«Estudio del quorum sensing en

Acinetobacter baumannii: implicaciones

clínicas»

María López Díaz

Tesis doctoral

Junio 2017

Directora: Dra. María del Mar Tomás Carmona

Tutor: Dr. Germán Bou Arévalo

Programa de Doctorado en Ciencias de la Salud (RD99/2011)

Instituto de Investigación Biomédica (INIBIC)
Complejo Hospitalario Universitario A Coruña‐ Universidad de A Coruña
La directora de la presente tesis doctoral, Dña. María del Mar Tomás Carmona,
licenciada en Medicina por la Facultad de Granada, Doctora en Microbiología por
la Universidad de A Coruña, Facultativa Especialista en Microbiología e
Investigadora del Instituto de Investigación Biomédica de A Coruña (INIBIC) del
Complejo Hospitalario Universitario A Coruña (CHUAC); junto con el tutor, D.
Germán Bou Arévalo, Doctor en Ciencias Biológicas por la Universidad
Autónoma de Madrid, Jefe de Servicio de Microbiología del Complejo Hospitalario
Universitario A Coruña y profesor de la Universidad de Santiago de Compostela,

CERTIFICAN:

Que Dña. María López Díaz, Licenciada en Biología por la Universidad de A

Coruña, ha realizado en el Servicio de Microbiología y en el Instituto de
Investigación Biomédica (INIBIC) del Complejo Hospitalario Universitario A
Coruña (CHUAC), y bajo su dirección y tutela, respectivamente, el trabajo
“Estudio del quorum sensing en Acinetobacter baumannii: implicaciones
clínicas”, el cual, reúne todas las condiciones para ser presentado como Tesis
Doctoral.

Y para que así conste, y surta los efectos oportunos, firmamos el presente
certificado en A Coruña, Junio del 2017.

Dra. María del Mar Tomás Carmona Dr. Germán Bou Arévalo
Directora Tutor
 ÍNDICE 9

ÍNDICE
ABREVIATURAS ............................................................................................... 11

RESUMEN.......................................................................................................... 13

INTRODUCCIÓN................................................................................................ 19
1. Características generales del quorum sensing ...................................................... 21
1.1 Vibrio fischeri, primer modelo descrito ............................................................. 21
1.2 Quorum sensing en bacterias Gram positivas: Staphylococcus aureus ........... 26
1.3 Quorum sensing en bacterias Gram negativas: Pseudomonas aeruginosa...... 28
2. Relación de los sistemas quorum sensing/quorum quenching con los mecanismos
de respuesta a diversas condiciones de estrés ......................................................... 32
2.1 Interferencia del quorum sensing: quorum quenching ...................................... 32
2.2 Estrés oxidativo (respuesta ROS) .................................................................... 35
2.3 Estrés por sales biliares ................................................................................... 36
2.4 Fagos en estado lisogénico/lítico ..................................................................... 38
3. Red de quorum en las diferentes especies de Acinetobacter ................................ 40
3.1 Acinetobacter spp ............................................................................................ 40
3.2 Acinetobacter baumannii: patógeno de éxito .................................................... 43
3.3 Sistemas de quorum sensing/quorum quenching en A. baumannii .................. 44

OBJETIVOS ....................................................................................................... 47

CAPÍTULOS ....................................................................................................... 51
Capítulo I. Quorum sensing en cepas clínicas de Acinetobacter baumannii: AidA, una
nueva enzima con actividad quorum quenching ........................................................ 53
Capítulo II. Secuenciación del genoma de una cepa clínica de Acinetobacter
baumannii perteneciente al clon ST79/PFGE-HUI-1 carente de la bomba de expulsión
AdeABC .................................................................................................................... 73
Capítulo III. Respuesta a sales biliares en cepas clínicas de Acinetobacter baumannii
carente de la bomba de eflujo AdeABC: virulencia asociada a la detección de quorum
sensing ...................................................................................................................... 77
Capítulo IV. Evolución genómica de dos cepas clínicas de Acinetobacter baumannii a
partir de clones ST-2 aislados en 2000 y 2010 (ST-2_clon_2000 y ST-2_clon_2010) 95
Capítulo V. Selección natural mediante moviloma (fagos y plásmidos) de cepas de
Acinetobacter baumannii (ST-2) con sistemas funcionales de la red quorum
(sensing/quenching) .................................................................................................. 99
5.1 MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................... 100
 10 ÍNDICE

5.2 RESULTADOS............................................................................................... 104

LEYENDA DE FIGURAS Y TABLAS.................................................................... 107

DISCUSIÓN ...................................................................................................... 127

CONCLUSIONES ............................................................................................. 137

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 141

ANEXOS ........................................................................................................... 155

Curriculum vitae ...................................................................................................... 157
 ABREVIATURAS 11

ABREVIATURAS
g Microgramo
ABC ATP-Binding-Cassette
ACP Acil binding protein
ADN Ácido desoxirribonucléico
AHL N-acil homoserín lactona

AI Autoinductor
AIP Péptido autoinductor
ARN Ácido ribonucléico
ATP Adenosín trifosfato
CAI-1 Cholerae autoinducer 1
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

CMI Concentración Mínima Inhibitoria

DO Densidad óptica
EPS Polisacárido extracelular
ER Expresión relativa
GEIH Grupo de Estudio de Infección Hospitalaria
HAI-1 Harveyi autoinducer 1
HSL Homoserín lactona
L Litro
MATE Multidrug and toxic-compound extrusion

Mb Millones de pares de bases

MDR Multidrug resistance
MFS Major facilitator superfamily

mg Miligramo
ml Mililitro
mM Milimolar
MMC Mitomicina C
MOI Multiplicidad de infección
 12 ABREVIATURAS

NGS Secuenciación masiva (Next Generation Sequencing)

nm Nanómetro
OMS Organización Mundial de la Salud
ORF Pauta abierta de lectura (Open Reading Frame)
PAβN Fenil-arginil-β-naftilamida
pb Pares de bases
PCR Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase chain
reaction)
PFGE Electroforesis en gel de campos pulsantes (Pulsed-field Gel
Electrophoresis)
PQS Señal quinolona de Pseudomonas
QQ Quorum quenching
QS Quorum sensing

REIPI Red Española de Investigación de Patologías infecciosas

RND Resistance nodulation division
ROS Especies reactivas de oxígeno (Reactive oxygen species)
qRT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa
inversa en tiempo real (Real Time Reverse Transcription
PCR)

SAM S-adenosilmetionina
SDS Dodecilsulfato sódico
SEIMC Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y
Microbiología Clínica
SMR Small multidrug resistance
SOD Superóxido dismutasa
ST Secuencia tipo (Sequence type)

TEM Microscopía electrónica de transmisión

UCI Unidad de Cuidados Intensivos
UFC Unidad Formadora de Colonia
UFP Unidades Formadoras de Placas de lisis
UPL Universal Probe Library
 RESUMEN 13

RESUMEN
En los últimos años ha crecido el interés en el estudio de la comunicación
intercelular bacteriana, la cual juega un papel importante en la regulación de
diferentes factores de virulencia. Las bacterias, pueden intercambiar información
mediante un proceso conocido como quorum sensing (QS), basado en la
expresión y reconocimiento de moléculas señal. Este proceso permite a las
bacterias compartir información de su densidad celular y así regular
adecuadamente su expresión génica. Por esta razón, el QS podría ser una diana
clave para la búsqueda y diseño de nuevas alternativas terapéuticas para el
tratamiento de infecciones causadas por patógenos multirresistentes como
Acinetobacter baumannii. Este patógeno, además de presentar una resistencia
intrínseca a multitud de antibióticos, posee una gran facilidad en la adquisición de
elementos genéticos y en el desarrollo de mutaciones convirtiéndolo en uno de
los principales microorganismos causantes de infecciones nosocomiales en todo
el mundo.

La inhibición de la comunicación entre bacterias conocida como quorum

quenching puede llevarse a cabo a través de diferentes vías, como la inhibición
en la síntesis de las moléculas señal, la intercepción de estas mediante
degradación enzimática (a través de acilasas o lactonasas) o mediante el empleo
de antagonistas del receptor de las mismas.

En la presente tesis doctoral se estudian los sistemas de quorum sensing/quorum

quenching en diferentes cepas clínicas de A. baumannii y su relación con
diversas condiciones de estrés (respuesta ROS, sales biliares y fagos en estado
lisogénico/ lítico), con la finalidad de desarrollar nuevas terapias antiinfecciosas
(conocidas como terapias antivirulentas) que permitan inhibir la movilidad
bacteriana, la formación de biofilm y por tanto el desarrollo de infección.
 RESUMO 15

RESUMO
Nos últimos anos medrou o interese no estudo da comunicación intercelular
bacteriana, a cal xoga un papel importante na regulación de diferentes factores
de virulencia. As bacterias poden intercambiar información mediante un proceso
coñecido como quorum sensing (QS), baseado na expresión e recoñecemento
de moléculas sinal. Este proceso permite ás bacterias compartir información da
súa densidade celular e así regular adecuadamente a súa expresión xénica. Por
esta razón, o QS podería ser unha diana clave para a procura e deseño de novas
alternativas terapéuticas para o tratamento de infeccións causadas por
patóxenos multirresistentes como Acinetobacter baumannii. Este patóxeno,
ademáis de presentar unha resistencia intrínseca a multitude de antibióticos,
posúe unha gran facilidade na adquisición de elementos xenéticos e no
desenvolvemento de mutacións converténdoo nun dos principais
microorganismos causantes de infeccións nosocomiais en todo o mundo.

A inhibición da comunicación entre bacterias coñecida como quorum quenching

pode levarse a cabo a través de diferentes vías como a inhibición na síntese das
moléculas sinal, a intercepción destas mediante degradación enzimática (a través
de acilasas ou lactonasas) ou mediante o emprego de antagonistas do receptor
das mesmas.

Na presente tese de doutoramento, estúdanse os sistemas de quorum

sensing/quorum quenching en diferentes cepas clínicas de A. baumannii e a súa
relación con diversas condicións de estrés (resposta ROS, sales biliares e fagos
en estado lisoxénico/lítico), coa finalidade de desenvolver novas terapias
antiinfecciosas (conocidas como terapias antivirulentas) que permitan inhibir a
movilidade bacteriana, a formación de biofilm e, polo tanto, o desenvolvemento
da infección.
 ABSTRACT 17

ABSTRACT
In recent years, bacterial intercellular communication, which plays an important
role in the regulation of different virulence factors, has been of great interest.
Bacteria are able to exchange information using cell-to cell communication
systems, known as quorum sensing (QS), based in chemical signaling molecules.
This process allows the bacteria to share information about cell density and
regulate gene expression accordingly. Therefore, QS could be a key target to
seek and to design new therapeutic alternatives for the treatment of infections
caused by multidrug resistant pathogens, such as Acinetobacter baumannii.

This pathogen not only shows an intrinsic resistance to a multitude of antibiotics,

but also possesses a great facility to acquire genetic elements and/or mutations
increasing its multidrug resistance phenotype, which makes it one of the main
microorganisms that cause nosocomial infections worldwide.

Inhibition of communication between bacteria (quorum quenching) may be

performed by different approaches such as inhibition of signal molecules
synthesis, interference of these signal molecules by enzymatic degradation (by
acylase or lactones) or by using receptor antagonists of these signal molecules.

In the present doctoral thesis, the quorum sensing/quorum quenching systems of

different clinical strains of A. baumannii and their relationship with various stress
conditions (ROS response, bile salts and lytic/lysogenic phages) are studied in
order to develop new anti-infective therapies (known as anti-viral therapies) that
allow inhibiting bacterial mobility, biofilm formation and thus the development of
infection.
INTRODUCCIÓN
 INTRODUCCIÓN 21

INTRODUCCIÓN

1. Características generales del quorum sensing

1.1 Vibrio fischeri, primer modelo descrito
Las bacterias fueron consideradas durante mucho tiempo como organismos
independientes, con escasa capacidad de comunicación intercelular. Fue a
finales de los años 60 cuando se demostró su habilidad para percibir las
condiciones ambientales e intercambiar información mediante moléculas de
señalización, compuestos químicos o autoinductores (AI) que son liberados al
ambiente y que difunden a través de la membrana celular. Además de liberar
estas moléculas, las bacterias también son capaces de medir su concentración
dentro de una población para proceder a la expresión de determinados genes y
desarrollar así una respuesta específica y simultánea. Este mecanismo de
regulación de la expresión genética en respuesta a la densidad celular recibe el
nombre de “detección de quorum” o “quorum sensing” (QS), término que fue
citado por primera vez en una revisión que publicaron Fuqua y colaboradores en
la revista Journal of Bacteriology en el año 1994 (1), y da como resultado
diferentes propiedades que no podrían explicarse a partir de una célula
bacteriana aislada. El QS permite la explicación de multitud de procesos
bacterianos diferentes como simbiosis, virulencia, la producción de antibióticos, la
formación de biofilm, movilidad, esporulación, producción de metabolitos
secundarios o mecanismos de resistencia al estrés, entre otros (2, 3).

El primer sistema biológico regulado por QS estudiado fue el de la

bioluminiscencia, en la bacteria marina Vibrio fischeri, descrito en 1966 por J. W.
Hastings y colaboradores donde observaron la relación simbiótica entre esa
bacteria y el calamar Euprymna scolopes. V.fisheri es una bacteria móvil que vive
libremente en los océanos, y también es capaz de prosperar dentro de los
organismos huésped. En el caso de E. scolopes, la bacteria es capaz de
proliferar dentro de un órgano específico que es responsable de la
bioluminiscencia. Esta bacteria produce luz en una reacción química, que es
utilizada por el calamar con el fin de contra-iluminar y ser capaz de sobrevivir en
sus entornos nocturnos y poder escapar de los depredadores. De forma
individual no generan luz pero mediante el proceso de QS son capaces de medir
 22 INTRODUCCIÓN

su densidad poblacional y determinar la producción de luz (4). El autoinductor

emitido por las bacterias y que permite iniciar el proceso de bioluminiscencia es
una molécula de la familia de las N-acilhomoserín lactonas (AHLs), formada por
un anillo lactona (HSL) y un ácido graso unido mediante enlace amida que
constituye la cadena lateral (Cn) (5) (Figura 1). Esta molécula se acumula en el
medio hasta alcanzar una concentración determinada y poder, de esta forma,
producir la activación específica de genes relacionados con la producción de luz.

Figura 1. Estructura química general de una N -acilhomoserín lactona (AHL) bacteriana. R1:
longitud de la cadena lateral; R2: con o sin sustituciones oxo- o hidroxi-.

