló el comportamiento agresivo
(Rubenstein y Wikelski 2005).
Teniendo en cuenta las evidencias obtenidas en las iguanas marinas y la relación
taxonómica hermana entre Amblyrhynchus y Conolophus, en este estudio
utilizamos A. cristatus como sistema biológico de referencia y utilizamos un
enfoque combinado de análisis biométricos, endocrinológicos y de ultrasonido
para examinar y explicar los niveles basales de esteroides en plasma. de P4 y E2
en las dos poblaciones sintópicas de iguanas terrestres de Galápagos C. marthae
y C. subcristatus.
Figura 1. Islas Galápagos. El triángulo indica el volcán donde se estudiaron
C. marthae y C. subcristatus .
2. Materiales y métodos
2.1) Declaración ética
La manipulación de los animales y la toma de muestras de sangre se
realizaron de acuerdo con un protocolo que minimizaba el estrés de los
animales, de acuerdo con las directrices de la Comunidad Europea y con la
aprobación del Parque Nacional Galápagos. Las muestras fueron exportadas
e importadas bajo los permisos CITES 101/BG e IT/IM/2015/MCE/01711, respectivamente.
2.2) Muestras
Se recolectaron muestras de hembras de C. marthae y C. subcristatus en tres
años diferentes: julio de 2010, junio de 2012 y 2014. Los tamaños de muestra
y el estado reproductivo considerados en la presente investigación se resumen
en la Tabla 1.
Durante todas las sesiones de campo, se extrajeron aproximadamente 2 ml
de sangre de cada iguana dentro de los 5 minutos posteriores a la captura,
utilizando una jeringa heparinizada de 5 ml. Se extrajo sangre de la vena caudal y
mantenido en hielo. Unas horas más tarde se centrifugó la sangre y se separó el
plasma. El plasma se almacenó a 10°C mientras estaba en el campo ya 40°C
una vez de vuelta en el laboratorio.
Todas las iguanas capturadas fueron pesadas y medidas. Luego se estimó el
índice de condición corporal (BCI) como la relación masa corporal/longitud hocico
cloaca (SVL)3 x 106 (la relación se multiplicó por 106 para reducir el número de
decimales). Aunque simple, este índice ya se ha utilizado para describir la
condición física de las iguanas marinas (Laurie 1989; Wikelski y Trillmich 1997,
Romero y Wikelski 2001) y terrestres (Costantini et al. 2009).
2.3) Análisis por ultrasonido
Para cada hembra, determinamos la cantidad de huevos, el tamaño de los huevos
y la etapa de desarrollo de los folículos utilizando una máquina de ultrasonido
portátil Sonosite (FUJIFILM SonoSite, Inc.). Las características técnicas del
dispositivo y la sonda utilizados, así como el protocolo aplicado, se pueden
encontrar en Gentile et al. (2016). Aunque la palpación del abdomen puede ser
un método posible para diagnosticar el embarazo, el uso de una máquina de
ultrasonido ofrece claras ventajas. De hecho, varios estudios lo identificaron como
el método más confiable para realizar una evaluación precisa de las condiciones
reproductivas en reptiles (lagarto: Gartrell et al. 2002; Gilman y Wolf 2007; tortuga:
Robeck et al. 1990). El análisis permitió determinar el estado reproductivo de cada
hembra, diferenciando los estadios de desarrollo de los huevos (Fig. 2): estadio
“a”, hembras que presentan folículos con huevos de dimensiones homogéneas,
esféricas y pequeñas; etapa "b", hembras con huevos sin cáscara más grandes,
pero no completamente formados; etapa “c”, hembras con huevos grandes,
completamente formados y sin cáscara; etapa "d", hembras no reproductivas que
no llevan huevos visibles dentro de los folículos. Un examen del cuerpo lúteo
resultaría útil para evaluar si una hembra ha puesto huevos en el pasado reciente.
Sin embargo, mientras que los cuerpos lúteos persisten en reptiles ovovíparos
después de la puesta de huevos (Glasser y Bullock 2012), en reptiles ovíparos
como Conolophus retroceden poco después de la puesta (Yadav 2008). Además,
junto con sus ventajas, el abordaje por ultrasonido tiene la desventaja de que no
permite la visualización del cuerpo lúteo (Norris y Lopez 2010).
estado de embarazo a b C d
2010 (julio)
C. Marthae 0 0 4 14
C. subcristatus 0 0 0 9
2012 (junio)
C. Marthae 0 0 2 dieciséis
2014 (junio)
C. Marthae 2 1 0 17
Cuadro 1. Estado de gestación de cada especie durante tres temporadas de
muestreo. (etapa a) Hembras con solo huevos foliculares; (etapa b) hembras con
huevos no completamente formados con solo la membrana de la cáscara; (etapa
c) hembras con huevos completamente formados; (etapa d) hembras no
reproductivas cuando no se visualizaron folículos ni óvulos.
Figura 2. Imágenes ecográficas originales.
Estadios: folículos “a” con óvulos de dimensiones homogéneas, esféricas y pequeñas;
“b” huevos sin cáscara grandes, pero no completamente formados; “c” huevos grandes,
completamente formados y sin cáscara; “d” sin huevos visibles.
2.4) Ensayos hormonales
Los niveles plasmáticos de las hormonas esteroides sexuales progesterona (P4) y 17β
estradiol (E2) se determinaron mediante ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas
competitivos (ELISA).
De hecho, varios estudios han analizado las hormonas esteroides en reptiles utilizando
radioinmunoensayo (RIA) (tortugas: Mahmoud et al. 1989; serpientes: Highfill y Mead
1975; Taylor et al. 2004; lagartijas: Judd et al. 1976; Arslan et al. 1978 , Amey y Whittier
2000, Husak et al. 2007). Los únicos trabajos sobre lagartijas iguaninas se refieren a A.
cristatus y usan RIA (Rubenstein y Wikelski 2005; Vitousek et al. 2010; Vitousek y
Romero 2013).
El radioinmunoensayo es un método común para cuantificar las hormonas esteroides
en vertebrados, sin embargo, existen algunos problemas asociados con este método.
La necesidad de instalaciones especiales para el manejo de la radiactividad, el corto
tiempo de estabilidad de los ligandos radiomarcados y los riesgos potenciales para la
salud se asocian comúnmente con esta metodología (Andoh 2006; Sink et al. 2008).
Por el contrario, ELISA es generalmente más rápido y seguro que RIA, es menos
costoso y muestra una mayor estabilidad de los reactivos.
En general, todavía faltan datos sobre cómo estos dos métodos son comparables. La
poca información disponible sugiere que pueden observarse diferencias al comparar los
resultados de RIA y ELISA.
Los problemas pueden residir especialmente en las diferencias en los protocolos de
análisis (Sink et al. 2008).
Todos los inmunoensayos ELISA se realizaron en el Laboratorio de Bioquímica Clínica
(Hospital Universitario Tor Vergata). Las muestras de plasma se conservaron a 40 °C
hasta que se analizaron.
Se utilizaron 50 µl de plasma para la determinación de cada hormona. Solo para E2, el
plasma se diluyó 1:2 con tampón de ensayo (que contenía proteínas y azida de sodio)
para eliminar la interferencia de la matriz. Todas las muestras se analizaron por
duplicado y se distribuyeron aleatoriamente entre placas.
Utilizamos el kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (CEA459Ge) recubierto
previamente con un anticuerpo monoclonal para P4. El rango de detección de los kits
ELISA de progesterona (CEA459Ge) fue de 1,23 a 100 ng/mL. La variación intraensayo
fue < 10%, la variación interensayo < 12%.
No pudimos utilizar kits ELISA del mismo lote a lo largo de todo el estudio, a pesar de
lo recomendado (Sink et al. 2008). De hecho, utilizamos kits ELISA pertenecientes a
dos lotes diferentes. Para evaluar la variación entre lotes, se analizaron 5 individuos
utilizando ambos lotes. El poder
,
curva y = axb donde
a = 0.059006 yb = 1.4786, datos ajustados con una proporción
de varianza explicada (R2 ) igual a 0.995. Usamos esa curva para ajustar las lecturas
del segundo lote. Para tener en cuenta el error experimental, se agregó a cada valor
pronosticado un número generado aleatoriamente comprendido dentro de los valores
residuales mínimo y máximo de la regresión.
Para el 17βestradiol (E2) se utilizó el inmunoensayo KA2535 precubierto con un
anticuerpo policlonal. El límite de detección de todos los kits ELISA de estradiol fue
de 14 pg/mL. La variación intraensayo fue de alrededor del 3%, la variación
interensayo del 9%. También para esta hormona se utilizaron kits pertenecientes a
dos lotes diferentes. Como se encontró una correspondencia completa en las
concentraciones de los animales sometidos a nuevas pruebas, no se aplicó ningún
procedimiento de ajuste en este caso.
Los ensayos de progesterona y 17βestradiol se realizaron de acuerdo con las
instrucciones de los fabricantes.
2.5) Análisis estadístico
Utilizamos pruebas paramétricas y no paramétricas para analizar las diferencias en
los niveles plasmáticos hormonales entre años, entre las dos especies y entre
hembras portadoras de huevos (estadios a, b y c) y hembras no portadoras de
huevos (estadio d), y probar la diferencia en el tamaño de nidada entre especies.
Cuando los datos presentaban una distribución normal, usamos la prueba t de
Student para datos no apareados y ANOVA, y cuando no se logró la suposición de
normalidad, se aplicaron la prueba U de MannWhitney y ANOVA de Kruskal Wallis.
Se realizaron análisis de correlación de Pearson para probar la relación entre el
tamaño de puesta y las métricas corporales (BCI, SVL y peso).
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software Past (versión 3.07 para
MAC) con dos colas y alfa establecido en 0.05.
3) Resultados
3.1) Estado reproductivo
De las 18 hembras de C. marthae muestreadas en 2010, 4 (22%) mostraron huevos
completamente formados (etapa c). No había huevos presentes en ninguna de las
otras 14 hembras (78%) (etapa d). Dos hembras (11%) muestreadas en 2012 llevaron
huevos no completamente formados (etapa c); los otros 16 (89%) no portaban huevos
(etapa d). Dos hembras (10 %) muestreadas en 2014 mostraron folículos con huevos
pequeños y esféricos (etapa a), una hembra (5 %) no llevaba huevos completamente
formados (etapa b) mientras que las 17 restantes (85 %) no llevaban huevos (etapa d ).
En 2010, todas las hembras de C. subcristatus muestreadas no llevaban huevos (etapa d).
En 2012 observamos nueve hembras (64%) con huevos completamente formados (etapa
c) y cinco (36%) sin huevos (etapa d). En 2014, una hembra (5 %) mostró folículos con
huevos pequeños y esféricos (etapa a), una hembra (5 %) llevó huevos no completamente
formados (etapa b), ocho hembras llevó huevos completamente formados (etapa c) (40
% ), y 10 hembras (50%) se encontraron sin huevos (etapa d).
Teniendo en cuenta tanto los huevos completamente formados como los no completamente
formados, estimamos tamaños de nidada iguales a 8,4 ± 3,4 y 5,4 ± 1,5 para C. subcristatus
y C. marthae, respectivamente. La diferencia entre tamaños fue estadísticamente
significativa (U = 20,5, P = 0,01). Para ambas especies, no observamos una relación lineal
significativa entre el tamaño de puesta y las medidas corporales (BCI, SVL y Peso) (para
todas las pruebas P > 0.05).
3.2) Progesterona (P4)
Los niveles plasmáticos de progesterona en C. marthae y C. subcristatus se muestran en
la Fig. 3. En general, considerando todas las hembras muestreadas, C. subcristatus
presentó una concentración de P4 más alta que C. marthae (U = 764, P = 0,01).
Cuando los años de muestreo se trataron por separado, C. subcristatus mostró niveles
significativamente más altos que C. marthae en junio de 2014 (U = 110, P = 0,042).
En C. marthae, los niveles plasmáticos de P4 fueron más altos en julio de 2010 que en
junio de 2012 y 2014 (aunque no están respaldados estadísticamente), mientras que C.
subcristatus mostró valores bajos.
Al analizar la diferencia entre hembras portadoras de huevos (hembras acumuladas en
estadios a, b y c) y hembras no portadoras de huevos (estadio d), C. marthae presentó
mayor concentración de niveles plasmáticos de P4 en hembras portadoras de huevos (U
= 109, p = 0,042). Además, observamos una diferencia significativa en la concentración de
P4 entre las hembras con huevos en tres etapas diferentes (a, b y c) (H = 6.533; P = 0.036,
Tab. 2). Las pruebas posthoc de MannWhitney, después de la corrección de Bonferroni,
mostraron una diferencia significativa entre las mujeres en las etapas
a y c (H = 2. 252; P = 0.035). Las demás pruebas por pares resultaron no
significativas (Pa vs b = 0,136
a las
ym
Pujeres
b vs c e
=n
0l,081).
as epoder
tapas
Sin eaembargo,
stadístico
y b para
ca
uando
dumentar
ebido
agrupamos
a e
la
l
pequeña muestra utilizada, los niveles de P4 resultaron más altos en las mujeres
en la etapa c que en la muestra agrupada (U = 0, P = 0,019).
En C. subcristatus no observamos una diferencia significativa entre hembras
portadoras de huevos y no portadoras de huevos (U = 157, P = 0.18), pero
encontramos diferentes varianzas (F = 3.11, P = 0.02). Considerando las sesiones
de muestreo de junio (2012+2014) y julio (2010) por separado, la prueba F indicó
una mayor varianza en junio que en julio (F = 13,38, P = 0,001).
También observamos una diferencia estadísticamente significativa entre las
varianzas al comparar hembras sin huevos muestreadas en junio (2012+2014)
con hembras sin huevos muestreadas en julio (2010) (F = 25,99, P = 0,0002; Fig.
4). Observamos una diferencia estadísticamente significativa entre el total de
hembras portadoras de huevos y las hembras no portadoras de huevos de 2010
(U = 27, P = 0,018), y las hembras portadoras de huevos mostraron niveles más
altos de P4. Sin embargo, esta significación desapareció cuando se comparó el
total de hembras portadoras de huevos con las hembras no portadoras de huevos
de junio (2012+2014) (U = 88; P = 0,36).
Figura 3. Patrones de progesterona en Conolophus marthae y C. subcristatus
durante tres temporadas de muestreo. Las concentraciones se informan como
medianas.
Figura 4. Niveles plasmáticos de progesterona en hembras no gestantes de julio
(2010) y junio (2012+2014) en C. subcristatus (mediana ± DE).
Concentración de progesterona
óvulos Huevos no completamente Huevos completamente
foliculares formados (b) 2 formados (c)
norte (a) 2 5
mínimo 0.479 1.025 3.061
máx. 0.503 2.358 19.045

Diferencia 0.0003 0.888 45.134
Estar de pie. desarrollador 0.017 0.942 6.718

Mediana 0.491 1.691 5.059
Tabla 2. Variabilidad en las concentraciones de progesterona entre tres estados
reproductivos activos en C. marthae.
3.3) 17βestradiol (E2)
En C. subcristatus encontramos diferencias significativas en los niveles
plasmáticos de 17βestradiol entre años (H = 12,44, P = 0,002) (fig. 5). La prueba
posthoc de Bonferroni indicó que los niveles plasmáticos de estradiol en 2010
fueron significativamente más bajos que en 2012 (P = 0,004) o 2014 (P = 0,02).
En cambio, C. marthae no mostró una diferencia significativa en los niveles de
estradiol entre años (H = 2,21, P = 0,3).
En general, observamos una mayor concentración de estradiol en las iguanas
rosas que en las amarillas (U = 273,5, P = 0,03).
En ambas especies no observamos una diferencia significativa en las
concentraciones plasmáticas de estradiol entre las hembras en las etapas
reproductivas ac y d (C. subcristatus P = 0.4; C. marthae P = 0.5). Sin embargo,
en C. marthae, surgió una diferencia estadísticamente significativa al comparar
hembras en los estadios b+c con hembras en el estadio a, presentando estas
últimas una mayor concentración de estradiol (t = 2,9817, P = 0,02).
En C. subcristatus, las hembras sin huevos mostraron niveles de estradiol y
variaciones más altas en junio (2012+2014) que en julio (2010) (U = 6, P = 0,001;
F = 15,193, P = 0,001; Fig. 6).
Figura 5. Patrones de 17βestradiol en Conolophus marthae y C. subcristatus
durante tres temporadas de muestreo. Las concentraciones se informan como
medianas.
Figura 6. Niveles plasmáticos de 17βestradiol en hembras no gestantes de julio
(2010) y junio (2012+2014) en C. subcristatus (mediana ± DE).
4. Discusión
Uno de los principales hallazgos de nuestro estudio está representado por la
observación de un patrón contrastado de niveles plasmáticos de progesterona en
las iguanas terrestres congenéricas C. subcristatus y C. marthae. En cuanto a C.
subcristatus, a pesar de las diferencias en las herramientas analíticas, los patrones
observados y el orden de magnitud de los niveles de concentración de hormonas
son consistentes con los encontrados por Rubenstein y Wikelski (2005) en A.
cristatus, previsiblemente cambiando durante los períodos de apareamiento y anidación.
De hecho, en A. cristatus la progesterona aumenta durante el período de
apareamiento en relación con la vascularización del oviducto y el mantenimiento
del embarazo. De hecho, se ha documentado un papel de la progesterona en el
mantenimiento del embarazo en muchos reptiles (Highfill y Mead 1975; Arslan et
al. 1978; Naulleau y Fleury 1990; Bonnet et al. 2001; Taylor et al. 2004).
Colonophus subcristatus mostró cambios significativos en los niveles de
progesterona y estradiol a lo largo de las tres temporadas reproductivas
consideradas en nuestro estudio. Los niveles altos de progesterona en plasma en
junio de 2012 y 2014 contrastaron con los niveles bajos de progesterona observados en julio de 2010
Los análisis de ultrasonido indicaron que en julio de 2010 ninguna hembra
muestreada portaba huevos, mientras que las muestreadas en junio de 2012 y
2014 se encontraban en diferentes etapas reproductivas, con muchas hembras
portando huevos en diversas etapas de desarrollo (64% en 2012, 50% en 2014).
El alto número de hembras portadoras de huevos en 2012 y 2014 asociado con
niveles plasmáticos de progesterona altos, y la ausencia correspondiente de
hembras portadoras de huevos en julio de 2010, cuando observamos niveles
bajos de progesterona, podrían ser suficientes para afirmar que la reproducción
de C. subcristatus de V. Wolf todavía está en curso en junio y finalizó en julio.
La diferencia en la varianza de los niveles de progesterona de las mujeres en la
etapa d (2012+2014 versus 2010) es consistente con tal escenario. De hecho,
mientras que el análisis de ultrasonido no permitió discriminar si la falta de
huevos indicaría la fase de apareamiento o la deposición, los perfiles hormonales
fueron informativos, especialmente cuando juntamos junio de 2012 y 2014 y
comparamos la muestra combinada con julio de 2010. La mayor variación en los
niveles plasmáticos de progesterona exhibidos por hembras sin huevos en junio
podría testificar la presencia de hembras en diferentes condiciones reproductivas:
(i) hembras en las que la progesterona podría haber disminuido después de la
deposición (Taylor et al. 2004); (ii) hembras que no se reprodujeron, sufriendo
los niveles hormonales bajos típicos de las hembras no receptivas (Vitousek et
al. 2010); (iii) hembras aún en fase de apareamiento, cuando la concentración
de hormonas es más baja que en el período temprano de anidación pero más
alta que en una condición posterior a la deposición (Rubenstein y Wikelski
2005). La presencia en junio de hembras todavía en fase de apareamiento
también se sugiere por la falta de una diferencia en los niveles de P4 en plasma
entre el total de hembras portadoras de huevos y las hembras no portadoras de
huevos de junio. Tal diferencia surgió en cambio cuando se compararon el total
de hembras portadoras de huevos y las hembras no portadoras de huevos de
julio.
El análisis de estradiol también proporciona apoyo adicional al escenario
descrito. De hecho, sabemos que en A. cristatus el estradiol alcanza su punto
máximo durante el período de apareamiento y disminuye fuertemente durante
todas las fases de anidación (Rubenstein y Wikelski 2005). En C. subcristatus
muestreadas en julio, no observamos hembras portadoras de huevos y tanto los
niveles de progesterona como de estradiol fueron muy bajos. Además, la
concentración de estradiol en las hembras que no portaban huevos fue menor
en julio que en junio, cuando también se observó una mayor variación. Esto
sugiere fuertemente que en junio muchas hembras tenían niveles altos de
estradiol porque todavía estaban en una fase de apareamiento (probablemente en la última etapa d
cuando E2 influye en el proceso de vitelogénesis (Edwards y Jones 2001;
Guillette et al. 1997; Ott et al. 2000; Rubenstein y Wikelski 2005), receptividad,
atracción (Mason y Adkins 1976; Rhen y Crews 2000; Winkler y Wade 1998), y
comportamientos agresivos contra los machos que intentan copular nuevamente
(Rhen et al. 1999; Woodley et al. 2000a; Woodley y Moore 1999b; Rubenstein
y Wikelski 2005). En julio, todas las hembras habían concluido la temporada de
reproducción y abandonado los sitios de nidificación, mostrando niveles muy
bajos de estradiol. Otros estudios en reptiles mostraron que los niveles de
estradiol extremadamente bajos surgen especialmente en la fase posterior al
parto (Jones y Guillette 1982; Taylor et al. 2004).
Por supuesto, la reproducción en Conolophus puede variar entre años y lugares
según la influencia de las condiciones ambientales y la disponibilidad de
recursos (Snell et al. 1984), como en muchos reptiles (Laurie 1990; Vitousek et
al. 2010). Nuestros datos indican que la temporada de puesta en C. subcristatus
de V. Wolf puede ocurrir en juniojulio, como en Isla Fernandina. Curiosamente,
estos son los dos únicos sitios conocidos donde C. subcristatus se reproduce
en esos meses. Fernandina y V. Wolf también se encuentran entre los volcanes
más occidentales de Galápagos. Queda por descubrir si esto se correlaciona
con condiciones climatológicas y ambientales particulares que pueden afectar
la reproducción.
El patrón de los niveles plasmáticos de progesterona en C. marthae, opuesto al
de C. subcristatus, y la presencia de hembras portadoras de huevos en 2010
podrían sugerir una reproducción levemente retrasada en la especie rosa en
comparación con la población sintópica congenérica.
En general, en C. marthae observamos un aumento significativo de los niveles
de progesterona en las hembras portadoras de huevos. También en este caso
quedó claro el papel de P4 en el mantenimiento del embarazo. Además, la
concentración de progesterona en plasma varió significativamente con la etapa
de la gravidez; de hecho, aumentó cuando los huevos alcanzaron la maduración
completa (formación de la cáscara y la yema). Esta observación sugiere un
papel del cuerpo lúteo y su producto principal (progesterona) en la secreción del
caparazón, como ocurre en muchos reptiles durante el embarazo (Ferguson
1985; Guillette y Jones 1985; Guilette et al. 1989). De todos modos, aunque en
C. marthae encontramos una relación positiva entre las etapas de desarrollo del
huevo y los niveles hormonales, observamos niveles de progesterona
constantemente bajos y comparables a lo largo de los tres años muestreados
(201020122014), número limitado de hembras portadoras de huevos y
reducción número de huevos, en comparación con C. subcristatus. Él
la concentración de estradiol fue mayor en C. marthae que en C. subcristatus,
pero no se observaron diferencias entre años en C. marthae. La asociación de
progesterona con el estado de embarazo fue una señal del funcionamiento del
sistema ovárico. En reptiles ovíparos, los cuerpos lúteos persisten durante la
gestación produciendo progesterona (Norris y Lopez 2001) y en C. marthae se
presentó una mayor producción de progesterona durante la gestación. Además,
en la especie rosada, el nivel de estradiol parecía más alto en la etapa temprana
de la maduración del huevo; esto está de acuerdo con la evidencia de que en
los reptiles los estrógenos son secretados por los folículos ováricos vitelogénicos
para luego disminuir a medida que los óvulos permanecen en el útero (McNicol
y Crews 1979; Etches y Petitte 1990; Norris y López 2010). Sin embargo,
aunque en C. marthae los perfiles hormonales de progesterona y estradiol
brindan evidencia fisiológica de un cambio hormonal en diferentes etapas
reproductivas, no permitieron identificar un período reproductivo específico.
Con base en nuestros datos, para C. marthae, podríamos plantear la hipótesis
de la ausencia de una temporada de reproducción específica. La iguana rosada
podría emplear estrategias reproductivas oportunistas que dependen de las
condiciones ambientales o interacciones interespecíficas con C. subcristatus.
En general, los reptiles tienden a programar la incubación de los huevos cuando
se presenta una temporada favorable con estrés fisiológico mínimo y recursos
alimentarios máximos. En la iguana rosada, podríamos plantear la hipótesis de
un oportunismo individual como ocurre comúnmente en otros vertebrados
(Milton et al. 2004) con hembras que responden a condiciones estresantes que
varían el período reproductivo y el tamaño de puesta. Podríamos plantear la
hipótesis de que la falta de reclutamiento observado para esta especie (Gentile
2012) puede deberse a un factor limitante como, por ejemplo, la depredación
de crías y juveniles por parte de halcones (Buteo galapagoensis) o gatos salvajes (Felis catus).
De hecho, los halcones y los gatos salvajes están constantemente presentes
en el volcán y ya están descritos como causa de mortalidad en la iguana marina
(Laurie y Brown 1990).
Sin embargo, ninguna hembra de C. marthae resultó en condiciones
reproductivas después de un estudio de ultrasonido reciente realizado en
noviembre de 2015 en un pequeño número de iguanas rosadas sanas, o
evidencia indirecta de actividad reproductiva (pares homoespecíficos, esperma
en la cloaca de machos y hembras) . Esto contrasta con la observación de dicha
evidencia en junio/julio (Gentile et al. 2016). Así, por este motivo, lo más
probable es que en la actualidad C. marthae sufra de falta de
la reproducción efectiva y la población resulta en desgaste (Gentile 2012).
En conclusión, nuestros resultados sugieren que los perfiles hormonales
son fundamentales para mejorar el conocimiento sobre la biología
reproductiva de las poblaciones silvestres, especialmente cuando las
observaciones a largo plazo son imposibles. Nuestros datos indican que C.
subcristatus presenta una temporada reproductiva específica y reconocible
en Volcán Wolf. Esta temporada alcanza su punto máximo en junio y
concluye en julio. En el mismo período, C. marthae muestra actividad
reproductiva, pero la combinación de perfiles hormonales y análisis de
ultrasonido demostró que dicha actividad no resulta en un alto número de
hembras reproductivas. Aunque la estrategia reproductiva oportunista no se
puede descartar por completo para C. marthae, la reproducción efectiva en
esta especie parece obstaculizada, lo que determina el desgaste. En este
sentido, está claro que se necesitan más investigaciones, especialmente
dirigidas a descubrir la relación entre el área de distribución, las características
del hábitat y su uso, mediante el seguimiento de los movimientos de los
individuos a lo largo del tiempo. Esto ayudará a localizar sitios de anidación,
actualmente desconocidos, y guiará futuras acciones de conservación para esta especie en pe
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CAPÍTULO 3
Relaciones entre los perfiles de leucocitos y la infección por Hepatozoon en
iguanas terrestres de Galápagos, Conolophus marthae y Conolophus
subcristatus
Onorati M1 , Fulvo A2 , Buen hombre S3 , Cruz M4 , Casagrande S2 , Cedeño