Las proteínas necesarias para la bioluminiscencia en V. fischeri están codificadas

dentro del operón lux. Los genes lux se organizan en dos unidades
transcripcionales, una de ellas contiene los siete genes que forman el operón
luxICDABEG y la otra unidad contiene el gen luxR. LuxI es la sintasa del
autoinductor 3-oxo-C6-HSL (N-(3-oxohexanoil)-L-homoserín lactona) que
interactúa con su receptor LuxR para formar un activador transcripcional del
operón luxICDABEG (6, 7). Los otros genes del operón lux son genes
estructurales implicados en la producción de luz, luxA y lux B codifican las
subunidades α y β de la luciferasa; los genes luxC, luxD y luxE codifican las
enzimas responsables de la síntesis del aldehído utilizado por la luciferasa como
sustrato. En cuanto a luxG, parece que está implicado en la síntesis de flavín
nucleótido (5). A bajas densidades celulares, la emisión de 3-oxo-C6-HSL no es
suficiente para inducir la transcripción del operón pero a medida que va
aumentando la población, la concentración del AI se acumula permitiendo la
transcripción del operón lux (Figura 2).
 INTRODUCCIÓN 23

Figura 2. Mecanismo de quorum sensing en la bacteria luminiscente V. fischeri.

En V. fischeri se conocen dos sistemas a parte del mencionado LuxI/LuxR que

son: AinS (sintasa)/AinR (receptor) cuya molécula señal sería C8-HSL (N-
octanoil-L-homoserín lactona); y LuxS (sintasa)/LuxP (receptor) con un AI-2
(permite la comunicación interespecie) como señal (8). Estos tres mecanismos se
pueden definir como sistemas sencillos regulados por una única molécula
autoinductora, pero la realidad es que muchas bacterias han desarrollado
sistemas complejos, donde pueden producir y detectar varios autoinductores con
una composición química variable. Un ejemplo es la bacteria marina Vibrio
harveyi, que emplea tres autoinductores para la comunicación intraespecie (HAI-
1, una AHL), interespecie (AI-2, un diéster furanosil borato) e intragénero (CAI-1,
(S)-3-hydroxytridecan-4-ona) (9). Los tres AIs son sintetizados por tres sintasas:
LuxM, LuxS y CqsA, respectivamente. Los receptores de membrana, de tipo
histidín-quinasa, son: LuxN, LuxQ y CqsS, respectivamente (Figura 3) (10). Estos
sistemas están asociados con la producción de bioluminiscencia, sideróforos,
proteasas, polisacáridos extracelulares (EPS) y otros factores de virulencia (11).
 24 INTRODUCCIÓN

Figura 3. Modelo del sistema de QS de V. harveyi. Tres sistemas sensoriales convergen para
controlar los niveles del regulador maestro, LuxR (Figura modificada de Hunter, G.A 2013).

Existen diferencias en la comunicación mediante QS entre bacterias Gram

negativas y Gram positivas. La principal se refiere al tipo de molécula AI que
emplean, las bacterias Gram negativas pueden utilizar AHLs y también, en el
caso de Pseudomonas aeruginosa, moléculas químicamente distintas como las
quinolonas. Mientras, las bacterias Gram positivas emplean oligopéptidos
modificados (AIPs) (12). Por lo tanto, para la detección de QS podríamos
clasificar las moléculas señal de la siguiente manera:
Autoinductores tipo 1 (AI-1) o AHLs que permiten la comunicación entre bacterias
Gram negativas de la misma especie; y oligopéptidos modificados (AIPs) que se
encargarían de la misma función en bacterias Gram positivas. Por otro lado,
existe un fenómeno que consiste en la comunicación entre bacterias de
diferentes especies, denominado en inglés “cross-talk”, que estaría mediada por
autoinductores tipo 2 (AI-2) y son moléculas producidas tanto por bacterias Gram
negativas como por Gram positivas (13), cuya estructura es un diéster furanosil
borato. Así como las AHLs y los oligopéptidos presentan una alta especificidad
facilitando la comunicación entre bacterias de la misma especie, los AI-2
permitirían un lenguaje interespecífico más universal facilitando la convivencia de
ambos sistemas (Figura 4) (14).
 INTRODUCCIÓN 25

Figura 4. Principales tipos de señales de QS en bacterias. (A) La molécula 3-oxo-C12-HSL de

P.aeruginosa que funciona como AI-1. (B) Oligopéptido empleado por Staphylococcus aureus. (C)
Diéster furanosil borato o AI-2 para comunicación “cross-talk”.

La síntesis de las AHLs ocurre mediante la unión de S-adenosilmetionina (SAM)

y una acil-ACP, proteína transportadora de grupos acilo (15), catalizada por
proteinas del tipo LuxI. Este complejo se convierte en AHL al liberar el
nucleósido 5’- metiltioadenosina (MTA). Estas AHLs pueden variar en la longitud
de la cadena acil (de C4 a C14), en la oxidación en la posición C3 y en la
saturación. La diversidad de productos proviene de los diferentes Acil-ACP que
se utilizan como segundo sustrato. Se han caracterizado más de 40 sintasas de
AHL, similares a LuxI, que comparten bloques de secuencias conservadas (16-
18) (Figura 5).

Figura 5. Síntesis de AHL catalizada por LuxI (Figura tomada de Fast W. 2013).
 26 INTRODUCCIÓN

1.2 Quorum sensing en bacterias Gram positivas: Staphylococcus aureus

El estudio del fenómeno QS es bien conocido en bacterias Gram negativas
donde las AHLs son las principales moléculas de señalización. En bacterias
Gram positivas estos circuitos de comunicación se descubrieron con
posterioridad y con el fin de regular multitud de actividades fisiológicas. En este
caso, en lugar de las moléculas de AHL, se emplean péptidos autoinductores
(AIPs) (14).
La detección de estos péptidos es llevada a cabo mediante un sistema de dos
componentes, una histidín-quinasa de membrana y una proteína que interacciona
con el ADN, llevando a cabo la transcripción y que, posteriormente, transducen la
señal por un mecanismo de fosforilación/defosforilación (2).
Una vez los precursores de los AIPs son sintetizados, estos se procesan y se
modifican para obtener el péptido maduro, el cual es exportado mediante un
transportador de la familia ABC (ATP-Binding-Cassette). Cuando la densidad
bacteriana es alta, se produce una mayor producción de AIPs que al alcanzar
una determinada concentración extracelular permite su unión a un receptor
histidín-quinasa de membrana. Esta unión permite la activación del receptor que
se autofosforila, transfiriendo el fosfato a un regulador de respuesta
citoplasmástico. Esta transferencia permite la activación de genes de QS del
regulón. En algunos casos, los AIPs son devueltos al interior celular donde
interaccionan con factores de transcripción para modular su actividad y producir
cambios en la expresión de los genes (19, 20). Algunos ejemplos de QS en
bacterias Gram positivas son la conjugación en Enterococcus faecalis, la
inducción de la competencia en Streptococcus pneumoniae y en Bacillus subtilis,
el desarrollo del micelio aéreo en Streptomyces o la producción de toxinas y
factores de virulencia en S. aureus (21).
El sistema mejor estudiado en este grupo es el de la patogénesis de S. aureus.
Las bacterias de esta especie presentan formas cocáceas, inmóviles y no
esporuladas; es la más patógena de su género y es el agente causal de multitud
de infecciones que pueden ser desde tipo cutáneo hasta enfermedades
sistémicas mortales (22) y su origen puede ser tanto hospitalario como
comunitario. El ser humano es el principal reservorio de S. aureus, formando
parte de la flora normal de la piel. Su habilidad para causar enfermedad depende
de la expresión de moléculas de adhesión, toxinas y compuestos que afectan al
 INTRODUCCIÓN 27

sistema inmune. El QS se encarga de esa regulación en la expresión de los

genes que codifican factores de virulencia (23).

El sistema de QS en S. aureus se produce a través del locus agr, formado por

dos unidades transcripcionales, ARNII y ARNIII, cuya transcripción es impulsada
por los promotores P2 y P3, respectivamente. El operón P2 codifica el transcrito
ARNII que produce los productos génicos agrB, agrD, agrC y agrA. El operón P3
codifica la transcripción de ARNIII que genera sólo un producto génico, una
toxina llamada delta-hemolisina, que incrementa la transcripción de varios
factores de virulencia. El transcrito de agrD codifica un AIP y el producto del gen
agrB es una endopeptidasa transmembrana responsable de la modificación del
anillo de tiolactona, y
de exportar el AIP al
medio extracelular.
Los genes agrC y
agrA codifican un
sistema de
transducción de señal
de dos componentes
formado por una
histidina quinasa
(AgrC) y su regulador
de respuesta
asociado AgrA (24).
Si la concentración de
S. aureus es baja, se
Figura 6. Sistema de QS en S. aureus a través del locus agr
producen niveles (Figura modificada de Cegelski, L. 2008).
basales de AIP, de su
proteína transportadora, de la histidina quinasa y del regulador de la respuesta
transcripcional. Esto permite al AIP salir al medio extracelular permitiendo la
producción de los factores de adhesión. Al aumentar la densidad de S. aureus,
se produce la unión del AIP a la histidina quinasa, produciendo su fosforilación y
también la del regulador transcripcional, que se une al ADN induciendo la
transcripción del ARNIII que permite la formación de biofilm y la expresión de
 28 INTRODUCCIÓN

factores de virulencia tales como hemolisinas, leucocidinas y exoenzimas (Figura

6) (22).
1.3 Quorum sensing en bacterias Gram negativas: Pseudomonas
aeruginosa
Existen varias características que presentan en común todas las bacterias Gram
negativas en relación a los sistemas de QS:
1. La molécula señal o el autoinductor que emplean es la AHL u otras moléculas
sintetizadas a partir de SAM, un cosustrato común que interviene en la
transferencia de grupos metilo, que pueden difundir libremente a través de la
membrana bacteriana.
2. El QS afecta a multitud de genes implicados en diferentes procesos biológicos.
3. Es un proceso autoinductor en el que el gen responsable de la síntesis de la
AHL forma parte de un operón inducido, por lo que nos encontraremos con un
bucle autoinductor (16).
El mecanismo de QS, como se ha indicado, se describió por primera vez en V.
fischeri y su sistema regulador LuxI/LuxR se considera el paradigma para la
regulación génica por QS en bacterias Gram negativas. Los homólogos de LuxI y
LuxR se han identificado en muchos genomas bacterianos y controlan la
expresión de genes en función de la densidad poblacional (25).
Un ejemplo de sistema QS bien caracterizado es el de P. aeruginosa. Esta
bacteria Gram negativa es un patógeno oportunista de pacientes
inmunocomprometidos y uno de los principales agentes causales de infecciones
nosocomiales. Interviene en la inducción y formación de un biofilm desarrollado,
jugando un papel importante en la aparición de fibrosis quística (26) .
Se han descrito dos sistemas QS completos e interrelacionados en P.
aeruginosa, el primero es el sistema LasI/LasR. LasI es una sintasa que genera
la 3-oxo-C12-HSL (N-oxododecanoil-L-homoserín lactona) y LasR actúa como
regulador transcripcional que requiere de la 3-oxo-C12-HSL para convertirse en
un factor de transcripción activo. Un segundo sistema consiste en las proteínas
RhlI (codificada por el gen rhlI) y RhlR (codificada por el gen rhlR). La RhlI es una
sintasa que produce la N-butanoil-L-homoserín lactona (C4-HSL) y RhlR es el
regulador transcripcional (27). Ambos sistemas están implicados en la producción
 INTRODUCCIÓN 29

de factores de virulencia tales como elastasas, proteasas, superóxido dismutasa

o la exotoxina A (27).
En el caso de las bacterias Gram negativas, la clase de moléculas de
señalización más comúnmente empleadas son las AHLs. Sin embargo, se han
descubierto otras clases de señales químicamente distintas de las anteriores,
como las quinolonas, diésteres de boro y péptidos cíclicos (28). El patógeno P.
aeruginosa es capaz de producir tres tipos de señales, las dos AHLs descritas
anteriormente y una tercera: 2-heptil-3-hidroxi-4-quinolona, también denominada
sistema PQS o “Señal Quinolona de Pseudomonas”. La síntesis de PQS requiere
de la expresión del operón pqsABCDE, cuya señal es regulada positivamente por
PqsR, una proteína reguladora transcripcional de tipo LysR y reprimida por la
proteína RhlR. La unión PQS-PqsR autoinduce la síntesis de PQS y es
responsable de la expresión de diversos factores de virulencia (19). Los tres
sistemas parecen estar interconectados en múltiples y complejas formas, de
manera que todos pueden intervenir en la regulación de un mismo factor de
virulencia (Figura 7).

Figura 7. Sistemas de QS en P. aeruginosa (Figura adaptada de Martínez JL et al, 2009)

Se ha demostrado que tanto la moléucla 3-oxo-C12-HSL como la C4-HSL

difunden libremente hacia el exterior de la célula bacteriana pero la
 30 INTRODUCCIÓN

permeabilidad de la primera es significativamente menor, por lo que su

eliminación de las bacterias se realiza más eficazmente a través del sistema de
eflujo de tipo RND (resistance nodulation division) (29). Las bombas de eflujo o
expulsión son proteínas transportadoras implicadas en la eliminación de otras
sustancias tóxicas fuera de la célula, incluyendo antibióticos y sustratos no
antibióticos tales como detergentes, metales pesados o solventes (30). Se
considera una parte vital del metabolismo xenobiótico y un mecanismo que
contribuye a la resistencia (31). Son omnipresentes, se encuentran tanto en
bacterias Gram positivas como en Gram negativas, así como en organismos
eucariotas (32). Las bombas de expulsión pueden estar formadas por un único o
múltiples componentes, siendo este último exclusivo de bacterias Gram
negativas (33). Son transportadores activos, por lo que requieren una fuente de
energía química para realizar su función. Algunos son transportadores activos
primarios que utilizan la hidrólisis de trifosfato de adenosina (ATP) como fuente
de energía, mientras que otros son secundarios, en los que el transporte se
acopla a una diferencia de potencial electroquímico creada al bombear hidrógeno
o iones de sodio desde o hacia el exterior celular. Las bombas de expulsión se
clasifican en seis diferentes familias en función de la fuente de energía empleada
para su actividad, en su organización y en los tipos de molécula que exporta:
MATE (multidrug and toxic-compound extrusion), MFS (major facilitator
superfamily), SMR (small multidrug resistance), RND (resistance nodulation
division) y ABC (ATP-binding cassette) (Figura 8) (34). Las bombas de expulsión
de la familia ABC son relevantes en anaerobios y bacterias Gram positivas pero
las mejor estudiadas son la familia MFS y la familia RND, presentes en bacterias
Gram positivas y negativas, respectivamente. Dentro de la familia MFS, los
ejemplos más destacables son NorA de S. aureus y PmrA de Streptococcus
pneumoniae (35). Los principales sistemas de eflujo, clínicamente relevantes en
bacterias Gram negativas, pertenecen a la superfamilia RND y se componen
normalmente de una proteína accesoria periplasmática, una proteína
transportadora y una proteína de membrana externa.
 INTRODUCCIÓN 31

Figura 8. Clasificación de las bombas de eflujo en función de la energía empleada y de los

compuestos que expulsa (Figura adaptada de Piddock L.J., 2006).

Ejemplos bien conocidos de bombas de tipo RND son la AcrAB-TolC de

Escherichia coli y la MexAB-OprM de P. aeruginosa (36). E. coli es la
enterobacteria más estudiada, se puede encontrar como microorganismo
comensal en el intestino humano pero también como patógeno y causar
infecciones del tracto urinario, sepsis, etc. Los sustratos que la bomba AcrAB-
TolC exporta, incluyen cloranfenicol, fluoroquinolonas, rifampicina, tetraciclinas,
sales biliares o dodecilsulfato sódico (SDS), entre otros.
La bacteria P. aeruginosa presenta más de diez sistemas de bombas de
expulsión, destacando dos por su implicación en los sistemas de señalización
celular. La primera, la bomba MexAB-OprM, está implicada en la resistencia a
fluoroquinolonas, β-lactámicos, tetraciclina, macrólidos, cloranfenicol,
novobiocina, trimetoprim o sulfonamidas, entre otros (37) y ha sido implicada en
la modulación del QS ya que produce la expulsión de moléculas de AHL (3-oxo-
C12-HSL) no afines al receptor LasR (homólogo a LuxR de V. fischeri) (29). Se
demostró que la hiperexpresión del sistema MexAB-OprM, estudiada en un
aislado de P. aeruginosa, provoca la expulsión no regulada de 3-oxo-C12-HSL
hacia el exterior celular, mostrando una disminución de la respuesta QS e
impidiendo la acumulación intracelular de estas señales y, por lo tanto, no
producen la activación de diferentes genes implicados en factores de virulencia
 32 INTRODUCCIÓN

(35). La capacidad de las bombas de eflujo para exportar moléculas relacionadas

con el QS también fue apoyada por otros estudios donde demostraron que
mutantes para ΔmexAB-oprM de P. aeruginosa mostraron una difusión reducida
de 3-oxo-C12-HSL al medio extracelular y, por lo tanto, su acumulación
intracelular, confirmando así que MexAB-OprM desempeñaría un papel en el
eflujo activo de esa molécula (38).
Por otro lado, se observó que la bomba MexGHI-OpmD también participa
activamente en la expulsión de moléculas de QS y de antranilato, un compuesto
tóxico precursor de los autoinductores PQS, por lo que una supresión de mexG u
opmD conduce al fracaso en la síntesis de 3-oxo-C12-HSL y PQS debido a la
acumulación intracelular del antranilato. Estos resultados demuestran una
función esencial de la bomba MexGHI-OpmD en la facilitación de la
comunicación célula-célula, en la sensibilidad a diferentes antibióticos y en la
promoción de la virulencia y del crecimiento en P. aeruginosa (39).

2. Relación de los sistemas quorum sensing/quorum quenching con

los mecanismos de respuesta a diversas condiciones de estrés
2.1 Interferencia del quorum sensing: quorum quenching
La rápida aparición de “superbacterias”, que se caracterizan por adquirir
resistencias a los antibióticos más comúnmente usados, ha incrementado la
necesidad de desarrollar nuevas estrategias contra estos patógenos microbianos.
Una de ellas, sería la estrategia quorum quenching (QQ) que se basa en la
interferencia de la comunicación microbiana y fue descrita por primera vez en el
año 2000 (40).

El mecanismo QQ puede interferir eficazmente con cualquiera de los procesos

claves del QS, lo que podría ser potencialmente explotado para interrumpir la
comunicación bacteriana y prevenir infecciones microbianas a través de la
inhibición de la movilidad así como de la formación de biofilm (41). Los procesos
de QQ que ocurren de manera natural actúan bloqueando los pasos clave del QS
tales como la generación, acumulación o recepción de la señal. Los
microorganismos existen en un entorno competitivo donde cohabitan con otras
especies, por lo que tuvieron la necesidad de desarrollar diferentes estrategias
 INTRODUCCIÓN 33

de supervivencia con el fin de conseguir beneficios y poder competir por el

espacio, el alimento y los nichos ecológicos (42).
Esta estrategia puede llevarse a cabo a través de tres vías (41):
1) Inhibición de la biosíntesis de AHLs: existen varios metabolitos que realizan
esta función, un ejemplo es el triclosán que inhibe la enoil-ACP reductasa,
implicada en la síntesis de acil-ACP. Otro ejemplo son los análogos de SAM,
como S-adenosilhomocisteína o S-adenosilcisteína (43).
2) Intercepción de la señal mediante degradación enzimática (enzimas QQ): Esta
degradación puede ocurrir de maneras diferentes, en función del mecanismo de
acción de las moléculas implicadas. Hasta la fecha han sido identificadas dos
tipos de enzimas que se encargan de esta función: lactonasas y acilasas. Las
lactonasas actúan abriendo el anillo HSL, las podemos encontrar en numerosas
especies del género Bacillus, la mejor caracterizada es la AiiA. También fueron
identificadas una lactonasa BlcC (antes llamada AttM) (44) y, más recientemente,
la lactonasa AiiB, ambas descubiertas en Agrobacterium tumefaciens. AhlD en
Arthrobacter o una nueva lactonasa metalo-independiente, AidH en
Ochrobactrum sp. (Figura 9) (45).

Figura 9. Degradación enzimática de AHLs (Figura adaptada de Dong and Zhang, 2005).

El segundo tipo de enzimas, las acilasas (amidasas), actúan rompiendo el enlace

amida entre la HSL y el ácido graso (46). Un ejemplo sería la acilasa AiiD, que se
encuentra en las especies bacterianas Gram negativas del género Ralstonia y
que presenta una alta especificidad de sustrato, en este caso por las AHL de
cadena larga (47). La bacteria P. aeruginosa PAO1 produce también dos
 34 INTRODUCCIÓN

acilasas: PvdQ y QuiP (48) o la cianobacteria Anabaena sp. que produce la

acilasa AiiC (49). Aunque la mayoría son enzimas intracelulares, la acilasa AhlM
de Streptomyces sp. es extracelular y tiene preferencia por AHLs menores de
ocho carbonos (47, 50). En cuanto a Acinetobacter, se ha descrito la expresión
de una acilasa, AmiE, en la cepa Ooi24 que degrada específicamente los
compuestos 3-oxo-C12-HSL y C10-HSL. El gen homólogo amiE también se
encontró en secuencias del genoma de las cepas Acinetobacter ursingii DSM
16037 y Acinetobacter sp. CIP 102129. Aunque estas dos cepas son
filogenéticamente diferentes de Ooi24, las secuencias de nucleótidos de amiE de
estas tres cepas muestran una identidad casi completa, ya que la divergencia se
limita a la posición de un único nucleótido (51). Estudios recientes demostraron
que una lactonasa modificada genéticamente fue empleada en la interrupción de
formación de biofilm en Acinetobacter baumannii, observándose resultados
relacionados con reducción en biomasa y espesor (52). Una disminución en la
formación de biofilm daría lugar a una mayor eficacia en los tratamientos
antibióticos debido al incremento de la sensibilidad de las células bacterianas
hacia el mismo. Los estudios relacionados con el QQ en Acinetobacter son
limitados y el escaso conocimiento sobre inhibidores de QS para este patógeno
supone un retraso en el desarrollo de nuevas alternativas con el fin de combatir a
la aparición y la evolución continua de cepas multirresistentes.
3) Obtención de antagonistas del receptor de AHLs: Las furanonas halogenadas,
producidas por el alga marina Delisea pulchra, son análogos estructurales de las
señales AHL. Un tratamiento con furanonas en V. fischeri da como resultado una
degradación acelerada de LuxR y por lo tanto, una inhibición del QS bacteriano
(43, 53).
En A. baumannii se encontraron AHLs sintéticas, con una cadena acil lateral de
entre siete y ocho carbonos además de un grupo 3’-oxo, que funcionaban como
antagonistas de AbaR. También se identificaron pequeñas moléculas capaces de
modular dos importantes fenotipos en A. baumannii directamente ligados a QS y
virulencia. Varios de los antagonistas de AbaR más potentes son capaces de
inhibir la movilidad superficial de A. baumannii y la producción de biofilm (54).
Estos compuestos representan nuevas y valiosas herramientas químicas en el
estudio del papel del QS en la virulencia de A. baumannii.
 INTRODUCCIÓN 35

2.2 Estrés oxidativo (respuesta ROS)

Los organismos aerobios emplean el oxígeno molecular (O 2) para la respiración y
la oxidación de nutrientes con el fin de obtener energía. Los subproductos
reactivos del oxígeno, tal como el radical anión superóxido (O2-), el peróxido de
hidrógeno (H2O2) y los radicales hidroxilo (OH-), se generan de manera continua
en células cultivadas aeróbicamente, estas se conocen como especies reactivas
de oxígeno (ROS). Su elevada reactividad se debe a que poseen electrones
desapareados que al reaccionar con otras moléculas orgánicas en procesos de
óxido-reducción pueden producir daños en la célula tales como: oxidación de
ácidos grasos poliinsaturados, oxidación de aminoácidos o daño en el propio
ADN. Se produce una descompensación en el balance de los mecanismos de
producción y eliminación de las ROS, al verse incrementados los primeros,
originando este estado de estrés oxidativo celular. Enzimas como la superóxido
dismutasa (SOD), la catalasa u otros agentes antioxidantes, como glutatión o
vitamina C, son capaces de eliminarlas. (55). Un ejemplo es el patógeno P.
aeruginosa, que compite con organismos coinfectantes a través de la secreción
de piocianina, un compuesto redox activo que genera ROS. La piocianina en su
forma reducida es altamente inestable y reacciona con el O 2 molecular para
formar O2-, H2O2 y OH-, afectando al crecimiento y viabilidad de una serie de
organismos (56). Sin embargo, se observó que la piocianina no mostraba
inhibición del crecimiento en bacterias como A. baumannii, que contrarrestaba
este estrés oxidativo mediante un aumento en la producción de catalasa y de
SOD. Se vio que un mutante para el gen de la sintasa autoinductora de AHL en
Acinetobacter nosocomialis M2, ΔabaI, al exponerlo a la piocianina, presentaba
niveles significativamente bajos de las enzimas catalasa y SOD en comparación
con su forma salvaje. Estos niveles se restauraron al suplementar con 3-OH-C12-
HSL, la molécula señal de QS en A. baumannii (57), demostrando que esas
enzimas se encuentran bajo el control del sistema de QS en esta bacteria.
Del mismo modo, la interferencia del QS en A. baumannii M2 empleando ácido
salicílico, un conocido “quencher” del QS (58), redujo los niveles de ambas
enzimas. Diversos estudios sugieren la implicación del mecanismo QQ bajo
respuesta ROS, un ejemplo sería la especie Deinococcus radiodurans conocida
por su resistencia al estrés oxidativo y en la que se identificó un sistema de QS
mediado por AHL (DqsI/DqsR). Se observó que en condiciones normales, de no
 36 INTRODUCCIÓN

estrés, el nivel de AHL fue blindado por enzimas QQ. Tras la exposición a H 2O2,
se indujo inmediatamente la expresión de DqsI, mientras la expresión de enzimas
de tipo QQ empiezan a aumentar después de la exposición al H 2O2. Tanto el
mutante para ΔdqsI como el mutante para ΔdqsR resultaron ser más sensibles al
estrés oxidativo en comparación con la cepa de tipo salvaje. La adición de AHLs
exógenas restaurararía por completo la supervivencia de ΔdqsI bajo este estrés
oxidativo. Por lo tanto, el mecanismo de QS regulado por DqsI/DqsR es una
estrategia adaptativa para D. radiodurans en respuesta a tensiones oxidativas
(59).

2.3 Estrés por sales biliares

Para que un patógeno pueda colonizar el intestino humano, tiene que superar
varias barreras, una de ellas es la de las sales biliares, que se encuentran
formando parte de la bilis. Las sales biliares son la forma en la que el cuerpo
guarda los ácidos biliares en la vesícula biliar y se secretan al intestino para la
digestión de lípidos. Hay dos tipos de ácidos biliares, los primarios que se forman
en el hígado a partir del colesterol, que son el ácido cólico y el ácido
quenodesoxicólico y los ácidos biliares secundarios que se obtienen cuando los
primarios son procesados metabólicamente en el intestino, dando lugar al ácido
desoxicólico a partir del ácido cólico y al ácido litocólico a partir del ácido
quenodesoxicólico. Cuando estos ácidos se unen a aminoácidos como la glicina,
taurina o glicocola, forman los ácidos biliares conjugados. Esta conjugación
permite que aumente la solubilidad en el medio acuoso (60). Las concentraciones
fisiológicas de la bilis en el intestino pueden variar de 2 a 23 mM en función del
área anatómica de estudio (es decir, entre un 0.1 y un 1.3%) (61). Por otro lado,
las sales biliares presentan una actividad de tipo detergente, con capacidad para
permeabilizar las membranas bacterianas y conducir, eventualmente, a su
colapso y a un daño celular (62).
Los factores que permiten a la bacteria tolerar las sales biliares son un elemento
importante en su capacidad para sobrevivir en el intestino. Hasta la fecha han
sido identificados dos mecanismos que permiten esta tolerancia, las bombas de
expulsión de tipo RND (63) y los transportadores de glutamato (64).
 INTRODUCCIÓN 37

En cepas clínicas de A. baumannii se han descrito tres sistemas de bombas de

tipo RND: AdeABC, AdeIJK y AdeFGH (65) pero ninguna de ellas ha sido
asociada todavía con la tolerancia a sales biliares en A. baumannii. La
hiperexpresión tanto de la bomba AdeABC, controlada por AdeRS, como de la
bomba AdeFGH, en la cual adeL sería su gen regulador negativo, está asociada
a un aumento en la producción de biofilm (66, 67). Por otra parte, la bomba
AdeFGH y en particular la bomba AdeABC juegan un papel importante en
resistencias adquiridas (65, 66), mientras que AdeIJK es responsable de la
resistencia intrínseca (65).
Uno de los papeles que desempeñan las bombas de tipo RND, además de la
resistencia a antimicrobianos y a antisépticos, la detoxificación de metabolitos
intracelulares, la mediación de la homeostasis celular o el tráfico de señales
intercelulares, es también la regulación de factores de virulencia mediante el QS
(68). Estudios previos en otras bacterias, como se observa en P. aeruginosa,
sugieren que las bombas de expulsión implicadas en multirresistencias tienen un
importante papel en el transporte de moléculas de QS al exterior celular. Las
bombas de expulsión de
tipo RND están
ampliamente distribuidas
en aislados clínicos de
A. baumannii. Sin
embargo, los estudios
realizados se han
centrado principalmente
en el eflujo de factores
de virulencia y de
antibióticos (69). Aunque
otros más recientes han
demostrado que la Figura 10. Papel potencial de la bomba de eflujo AdeFGH en

formación de biofilm el transporte de moléculas AHLs en A. baumannii durante la

formación de biofilm (Figura adaptada de He, X., 2015)
formado por A.
baumannii se encuentra relacionada con el QS. Se observó la correlación
positiva entre la formación de biofilm y el incremento en la expresión de los
genes adeB y adeG, de las bombas AdeABC y AdeFGH, respectivamente.
 38 INTRODUCCIÓN

Presumiblemente, la hiperexpresión de AdeFGH aceleraría la síntesis y el

transporte de AHLs durante la formación de biofilm en A. baumannii (66) por lo
que la inactivación de la bomba AdeFGH podría ser una forma efectiva de
prevenir la formación de biofilm de A. baumannii durante la infección (Figura 10).