V5 , Carroña
J 6 , Carosi
M 1 ,
V ignoli
L 1
y ,

G entile
G 2
(2016).
1
2
3
Escuela de Biología, Universidad de Leeds, Leeds, Reino Unido
4
Parque Nacional Galápagos, Puerto Ayora, Isla Santa Cruz,
Islas Galápagos, Ecuador
5
Programa de Biotecnología, Universidad de Guayaquil, Guayaquil,
Ecuador
6
Enviado (PlosOne)
1. Introducción
Los parásitos pueden tener un impacto directo en la fisiología y el
comportamiento del huésped al ejercer presiones importantes sobre varios
aspectos de la dinámica de la población huésped, como el crecimiento
(Holmes 1982; Hudson et al. 1998), la distribución espacial (Price 1980; van
Riper et al. 1986) y el éxito reproductivo (Schall 1996; Pacejka et al. 1998; Amo et al. 2004).
Los hemoparásitos ocurren con frecuencia en vertebrados ectotérmicos e
incluyen protistas, procariotas y virus que habitan en el torrente sanguíneo
con formas tanto intraeritrocíticas como extracelulares. Los parásitos de la
sangre son muy comunes en las especies de reptiles, y las hemogregarinas
intracelulares de esporozoos se encuentran entre las más comunes (Telford
1984; Smith 1996). El género Hepatozoon (Apicomplexa: Adeleorina), con
más de 300 especies reportadas que infectan animales, representa el grupo
de hemoparásitos de mayor distribución (Telford 1984; Smith 1996; Baneth
et al. 2003; Vilcins et al. 2009; Tomé et al. 2012). La transmisión de estos
parásitos intraeritrocíticos generalmente ocurre a través de la ingestión de un
invertebrado infectado que contiene esporocistis/esporozoítos, seguido del
desarrollo merogónico en los órganos internos del huésped (Telford 1984;
Smith 1996). Hay muy pocos datos disponibles sobre los efectos de las
hemogregarinas en huéspedes reptiles (Schall 1986; Manwell 1977; Sorci
1995), pero parecen capaces de provocar respuestas inflamatorias
significativas (Wozniak y Telford 1991; Stacy et al. 2011) y enfermedades
como anemia hemolítica (Telford 1984).
Por lo general, se ha demostrado que los mosquitos culicinos y anofelinos,
los ácaros y las garrapatas ixódidas son vectores potenciales de transmisión
(Telford 1984). Los ectoparásitos como los ácaros y las garrapatas no solo
afectan al huésped al transmitir parásitos sanguíneos (Wozniak et al. 1996;
Oppliger y Clobert 1997; Main y Bull 2000), sino que también pueden afectar
directamente tanto la condición corporal como la supervivencia al causar
lesiones, pérdida de sangre, y anemia (Hair et al. 1992; Bull y Burzacott 1993;
Goldberg y Holshuh 1993; Wikelski 1999; Fitze et al. 2004).
El sistema inmunitario es el principal mecanismo de defensa a través del cual
el organismo se protege del ataque de patógenos, y los leucocitos o glóbulos
blancos (WBC) son los mediadores cruciales de la respuesta inmunitaria
(Lobato et al. 2005; Davis et al. 2011). Para el mantenimiento de una red de
defensa inmunitaria eficaz, los glóbulos blancos se mueven continuamente
dentro de los tejidos, a través del torrente sanguíneo, destruyendo o
neutralizando los microorganismos invasores activos (Dhabhar 2000).
Los leucocitos de reptiles se pueden clasificar como granulocitos (heterófilos, eosinófilos,
basófilos) y células mononucleares (linfocitos, monocitos, azurófilos) (Stacy et al. 2011;
Nardini et al. 2013).
Los azurófilos son un tipo de célula exclusivo de los reptiles; sin embargo, la mayoría de
los investigadores los agrupan con los monocitos (Hawkey y Dennett 1989; LeBlanc et al.
2000; Davis et al. 2008).
Los linfocitos componen hasta el 80 % de los tipos de leucocitos en muchas especies de
reptiles (Sypek et al. 1988; Stacy et al. 2011). Son células inmunes altamente específicas
involucradas en una variedad de funciones inmunológicas como la síntesis y secreción
de inmunoglobulinas y la eliminación de antígenos (Campbell 1996; Davis et al. 2008;
Stacy et al. 2011).
Los heterófilos (del 30 % al 45 % de los leucocitos) son las principales células
fagocitadoras inmunitarias que ingresan a los tejidos durante la respuesta inflamatoria
(Jain 1993; Campbell 1995; Strik et al. 2007; Davis et al. 2008) al participar en la
destrucción de microorganismos con oxígeno dependiente. o mecanismos independientes
(Thrall et al. 2012). Los glóbulos blancos restantes están representados por: (i)
eosinófilos, asociados con inflamación alérgica (Thrall et al. 2012) y parasitismo (Jain
1993; Strick et al. 2007); (ii) monocitos que son células fagocíticas asociadas con
infecciones crónicas a menudo causadas por parásitos o bacterias (Gregory et al. 2004;
Davis et al. 2008 Stacy et al. 2011); (iii) basófilos, cuya función no se comprende bien
pero parece estar involucrada en infecciones virales (Sypek et al. 1988; Strick et al.
2007; Stacy et al. 2011).
En general, las alteraciones en el número de leucocitos se han descrito comúnmente
como resultado de infecciones y enfermedades, y la caracterización de los perfiles de
leucocitos (es decir, el número relativo de diferentes tipos de leucocitos en la sangre
periférica) es particularmente útil en el campo de la biología de la conservación para
describir un estado de salud alterado (Wakelin 1996; Davis et al. 2004; Davis et al. 2008).
Aunque la respuesta de los leucocitos parece ser específica de especie o género
(Johnstone et al. 2012), se observa un aumento general de heterófilos y una disminución
de linfocitos en respuesta a varios factores estresantes, incluidas las infecciones
parasitarias (Maxwell y Robertson 1998; Ots et al. 1998; Davis et al. 2008; Müller et al.
2011). La magnitud de la alteración de estos perfiles de glóbulos blancos depende de la
intensidad y persistencia del factor estresante (Averbeck 1992; Vleck et al. 2000). Dado
que los números de heterófilos (H) y linfocitos (L) se ven afectados por los mismos
factores estresantes con tendencias opuestas, la medición de la relación H/L se usa
comúnmente
como herramienta de diagnóstico para evaluar el estrés a largo plazo en
vertebrados (Gross y Siegel 1983; Maxwell 1993; Maxwell y Robinson 1998;
Lobato et al. 2005; Davis et al. 2008; Xuereb et al. 2012; Lentfer et al. 2015).
La relación H/L de leucocitos no se ha utilizado con frecuencia para demostrar
los vínculos entre el estrés y los parásitos en las poblaciones silvestres de
reptiles. Más a menudo, las infecciones hemoparasitarias en reptiles se
relacionaron con la tasa de crecimiento individual y la condición corporal
(Madsen et al. 2005; Ujivari y Madsen 2006; Curtis y Baird 2008). Algunos
estudios han identificado claramente a los ectoparásitos como causa de
mortalidad y en estos casos se ha observado reducción de la masa corporal
y supervivencia (Sorci y Clobert 1995; Klukowski 2004). Sin embargo, a
menudo no se informan los efectos perjudiciales de las infecciones por ecto/
endoparásitos (Christian y Bedford 1995; Brown et al. 2006; Schlaepfer 2006;
Sperry et al. 2009).
En el presente estudio analizamos el impacto de los estresores potenciales
de ectoparásitos (Amblystoma spp.) y endoparásitos (Hepatozoon spp.) sobre
la salud y parámetros hematológicos de dos poblaciones sintópicas de iguanas
terrestres de Galápagos presentes en Volcán Wolf (Isla Isabela): Conolophus
marthae (la iguana rosa) (En Peligro Crítico, Lista Roja de la UICN) y
Conolophus subcristatus (la iguana amarilla)
(Vulnerable, Lista Roja de la UICN). Somos conscientes del escaso
conocimiento sobre los patrones de variación natural de los parámetros
hematológicos en las poblaciones silvestres de reptiles y su relación con los parásitos.
Específicamente, nuestro objetivo es probar el impacto de Hepatozoon spp.
presente en las Islas Galápagos con más de una especie (Bataille et al. 2012)
y en Volcán Wolf con haplotipos únicos (Gentile et al. en prep.) con respecto
a los perfiles de leucocitos, hematocrito e índice de condición corporal.
Además, utilizamos una población de C. subcristatus que se encuentra en
una zona costera donde los ectoparásitos y los hemoparásitos están
marginalmente presentes (Bahía Urbina), como condición "en blanco" para
las comparaciones hematológicas.
Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que se utiliza una gama tan
diversa de medidas hematológicas, durante un período de estudio de cinco
años, para estimar el impacto de los parásitos en la salud de las especies de
iguanas de vida libre.
2.1) Área de estudio y especies
El estudio se realizó en dos áreas diferentes de la isla Isabela: el Volcán Wolf
(1.707 m.), el pico más alto (1.707 m) del archipiélago de Galápagos ubicado en
el lado norte de la isla, y Bahía Urbina, una zona costera turística situada en el
lado oeste (Fig. 1).
Se muestrearon iguanas terrestres de ambas áreas. En cambio, las muestras de
C. marthae se obtuvieron exclusivamente del volcán, donde se encuentra
endémicamente en la parte superior y a lo largo de las laderas del noroeste. Los
resultados de este estudio se basan en muestras recolectadas en Volcán Wolf
en cinco años, mayo de 2006, 2009, julio de 2010, junio de 2012, 2014 y muestras
recolectadas en Bahía Urbina solo durante junio de 2014.
Figura 1. Islas Galápagos. El triángulo indica el volcán Wolf, el círculo la zona
costera Bahía Urbina donde se recolectaron las muestras.
2.2) Toma de muestras y extracción de sangre
Recolectamos 2 mL de la vena caudal de cada iguana utilizando una jeringa
heparinizada. Colocamos aproximadamente 10 microlitros de sangre en la parte
superior de un portaobjetos y creamos un frotis. Los frotis de sangre se secaron
al aire, se almacenaron y luego se tiñeron siguiendo un método de Romanowky
modificado (Work et al. 1998).
Una porción de la sangre recolectada se colocó en un tubo capilar de
microhematocrito y se centrifugó durante 2 minutos a 2000 rpm, para determinar
la proporción de glóbulos rojos (hematocrito o PCV). La sangre restante se
almacenó para estudios adicionales.
Después del sangrado, cada iguana fue pesada y medida desde el hocico hasta
la cloaca (longitud hocicocloaca, SVL). Para explorar los efectos de los parásitos
en el estado nutricional, estimamos un índice de condición corporal (BCI) como
masa corporal/SVL3 x 106 (Laurie 1989; Wikelski y Trillmich 1997, Romero y
Wikelski 2001; Costantini et al. 2009).
Solo en 2012 y 2014 contamos el número de garrapatas escaneando las axilas
de cada individuo.
Después de todas las mediciones y antes de su liberación, se marcaron las
iguanas y se implantaron subcutáneamente etiquetas PIT con códigos
alfanuméricos únicos en cada individuo. Tal marcado nos permitió reconocer
individuos de año en año.
2.3) Fórmula leucocitaria y detección de parásitos
Cada portaobjetos se devolvió al laboratorio y se examinó con un objetivo de
inmersión en aceite (x100). Los datos se recogieron del área del frotis donde se
produjo una distribución uniforme de eritrocitos y sin superposición celular.
Describimos la fórmula leucocitaria (proporción de diferentes tipos de leucocitos)
de cada individuo examinando un total de 100 leucocitos, evaluando la proporción
de heterófilos (H), eosinófilos (E), basófilos (B), linfocitos (L) y monocitos (M).
No se consideraron los azurófilos. Luego del conteo de células, se calculó la
relación H/L para cada iguana.
Analizamos la parasitemia registrando el número de eritrocitos infectados con
hemogregarina observados en 20 minutos, tiempo durante el cual se encontraron
aproximadamente 100 campos y 5 x 105 glóbulos rojos (Valkiūnas et al. 2008). Si
no se detectaban hemoparásitos después de 20 minutos, el individuo se clasificaba
como no infectado.
Dicho método demostró ser suficientemente eficiente después de probar la parasitemia
mediante un enfoque basado en PCR (Fulvo 2010).
Cuando se completó el análisis de la carga parasitaria de cada individuo, estimamos
parámetros epidemiológicos como: (i) la intensidad de la infección como el porcentaje de
glóbulos rojos infectados encontrados en aproximadamente 10000 células (Godfrey et al.
1987); (ii) la prevalencia como porcentaje de individuos con infección; (iii) la incidencia
como la proporción de nuevos casos de infección dentro del período de estudio, es decir,
el porcentaje de individuos no infectados en el pasado, pero que se encontraron infectados
después de la recaptura.
Utilizamos el método de ShapiroWilks para probar la normalidad. Cuando no se cumplió
con la normalidad, los datos se transformaron logarítmicamente.
Se utilizaron pruebas de contingencia de chicuadrado para comparar la prevalencia de
parásitos entre años y especies.
Para determinar si los endoparásitos afectaron el perfil leucocitario de las poblaciones de
C. marthae (CM) y C. subcristatus (CS) en Volcán Wolf, realizamos análisis de modelo
lineal general (GLM). Los parámetros hematológicos (H, L, E, M, H/L, parasitemia) fueron
las variables de respuesta.
Se consideraron las siguientes variables predictoras (y su interacción): especie, sexo y
temporada (mayo: 2006+2009; junio: 2012+2014; julio: 2010). Cuando se consideró un
solo tipo de glóbulo blanco como variable de respuesta, el modelo también incluyó la
parasitemia como covariable. Se utilizaron GLM para determinar las diferencias en los
parámetros hematológicos (H, L, E, M, H/L, parasitemia) entre las poblaciones de CS de
Volcán Wolf y Baia Urbina al incluir el sitio como un factor predictivo adicional. Dado que
Bahía Urbina fue muestreada solo en junio de 2014, la variable temporada se estableció
como un factor aleatorio anidado dentro de la variable sitio. Se realizaron comparaciones
por pares post hoc de diferencia mínima (LSD) para probar las diferencias entre grupos.
Como la información sobre las garrapatas se recopiló solo en dos años, utilizamos la
correlación de Pearson para evaluar la posible relación entre las cargas ectoparásitas y
endoparásitas, así como para evaluar una posible relación con las variaciones del perfil
de leucocitos.
Todos los análisis se realizaron utilizando el software Past (versión 3.07 para MAC) y
STATISTICA (StatSoft, versión 8 para Windows) con dos colas y alfa configurado en 0.05.
3) Resultados
3.1) Comparaciones interespecíficas (Volcán Wolf)
Todas las iguanas muestreadas presentaron garrapatas en las axilas, ya sea en estado de
larva/ninfa o adulto. No observamos diferencias en el número de garrapatas entre las especies
de estudio (t = 0,45, P = 0,6). No se encontró correlación entre la
y
ahbundancia
emoparásitos
de gnarrapatas
i entre la
carga de garrapatas y los marcadores hematológicos (para ambas especies, P > 0,05).
En Volcán Wolf, la prevalencia de infección por Hepatozoon fue muy alta en ambas especies,
oscilando entre 69,4% 87,5% (Tabla 1; Fig. 2).
Año norte % infectado parasitemia ectoparásitos