Varios estudios han demostrado cómo los factores de virulencia asociados al

sistema QS pueden ser regulados de manera diferente en el intestino a través de
las sales biliares y, por lo tanto, por las diferentes bacterias comensales
presentes (70, 71). El sistema de QS permite a las poblaciones bacterianas vivir
y proliferar en un ambiente, a veces hostil, mediante una comunicación
intercelular efectiva. Sin embargo, esto no ha sido investigado aún en cepas de
A. baumannii. Del mismo modo, no se han llevado a cabo estudios en relación al
mecanismo de QQ y sales biliares.

2.4 Fagos en estado lisogénico/lítico

Como hemos comentado, el mecanismo de QS les permite a las bacterias
adaptarse a diferentes ambientes y persistir. Otro sistema global que se asocia a
la regulación génica y a la adaptabilidad ambiental es el sistema de reparación
de emergencia o sistema SOS (72, 73). Esta respuesta es inducida por la
presencia de daños en el ADN permitiendo la reparación del material genético y
la supervivencia celular. Entre los genes que constituyen el sistema SOS, se
encuentran un represor transcripcional denominado LexA y una proteína
activadora de unión al ADN, RecA. En estado normal, el LexA reprime la
expresión de los genes SOS. Cuando se detectan daños en el ADN, las hebras
simples de este son reconocidas por RecA que le produce un cambio
conformacional, adquiriendo su forma activa. De esta forma, promueve la
autohidrólisis de LexA y la inducción de la respuesta SOS y de genes que
participan en procesos de reparación celular. Por otra parte, existen otros
procesos asociados a la activación de la respuesta SOS, como la inducción del
ciclo lítico en bacteriófagos o la expresión de toxinas. Este proceso es reversible
y cuando el ADN es reparado, RecA desaparece y LexA, nuevamente
sintetizado, vuelve a reprimir la expresión de los genes SOS.
 INTRODUCCIÓN 39

Habitualmente, se ha visto incompatible la relación entre bacterias y fagos. Sin

embargo, los bacteriófagos pueden transferir genes y ampliar el repertorio
metabólico de sus huéspedes bacterianos, conferir virulencia o eliminar
organismos competidores y, de esta forma, mejorar la aptitud bacteriana.
Estudios recientes demostraron que pueden promover la formación de biofilm
ofreciendo ventajas a nivel poblacional a sus anfitriones (74).

Tabla 1. Transferencia de genes mediante fagos temperados y sus beneficios en el hospedador

bacteriano (Adaptada de Obeng N, Trends Microbiol. 2016).

Característica
Fago(s) Hospedador Genes afectados
beneficiosa
Burkholderia
KL3 Desconocido
Exclusión de cepacia
superinfección Enterococcus
Desconocido Desconocido
faecalis
Metabolismo Λ, P1, P2 y Escherichia
Desconocido
del carbono Mu coli
Salmonella
Sintasa inducible de
Metabolismo enterica
sopEφ óxido nítrico
del nitrato serotipo
Typhimurium
Cambios Vibrio Isla de patogenicidad
CTXφ
fenotípicos cholerae VP-2
estables Streptococcus
SM1 pblA y pblB
mitis
Salmonella
enterica
Factores de sopEφ sopE
serotipo
virulencia
Typhimurium
Fagos Escherichia Toxinas Shiga stx-1 y
lambda coli stx-2
Clostridium Regulación de la
φCD38-2
difficile expresión de toxina
φCTX P. aeruginosa Citotoxina
Regulación positiva
de los reguladores de
Tolerancia al CPS-53 y Escherichia
respuesta general a
estrés CP4-57 coli
estrés oxidativo,
Plasticidad
osmótico y ácido
fenotípica
Clostridium Cassette de QS Agr
phiCDM1
Quorum difficile sin agrA
sensing Escherichia
Λ Desconocido
coli
Reguladores de alta a
Rasgos que Escherichia
Movilidad CP4-57 baja movilidad
afectan a la coli
formación
Lisis en el
de biofilm Streptococcus
interior del SV1 sv1
pneumoniae
biofilm
 40 INTRODUCCIÓN

Lisis que
Salmonella
conduce a la Genes líticos
enterica
liberación de ST64B ST64B(SL1344_1995-
serotipo
bacteriocina SL1344-1957)
Typhimurium

Los fagos pueden integrarse en sus células huésped, mediante un proceso

denominado lisogenia. En cada infección, estos virus deciden entre los ciclos
líticos y lisogénicos, es decir, si se replican y lisan su huésped o si se lisogenizan
y mantiene viable al huésped. Recientemente, se demostró en la bacteria
Bacillus subtilis que los virus emplean un sistema de comunicación mediante
pequeñas moléculas con el fin de decidir entre la lisis o la lisogenia, mecanismo
que se podría denominar el “quorum sensing vírico”. Durante la infección del
huésped, el fago produce un péptido de comunicación de seis aminoácidos de
longitud que se libera al medio. En las infecciones posteriores, los fagos de la
progenie miden la concentración de este péptido y se lisogenizan si la
concentración es suficientemente alta. Se encontró que diferentes fagos codifican
versiones diferentes del péptido, lo que demuestra un código de comunicación
péptido-específico de fago para las decisiones de lisogenia. Este sistema está
codificado por tres genes de fagos: aimP, que produce el péptido; aimR, el
receptor peptídico intracelular; y aimX, un regulador negativo de la lisogenia. El
sistema arbitrario permite a un fago descendiente «comunicarse» con sus
predecesores, es decir, estimar la cantidad de infecciones anteriores recientes y,
por lo tanto, decidir si emplea el ciclo lítico o lisogénico (75).

3. Red de quorum en las diferentes especies de Acinetobacter

3.1 Acinetobacter spp
Dentro del género Acinetobacter merece especial atención la especie A.
baumannii ya que en los últimos 30 años ha alcanzado una amplia distribución en
los países desarrollados y ha destacado como uno de los principales organismos
multirresistentes y causantes de infecciones nosocomiales. Según el estudio
multicéntrico de A. baumannii realizado en España en el año 2000 (GEIH-Ab
2000) por la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología
Clínica (SEIMC), A. baumannii fue aislado en el 89% de los hospitales
participantes (76). Además, la IDSA (Infectious Diseases Society of America) ha
 INTRODUCCIÓN 41

incluido a A. baumannii dentro de ESKAPE, siglas que representan a los

patógenos más importantes causantes de infecciones tanto hospitalarias como
comunitarias: Enterococcus faecium, S. aureus, Klebsiella pneumoniae, A.
baumannii, P. aeruginosa y Enterobacter spp (77). A. baumannii se considera
responsable de entre el 2% y el 10% de las infecciones hospitalarias producidas
por microorganismos Gram negativos.
La historia del género Acinetobacter se asocia con numerosos cambios
taxonómicos y se remonta a principios del siglo XX, cuando el microbiólogo
holandés Beijerinck describió un microorganismo llamado Micrococcus
calcoaceticus. En las décadas siguientes se nombraron con hasta 15 géneros y
especies diferentes a organismos con características similares: Diplococcus
mucosus, Micrococcus calcoaceticus, Alcaligenes haemolysans, Mima
polymorpha, Moraxella lwoffi, Herellea vaginicola, Bacterium anitratum, Moraxella
lwoffi var. Glucidolytica, Neisseria winogradskyi, Achromobacter anitratus y
Achromobacter mucosus. Finalmente en 1954, Bouvet y Grimont propusieron la
designación actual del género Acinetobacter aunque no fue hasta 1968 cuando
fue aceptada (78). Actualmente, debido a la aparición de técnicas de
secuenciación masiva de genomas y basándose en estudios de hibridación ADN-
ADN, la clasificación del género Acinetobacter incluye 53 especies validadas
para su publicación (http://apps.szu.cz/anemec/Classification.pdf) (Acceso
noviembre 2016) (Tabla 2). Desde un punto de vista clínico, las especies más
relevantes son A. baumannii, Acinetobacter pitti sp. nov. y Acinetobacter
nosocomialis sp. nov. (79). Estas 3 especies, junto A. calcoaceticus, están
estrechamente relacionadas y resulta complicado diferenciarlas mediante
métodos fenotípicos rutinarios, por lo que se incluyeron dentro de un grupo
común denominado complejo A. calcoaceticus-A. baumannii (80).
El genero Acinetobacter comprende un grupo heterogéneo de bacilos o
cocobacilos Gram negativos, frecuentemente dispuestos en parejas, inmóviles,
estrictamente aerobios, no fermentadores de glucosa, catalasa positivos, oxidasa
negativos y que presentan un contenido en guanina y citosina de entre el 39% y
el 47%. Suelen crecer bien en cualquier medio de cultivo rutinario y su
temperatura óptima de incubación se sitúa en los 37ºC (78).
 42 INTRODUCCIÓN

Tabla 2. Especies pertenecientes al género Acinetobacter.

Especie Referencia
A. albensis Krizova et al. 2015
A. apis Kim et al. 2014
A. baumannii Bouvet and Grimont 1986
A. baylyi Carr et al. 2003
A. beijerinckii Nemec et al. 2009
A. bereziniae Nemec et al. 2010
A. bohemicus Krizova et al. 2014
A. boissieri Álvarez-Pérez et al. 2013
A. bouvetii Carr et al. 2003
A. brisouii Anandham et al. 2010
A. calcoaceticus Bouvet & Grimont 1986
A. celticus Radolfova-Krizova et al 2016
A. courvalinii Nemec et al. 2016, Bouvet & Jeanjean 1989
A. dijkshoorniae Cosgaya et al. 2016
A. dispersus Nemec et al. 2016, Bouvet & Jeanjean 1989
A. equi Poppel et al. 2016
A. gandensis Smet et al. 2014
A. gerneri Carr et al. 2003
A. grimontii (=A. junii) Carr et al. 2003, Vaneechoutte et al. 2008
A. guangdongensis Feng et al. 2014
A. guillouiae Nemec et al. 2010
A. gyllenbergii Nemec et al. 2009
A. haemolyticus Bouvet and Grimont 1986
A. harbinensis Li et al. 2014
A. indicus Malhotra et al. 2012
A. johnsonii Bouvet and Grimont 1986
A. junii Bouvet and Grimont 1986
A. kookii Choi et al. 2013, sp. nov.
A. lwoffii Bouvet & Grimont 1986, Tjernberg & Ursing 1989
A. modestus Nemec et al. 2016, Touchon et al. 2014
A. nectaris Álvarez-Pérez et al. 2013
A. nosocomialis Nemec et al. 2011, Tjernberg & Ursing 1989
A. pakistanensis (=A. Abbas et al. 2014, Nemec & Radolfova-Krizova 2016
bohemicus)
A. parvus Nemec et al. 2003
A. pittii Nemec et al. 2011
A.populi Li et al. 2015
A. pragensis Radolfova-Krizova et al. 2016
A. proteolyticus Nemec et al. 2016, Touchon et al. 2014
A. puyangensis Li et al. 2013
A. qingfengensis Li et al. 2014
A. radioresistens Nishimura et al. 1988, Bouvet & Grimont 1986
A. rudis Vaz-Moreira et al. 2011
A. schindleri Nemec et al. 2001
A. seifertii Nemec et al. 2015, Gerner-Smidt & Tjernberg 1993
A. soli Kim et al. 2008
A. tandoii Carr et al. 2003
A. tjernbergiae Carr et al. 2003
A. towneri Carr et al. 2003
A. ursingii Nemec et al. 2001
A. variabilis Krizova et al. 2015
A. venetianus Vaneechoutte et al. 2009 ex Di Cello et al. 1997
 INTRODUCCIÓN 43

A. vivianii Nemec et al. 2016, Touchon et al. 2014

La mayoría de las especies de Acinetobacter son ubicuas y se han aislado a

partir de diversos nichos ecológicos como el suelo y el agua (81), forma parte de
la flora normal de la piel humana y puede colonizar el tracto respiratorio superior,
sin resultar patógeno en personas sanas (82). Desde un punto de vista clínico, la
capacidad de estas bacterias de sobrevivir en diversas superficies (tanto
húmedas como secas) en el ámbito hospitalario y la capacidad para adquirir
multirresistencias, afectando mayormente a pacientes inmunocomprometidos,
convierten a este género en una de las principales amenazas, siendo A.
baumannii su mayor representante en el ambiente hospitalario (83).

3.2 Acinetobacter baumannii: patógeno de éxito

Las enfermedades infecciosas fueron, durante siglos, una de las principales
causas de muerte en el mundo hasta el desarrollo de los antibióticos. Su uso
permitió reducir estas muertes en los países desarrollados de manera drástica
aumentando la esperanza de vida media de la población. Al mismo tiempo que
se trataban las infecciones, los microorganismos iban evolucionando,
adaptándose a su nuevo entorno y encontrando la forma de inactivar o impedir la
acción antibiótica llegando a aparecer especies multirresistentes, convirtiéndose
éstas en uno de los mayores retos de la medicina actual.

En febrero del año 2017, La Organización Mundial de la Salud (OMS) publicó su

primera lista de “patógenos prioritarios” resistentes a los antibióticos, en la que se
incluyen las 12 familias de bacterias más peligrosas para la salud humana y para
las que se necesitan urgentemente nuevos antibióticos ya que han adquirido
resistencias a carbapenémicos y a cefalosporinas de tercera generación, las
mejores opciones de tratamiento para bacterias multirresistentes. Dentro de esta
lista destaca el género Acinetobacter spp., en especial la especie A. baumannii
por su facilidad para desarrollar resistencias a diferentes grupos de antibióticos.

La necesidad de desarrollar alternativas al uso de antibióticos con el fin de evitar

o disminuir la aparición de multirresistencias es fundamental, una de ellas podría
 44 INTRODUCCIÓN

ser la basada en el QS y su interrupción (formando parte de las llamadas

“terapias antivirulentas”).

Varios son los factores que contribuyen al éxito de A. baumannii en el entorno

hospitalario convirtiéndolo en un patógeno de interés clínico: i) persistencia
durante largos periodos de tiempo en superficies animadas e inanimadas
(resistencia a la desecación) (84); ii) resistencia a los antimicrobianos y a los
desinfectantes o biocidas; iii) virulencia ( colonización, invasividad o citotoxicidad)
(85).
Las infecciones nosocomiales causadas por microorganismos oportunistas como
A. baumannii, se han incrementado. Entre ellas destacamos infecciones graves
como bacteriemias, meningitis y neumonías (86). Este microorganismo suele
afectar principalmente a pacientes ingresados en las Unidades de Cuidados
Intesivos (UCIs), donde están expuestos a dispositivos invasivos y/o a un estado
de inmunosupresión, dando lugar a brotes epidémicos (87). Uno de los posibles
orígenes de los brotes nosocomiales son las colonizaciones intestinales por este
patógeno (88, 89). Los tipos de muestras más frecuentemente analizadas en
pacientes incluyen esputos, exudados de traqueotomías, heridas, muestras
axilares, muestras faríngeas y frotis rectales. En un estudio español, que incluyó
la detección de A. baumannii en diferentes muestras de vigilancia de pacientes
en UCIs, el microorganismo se identificó en el 75% de las muestras axilar-
faríngeas y en el 77% de los frotis rectales. También fue hallado en el 90% de los
pacientes tras el análisis de una combinación de muestras
axilares/rectales/faríngeas y en el 96% de los pacientes después del análisis de
una combinación de muestras faríngeo-rectales (90).

3.3 Sistemas de quorum sensing/quorum quenching en A. baumannii

La maquinaria de QS en A. baumannii está mediada por un sistema de dos
componentes denominado AbaI/AbaR, homólogo al sistema LuxI/LuxR
encontrado en V. fischeri. Este sistema comprende una sintasa autoinductora,
AbaI, y una proteína receptora de AHLs denominada AbaR que forma un
complejo con la N-(3-hidroxidodecanoil)-L-homoserín lactona (3-OH-C12-HSL)
regulando los factores de virulencia, la formación de biofilm y la movilidad
superficial (54). Se observó, en mutantes ΔabaI, una reducción de entre el 30% y
 INTRODUCCIÓN 45

el 40% en la formación de biofilm en comparación con la cepa isogénica parental.

Una adición exógena de AHL purificada restaura la maduración del biofilm en
mutantes para ΔabaI (91).
Varias cepas de A. baumannii (63%) producen más de un tipo de AHL. Sin
embargo, ninguna de las señales de AHL puede ser asociada a una especie
particular del género. Las señales de QS en Acinetobacter no están distribuidas
de manera homogénea y, por este motivo, la distinción entre cepas virulentas y
no virulentas en función de estas señales resulta difícil. Se analizó la producción
de AHL en la formación de biofilm en cepas clínicas de A. baumannii y se
observó que alrededor del 60% (n=30) de las cepas clínicas de estudio formaron
biofilm al someterlas a una incubación prolongada. De las 30 cepas, únicamente
7 producían AHL de cadena larga. Esto puede ser debido a que la formación de
biofilm es un evento multifactorial y las señales de QS es solo uno de los muchos
factores implicados. Dos moléculas fueron particularmente abundantes en estas
cepas: N-dodecanoil-L-homoserín lactona (C12-HSL) y N-decanoil-L-homoserín
lactona (C10-HSL) (92).
OBJETIVOS
 OBJETIVOS 49

OBJETIVOS

A.baumannii es uno de los patógenos nosocomiales que más peligro entraña

debido, entre otros factores, a su alta tasa de multirresistencias. Por este motivo,
son necesarios nuevos enfoques que permitan desarrollar nuevas estrategias y
nuevos fármacos que puedan combatir este problema.
En la presente tesis doctoral, se llevó a cabo el análisis de los sistemas QS/QQ
en diferentes cepas clínicas de A. baumannii mediante la secuenciación de las
mismas o exposición a diferentes factores de estrés, con la finalidad de encontrar
nuevas dianas para el desarrollo de posibles terapias antiinfecciosas. Para ello,
se propusieron los siguientes objetivos:

 Capítulo I
1. Analizar los sistemas de quorum sensing y quorum quenching,
mediante ensayos mirobiológicos y transcriptómicos (microarrays y
qRT-PCR), en cepas clínicas de A. baumannii.
2. Estudiar la participación de los sistemas quorum sensing y quorum
quenching en el mecanismo de estrés oxidativo (sistema ROS).
3. Caracterización de una nueva enzima QQ (AidA) en cepas clínicas de
A.baumannii.
 Capítulo II
4. Secuenciación del genoma completo de la cepa clínica de A.
baumannii, Ab421_GEIH-2010 perteneciente al clon ST79/PFGE-HUI-1
(único clon susceptible a antibióticos carbapenémicos del II Estudio
Multicéntrico Español GEIH–REIPI A. baumannii 2000-2010) que no
presenta la bomba de eflujo AdeABC.
5. Analizar la secuencia completa del genoma de la cepa Ab421_GEIH-
2010 para describir sus características genómicas en relación a la
resistencia a antibióticos como tigeciclina, quinolonas y
aminoglucósidos.
 Capítulo III
6. Analizar, mediante estudios microbiológicos y transcriptómicos, la
respuesta al estrés (en presencia de sales biliares) en cepas clínicas
de A. baumannii (clon ST79/PFGE-HUI-1), carentes de la bomba de
 50 OBJETIVOS

eflujo AdeABC, así como en cepas isogénicas de A. baumannii

ATCC17978.
7. Analizar los factores de virulencia asociados a la activación del QS (en
presencia de sales biliares) en cepas clínicas de A. baumannii carentes
de la bomba de eflujo AdeABC.
 Capítulo IV
8. Secuenciación de dos cepas clínicas de A. baumannii aisladas en el
mismo hospital en el año 2000 y en el año 2010, pertenecientes al
mismo ST (ST-2_clon-2000 y ST-2_clon-2010) con el fin de analizar la
evolución de las poblaciones bacterianas.
9. Estudiar las secuencias completas de ambos genomas para describir
sus características y funciónes en relación a la presencia de proteínas
procedentes de bacteriófagos clínicos.
 Capítulo V
10. Estudiar la evolución molecular mediante secuenciación y análisis
genómico de dieciocho cepas clínicas de A. baumannii aisladas en el
mismo hospital y unidad de cuidados intensivos (UCI) (9 cepas
Ab_GEIH-2000s vs 9 cepas Ab_GEIH-2010s), pertenecientes al clon
ST-2 del II Estudio Multicéntrico Español (GEIH-REIPI A. baumannii
2000-2010).
11. Desarrollo de la secuencia lineal de los bacteriófagos (Ab105-1φ y
Ab105-2φ) a partir de la cepa representativa de la colección Ab_GEIH-
2010s (Ab105_GEIH-2010).
12. Caracterización de ambos bacteriófagos (Ab105-1φ y Ab105-2φ) en
cepas clínicas Ab_GEIH-2010s.
13. Análisis funcional de la red quorum (sistemas sensing/quenching) de
los aislamientos pertencientes a las colecciones Ab_GEIH-
2000s/2010s.
14. Capacidad infectiva de los bacteriófagos (Ab105-1φ y Ab105-2φ) en
aislamientos de las colecciones Ab_GEIH-2000s/2010s en condiciones
de estrés (3-oxo-C12-HSL) en relación con la enzima QQ, AidA.
CAPÍTULOS
 CAPÍTULO I 53

Capítulo I. Quorum sensing en cepas clínicas de Acinetobacter

baumannii: AidA, una nueva enzima con actividad quorum quenching

En la actualidad, no se conocen muchos estudios acerca de los sistemas de QS

y QQ en A. baumannii. Los realizados en otras especies muestran que el
mecanismo QQ podría interferir eficazmente con cualquiera de los procesos
clave del QS y ser potencialmente explotado para prevenir infecciones
microbianas, evitando la formación de biofilm y la movilidad (41).

En este primer capítulo, se analizaron dichos mecanismos en siete aislamientos

clínicos de A. baumannii con diferentes STs (Secuencia Tipo) y sensibilidades a
varios antibióticos, procedentes del II Estudio Multicéntrico Español GEIH–REIPI
A. baumannii 2000-2010.

El análisis de microarrays de uno de estos aislados, Ab1, previamente cultivado

en presencia de 3-oxo-C12-HSL, reveló la presencia de una posible enzima QQ
(α/β hidrolasa, AidA). Se realizaron estudios de movilidad y se observó que esta
enzima QQ estaba presente en todas las cepas clínicas no móviles (67% de los
cuales se aislaron del tracto respiratorio) cultivados en medio LB-LN (medio
Luria-Bertani bajo en nutrientes). Curiosamente, el gen que codifica la enzima
AidA, no se encontraba en el genoma de la única cepa clínica móvil que crecía
en este medio, Ab7 (A. baumannii cepa Ab421_GEIH-2010, aislado de una
muestra de sangre). En cuanto a la formación de biofilm, también se observó una
disminución en presencia de 3-oxo-C12-HSL.

Finalmente, para confirmar la actividad QQ, AidA se expresó en E. coli

BL21(DE3) usando el vector pET28 y se realizaron estudios de movilidad tipo
twitching (movimiento lento en superficie mediado por la extensión y retracción
de pili tipo IV) y de formación de biofilm. Se observó que la cepa E. coli
BL21(DE3)pET28-AidA, no mostraba movilidad. También se confirmó la actividad
QQ a través de la cepa Chromobacterium violaceum CV026 utilizada como
biosensor (93). Esta bacteria produce violaceína en presencia de AHLs de
cadena corta como C6-HSL; sin embargo, la presencia de AHLs de cadena larga
inhibe la producción de ese pigmento y, como resultado, se puede observar la
 54 CAPÍTULO I

formación de un halo blanco. En todas las cepas, excepto en Ab7 (la cepa de
referencia que exhibe la movilidad superficial) y en la cepa control, no se detectó
halo y, por lo tanto, la 3-oxo-C12-HSL, con la cual se incubaron los cultivos, no
estaba presente (actividad QQ). En cuanto a la cuantificación de biofilm, también
se observó una disminución significativa en la cepa E. coli BL21 (DE3) pET28-
AidA.

También se estudió la participación de los sistemas QS/QQ en la respuesta ROS

mediante qRT-PCR. En presencia de H2O2, activador de la respuesta ROS, la
expresión del gen α/β hidrolasa (sistema QQ) disminuyó significativamente
(P<0,05), mientras que el gen abaI (sistema QS) se encontraba hiperexpresado
(P <0,05).

A continuación, se adjunta la publicación correspondiente en la revista PloS One:

CAPÍTULO I 55
56 CAPÍTULO I
CAPÍTULO I 57
58 CAPÍTULO I
CAPÍTULO I 59
60 CAPÍTULO I
CAPÍTULO I 61
62 CAPÍTULO I
CAPÍTULO I 63
64 CAPÍTULO I
CAPÍTULO I 65
66 CAPÍTULO I
CAPÍTULO I 67
68 CAPÍTULO I
CAPÍTULO I 69
70 CAPÍTULO I
CAPÍTULO I 71
72 CAPÍTULO I
 CAPÍTULO II 73

Capítulo II. Secuenciación del genoma de una cepa clínica de

Acinetobacter baumannii perteneciente al clon ST79/PFGE-HUI-1
carente de la bomba de expulsión AdeABC

Las técnicas de secuenciación de genomas facilitan tanto los estudios

filogenéticos como epidemiológicos. Nos proporcionan un mayor conocimiento
genómico, pudiendo desvelar multitud de mutaciones así como pérdida y
ganancia de genes implicados en resistencias o virulencia bacteriana.

En el presente trabajo, se procedió a la secuenciación de una de las cepas

clínicas estudiada en el primer capítulo de esta tesis doctoral. Este aislado
pertenece al clon ST79/PFGE-HUI-1, incluido en el II Estudio Multicéntrico
Español GEIH–REIPI A. baumannii 2000-2010 y procedente del hospital Insular
de Gran Canaria.

Estudios previos del clon ST79/PFGE-HUI-1 revelaron, mediante análisis de

qRT-PCR, la ausencia de la bomba de eflujo AdeABC (94), por lo que se realizó
la secuenciación de dicha cepa, Ab 421_GEIH-2010 (nombrada Ab7 en el primer
capítulo), con el fin de conocer más acerca de las características genéticas de la
misma (código de acceso GenBank CP014266).

Tres bombas de expulsión de tipo RND han sido descritas en aislados clínicos de
A. baumannii: AdeABC, AdeFGH y AdeIJK. La bomba AdeABC confiere
resistencia a un gran número de antibióticos y está regulada por el sistema de
dos componentes AdeRS (67, 69). La bomba AdeIJK está regulada por un
regulador transcripcional de tipo TetR, AdeN. Finalmente, la bomba AdeFGH
también se relaciona con resistencias a numerosos antimicrobianos (65). La
hiperexpresión de esta última se ha asociado a una mutación en su regulador de
tipo LysR, denominado AdeL (95).

En el presente capítulo, se realizó la secuenciación del genoma con el

secuenciador GS Junior (454 Life Sequencing Inc., Branford, CT, EE.UU.). El
posterior análisis reveló un tamaño de 3,98 Mb, un contenido medio de CG del
39,2% y la presencia de 3066 regiones codificantes. El genoma anotado mostró
47 genes responsables de resistencias a antibióticos y compuestos tóxicos.
 74 CAPÍTULO II

Incluye 14 genes que codifican las bombas de eflujo AdeIJK y AdeFGH

asociadas con un perfil de resistencia a múltiples fármacos. Además, se observó
la presencia de una mutación en el gen regulador adeL que introdujo una
sustitución aminoacídica (Met7→STOP) produciendo la interrupción de esta
proteína.