Significar SE Significar SE
C. Marthae
2006 dieciséis 87.5 9.7 3.1
2009 79 87.3 16.2 3.6
2010 56 83,9 20,3 3,5
2012 82 76,8 29,3 6,4 40,9 2.3

2014 62 77,4 17,1 5,3 53,1 4.4
C. subcristatus (W)
2006 25 72 160.4 133.5
2009 77 79,2 45,8 8,9
2010 20 85 168,4 97
2012 72 69,4 97,4 24,1 41.6 2.5

2014 53 75,4 30,6 8,5 53 2.9
C. subcristatus (BU)
2014 31 9.7 8.6 7.6 0.19 0.08
Tabla 1. Prevalencia, parasitemia y carga de garrapatas para Conolophus marthae y
Conolophus subcristatus durante todo el período de estudio.
Figura 2. Porcentaje de individuos con infección por Hepatozoon
(prevalencia) durante el período de estudio.
La prevalencia no cambió durante el período de estudio (C. marthae: X2 =
3,9, df = 4, P = 0,4; C. subcristatus: X2 = 3,5, df = 4, P = 0,4) y entre
especies (X2 = 3,44, df = 1, p = 0,080). En general, ambas especies
presentaron valores bajos de intensidad de infección (CM 0.1%; CS 0.5%),
mostrando la mayoría de las iguanas bajas cargas parasitarias (Fig. 3 4).
Para ambas especies observamos una alta incidencia de infección: 60%
en CM (3 de 5 individuos recapturados), 66% en CS (2 de 3 individuos recapturados).
Nunca observamos la desaparición de Hepatozoon de un individuo
infectado.
La parasitemia fue mayor en CS que en CM (F1,527 = 9,029, P = 0,003).
Varió a lo largo del período de estudio (F2,527 = 4,553; P = 0,011), pero
no se encontró diferencia entre especies en el patrón temporal (F2,527 =
1,925; P = 0,147). Ambas especies presentaron una diferencia significativa
entre el pico de julio y el mínimo de mayo (P = 0,044).
Los linfocitos (L) fueron las células más numerosas en el conteo diferencial
de leucocitos seguidos por H, M, E y B en ambas especies (Cuadro 2).
Figura 3. Histograma de distribución de la parasitemia en individuos de
Conolophus marthae.
Figura 4. Histograma de distribución de parasitemia en individuos de
Conolophus subcristatus.
Infección Parámetros
estado de leucocitos C. Marthae
0 2006 2009 2010 2012 2014
norte 2 10 9 19 14
Linfocitos (%) 53 ± 6 Heterófilos 53,7 ± 3,9 71,1 ± 4,8 62,4 ± 4,7 65,1 ± 3,9
(%) 35,5 ± 4,5 34,9 ± 3,4 21,4 ± 4,4 29,9 ± 4,2 23,5 ± 3,2
Eosinófilos (%) 4,5 ± 1,5 Monocitos 5,3 ± 0,9 0,5 ± 0,3 3,2 ± 0,6 3,1 ± 0,7
(%) 6,5 ± 3,5 Basófilos (%) 5,5 ± 1,2 6,7 ± 1,1 0 4,4 ± 1 7,5 ± 0,9

0,5 ± 0,5 0,6 ± 0,2 0 0 0,1 ± 0,1
Relación H/L 1,3 ± 0,4 0,6 ± 0,1 0,3 ± 0,09 0,9 ± 0,4 0,4 ± 0,1
1 norte 14 69 47 63 48
Linfocitos (%) 40,7 ± 5 Heterófilos 53,3 ± 1,7 67,3 ± 2,2 51,8 ± 2,8 67,8 ± 2,2
(%) 42,7 ± 3,9 Eosinófilos (%) 12,4 34,2 ± 1,5 24,6 ± 1,8 37,4 ± 2,3 21,8 ± 1,7
± 1,9 Monocitos (%) 3,7 ± 0,6 4,9 ± 0,4 2,1 ± 0,3 3,9 ± 0,5 3,1 ± 0,3
Basófilos (%) 7 ± 0,4 5,9 ± 0,5 6,7 ± 0,7 6,8 ± 0,5

0,4 ± 0,2 0,5 ± 0,08 0,1 ± 0,04 0,03 ± 0,02 0,2 ± 0,05 0,4 ± 0,05 1,9
Relación H/L 1,5 ± 0,3 0,8 ± 0,06 ± 0,7 0,4 ± 0,05
C. subcristatus
0 2006 2009 2010 2012 2014
norte 7 dieciséis 3 22 13
Linfocitos (%) 40,3 ± 4,1 Heterófilos 52,3 ± 3,4 86,3 ± 0,3 47,9 ± 4,3 68,6 ± 4,3
(%) 43,3 ± 4 Eosinófilos (%)
2,3
9,7 ± 36,8 ± 2,9 9,6 ± 0,3 45,3 ± 4 21,8 ± 3,7
Monocitos (%) 6 ± 1,9 Basófilos 5,1 ± 0,7 0 1,7 ± 0,3 2,3 ± 0,7
(%) 0,7 ± 0,3 Relación H/L 5,3 ± 0,9 4 5 ± 0,8 7,1 ± 1

0,4 ± 0,1 0 0,04 ± 0,04 0,07 ± 0,07
2,7 ± 1,1 0,8 ± 0,1 0.1 1,8 ± 0,6 0,4 ± 0,08
1 norte 18 61 17 50 40
Linfocitos (%) 34,6 ± 2,5 Heterófilos 49,7 ± 2 60,1 ± 2,9 47,2 ± 2,7 54,6 ± 3
(%) 47,5 ± 2,2 Eosinófilos (%) 13,2 38,9 ± 1,5 30,6 ± 2,4 44,4 ± 2,3 32,1 ± 2,3
± 1,5 Monocitos (%) 4,1 ± 0,7 5,1 ± 0,4 2,8 ± 0,5 2,9 ± 0,7 4,8 ± 0,8
Basófilos (%) 5,9 ± 0,6 5 ± 1 5,4 ± 0,9 8 ± 0,6