A continuación, se adjunta la publicación correspondiente en la revista Genome

Announcements:
CAPÍTULO II 75
76 CAPÍTULO II
 CAPÍTULO III 77

Capítulo III. Respuesta a sales biliares en cepas clínicas de

Acinetobacter baumannii carente de la bomba de eflujo AdeABC:
virulencia asociada a la detección de quorum sensing

A. baumannii es un patógeno conocido por ser uno de los principales agentes

causantes de infecciones nosocomiales (96), cada vez más involucrado en brotes
hospitalarios en las UCIs (87). En la mayoría de estos brotes, numerosos objetos
inanimados del ambiente hospitalario han sido identificados como la principal
fuente de infección (97, 98). Sin embargo, se sabe que el género Acinetobacter
es un habitante de la piel humana. Por lo tanto, algunos investigadores han
postulado que, en el contexto de un brote de infección por A. baumannii, los
seres humanos pueden ser portadores transitorios facilitando esta contaminación
cruzada y representando también una posible fuente de propagación hospitalaria
de la infección (99). El tracto digestivo de los pacientes de las UCIs es un
importante reservorio de A. baumannii multirresistente en los entornos
hospitalarios (88). En un estudio español que incluyó la detección de A.
baumannii en diferentes muestras de vigilancia de pacientes de las UCIs, el
microorganismo fue identificado en el 75% de las muestras axilar-faríngeas y en
el 77% de los frotis rectales (90). Varios factores afectan a la capacidad del
microorganismo de persistir en un alto número en el intestino, tanto como
patógeno comensal como oportunista. Uno de estos factores es la tolerancia a
las sales biliares (61). Varios estudios han propuesto cómo los factores de
virulencia asociados con el sistema QS pueden ser regulados de manera
diferente a través del intestino por las sales biliares y, por tanto, por las diferentes
bacterias comensales presentes (70, 71).

En el presente trabajo y con el fin de estudiar esta asociación entre sales biliares
y QS en A. baumannii, se llevaron a cabo trabajos tanto en la cepa clínica
Ab421_GEIH-2010 (Ab7 en el primer capítulo), que no presenta la bomba
AdeABC y que hiperexpresa la bomba AdeFGH; como en la cepa de referencia
A. baumannii ATCC17978 y sus mutantes isogénicos para la bomba AdeABC (A.
baumannii ∆adeB ATCC 17978) y para el gen regulador de la bomba AdeFGH,
adeL (A. baumannii ∆adeL ATCC 17978).
 78 CAPÍTULO III

Se determinó el perfil de resistencias de estas cepas a varios antibióticos en

presencia del 0,5% de sales biliares (concentración fisiológica en el ser humano)
y del inhibidor de bombas de expulsión fenil-arginil-β-naftilamida (PAβN).

La resistencia de las cepas de A. baumannii a los diferentes antibióticos se vio

incrementada en presencia de las sales biliares, aunque no significativamente, lo
que podría indicar que la expresión de AdeFGH no estaría modulada por estas.
La CMI (concentración mínima inhibitoria) a tobramicina, tigeciclina, norfloxacino,
ciprofloxacino, gentamicina, tetraciclina y netilmicina se redujeron en A.
baumannii ∆adeL ATCC 17978 en presencia del inhibidor de bombas de eflujo
RND. Estos resultados confirman la hiperexpresión de la bomba de eflujo
AdeFGH en relación con la resistencia a antibióticos. Además, los niveles de
expresión, obtenidos mediante qRT-PCR, del gen adeG (AdeFGH,) explicarían
los resultados de los ensayos de CMIs. El nivel de expresión de adeG fue 2,53
veces mayor en presencia que en ausencia de tigeciclina (0,5 mg/L). En la cepa
clínica Ab421_GEIH-2010 las CMIs a tobramicina, tigeciclina, norfloxacino,
ciprofloxacino, gentamicina, tetraciclina y netilmicina disminuyeron en presencia
del inhibidor. La expresión fue 2,71 veces mayor en presencia que en ausencia
de tigeciclina en este aislado.

También se realizaron ensayos de movilidad superficial y de biofilm en presencia

de sales biliares y en medios de cultivo diferentes: LB normal, LB bajo en sales
(LB-LS) y LB bajo en nutrientes (LB-LN). En LB normal las cepas A. baumannii
ATCC17978 y A. baumannii ∆adeL ATCC 17978 no crecieron, mientras que A.
baumannii ∆adeB ATCC 17978 y Ab421_GEIH-2010 crecieron en presencia de
0,5 y 1% de sales biliares. La movilidad superficial de las cepas isogénicas
también fue mayor en presencia de sales biliares (0,5%) en el medio LB-LS. Sin
embargo, el mayor aumento en la movilidad de cepa Ab421_GEIH-2010 cultivada
en presencia de sales biliares (0,5%) se observó en LB-LN. Por lo tanto, esa
concentración de sales biliares y el medio modificado LB-LN fueron
seleccionados para realizar el resto de experimentos en este estudio. En los
ensayos de biofilm, la presencia de sales biliares produjo un incremento en la
capacidad de formación del mismo.
 CAPÍTULO III 79

En relación a los estudios de expresión génica, que se llevaron a cabo mediante

microarrays y qRT-PCR, se observó hiperexpresión de genes QS (del A1S_0112
al A1S_0116) en cepas carentes de la bomba AdeABC (A. baumannii ΔadeB
ATCC17978 y en cepas clínicas pertenecientes al clon ST79/PFGE-HUI-1
cultivadas en presencia de sales biliares). En cuanto a los estudios de
microarrays en A. baumannii ΔadeB ATCC17978 y a los estudios de qRT-PCR
en las cepas clínicas del clon ST79/PFGE-HUI-1, incluyendo la cepa
Ab421_GEIH-2010, se observó la implicación del transportador de
glutamato/aspartato relacionado con la tolerancia al ácido y de proteínas
asociadas a la adaptación a sales biliares. También se produjo una
hiperexpresión en otros factores de virulencia modulados por el sistema QS,
como movilidad superficial, formación de biofilm (A1S_2218 y A1S_1510) y en el
sistema de secreción tipo VI (T6SS).

A continuación se adjunta la publicación correspondiente en la revista Frontiers in

Cellular and Infection Microbiology:
CAPÍTULO III 81
82 CAPÍTULO III
CAPÍTULO III 83
84 CAPÍTULO III
CAPÍTULO III 85
86 CAPÍTULO III
CAPÍTULO III 87
88 CAPÍTULO III
CAPÍTULO III 89
90 CAPÍTULO III
CAPÍTULO III 91
92 CAPÍTULO III
CAPÍTULO III 93
 CAPÍTULO IV 95

Capítulo IV. Evolución genómica de dos cepas clínicas de

Acinetobacter baumannii a partir de clones ST-2 aislados en 2000 y
2010 (ST-2_clon_2000 y ST-2_clon_2010)

La gran habilidad que presenta A. baumannii para persistir en el ambiente

hospitalario se debe, entre otras causas, a la adquisición de elementos móviles
como transposones, plásmidos o fagos (lo que se conoce como el moviloma).

En este estudio, se secuenciaron dos cepas clínicas de A. baumannii (ST-

2_clon_2000 y ST-2_clon_2010) pertenecientes al II Estudio multicéntrico A.
baumannii GEIH-REIPI 2000-2010 (número de acceso GenBank PRJNA308422).
La cepa ST-2_clon_2000 es sensible a antibióticos carbapenémicos, en cambio,
la cepa ST-2_clon_2010 es resistente. Ambas mostraban una relación clonal del
90%, obtenida mediante electroforesis en gel de campo pulsante (PFGE),
después de una década en el mismo hospital y en la misma unidad (UCI), por lo
que resultó interesante plantearse un mayor estudio de las mismas con el fin de
revelar los mecanismos que permitieron esta capacidad de adaptación.

Estas cepas fueron secuenciadas usando la plataforma GS FLX+ de Roche 454.

El tamaño del genoma de la cepa ST-2_clon_2000 resultó de 3,9 MB y el de la
cepa ST-2_clon_2010 de 4,1 MB.

La comparación de las secuencias cromosómicas de las cepas ST-2_clon_2000

y ST-2_clon_2010 reveló lo siguiente: (i) 3,627 proteínas fueron idénticas en
ambas cepas; (ii) 88 proteínas eran muy similares; (iii) cinco proteínas comparten
una similitud de menos del 60%; (iv) 20 proteínas eran únicas para ST-
2_clon_2000; (v) 212 proteínas sólo estaban presentes en ST-2_clon_2010, la
mayoría de las cuales eran similares a proteínas de fagos; y (vi) el cromosoma
de la cepa ST-2_ clon-2010 contiene varias secuencias de bacteriófagos.
Finalmente, la comparación de secuencias plasmídicas indicó lo siguiente: (i) 90
proteínas fueron idénticas en ambas cepas; (ii) tres proteínas mostraron un alto
grado de similitud (>60% de similitud); (iii) se encontraron 17 proteínas
plasmídicas sólo en ST-2_clon-2010 (pMMCU3 que albergaba el gen blaOXA-24 y
 96 CAPÍTULO IV

el sistema de toxina/antitoxina AbkA/AbkB) (100, 101); y (iv) ST-2_clon_2000 no

compartió ninguna proteína plasmídica con ST-2_clon_2010.

A continuación, se adjunta la publicación correspondiente en la revista Genome

Announcements:
CAPÍTULO IV 97
98 CAPÍTULO IV
 CAPÍTULO V 99

Capítulo V. Selección natural mediante moviloma (fagos y plásmidos)

de cepas de Acinetobacter baumannii (ST-2) con sistemas
funcionales de la red quorum (sensing/quenching)

Actualmente, A. baumannii es endémica en algunas UCIs y es el segundo o

tercer patógeno más común en los entornos hospitalarios (102). Esto se debe a
su capacidad para persistir en el ambiente hospitalario durante largos períodos
de tiempo, al aumento continuo de la resistencia a múltiples fármacos y también
a la virulencia y/o patogenicidad adquiridas principalmente a través de elementos
genómicos móviles (fagos, plásmidos y transposones). La proliferación de
elementos móviles estimula la recombinación cromosómica y el reordenamiento,
contribuyendo a una mayor variabilidad genética y de adaptación (80). Las
infecciones de fagos en bacterias pueden afectar al comportamiento y aptitud del
anfitrión.

Los bacteriófagos pueden pueden introducir multitud de genes que proporcionan

funciones de diferentes tipos a sus huéspedes, pueden proporcionar cambios
fenotípicos estables o una mayor plasticidad al huésped, mejorando así la
supervivencia bacteriana bajo condiciones de estrés (74). Existe una clara
relación entre la regulación de la respuesta bacteriana a los fagos y el sistema de
QS (103). Además, como ya se comentó anteriormente, los mecanismos QQ
ocurren naturalmente bloqueando los pasos clave del QS, tales como la
generación, acumulación o recepción de señales. En el primer capítulo de esta
tesis se describe una nueva enzima QQ aislada a partir de cepas clínicas de A.
baumannii, AidA (104). Esta enzima podría estar implicada en competencia
bacteriana, ya que es capaz de hidrolizar las moléculas de señalización que
median entre especies.

Por otro lado, también se ha demostrado que el transporte de plásmidos puede

tener efectos complejos sobre el fenotipo bacteriano: alterando la formación de
biofilm (105, 106), la hidrofobicidad celular (107), la tolerancia al estrés o la
movilidad (106). Harrison y colaboradores, mostraron que el transporte de
plásmidos también puede limitar la coevolución de bacterias y fagos, alterando la
trayectoria evolutiva a largo plazo de las poblaciones bacterianas (108).
 100 CAPÍTULO V

En este trabajo se compararon dieciocho genomas de cepas aisladas en el

mismo hospital y en la misma unidad (UCI) con diez años de diferencia: 9
Ab_GEIH-2000s y 9 Ab_GEIH-2010s. Todas pertenecenecientes al clon ST-2 del
II Estudio Multicéntrico GEIH-REIPI A. baumannii 2000-2010 realizados en
España.

El presente capítulo constituye un último manuscrito en preparación. A

continuación, se detallan los materiales y métodos así como los resultados.

5.1 MATERIAL Y MÉTODOS

Cepas y relación clonal

Se seleccionaron 18 cepas clínicas de A. baumannii procedentes del II Estudio

Multicéntrico Español (GEIH-REIPI A. baumannii 2000-2010), aisladas en los
años 2000 (Ab_GEIH-2000s) y 2010 (Ab_GEIH-2010s) (109), en la misma UCI
de un hospital español (101) y pertenecientes al clon ST2 (indicado por
tipificación multilocus de secuencias, MLST en inglés).

Secuenciación masiva (NGS o Next Generation Sequencing) y análisis de

genomas

Se realizó secuenciación en las cepas nombradas utilizando el secuenciador

Roche 454 GS FLX + y el sistema Illumina MiSeq. Posibles ORFs se predijeron a
partir de contigs ensamblados utilizando el programa GeneMarKS (110), que
previamente fue probado con el genoma de A. baumannii (GI: 83207914). Para
la anotación funcional de cada proteína predicha se emplearon los programas
Blast2Go (111) y RAST (112). Los ARNr y ARNt se identificaron utilizando las
herramientas RNAmmer (113) y ARNtscan SE 1.21 (114). La construcción del
pan-genome (colección de genes de una especie), del core-genome (genes
presentes en todas las cepas de una especie) y del accessory genome (genes
que no están presentes en todas las cepas de una especie) de los aislados de
las colecciones Ab_GEIH-2000s/2010s se llevó a cabo utilizando los programas
PanSeq (115) y Spine tools (116). Las secuencias de fagos se ensamblaron
manualmente para mejorar su continuidad. Se realizaron amplificaciones
mediante PCR para confirmar los resultados de ensamblaje in silico. Las
secuencias de fagos ensambladas se analizaron utilizando las herramientas
 CAPÍTULO V 101

PHAST y PHASTER (117). La anotación manual de todas las proteínas de fagos

detectadas se realizó utilizando las herramientas Blast (118) e InterProScan
(119).

Bacteriófagos temperados

La inducción de fagos con mitomicina C (MMC) fue analizada en la cepa

Ab105_GEIH-2010 (aislado representativo de la colección Ab_GEIH-2010s)
mediante tres métodos:

a.1) Estudios de expresión mediante microarrays y qRT-PCR: Se obtuvo

ARN tratado con ADNasa a partir de cultivos en fase exponencial media de
crecimiento tratado con MMC a una concentración final de 10 g ml-1 e incubado
durante una hora adicional. Los controles correspondientes se tomaron de la
misma manera sin la adición de MMC.