0,4 ± 0,2 0,4 ± 0,09 0,6 ± 0,2 0,08 ± 0,05 0,3 ± 0,09
Relación H/L 1,5 ± 0,1 1 ± 0,1 0,5 ± 0,07 1,4 ± 0,2 0,9 ± 0,1
Tabla 2. Perfiles de leucocitos en Conolophus marthae y Conolophus
subcristatus según diferentes grados de infección por Hepatozoon (0: no
infectado; 1: infectado). (n: número de frotis analizados).
Conolophus subcristatus mostró mayor H (F1,525 = 10,820; P = 0,001) y
relación H/L (F1,525 = 3,713; P = 0,053) que CM. La relación H, L y H/L
varió entre temporadas (H: F2525 = 19,345; P 0; L: F2525 = 13,173; P
0; H/L: F2525 = 12,697; P 0) , sin diferencia entre especies
(especie*temporada: F1,525 = 0,467; P = 0,495). Específicamente, H y la
relación H/L fueron significativamente más bajas en julio, mientras que L
mostró el patrón opuesto (para todas las pruebas post hoc P 0). Con la única excepción de
glóbulos blancos fueron influenciados por parasitema, con tendencias contrastantes:
positivo para H (F2,525 = 4,160; P = 0,042) y relación H/L (F2,525 = 4,639; P =
0,032), y negativo para L (F2, 525 = 3,960; P = 0,047) y M (F2,525 = 4,035; P =
0,045).
En ambas especies no observamos correlaciones significativas entre PCV y
parasitemia (CM: P = 0,2; CS: P = 0,4) ni diferencias de PCV entre individuos
infectados y no infectados (CM: P = 0,2; CS: P = 0,2 ).
El BCI no difirió entre especies sino solo entre sexos, resultando mayor en los
machos de ambas especies (F1,535 = 16.216; P = 0.0001).
Además, el BCI no difirió entre individuos infectados y no infectados en ambas
especies y no se correlacionó con la parasitemia o la carga de garrapatas (para
todas las pruebas, P ≥ 0,05).
3.2) Comparaciones de sitios (C. subcristatus)
En general, en Bahía Urbina observamos un menor número de garrapatas que en
Wolf (t = 46, P < 0,00001) así como un menor número de individuos infectados por
Hepatozoon (prevalencia 9,7%; n = 31; Tab. 1).
La parasitemia fue significativamente mayor en el volcán que en Bahía Urbina por
sitio (F1272 = 44,29, P 0) y estación (F1272 = 3,774, P = 0,024).
La relación H, L y H/L no difirió entre sitios (para todos los parámetros F1,272 ≤
1,138, P ≥ 0,372), pero mostró patrones temporales claros específicos del sitio
(temporada (sitio) H: F2, 271 = 8,599, F2,
P 2 71
0; L=:
F
10,028,
2, 271 P
= 5,749,
0). EPspecíficamente,
= 0la
,017;
relación
H/L: H
y H/L en Bahía Urbina (junio) fue menor que la relación H y H/L observada en V.
Wolf en mayo (H: P 0; H/L: P = 0,00001) y junio (H: P = 0,0005; H/L: P = 0,0003),
mientras que no hubo diferencia entre Bahía Urbina y V. Wolf (julio) para la relación
H y H/L (H: P = 0,43; H/L: P = 0,97) (H/L: Fig. 5). L mostró un patrón opuesto
observándose valores más altos en V. Wolf en mayo (P = 0.00002) y junio (P =
0.0003), mientras que no se observó diferencia entre B. Urbina y la muestra de julio
de V. Wolf (P = 0.99 ). El BCI difirió significativamente entre sitios resultando mayor
en Bahía Urbina (F2,272 = 66,153, P 0).
0,1
0,0
0,1
0,2
REGISTRO
H/
L
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Puede Junio Julio LOBO
BAHÍA URBINA
Estación
Figura 5. Patrón de la relación H/L en relación con la estación y el sitio en C.
subcristatus.
4. Discusión
Ambas poblaciones de iguanas terrestres presentaron una alta prevalencia
de infección por Hepatozoon con bajos niveles de parasitemia durante todo
el período de estudio. El hepatozoon nunca desapareció de los individuos
infectados. Por el contrario, se produjeron muchos casos de “infección
nueva” (los valores de incidencia fueron altos para ambas especies: CS 66%, CM 60%).
Generalmente, una vez infectados, los animales de vida libre muestran una
presencia relativamente estable de hemoparásitos durante largos períodos
(Smallridge y Bull 2000). Para las hemogregarinas, la eliminación o
disminución de la parasitemia en reptiles se ha observado en pocos estudios
(Smallridge y Bull 2000; Salkeld y Schwarzkopf 2005). De hecho, estos
hemoparásitos, como muchos protozoos parásitos de larga vida, persisten a
lo largo de la vida del huésped (De Biasi et al. 1989; De Vieira Santos et al.
2005). Sin embargo, los factores que explican la persistencia de la
hemogregarina a largo plazo en huéspedes vertebrados son poco conocidos.
Como ya se describió para los protozoos hemogregarinos en serpientes y
tortugas, podemos hipotetizar dos escenarios: (i) casos de reinfección continua con reposición
etapas de multiplicación asexual del parásito en los tejidos del huésped, o
(ii) liberación de merozoítos latentes con la consiguiente transformación en
gametocitos (Jakes et al. 2003; Široký et al. 2004).
Nuestro estudio no pudo confirmar algunas relaciones positivas esperadas.
Por ejemplo, no pudimos proporcionar evidencia de una relación positiva
entre el número de garrapatas y el número de tipos específicos de
leucocitos o en particular con la relación H/L, como se observa en Lobato
et al. (2005). Tampoco encontramos ningún efecto del tamaño corporal en
la relación H/L, de manera consistente con lo observado en Mole
Salamanders por Davis y Maerz (2008). Sin embargo, observamos que
incluso los niveles bajos de parasitemia, aunque no afectaron el índice de
condición corporal y el hematocrito, sí afectaron los perfiles de leucocitos,
y los glóbulos blancos heterófilos mostraron un papel predominante en la
respuesta inmune en Conolophus. Específicamente, observamos una
tendencia de los dos glóbulos blancos más abundantes (H, L) a responder
inversamente a la infección por Hepatozoon como se esperaba cuando el
sistema inmunitario se activa contra las hemogregarinas (Xuereb et al.
2012). Generalmente, en reptiles y aves, las proporciones de heterófilos y
por lo tanto la relación H/L muestran los cambios más extremos bajo diferentes niveles de inf
1995; Figuerola et al. 1999; Davis et al. 2004) y, en general, se produce
una mayor proliferación y diferenciación de estos leucocitos fagocíticos
para mejorar la respuesta a la infección (Thrall et al.
2012; Davis et al. 2008). El hecho de que las iguanas de Conolophus
respondan a los parásitos mostrando un mayor número de heterófilos
circulantes (con C. subcristatus más parasitada mostrando una mayor
proporción de heterófilos que C. marthae menos parasitada ) puede reflejar
un alto grado de activación del sistema inmunológico innato y un
dependencia de la proliferación de H con la magnitud de la infección.
Coherentemente, la tendencia opuesta de los linfocitos podría interpretarse
como una redistribución de L de la sangre a los tejidos linfáticos u otros
órganos inducida por el estrés, como se describe comúnmente en los
vertebrados durante una condición de estrés (Dhanhar et al. 1996; Dhabhar
2002). Sin embargo, observamos el pico mínimo de H y relación H/L en
julio cuando la parasitemia alcanzó su valor máximo. Por lo tanto,
planteamos la hipótesis de que los endoparásitos no son el único factor
que afecta este marcador de estrés. La comparación entre dos poblaciones
de C. subcristatus nos permitió explorar más a fondo este resultado inesperado.
En el volcán observamos una relación H y H/L alta en junio, cuando muchas
hembras estaban reproductivamente activas, y la relación H/L mínima
durante julio, cuando CS aparentemente está completando la actividad
reproductiva (Onorati et al. presentado). Nuestros datos podrían sugerir que el
estrés experimentado por las iguanas durante la reproducción contribuyen en
conjunto a la infección de parásitos en los patrones de leucocitos observados.
De hecho, cuando analizamos las poblaciones de C. subcristatus en julio, no
observamos diferencias en el perfil leucocitario entre la de Bahía Urbina,
considerada la “condición en blanco” (casi sin Hepatozoon y fuera de la época
reproductiva), y la fuertemente parasitada de Volcán Wolf. .
Este resultado podría indicar que, a pesar de que Hepatozoon provoca una
activación del sistema inmunológico, especialmente al aumentar los heterófilos
fagocíticos, la diferencia sustancial en H/L entre junio y julio podría deberse a
la fase reproductiva percibida como estresante. Este resultado es consistente
con los estudios de estrés inducido por la reproducción en otros ectotermos,
donde el estado reproductivo determinó un aumento en la relación H/L (Kilgas
et al. 2006; Davis y Maerz 2008). De hecho, sugerimos que las iguanas pueden
tener la capacidad fisiológica de modular la activación de su sistema
inmunológico ante diferentes estresores: reproducción e infección
endoparasitaria, en nuestro caso. Las iguanas mostraron una fuerte activación
del sistema inmunológico cuando entraron en una fase energéticamente
costosa como es la reproducción. El mayor trabajo del sistema inmunitario
durante la reproducción podría resultar directamente en una fuerte infección
consecutiva tan pronto como termine la reproducción y la respuesta inmunitaria
se atenúe, como ocurrió en julio. Ciertamente, este tema merece más atención
y una investigación en profundidad es para aclarar si la diferente intensidad de
los factores estresantes que actúan contemporáneos puede dar como resultado
una respuesta inmune afinada.
En conclusión, además de brindar referencia para futuros estudios de iguanas
en la naturaleza, este estudio entregó información importante para la
conservación de estas especies de iguanas y proporcionó un avance sustancial
en el conocimiento del impacto de Hepatozoon en las especies de Conolophus .
La constancia de la prevalencia de la infección a lo largo de los años sugiere
una interacción estable huéspedparásito que las iguanas parecen capaces de
afrontar. De hecho, a pesar de que Hepatozoon tiene un impacto en
Conolophus, como lo indican los recuentos de glóbulos blancos, la respuesta
del sistema inmunitario en relación con la reproducción parece más fuerte.
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Internacional de Parasitología 21(5): 511516.
46(4): 555561.
CAPÍTULO 4
Efectos de la infección y reproducción parasitarias sobre los niveles plasmáticos
de corticosterona en iguanas terrestres de Galápagos, Conolophus marthae y
Conolophus subcristatus
Onorati M1 , Sancesario G2 , Carrión J3 B, ernardini S2 y , lauro d2 ,

Carosí M1 , Vignoli L1 , Gentile G4 (2016).
1
2
Dipartimento de Medicina Interna, Università Tor Vergata, Roma,
Italia
3
4
Enviado (hormonas y comportamiento)
1. Introducción
En los últimos años, los niveles de glucocorticoides se han utilizado cada vez
más como índices fisiológicos de la salud individual y de la población (Wingfield
et al. 1997; Romero 2004; Walker et al. 2005; Wikelski y Cooke 2006; Bonier et
al. 2009). Se han observado niveles de referencia elevados en animales que
enfrentan perturbaciones ambientales (Foley et al. 2001) y antropogénicas (Creel
1997; Wingfield y Romero 2001).
Generalmente, los niveles elevados de glucocorticoides se relacionan con
individuos o poblaciones en peor estado de salud (Bonier et al. 2009).
Los glucocorticoides (GC) son hormonas esteroides secretadas en respuesta a
una multiplicidad de factores estresantes (Sapolski et al. 2000). Cuando ocurre
un cambio ambiental interno y/o externo, el eje hipotálamopituitariosuprarrenal
(HPA) estimula la secreción de GC por parte de las glándulas suprarrenales para
ayudar al organismo a responder a condiciones estresantes (Wingfield et al.
1997; Wingfield y Ramenofsky 1999; Wingfield y Romero 2001; McEwen y
Wingfield 2003; Wingfield y Sapolsky 2003; Wingfield 2013). Los glucocorticoides
son el producto final del eje HPA y participan en el control de la homeostasis
activando procesos inmediatos de salvamento (Romero et al. 2009).
Normalmente, las liberaciones de glucocorticoides a corto plazo son útiles para
la supervivencia individual porque estimulan mecanismos de emergencia tanto
fisiológicos como conductuales exclusivamente orientados a superar la
perturbación (Wingfield y Romero 2001; Wingfield y Sapolsky 2003). Sin embargo,
la activación a largo plazo de la respuesta al estrés con concentraciones de GC
crónicamente elevadas podría ser perjudicial.
Concentraciones elevadas prolongadas podrían exponer al individuo a una
sobreestimulación a largo plazo de los mecanismos de supervivencia con la
inhibición consecutiva de muchas funciones fundamentales, incluidas la
reproducción, el crecimiento y la inmunocompetencia (Sapolsky 1987; Wingfield et al.
1997; Dhabhar 2000; Sapolsky et al. 2000; Dallman y Bhatnagar 2001). Por lo
tanto, los niveles altos persistentes suelen ser perjudiciales para la salud,
aumentando las enfermedades y patologías relacionadas con el estrés (Romero
et al. 2009).
En reptiles, la corticosterona (CORT) es la principal hormona glucocorticoide
suprarrenal producida para promover respuestas ventajosas frente a eventos
estresantes (Greenberg y Wingfield 1987; Hanke y Kloas 1995). Se ha observado
que muchos factores estresantes producen efectos en los niveles de CORT,
incluidos los factores físicos (Lutterschmidt y Mason
2009; Telemeco y Addis 2014; Refsnider et al. 2015) y estresores bióticos como
depredación (Thaker et al. 2009), competencia social (Comendant et al. 2003) e
infecciones parasitarias (Dunlap y Schall 1995; Hanley y Stamps 2002; Sperry et al.
2009). Sin embargo, la interpretación de la respuesta al estrés a lo largo de CORT
siempre requiere una gran atención, ya que sus niveles plasmáticos cambian de
acuerdo no solo a factores dependientes del estrés (duración e intensidad), sino
también a factores dependientes individuales (sexo y estado reproductivo) que
deben tenerse en cuenta cuando se utilizan GC. utilizados como índices fisiológicos
de condición en poblaciones silvestres (Breuner et al. 1999; Romero 2002; Moore y
Jessop 2003). Debido a que muchos factores juegan un papel en la definición de los
niveles de corticosterona de referencia individuales, para comprender completamente
las consecuencias de los factores estresantes específicos en la actividad endocrina,
es importante examinar las respuestas en diferentes contextos individuales (por
ejemplo, el estado reproductivo), investigando concomitantemente correlatos
adicionales como el sistema inmunológico. , cuya conexión con el estrés y los
glucocorticoides ya ha sido bien establecida (Dhabhar 2002; Martin 2009).
En este estudio examinamos las alteraciones en los niveles de corticosterona que
acompañan a las infecciones hemoparasitarias en dos poblaciones sintópicas de
iguanas terrestres de Galápagos que viven en Volcán Wolf (Isla Isabela): Conolophus
marthae (aquí la iguana rosa) (En Peligro Crítico, Lista Roja de la UICN) y Conolophus
subcristatus ( aquí la iguana amarilla)
(Vulnerable, Lista Roja de la UICN). En el área se encuentra una población de alta
densidad de garrapatas (Amblyomma spp.) (Schatz 1991). Se sabe que las
garrapatas son vectores potenciales de transmisión de hemoparásitos (Telford 1984).
En concreto, los hemoparásitos intracelulares,
esporozoos
hemogregarinas
del género H
de
epatozoon, como
son los hemoparásitos de reptiles más comunes transmitidos por garrapatas.
El género Hepatozoon (Apicomplexa: Adeleorina) está presente en las Islas
Galápagos con diferentes especies (Bataille et al. 2012). Hay muy pocos datos
disponibles sobre los efectos de las hemogregarinas en huéspedes reptiles (Schall
1986; Manwell 1977; Sorci 1995), pero parecen capaces de provocar respuestas
inflamatorias significativas (Wozniak y Telford 1991; Stacy et al. 2011) y enfermedades
como anemia hemolítica (Telford 1984).
También utilizamos una población de C. subcristatus que se encuentra en una zona
costera donde notoriamente falta la presencia de parásitos (Bahía Urbina), como
condición “en blanco” para las comparaciones endocrinológicas. Por lo tanto,
si la secreción de glucocorticoides es una función de la infección, esperamos los
niveles plasmáticos de corticosterona de referencia más altos en la mayoría de la
población parasitada en el volcán. Además, considerando el complejo escenario
relacionado con la actividad de la glándula suprarrenal, para interpretar mejor los
patrones de glucocorticoides observados, analizamos simultáneamente: (a) la
relación heterófilos/linfocitos comúnmente utilizada como marcador hematológico
de estrés en varias especies de reptiles (Duggan 1981; Moberg 1985; Xuereb et al.
2012), (b) el estado reproductivo de las hembras a través de la identificación
ecográfica de los huevos, ya que la CORT podría aumentar durante la temporada
de puesta de huevos (Wack et al. 2008), (c) los niveles plasmáticos de testosterona
en los machos, que tienen se ha asociado con una mayor carga de parásitos debido
a su actividad inmunosupresora (Folstad y Karter 1992; Saino et al. 1995; Salvador
et al. 1996).
2.1) Declaración ética
La manipulación de los animales y la toma de muestras de sangre se realizaron de
acuerdo con un protocolo que minimizaba el estrés de los animales, de acuerdo con
las directrices de la Comunidad Europea y con la aprobación del Parque Nacional
Galápagos. Las muestras fueron exportadas e importadas bajo los permisos CITES
101/BG e IT/IM/2015/MCE/01711, respectivamente.
2.2) Sitios de campo y sesiones de muestreo
El estudio se realizó en dos áreas diferentes de la isla Isabela: el Volcán Wolf, el
pico más alto (1.707 m) del archipiélago de Galápagos ubicado en el lado norte de
la isla, y Bahía Urbina, una zona costera turística situada en el lado oeste (Fig. . 1).
Las muestras de sangre de iguana fueron recolectadas en Volcán Wolf (O) en julio
de 2010 y junio de 2012, 2014; y en Bahía Urbina (BU) en junio de 2014.
Figura 1. Islas Galápagos. El triángulo indica el volcán Wolf, el círculo la zona costera
Bahía Urbina donde se recolectaron las muestras.
2.3) Fase de campo
Durante todas las sesiones de campo, se recolectaron 2 mL de sangre de la vena
caudal de cada individuo utilizando una jeringa heparinizada de 5 mL. Las muestras de
sangre se recolectaron dentro de los 3 a 5 minutos desde la captura, bajo el supuesto
de que esto representa un tiempo suficientemente corto para que los niveles de
corticosterona representen las concentraciones de referencia (Romero y Romero
2002). De hecho, este intervalo de tiempo es suficientemente corto para evitar que los
niveles plasmáticos de corticosterona estén sesgados por el estrés de captura
(Wingfield et al. 1997; Sapolsky et al. 2000; Romero and Wikelski 2001; Romero 2004;
Cash et al. 1997; Tyrrell and Cree 1998).
Colocamos aproximadamente 10 microlitros de sangre en la parte superior de un
portaobjetos y creamos un frotis. Los frotis de sangre se secaron al aire. Las muestras
de sangre se colocaron en hielo inmediatamente después de la recolección y luego se
centrifugaron durante 2 minutos a 2000 rpm para separar el plasma. Cada iguana se
pesó y se midió la longitud hocicocloaca (SVL). Luego se estimó el índice de condición
corporal (BCI) como la relación masa corporal/longitud hocicocloaca (SVL)3 x 106 (la
relación se multiplicó por 106 para reducir el número de decimales). Este índice ya se
ha utilizado
para especies de iguanas (Laurie 1989; Wikelski y Trillmich 1997, Romero y
Wikelski 2001; Costantini et al. 2009). Para cada hembra, determinamos el
número de huevos, el tamaño del huevo y la etapa de desarrollo de los folículos
utilizando una máquina de ultrasonido portátil Sonosite (FUJIFILM SonoSite,
Inc.) como en Onorati et al. (presentado). Determinamos el estado reproductivo
de cada hembra, diferenciando entre hembras reproductivas (portadoras de
huevos) y no reproductivas (sin huevos). Distinguimos diferentes estadios
reproductivos: (estadio a) hembras que muestran folículos con huevos de
dimensiones homogéneas, esféricas y pequeñas, (estadio b) hembras que
muestran huevos más grandes, pero no completamente formados, sin cáscara,
(estadio c) hembras que muestran huevos grandes, completamente formados ,
huevos sin cáscara; hembras no reproductivas cuando no había huevos visibles
(etapa d).
2.4) Fase de laboratorio: análisis hematológico
Los frotis de sangre se tiñeron siguiendo el método de Romanowsky, con
modificaciones (Work et al. 1998) para el posterior recuento de glóbulos blancos
(WBC). Contamos un total de 100 leucocitos. Las células se clasificaron como
heterófilos, monocitos, basófilos, eosinófilos o linfocitos. Calculamos
específicamente la proporción de heterófilos a linfocitos (H/L).
La parasitemia se determinó registrando el número de eritrocitos infectados por
Hepatozoon (hasta el momento el único hemoparásito conocido que infesta a
Conolophus spp., Fulvo 2010) observado en 20 minutos. Si no se observaban
hemoparásitos después de este tiempo, el individuo se clasificaba como no
infectado.
2.5) Fase de laboratorio: análisis hormonal
A pesar de que el radioinmunoensayo (RIA) es un método común para cuantificar
las hormonas esteroides en vertebrados, determinamos los niveles plasmáticos
de corticosterona y testosterona mediante ensayos inmunoabsorbentes ligados
a enzimas competitivos (ELISA), por las razones mencionadas en Onorati et al.
(presentado).
Todos los inmunoensayos ELISA se realizaron en el Laboratorio de Bioquímica
Clínica (Hospital Universitario Tor Vergata). Las muestras de plasma se
conservaron a 40 °C hasta que se analizaron. Para la corticosterona usamos
cinco kits ELISA (KA0468) prerecubiertos con un anticuerpo policlonal.
Usamos 10 µl de plasma diluido con 90 µl de tampón de ensayo. Él
el límite de detección se estableció en 0,28 ng/mL. La variación intraensayo fue del
4,1% y la variación interensayo del 10,1%.
Para testosterona usamos cuatro kits ELISA (KA0309) prerecubiertos con un
anticuerpo monoclonal. Utilizamos 50 µl de plasma para la detección de la hormona.
El límite de detección se estableció en 5,67 pg/mL. La variación intraensayo fue del
10 %, la variación interensayo del 11,3 %.
Todas las muestras se analizaron por duplicado y se distribuyeron aleatoriamente
entre placas. Todos los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones de
los fabricantes del kit.
Los análisis fueron realizados por el paquete STATISTICA 8 para Windows, y Past
versión 3.07 para MAC.
Se utilizaron los valores transformados logarítmicamente de todos los parámetros
hormonales y hematológicos para obtener distribuciones normales. Utilizamos
ANOVA de una vía con HSD (Diferencia Significativa Honesta) de Tukey
comparaciones por pares post hoc para analizar las diferencias en los niveles
plasmáticos de parasitemia y corticosterona entre años.
Probamos las diferencias estadísticas de parasitemia, índice de condición corporal
y relación H/L entre infectados y no infectados y entre sexos con la prueba t de
Student no pareada .
Se realizaron modelos lineales generalizados (GLZ) con una función de enlace de
identidad para evaluar qué factores explicaban mejor la variación de los niveles
plasmáticos de corticosterona y testosterona. Hembras y machos se analizaron por
separado en modelos GLZ, ya que en vertebrados se han descrito diferencias
sexuales en la actividad adrenocortical (Kirschbaum et al. 1992; Kudielka y
Kirschbaum 2005). Para la corticosterona, para ambos sexos construimos dos
modelos diferentes, uno combinando C. marthae (CM) y C. subcristatus (CS) que
viven en el volcán y otro combinando ambas poblaciones de CS (W+BU).
La testosterona se analizó solo en hombres.
Para los machos, todos los modelos incluyeron la especie (o el sitio para el modelo
considerando solo las poblaciones de CS ) como factor categórico y el índice de
condición corporal, la parasitemia y la relación H/L como covariables. Para las
hembras, todos los modelos incluyeron especie (o sitio para el modelo con respecto
solo a las poblaciones de CS ), estado reproductivo (sí o no) como factor categórico
e índice de condición corporal, parasitemia, relación H/L como covariables.
Probamos también la interacción entre las especies y el estado reproductivo.
3) Resultados
3.1) Corticosterona y parasitemia
La parasitemia de ambas especies se muestra por sexo en la Tabla 1.
En general, C. subcristatus mostró un mayor valor de parasitemia que C. marthae (t = 4,3;
P = 0,00005).
Para ambas especies no se encontró diferencia en la parasitemia entre años, en machos o
hembras (para todos P > 0.05). Ni siquiera surgió una diferencia entre sexos (CM: t = 1,7, P =
0,08; CS: t = 0,9, P = 0,3). En ambas especies no observamos una diferencia significativa en
los niveles plasmáticos de corticosterona de individuos infectados y no infectados al agrupar
sexos y años (CM: t = 0,7, P = 0,5; CS: t = 1,2, P = 0,8).
La parasitemia no explicó la variación de los niveles plasmáticos de corticosterona tanto en
machos (Wald = 0.005, df = 1, P = 0.94) como en hembras (Wald = 0.74, df = 1, P = 0.39) en
el volcán Wolf y también considerando solo poblaciones de CS (W+BU) (mujeres: Wald =
0,02, df = 1, P = 0,88; hombres: Wald = 2,74, df = 1, P = 0,09). Solo en el CS del volcán surgió
una correlación positiva entre la relación H/L y la parasitemia (r = 0.27; P = 0.04). En ambas
especies, el BCI no difirió entre infectados y no infectados (CM: t = 0,7, P = 0,5; CS: t = 0,8,
P = 0,4).
Especies
Sexo norte parasitemia
Año
Significar SE Mediana
Hembras cm (ancho)
2010 9 30 10.8 15
2012 11 44.4 24.5 14
2014 18 27.7 13.3 9
CS (W)
2010 4 98.2 43.6 101.5
2012 11 59.4 34.5 11
2014 14 46,8 20.8 17
machos cm (ancho)
2010 8 22.1 8.1 14
2012 11 17.1 6.6 11
2014 23 8.5 3.1 3
CS (W)
2010 4 48 65.8 19.6
2012 11 28 33.5 12
2014 12 41 25 3.5
Hembras CS (BU)
2014 15 1.6 1.6 0
machos CS (BU)
2014 12 0.08 0.08 0
Cuadro 1. Parasitemia de C. subcristatus (CS) y C. marthae (CM)
de Volcán Wolf y C. subcristatus de Bahía Urbina.
3.2) Niveles plasmáticos de corticosterona en mujeres
El estado reproductivo de las hembras se reporta en la Tabla 2.
En las hembras de C. marthae , los niveles plasmáticos de corticosterona variaron de
0,16 a 74,11 ng/ml, mientras que en C. subcristatus de 0,22 a 158 ng/ml (las medias
y medianas se muestran en la Tabla 3).
Para ambas especies se observaron diferencias estadísticamente significativas entre
años (CM: F = 6,3; P = 0,004; CS: F = 5,9 P = 0,007). Las pruebas HSD de Tukey por
pares indicaron respectivamente: en CM los niveles más altos de CORT en 2012
(P20122010 = 0,03, P20122014 = 0,007), en CS una concentración más alta en
2012 que en 2010 (P20122010 = 0,009). En el volcán, la variación de los niveles de
corticosterona fue explicada únicamente por el estado reproductivo (Wald = 7.89, df =
1, P = 0.005, Fig. 2) y por su efecto interactivo con las especies (Wald = 4.55, df = 1,
P = 0.03, figura 3).
La varianza de la corticosterona no se explicó estadísticamente por H/L, aunque el
valor de P estuvo en el límite (Wald = 3,54, df = 1, P = 0,059).
Ninguna variable explicó la varianza de los niveles de corticosterona en hembras de
CS (W+BU) (todas P > 0,09).
No observamos un efecto significativo del índice de condición corporal en las
variaciones de corticosterona (todos P > 0,2).
Año Etapa reproductiva Nene