Para la extracción de ARN se empleó el kit High Pure RNA Isolation (Roche,
Germany). Los microarrays fueron diseñados específicamente para Ab
105_GEIH-2010 por Bioarray Diagnóstico Genético (Alicante, Spain) usando
eArray (Agilent). El marcado fue llevado a cabo siguiendo el método de dos
colores usando Fair Play III, versión 1.3 (Agilent). Se realizaron tres extracciones
independientes (réplicas biológicas) de ARN por cada condición. El análisis
estadístico se realizó usando Bioconductor. Se consideraba que un gen era
inducido cuando el ratio del tratado frente al no tratado era ≥1.5 y el p-valor era <
0.05.

La qRT-PCR se llevó a cabo con el fin de estudiar la expresión de los genes de

bacteriófagos en relación a la interacción con el hospedador bacteriano. Se
empleó el kit Lightcycler 480 RNA MasterHydrolysis Probe (Roche, Germany).
Las sondas TaqMan UPL (Universal Probe Library), las sondas TaqMan y los
cebadores se nombran en la Tabla 1S. Todos los experimentos se realizaron por
triplicado. Para cada cepa, se normalizó la expresión relativa (ER) de todos los
genes con el gen de referencia rpoB.

a.2) Curvas de crecimiento: Se realizó una dilución 1: 100 (v / v) en LB

procedente de un cultivo overnight de la cepa clínica Ab105_GEIH-2010 y se
incubaron en agitación a 37ºC. Uno de los cultivos bacterianos fue expuesto a
 102 CAPÍTULO V

MMC (para la inducción de los bacteriófagos) a una concentración final de 10 g

ml-1 cuando la DO600nm (Densidad óptica) alcanzó 0,5. Posteriormente, se
tomaron muestras de 1 ml para la extracción de ARN y para microscopía de
transmisión (TEM) cada 20 minutos durante la primera hora y, después, cada
hora.

a.3) Aislamiento de fagos y estudios de TEM: El cultivo de Ab105_GEIH-

2010 se sometió a inducción con MMC como se describió anteriormente. Los
lisados se centrifugaron a 3400x g durante 10 minutos y el sobrenadante se filtró
empleando membranas con un tamaño de poro de 0,22 nm (Millipore). Se añadió
NaCl a una concentración final de 0,5 M, se mezclaron a fondo y se dejaron en
hielo durante una hora. Posteriormente, se centrifugaron a 3400x g, a 4ºC
durante 40 minutos, y el sobrenadante se transfirió a un tubo estéril. Se añadió
un 10% (peso / volumen) de PEG 6000 y se homogeneizaron los tubos a
temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de una incubación overnight a
4ºC. Los fagos se precipitaron a 3400x g, a 4ºC durante 40 minutos y se
resuspendieron en tampón SM (0,1 M NaCl, 1mM MgSO4, 0,2 M Tris–HCl; pH
7,5) (120). Se almacenaron a 4ºC hasta su procesamiento para TEM. Estas
muestras se analizaron después de una tinción negativa con acetato de uranilo al
1%, usando un microscopio electrónico JEOL JEM-1011.

Red de quorum en aislamientos de Ab_GEIH_2010s: genes de QS y QQ

Se examinó, mediante qRT-PCR, la ER de genes de la red quorum (abaI del

sistema QS y aidA del sistema QQ) (104). Se obtuvo el ARN del cultivo en
presencia de la AHL 3-oxo-C12-HSL, asociada a la inhibición del sistema QS (54,
104) y con H2O2, implicado en la activación del sistema QS (57, 104). Se utilizó
el kit Lightcycler 480 RNA MasterHydrolysis Probe (Roche, Alemania) para los
estudios de qRT-PCR. Las sondas Taqman UPL, las sondas Taqman y los
cebadores empleados se nombran en la Tabla 1S. Todos los experimentos se
realizaron por triplicado a partir de tres extracciones de ARN diferentes. Los
resultados de expresión fueron normalizados en base al nivel de expresión del
gen de referencia rpoB. También se estudió la movilidad superficial (fenotipo de
detección de quorum) (104) de todas las cepas. Los ensayos de movilidad se
llevaron a cabo en placas LB-LN (bajo en nutrientes) (121) que contenían 2 gr. de
 CAPÍTULO V 103

triptona, 1 gr. de extracto de levadura, 5 gr. de NaCl y 0,25% de Difco agar

(BactoTM).

Extracción de los bacteriófagos

Los bacteriófagos lisogénicos (Ab105-1φ y Ab105-2φ) se obtuvieron a partir de

un cultivo de la cepa de A.baumannii Ab105_GEIH-2010, para ello la bacteria se
cultivó en medio LB a 37ºC hasta que alcanzó la fase logarítmica tardía de
crecimiento. Con la finalidad de lisar las células y obtener también los fagos
presentes en su interior, el cultivo se incubó en presencia de cloroformo al 10%
durante 30 minutos y se centrifugó a 3000x g durante 15 minutos, el
sobrenadante se recuperó y se filtró a través de membranas de 0,22 µm de
Millipore para obtener los bacteriófagos. Con el fin de conseguir una alta
concentración, se extendieron mediante el método de doble capa en agar (122)
infectando la cepa de A.baumannii Ab177_GEIH-2000 que no presenta
bacteriófagos. Las placas se lavaron en agitación durante 3 horas con 3 ml de
tampón de fagos (Tris-HCL 10 mM pH 7,5 y 1,8 MgSO4) recuperándose el
tampón y siendo los fagos filtrados de nuevo.

Estimación de la susceptibilidad bacteriana a bacteriófagos

Todas las cepas de colecciones Ab GEIH-2000s/2010s se cultivaron durante toda

la noche. Posteriormente, se realizó una dilución 1:100 en medio LB y en medio
LB suplementado con 10 μM de 3-oxo-C12-HSL (AHL exógena que inhibe la
detección de quorum en A. baumannii). Cuando los cultivos crecieron hasta una
DO600nm de 0,1, se infectaron a un MOI (multiplicidad de infección, se calcula
dividiendo el número de fagos (UFP) entre el número de bacterias (UFC), en un
determinado volumen de mezcla de infección.) de 10 con los bacteriófagos
previamente purificados de la cepa Ab105_GEIH-2010. Los cultivos se incubaron
a 37ºC y en agitación a 180 rpm durante 4 horas. Se usó una alícuota de cada
cultivo para establecer la UFC por medio de placas de dilución en serie. A
continuación, los bacteriófagos se extrajeron como se describió anteriormente y,
finalmente, los UFP se enumeraron por el método de doble capa de agar usando
la cepa Ab177_GEIH-2000 como sustrato de la infección.
 104 CAPÍTULO V

Detección de la ß-lactamasa OXA 24/40 y el sistema toxina-antitoxina

AbkA/AbkB en las colecciones Ab_GEIH-2000s/2010s

Se determinó el perfil de sensibilidad a varios antibióticos mediante microdilución,

de acuerdo con las recomendaciones del CLSI (123). Además, se analizó por
PCR la presencia de la ß-lactamasa OXA 24/40 y del sistema toxina-antitoxina
AbkA/AbkB en todas las cepas de las colecciones Ab_GEIH-2000s/2010s

5.2 RESULTADOS
Características genómicas de las colecciones Ab_GEIH-2000s/2010s

En la Tabla 1 se observa que el 44,44% de los aislamientos de Ab_GEIH-2000s

presentaban el plásmido AbATCC329/pMMCU3 albergando la ß-lactamasa OXA
24/40 y el sistema toxina-antitoxina AbKA/AbkB frente al 100% de los
aislamientos de Ab_GEIH2010s. La comparación de las secuencias
cromosómicas de colecciones Ab_GEIH-2000s/2010s reveló lo siguiente (Figura
1):

i) El número de proteínas similares en Ab GEIH-2010s fue mayor que en

Ab_GEIH2000s (3654 proteínas frente a 3301 proteínas).

ii) De estas proteínas, 239 de Ab_GEIH-2010 (core-genome) se localizaron en

bacteriófagos, frente a 21 de Ab_GEIH-2000s.

iii) De las 51 proteínas presentes sólo en Ab_GEIH-2010s (accesory-genome), 40

de ellas (79%) se localizaron en los bacteriófagos. Por último, la comparación de
las secuencias plasmídicas indicó la presencia de 17 proteínas que sólo se
encontraron en Ab_GEIH-2010s. Además, en el genoma de la cepa
Ab105_GEIH-2010 (representativa de la colección Ab GEIH-2010s) se hallaron
dos fagos temperados (bacteriófagos): Ab105-1φ (tamaño 41.496 pb; 63 ORFs) y
Ab105-2φ (tamaño 61.304 pb; 93 ORFs). Las secuencias se depositaron en el
GenBank bajo los números de secuencia KT588074 y KT88075,
respectivamente. El fago con mayor homología para ambos fue el bacteriófago
Siphoviridae YMC / 09/02 / B1251 ABA BP (Bphi-B1251 [NC_019541.1]). Todos
las ORFs que comprenden los dos bacteriófagos, se muestran en las Tablas 2S y
3S. Los genomas de fagos alineados completos (ORFs) se muestran en la Figura
2. Por último, se observó la presencia de los bacteriófagos Ab105-1 φ y Ab105-2
 CAPÍTULO V 105

φ en todas las cepas de la colección de Ab_GEIH-2010s pero no en la colección

Ab_GEIH-2000s (Figura 3).

Respuesta de los bacteriófagos temperados (Ab105-1φ y Ab105-2φ) a la

MMC

La respuesta SOS produjo diferencias en la expresión en los genes de los dos

bacteriófagos de Ab105_GEIH-2010, estudiada mediante microarrays. Sólo tres
ORFs se expresaron en el bacteriófago Ab105-1φ, mientras que 28 ORFs se
expresaron en el bacteriófago Ab105-2φ (Tabla 2). Además, 40 minutos después
de la adición de MMC, se observó mediante qRT-PCR la hiperexpresión, en el
bacteriófago Ab105-2φ, de ORF06 (proteína similar a MazG) con una ER de 200
veces, de ORF27 (metiltransferasa-SAM) con una ER de 81,3 veces y
finalmente, ORF93 (umuC) con una ER de 10 veces. El comportamiento
bacteriano después de la incubación con MMC se muestra en la Figura 4 donde
se pudo observar lisis bacteriana. Por último, también en la misma figura, se
muestra la morfología característica de los fagos de la familia Siphoviridae,
presentando una cola larga y una cápside icosaédrica con un diámetro de 60 nm
(http://viralzone.expasy.org/).

Respuesta de los aislamientos de A.baumannii Ab_GEIH-2000s/2010s a las

condiciones de estrés (3-oxo-C12-HSL y H2O2)

Los resultados de la expresión de los genes abaI (QS) y aidA (QQ) en todas las
cepas de las colecciones Ab_GEIH-2000s/2010s, en condiciones de estrés, se
analizan en la Tabla 4. En presencia de la molécula 3-oxo-C12-HSL (inhibición
del QS), todos los aislados de Ab_GEIH-2010s mostraban hiperexpresion del gen
aidA mientras que solamente el 55,5% de los aislamientos de Ab_GEIH-2000s
mostraban esta enzima QQ hiperexpresada así como solo un 44,4% de estas
cepas hiperexpresaban el gen abaI. Por otra parte, la activación del sistema QS
mediante la respuesta ROS (presencia de H2O2) produjo la hiperexpresión del
gen abaI en todos los aislamientos de este estudio. Finalmente, el perfil de
movilidad superficial fue también homogéneo en cepas de Ab_GEIH-2010s frente
a la heterogeneidad de los aislados de Ab_GEIH-2000s (Figura 5).
 106 CAPÍTULO V

Impacto de los bacteriófagos: capacidad infectiva

En todas las cepas de la coleción Ab_GEIH-2010s, así como en la cepa

Ab177_GEIH-2000 con una red quorum funcional (portadoras de la proteína
AidA), la capacidad infectiva (UFP/UFC) de los bacteriófagos (Ab105-1φ y
Ab105-2φ) no presentó diferencias estadísticamente significativas tanto en
presencia como en ausencia de la molécula 3-oxo-C12-HSL. Sin embargo, en las
cepas de la colección Ab_GEIH-2000s, carentes de la proteína AidA
(Ab175_GEIH-2000 y Ab192_GEIH-2000), con baja expresión de la misma
(Ab158_GEIH-2000 y Ab183_GEIH-2000) así como en las que presentaban
mutaciones o deleciones en la proteína AbaR (Ab169_GEIH-2000 y
Ab161_GEIH-2000), estos bacteriófagos no fueron capaces de infectar. Además,
en la única cepa del estudio que no presentaban las proteínas AidA, AbaI ni
AbaR (Ab166_GEIH-2000), se observó un incremento estadísticamente
significativo de la escasa capacidad infectiva de los bacteriófagos (Ab105-1φ y
Ab105-2φ) en dicha cepa, en presencia de la molecula externa 3-oxo-C12-HSL
(Figura 6).

Plásmido con ß-lactamasa OXA 24/40 y sistema toxina-antitoxina

AbkA/AbkB
Las CMIs de las cepas de este estudio se muestran en la Tabla 3. Las CMIs a
imipenem (64 mg/L) y meropenem (> 128 mg/L) fueron las mismas para todos los
aislados de Ab_GEIH-2010 a diferencia de los pertenecientes a Ab_GEIH-2000.
Además, las cepas de Ab_GEIH-2010 mostraron mayor susceptibilidad que las
cepas de Ab_GEIH-2000 a amikacina (resistencia asociada a enzimas
modificadoras de aminoglucósidos).

A continuación, se adjuntan las tablas y figuras de este manuscrito en

preparación:
 CAPÍTULO V 107

LEYENDA DE FIGURAS Y TABLAS

Tabla 1. Análisis de secuenciación masiva de las cepas de estudio. Dichas
secuencias forman parte del Bioproyecto “II Spanish Multicenter Study. GEIH-
REIPI Acinetobacter baumannii 2000-2010” con código de acceso en “Bioproject
Genbank”: PRJNA308422.

Tabla 2. Resultados de expresión por microarrays del genoma de la cepa

representativa Ab105 de la colección Ab_GEIH-2010s bajo respuesta SOS y
expresión lítica/metabólica de genes de los fagos Ab 105-1φ y Ab105-2φ. Datos
adscritos a Gene Expression Omnibus [GEO, Genbank] con código de acceso:
GSE72885.

Tabla 3. Cepas y CMIs a diferentes antibióticos. CAZ: ceftazidima; IMP:

Imipenem; MER: Meropenem; SUL: Sulbactam; GEN: Gentamicina; TOB:
Tobramicina; AMK: Amicacina; CIP: Ciprofloxacino; MIN: Minociclina; TIG:
Tigeciclina; COL: Colistina; DOR: Doripenem; DOX: Doxiciclina; TET:
Tetraciclina; RIF: Rifampicina. Como controles se utilizaron las cepas E. coli
ATCC25922 y P. aeruginosa ATCC27853.