Especies
a b C d
2010 0 0 3 6 9
CM 1 11
2012 0 0 10
2014 3 0 1 14 18
2010 0 0 0 4 4
CS 1 11
2012 0 0 10
2014 1 1 8 5 15
Cuadro 2. Estados reproductivos de hembras que viven en volcán.
Reproductivo
Sexo Especies norte
Corticosterona ng/ml
Expresar
Año norte Significar SE Mediana
Hembras C. Marthae
2010 9 3 3.8 2.8 0.9
2012 11 1 13.4 6.7 4
2014 18 4 8.9 1.4 0.6
C. subcristatus
2010 4 0 2.2 0.8 1.9
2012 11 9 75.1 19.5 105
2014 15 10 dieciséis 7.7 5.1
machos C. Marthae
2010 7 31.1 31.1 27,9 2.7
2012 11 1.1 1.1 0.4 0.5
2014 23 1.9 1.9 0.7 0.7
C. subcristatus
2010 4 5.4 5.4 3.9 2.1
2012 11 20.5 20.5 9.7 10.6
2014 dieciséis 13.7 13.7 9.4 0.8
Tabla 3. Niveles plasmáticos de corticosterona en C. marthae
y C. subcristatus del Volcán Wolf.
Figura 2. Corticosterona y estado reproductivo.
Figura 3. Variación de corticosterona en relación al efecto interactivo
entre especies y estado reproductivo.
3.3) Niveles plasmáticos de corticosterona y testosterona en hombres
En machos de C. marthae, los niveles plasmáticos de corticosterona oscilaron
entre 0,21 y 13,9 ng/ml, mientras que en C. subcristatus oscilaron entre 0,19 y 153
ng/ml (las medias y medianas se muestran en la Tabla 3). Para ninguna de las
dos especies observamos diferencias estadísticamente significativas entre años
(CM: F = 1,5, P = 0,2; CS: F = 2,3, P = 0,1). En Volcán Wolf, la variación de los
niveles de corticosterona se explicó únicamente por la relación H/L (Wald = 7,35,
df = 1, P = 0,007). El sitio fue la única variable explicativa de la varianza de la
corticosterona para el modelo con poblaciones agrupadas de C. subcristatus (Wald
= 10,35, df = 1, P = 0,001).
Los machos de Bahía Urbina mostraron niveles plasmáticos de corticosterona
más altos que los del volcán (Fig. 4). En cuanto a las mujeres, la varianza de la
corticosterona en los hombres no se explicó estadísticamente por H/L, aunque el
valor de P estuvo en el límite (Wald = 3,64, df = 1, P = 0,056).
No observamos una correlación estadísticamente significativa entre los niveles
plasmáticos de corticosterona y testosterona (para ambas poblaciones en el volcán
P > 0,05). En la GLZ, la especie fue la única variable explicativa de la variación en
los niveles de testosterona en el volcán (Wald = 4.62, df = 1, P = 0.03); en
particular, los machos CM mostraron concentraciones de testosterona más altas
que los machos CS. La parasitemia y la relación H/L no explicaron la variación en
los niveles plasmáticos de testosterona en el volcán (Parasitemia: Wald = 0,05, P
= 0,82; relación H/L: Wald = 0,03, P = 0,86).
No observamos un efecto significativo de ninguno de los factores considerados en
los niveles de testosterona para el modelo con poblaciones agrupadas de C.
subcristatus (todos P > 0,3).
1,5
1,4
1,3
1,2
1,1
1,0
CORTE
(registro)
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
LOBO BAHÍA URBINA
Sitio
Figura 4. Variación de corticosterona en Conolophus subcristatus en
relación al sitio.
4. Discusión
En este estudio, utilizamos los niveles de corticosterona en plasma para
investigar los posibles impactos del Hepatozoon en la fisiología del estrés de
las iguanas terrestres de Galápagos; sin embargo, no encontramos ninguna
evidencia que apoye una relación entre el nivel de infección por hemoparásitos
y la concentración plasmática de glucocorticoides en C. marthae y C.
subcristatus en Volcán Wolf. De hecho, en ambas especies no observamos
diferencias significativas en los niveles basales de corticosterona ni en el
índice de condición corporal entre individuos infectados y no infectados. Solo
en los machos observamos una diferencia entre sitios, pero inesperadamente,
la mayor concentración de corticosterona se encontró en la población de
Bahía Urbina, casi no afectada por Hepatozoon. Estos resultados indican
que la intensidad de la infección por hemoparásitos no se refleja en los
niveles de glucocorticoides de las iguanas terrestres de Galápagos.
Sin embargo, llama la atención la inesperada diferencia en los niveles de la
hormona del estrés entre V. Wolf y Bahía Urbina. Bahía Urbina es una zona
costera turística visitada regularmente por humanos; en cambio, V. Wolf es un
área restringida donde no se permite el turismo. El turismo podría ser un factor
hipotético que podría explicar los diferentes niveles de corticosterona en los dos
sitios. Sin embargo, somos conscientes de que los dos sitios también pueden diferir
en otras características. Por lo tanto, no podemos distinguir si las diferencias que
observamos se deben a factores dependientes de la población, como diferente
estatus social y/o capacidad de habituación (Romero 2004), factores dependientes
del sitio como el turismo (Romero y Wikelski 2002) y parámetros ambientales
( Smith et al. 1994; Romero y Wikelski 2001) que podría diferir entre sitios. Por esta
razón, necesitamos investigar más a fondo este aspecto. De todos modos, esta
comparación entre poblaciones nos permite excluir una condición de estrés crónico
por hemoparásitos. Podríamos plantear la hipótesis de que el nivel de
hemoparasitismo que observamos podría no alcanzar el umbral requerido para
activar las respuestas endocrinas. Sabemos que estos parásitos podrían estar bien
adaptados a sus huéspedes naturales y, a veces, se considera que no causan
estrés ni enfermedades (Nardini et al. 2013).
Sin embargo, a pesar de que no se detectó una concentración plasmática elevada
de corticosterona con parasitemia, en C. subcristatus se encontró un aumento en la
relación H/L. Así, en la iguana amarilla surgió una activación del sistema
inmunológico especialmente en las células fagocíticas, como se reporta para
muchos vertebrados parasitados (Davis et al. 2004; Lobato et al. 2005).
La mayoría de los estudios sobre la fisiología del estrés, incluida la presente
investigación, se basaron en datos correlativos. En los reptiles, como en otros
vertebrados, una serie de factores afectan la actividad adrenocortical (Wingfield et al.
1992; Romero 2002; Moore y Jessop 2003). En este estudio, el nivel plasmático de
corticosterona se correlacionó positivamente con la condición reproductiva en las
mujeres. Los niveles de corticosterona parecían elevados en las hembras que
llevaban huevos (pequeños, no completamente formados o completamente
formados) en ambas especies de iguanas terrestres. También en las iguanas
marinas, la CORT se elevó principalmente durante el período de gestación y
anidación antes de la puesta de huevos, para disminuir significativamente
inmediatamente después de la puesta de huevos (Rubenstein y Wikelski 2005). Sin
embargo, la conexión entre la condición reproductiva y los niveles de glucocorticoides
en plasma no está del todo aclarada, incluso para los grupos mejor estudiados
como los peces y las aves (Lattin et al. 2016). En nuestro estudio, el aumento
observado de CORT en hembras reproductivas podría reflejar las demandas energéticas de la reproduc
Esto sería consistente con la hipótesis de movilización de energía de Wingfield y
Ramenofsky (1999), según la cual las concentraciones de corticosterona son más
altas durante los períodos que requieren aporte de energía.
Sin embargo, la CORT no aparece como un simple mediador de la movilización
de reservas energéticas para la reproducción. Un aumento de CORT parece
tener un papel en el proceso de producción de huevos. Esta hipótesis está
respaldada por la observación de que, mientras que todas las hembras no
reproductivas mostraron niveles basales de corticosterona similares sin diferencia
entre especies, en las hembras reproductivas observamos una diferencia a favor
de la iguana amarilla, en la que la mayoría de las hembras reproductivas (90%)
mostraron huevos maduros. Este aumento de CORT en hembras reproductivas
con huevos completamente formados podría ser la consecuencia directa de un
cambio metabólico requerido para el desarrollo del huevo, como ya se ha descrito
en otros reptiles (Wilson y Wingfield 1992). De hecho, en general, se ha
observado una asociación positiva entre el estado reproductivo y el nivel de
glucocorticoides para muchos vertebrados que ponen huevos (Silverin y Wingfield
1982; Wilson y Wingfield 1992; Wack et al. 2008).
Muchos estudios demostraron la participación de los glucocorticoides en procesos
relacionados directamente con el desarrollo del óvulo (vitelogénesis, maduración
de ovocitos, ovulación) (Grassman y Crews 1989; Moore y Jessop 2003; Taylor
et al. 2004). Este es el primer estudio donde se describe una relación significativa
entre la condición reproductiva y los niveles basales de corticosterona en plasma
para las especies de Conolophus .
Otro problema que investigamos se refería a los niveles plasmáticos de
testosterona en los hombres en comparación con los niveles de corticosterona.
Varios estudios de vertebrados no mamíferos han demostrado que la
corticosterona exógena puede reducir los niveles de testosterona en plasma en
diversos grados (Moore y Zoeller 1985; Wingfield y Silverin 1986; Tokarz 1987).
Sin embargo, los niveles plasmáticos de testosterona y corticosterona también
pueden aumentar simultáneamente (Orchinik et al. 1988).
Estos resultados opuestos subrayan que la interpretación de la relación entre el
eje suprarrenal y gonadal no es simple. En los machos de iguana rosada
observamos niveles de testosterona más altos que en las iguanas amarillas.
Sin embargo, nunca surgió una diferencia en los niveles de corticosterona entre
dos especies. La falta de correlación entre los niveles individuales de
corticosterona y testosterona indica que los niveles más altos de testosterona
que observamos en C. marthae son parcialmente independientes de las hormonas
del estrés. En la mayoría de los vertebrados, la expresión completa del
comportamiento agresivo requiere niveles basales elevados de esteroides gonadales (Book et al. 20
Los aumentos de testosterona están asociados con un comportamiento más
sexual y agresivo (Miles et al. 2007). En nuestro estudio, los niveles más altos de
testosterona en C. marthae concuerdan con las observaciones
en el campo, donde los machos parecían más agresivos y desafiantes
después de ser liberados que los machos amarillos congéneres. La
testosterona puede estar involucrada en la agresión asociada con el
establecimiento y mantenimiento de un territorio de reproducción
(Wingfield y Marler 1988; Wingfield et al. 1990). Esto también es
concebible que ocurra en Conolophus , aunque la falta de una relación
entre la parasitemia, la relación H/L y la variación de la testosterona
no apoyaría la acción inmunosupresora generalmente asociada con
un alto nivel de tal hormona.
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CAPÍTULO 5
Conclusiones
Este estudio tuvo un lugar importante en la investigación de campo ya que fue el
primero en investigar los aspectos endocrinos y fisiológicos de las iguanas terrestres
amenazadas de Galápagos.
A lo largo de la primera parte del proyecto de doctorado, el análisis de las hormonas
esteroides sexuales progesterona (P4) y 17βestradiol (E2) permitió describir una
época reproductiva específica en Volcán Wolf para Conolophus subcristatus, mientras
que para C. marthae, la reproducción efectiva en este la especie parece obstaculizada,
lo que determina el desgaste.
La adquisición de conocimientos en biología reproductiva permitió también la
interpretación de las respuestas de estrés del sistema inmunológico y endocrino. De
hecho, la identificación de la época reproductiva permitió controlar un posible factor de
confusión, como es la reproducción, en el estudio de la dinámica del estrés.
El segundo paso del proyecto se centró en la fisiología del estrés. Este fue el primer
estudio que abordó este tema, con diferentes marcadores de estrés, en iguanas de
Conolophus . Gracias a los perfiles hematológicos, se describió cómo Hepatozoon
provocó una activación del sistema inmunológico, especialmente de formas heterófilas
fagocíticas; sin embargo, también se aclaró que tanto la reproducción como la infección
parasitaria contribuyeron a los patrones de leucocitos observados. En este estudio, la
capacidad fisiológica de las iguanas para modular la actividad del sistema inmunológico
en respuesta a diferentes estresores (reproducción e infección endoparasitaria) surgió
explícitamente por primera vez en reptiles. Otro aspecto que surgió en estas especies
de iguanas durante el análisis de la fisiología del estrés fue que la relación H/L parecía
ser un indicador más persistente de estrés por parásitos que los niveles más sensibles
de corticosterona. Los niveles de la hormona del estrés aumentaron exclusivamente
como respuesta a una situación natural y potencialmente mortal como la reproducción.
Estos resultados confirmaron que el papel de los glucocorticoides durante la
reproducción es complejo y que la interacción entre los sistemas suprarrenal y gonadal
puede ser importante para la eficiencia reproductiva, disipando la suposición de que la
activación suprarrenal es necesariamente perjudicial. En general, probé que la
corticosterona inicial y la relación H/L no se pueden usar indistintamente como
indicadores de estrés por parásitos, pero juntos pueden proporcionar una imagen
completa sobre el
estado de estrés de las especies de iguanas en estudios in situ .
El resultado final adicional de este estudio fue de implicación metodológica. De hecho, si bien
los objetivos específicos del proyecto variaron entre dos partes diferentes de la tesis
(reproducción y fisiología del estrés), ambas tenían en común el enfoque metodológico que era
el uso de ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) para analizar los niveles de
hormonas esteroides en plasma. . Este estudio validó con éxito el método ELISA en especies
de iguanas terrestres. Este procedimiento pareció ser un buen candidato para un método
alternativo de RIA (radioinmunoensayo) más costoso y peligroso, y será útil en el futuro para
estudios endocrinos sobre hormonas esteroides en otras especies de iguanas.
En conclusión, este estudio mejoró el conocimiento de la biología reproductiva de las especies
de Conolophus . La información obtenida será la base para futuras investigaciones destinadas
a revelar posibles dificultades reproductivas, especialmente para las especies nuevas y
amenazadas C. marthae.
Además, este estudio proporcionó una evaluación integral de la fisiología del estrés relacionado
con los parásitos, proporcionando datos sensibles para la implementación de futuras acciones
de conservación.
AGRADECIMIENTOS
Un pequeño espacio para agradecer.
Viví tres años muy intensos, con experiencias únicas que quedarán en mi
corazón para toda la vida. Todo esto no hubiera sido posible sin el apoyo de mi
maravillosa familia. Así que el mayor agradecimiento es para ellos. Presencia
simple y profunda.
Un segundo agradecimiento, pero no menos importante que el primero, es para
mi Amada, Amiga, Compañera de Vida: Simone. Me apoyó incondicionalmente,
comprendiendo cada momento de crisis y alegría. Suavemente, nunca exigió,
sino que dio certezas. Claramente, muchas gracias también a su maravillosa
familia.
Gracias a mi viejo Elliott, siempre dispuesto a brindar amor incondicional.
Otro agradecimiento va para mi amiga Livia. Compartimos tanto: lágrimas,
miedos, pero también ricas risas. Tuve la suerte de haber recorrido parte de este
camino con ella.
Agradezco al Parque Nacional Galápagos por la hospitalidad y la oportunidad de
vivir allí tres meses inolvidables.
Me gustaría expresar mi agradecimiento a mis tutores Leonardo, Monica y
Gabriele. Una palabra más para Leo, ya que comencé con él hace muchos años,
así que muchas gracias por todo el apoyo moral que me brindó durante este
camino de crecimiento.
Antes de cerrar me doy las gracias. Siempre pensé que el crecimiento cultural,
la curiosidad por la vida y la rectitud de alma eran fundamentales para ser mejor
persona. No sé qué me depara el futuro, pero seguiré creyendo en estos valores
para siempre.

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Onorati M1 , Sancesario G2, Carrión J3 , bernardini s2 , lauro d2 ,

foliculares formados (b) 2 formados (c)

máx. 0.503 2.358 19.045

Estar de pie. desarrollador 0.017 0.942 6.718

Onorati M1 , Fulvo A2 , Buen hombre S3 , Cruz M4 , Casagrande S2 , Cedeño

Año norte % infectado parasitemia ectoparásitos

2006 dieciséis 87.5 9.7 3.1 ­ ­

2009 79 87.3 16.2 3.6 ­ ­

2010 56 83,9 20,3 3,5 ­ ­

2012 82 76,8 29,3 6,4 40,9 2.3

2009 77 79,2 45,8 8,9 ­ ­

2010 20 85 168,4 97 ­ ­

2012 72 69,4 97,4 24,1 41.6 2.5

Linfocitos (%) 53 ± 6 Heterófilos 53,7 ± 3,9 71,1 ± 4,8 62,4 ± 4,7 65,1 ± 3,9

(%) 35,5 ± 4,5 34,9 ± 3,4 21,4 ± 4,4 29,9 ± 4,2 23,5 ± 3,2

Eosinófilos (%) 4,5 ± 1,5 Monocitos 5,3 ± 0,9 0,5 ± 0,3 3,2 ± 0,6 3,1 ± 0,7

(%) 6,5 ± 3,5 Basófilos (%) 5,5 ± 1,2 6,7 ± 1,1 0 4,4 ± 1 7,5 ± 0,9

Linfocitos (%) 40,7 ± 5 Heterófilos 53,3 ± 1,7 67,3 ± 2,2 51,8 ± 2,8 67,8 ± 2,2

(%) 42,7 ± 3,9 Eosinófilos (%) 12,4 34,2 ± 1,5 24,6 ± 1,8 37,4 ± 2,3 21,8 ± 1,7

± 1,9 Monocitos (%) 3,7 ± 0,6 4,9 ± 0,4 2,1 ± 0,3 3,9 ± 0,5 3,1 ± 0,3

Basófilos (%) 7 ± 0,4 5,9 ± 0,5 6,7 ± 0,7 6,8 ± 0,5

Linfocitos (%) 40,3 ± 4,1 Heterófilos 52,3 ± 3,4 86,3 ± 0,3 47,9 ± 4,3 68,6 ± 4,3

Monocitos (%) 6 ± 1,9 Basófilos 5,1 ± 0,7 0 1,7 ± 0,3 2,3 ± 0,7

(%) 0,7 ± 0,3 Relación H/L 5,3 ± 0,9 4 5 ± 0,8 7,1 ± 1

Linfocitos (%) 34,6 ± 2,5 Heterófilos 49,7 ± 2 60,1 ± 2,9 47,2 ± 2,7 54,6 ± 3

(%) 47,5 ± 2,2 Eosinófilos (%) 13,2 38,9 ± 1,5 30,6 ± 2,4 44,4 ± 2,3 32,1 ± 2,3

± 1,5 Monocitos (%) 4,1 ± 0,7 5,1 ± 0,4 2,8 ± 0,5 2,9 ± 0,7 4,8 ± 0,8

Basófilos (%) 5,9 ± 0,6 5 ± 1 5,4 ± 0,9 8 ± 0,6

Onorati M1 , Sancesario G2 , Carrión J3 B, ernardini S2 y , lauro d2 ,

2012 11 44.4 24.5 14

2014 18 27.7 13.3 9

2010 4 98.2 43.6 101.5

2012 11 59.4 34.5 11

2014 14 46,8 20.8 17

2010 8 22.1 8.1 14

2012 11 17.1 6.6 11

2014 23 8.5 3.1 3

2010 4 48 65.8 19.6

2014 15 1.6 1.6 0

2014 12 0.08 0.08 0

Año Etapa reproductiva Nene

Año norte Significar SE Mediana

2010 9 3 3.8 2.8 0.9

2012 11 1 13.4 6.7 4

2014 18 4 8.9 1.4 0.6

2010 4 0 2.2 0.8 1.9

2012 11 9 75.1 19.5 105

2014 15 10 dieciséis 7.7 5.1

2010 7 31.1 31.1 27,9 2.7

2012 11 1.1 1.1 0.4 0.5

2014 23 1.9 1.9 0.7 0.7

2010 4 5.4 5.4 3.9 2.1

2012 11 20.5 20.5 9.7 10.6

2014 dieciséis 13.7 13.7 9.4 0.8

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2010 20 85 168,4 97