Tabla 4. Expresión relativa de los genes de la red quorum (abaI y aidA) en

presencia de 3-oxo-C12-HSL y H2O2. NA, No aplicable. *, Indica la existencia de
deleciones o mutaciones en dichas cepas.

Tabla 1S. (Material Suplementario). Cebadores y sondas usados en este estudio.

Tabla 2S. (Material Suplementario). Descripción functional de las proteínas

(ORFs) del bacteriófago Ab 105-1ϕ.

Tabla 3S. (Material Suplementario). Descripción functional de las proteínas

(ORFs) del bacteriófago Ab 105-2ϕ.

Figura 1. (A). Comparación genómica de los aislamientos de Ab_GEIH-2000s y

Ab_GEIH_2010s: Cada cepa está representada por un óvalo de color en función
de la participación en Ab_GEIH-2000s (azul) o Ab_GEIH-2010s (amarillo). El
número en las porciones no solapadas de cada óvalo es el número de CDS
(secuencia de ADN codificante) en cada cepa (accessory-genome). El número
total de CDS dentro de cada genoma se muestra entre paréntesis debajo del
 108 CAPÍTULO V

nombre de la cepa. En el centro, el tamaño del core-genome se realizó con el

programa Adobe Illustrator; (B) Comparación genómica de los aislamientos de
Ab_GEIH-2000s: el core-genome (centro) y el accessory-genome de cada
aislamiento (óvalo azul). El número total de CDS dentro de cada genoma se
muestra entre paréntesis debajo del nombre de la cepa; (C) Comparación
genómica de aislamientos de Ab_GEIH-2010s: el core-genome (centro) y el
accessory-genome de cada aislamiento (óvalo amarillo). El número total de CDS
dentro de cada genoma se muestra entre paréntesis debajo del nombre de la
cepa.

Figura 2. Representación de la anotación del genoma para los fagos Ab 105-1φ

(A) y Ab 105-2φ (B). Los genes se han predicho utilizando, GenMark (probado
con la anotación existente de A. baumannii MDR-TJ). La anotación de los genes
resultantes se realizó integrando los resultados de los programas Blast2Go, Rast,
Phast y anotación manual utilizando BLAST. Usando esta información los genes
se han clasificado en diferentes categorías. Las secuencias codificantes se
representan con flechas.

Figura 3. La gráfica Circos, representa el genoma de los fagos Ab 105-1φ y Ab

105-2φ. Desde la parte más externa a la más interna: 1) Nombres de las ORF
predichas, 2) Genomas de ambos fagos, 3) Genes clasificados usando las
mismas categorías explicadas en la figura anterior 4) Similitud entre los genomas
de los dos fagos y las secuencias de las otras cepas de la colección Ab_GEIH_
2010s, el color rojo no significa ninguna similitud entre ellos en esa región, es
decir, esta región no está presente en el otro genoma o no se ha detectado con
suficiente confianza, el color verde significa que con un alto nivel de confianza, la
región está presente. 5) Similitud entre los genomas de los dos fagos y las
secuencias de las otras cepas de la colección Ab_GEIH_2000s.

Figura 4. A. Curvas de crecimiento de la cepa representativa Ab105_GEIH-

2010s, bajo respuesta SOS (inducción con MMC). B. Fagos examinados por
TEM.

Figura 5. Estudios de movilidad de los aislamientos Ab_GEIH-2000s/2010s a.

Ab155_GEIH-2000; b.Ab158_GEIH-2000; c.Ab161_GEIH-2000; d. Ab166_GEIH-
2000; e. Ab169_GEIH-2000; f. Ab175_GEIH-2000; g. Ab177_GEIH-2000; h.
 CAPÍTULO V 109

Ab183_GEIH-2000; i. Ab192_GEIH-2000; j. Ab33_GEIH-2010; k. Ab49_GEIH-

2010; l. Ab54_GEIH-2010; m. Ab76_GEIH-2010; n. Ab103_GEIH-2010; ñ.
Ab104_GEIH-2010; o. Ab105_GEIH-2010; p. Ab121_GEIH-2010 q.
Ab122_GEIH-2010.

Figura 6. Efecto de la red quorum (portando la enzima AidA) en la capacidad de

infección de los bacteriófagos. Tres cepas de A. baumannii (Ab105_GEIH-2010,
Ab177_GEIH-2000 y Ab166_GEIH-2000) se infectaron con Ab105-1φ y Ab105-2
φ tanto en presencia como en ausencia de la molécula 3-oxo-C12-HSL (gris claro
y gris oscuro, respectivamente), empleada como inhibidor del QS en A.
baumanni. ** Indica que existen diferencias estadísticamente significativas
aplicando el test t de Student de dos colas y P< 0.05
 110 CAPÍTULO V

Tabla 1

Cepas ST-2 Núm. accesoa GenBank Tamaño (GC%) Contigs CDSsa ARN AbATCC329 / Plásmido pMMCU3 b
Ab 155_GEIH-2000 LJHA00000000 3,991,758 (39.0%) 64 3,759 63 -
Ab 158_GEIH-2000 MSMC00000000 3,860,705 (39.6%) 885 3,507 22 +
Ab 161_GEIH-2000 MSMB00000000 3,848,902 (39.6%) 820 3,483 24 +
Ab 166_GEIH-2000 MSMG00000000 3,572,409 (39.8%) 1134 3,141 20 -
Ab 169_GEIH-2000 MSMF00000000 3,653,226 (39.5%) 973 3,273 21 -
Ab 175_GEIH-2000 MSMI00000000 3,744,299 (39.7%) 895 3,392 21 -
Ab 177_GEIH-2000 MSME00000000 3,896,859 (39.4%) 511 3,617 27 -
Ab 183_GEIH-2000 MSMJ00000000 3,869,061 (39.5%) 793 3,523 24 +
Ab 192_GEIH-2000 MSMH00000000 3,781,564 (39.4%) 542 3,466 24 +
Ab 105_GEIH-2010 LJHB00000000 4,092,613 (39.0%) 77 3,918 67 +
Ab 33_GEIH-2010 MSMK00000000 4,032,038 (39.3%) 483 3,826 24 +
Ab 49_GEIH-2010 MSMM00000000 3,863,043 (39.4%) 626 3,620 28 +
Ab 54_GEIH-2010 MSML00000000 3,972,430 (39.4%) 655 3,707 29 +
Ab 76_GEIH-2010 MSLY00000000 3,862,509 (39.6%) 888 3,523 24 +
Ab 103_GEIH-2010 MSLX00000000 3,883,445 (39.6%) 850 3,559 24 +
Ab 104_GEIH-2010 MSMA00000000 3,960,610 (39.4%) 650 3,690 25 +
Ab 121_GEIH-2010 MSLZ00000000 3,987,262 (39.3%) 522 3,758 25 +
Ab 122_GEIH-2010 MSMD00000000 3,839,340 (39.6%) 837 3,505 24 +
 CAPÍTULO V 111

Tabla 2

ORF Descripción Función general Nivel de expresión

Ab 105-1ϕ
ORF08 ATPasa tipo AAA / Familia de las ATPasas RecA Replicación viral 10,7
ORF09 Proteína hipotética/Función desconocida - 4,5
ORF10 Proteína hipotética/Función desconocida - 3,4
Ab 105-2ϕ
ORF01 Integrasa Estado lisogénico 3,26
ORF02 Proteína hipotética/Función desconocida - 5,60
Protección bacteriana- Sistema
ORF03 Metiltransferasa-SAM 7,09
antiviral
ORF04 Proteína hipotética/Función desconocida - 6,83
ORF05 Proteína de fago - 7,90
Protección bacteriana- Sistema
ORF06 Proteína del tipo MazG 10,96
antiviral
ORF07 Proteína hipotética/Función desconocida - 10,39
ORF08 Proteína hipotética/Función desconocida - 13,36
ORF09 ATPasa tipo AAA / Familia de las ATPasas RecA Replicación viral 12,40
ORF11 Proteína hipotética/Función desconocida - 16,75
ORF18 Regulador transcripcional de la familia XRE (represor) Regulación lítica/lisogénica 4,35
ORF19 Regulador transcripcional (Represor del tipo Lambda) Regulación lítica/lisogénica 10,36
ORF20 Proteína hipotética/Función desconocida - 9,17
ORF21 Proteína O, replicación fago Replicación viral 5,15
ORF22 Helicasa Replicación viral 3,94
ORF23 Proteína hipotética/Función desconocida - 4,59
ORF24 Integrasa Estado lisogénico 5,12
ORF25 Regulador transcripcional de la familia MarR Regulación lítica/lisogénica 4,20
ORF26 Proteína hipotética/Función desconocida - 4,09
Protección bacteriana- Sistema
ORF27 Metiltransferasa-SAM 4,00
antiviral
ORF28 Proteína hipotética/Función desconocida - 3,10
 112 CAPÍTULO V

ORF29 Proteína hipotética/Función desconocida - 3,22

Posible chaperona molecular de la clase DnaJ con extremo C-Terminal
ORF30 Replicación/metabolismo ADN 3,83
del dominio dedo de zinc
ORF32 Proteína hipotética/Función desconocida - 2,54
ORF33 Proteína hipotética/Función desconocida - 2,16
ORF58 Proteína hipotética/Función desconocida - 3,07
ORF66 Regulador transcripcional Rha Regulación lítica/lisogénica 2,04
Interacción virus-hospedador
ORF80 Subunidad UmuC, ADN polimerasa V, reparadora de errores 2,73
(virulencia)
 CAPÍTULO V 113

Tabla 3

Cepas ST-2 CAZ IMP MER SUL GEN TOB AMK CIP MIN TIG COL DOR DOX TET RIF
Ab 155_GEIH-2000 <0,12 0,12 0,06 128 0,25 0,5 1 0,5 4 16 0,25 <0,06 8 32 32
Ab 158_GEIH-2000 >256 >128 >128 64 >128 8 64 0,25 8 32 0,25 >128 64 >128 2
Ab 161_GEIH-2000 >256 >128 >128 32 >128 4 128 64 16 32 0,25 >128 >64 >128 4
Ab 166_GEIH-2000 32 2 16 2 32 2 1 32 16 16 0,06 32 64 >128 4
Ab GEIH-
2000s Ab 169_GEIH-2000 64 1 1 2 >128 4 512 128 8 16 0,12 >128 64 >128 2
Ab 175_GEIH-2000 16 8 4 4 >128 4 128 128 0,5 16 0,25 >128 4 128 2
Ab 177_GEIH-2000 128 4 8 4 >128 4 64 64 16 16 0,12 >128 64 >128 4
Ab 183_GEIH-2000 >256 128 >128 64 >128 64 256 64 8 16 0,12 >128 64 >128 4
Ab 192_GEIH-2000 >256 128 <128 32 >128 32 128 64 8 8 0,25 >128 64 >128 4
Ab 105_GEIH-2010 128 64 >128 128 >128 4 2 >128 8 16 0,12 >128 64 >128 4
Ab 33_GEIH-2010 128 64 >128 32 >128 4 4 >128 16 32 0,25 >128 64 >128 4
Ab 49_GEIH-2010 256 64 >128 32 8 64 32 64 1 0,5 <0,5 128 32 >128 2
Ab GEIH- Ab 54_GEIH-2010 128 64 >128 128 >128 4 2 >128 8 8 0,12 >128 64 >128 4
2010s Ab 76_GEIH-2010 128 64 >128 64 >128 4 2 >128 8 16 0,25 >128 64 >128 4
Ab 103_GEIH-2010 128 64 >128 64 >128 2 1 >128 8 16 0,25 >128 64 >128 64
Ab 104_GEIH-2010 128 128 >128 128 >128 4 2 >128 16 8 0,25 >128 64 >128 64
Ab 121_GEIH-2010 128 64 >128 128 >128 4 2 >128 16 16 0,12 >128 64 >128 4
Ab 122_GEIH-2010 128 64 >128 128 >128 8 2 >128 8 8 0,25 >128 64 >128 4
 114 CAPÍTULO V

Tabla 4

Código acceso Genbanka 3-oxo-C12-HSLb H2O2c

Cepas ST-2
abaR abaI aidA abaI aidA abaI aidA
Ab 155_GEIH-2000 ODA52665.1 ODA52667.1 ODA50170.1 1,20 1,50 3,00 0,50
Ab 158_GEIH-2000 OLV45102.1 OLV48145.1 OLV47950.1 3,63 1,09 2,10 0,67
Ab 161_GEIH-2000 OLV47680.1* OLV49329.1 OLV44152.1 0,69 1,75 2,25 0,34
Ab 166_GEIH-2000 - - - NA NA NA NA
Ab GEIH-
Ab 169_GEIH-2000 OLV61375.1* OLV61377.1 OLV61862.1 0,50 2,11 1,97 1
2000s
Ab 175_GEIH-2000 OLV76671.1* OLV72445.1 NA 1,35 NA 2,89 NA
Ab 177_GEIH-2000 OLV61352.1 OLV61354.1 OLV60446.1 0,20 2,39 1,60 0,78
Ab 183_GEIH-2000 OLV73449.1 OLV79706.1 OLV77156.1 0,45 0,34 1,65 0,67
Ab 192_GEIH-2000 OLV66603.1 OLV66482.1 NA 6,19 NA 1,80 NA
Ab 105_GEIH-2010 ODA55972.1 ODA55974.1 ODA53988.1 0,92 3,94 1,55 0,36
Ab 33_GEIH-2010 OLV79037.1 OLV79035.1 OLV80563.1 1,10 1,50 1,50 0,50
Ab 49_GEIH-2010 OLV89715.1 OLV84391.1 OLV86104.1 1,23 6,49 2,10 0,14
Ab 54_GEIH-2010 OLV83069.1 OLV83067.1 OLV85628.1 1,09 1,50 5,16 0,20
Ab GEIH-
Ab 76_GEIH-2010 OLV40014.1 OLV29965.1 OLV34275.1 0,64 1,80 2,20 0,25
2010s
Ab 103_GEIH-2010 OLV41119.1 OLV35969.1 OLV33173.1 1,44 1,77 1,80 0,10
Ab 104_GEIH-2010 OLV48295.1 OLV40038.1 OVL46713.1 1,14 2,62 2,14 0,23
Ab 121_GEIH-2010 OLV37874.1 OLV38310.1 OVL36028.1 0,80 1,70 3,14 0,20
Ab 122_GEIH-2010 OLV58946.1 OLV53842.1 OVL52031.1 0,40 3,73 1,75 0,33
 CAPÍTULO V 115

Tabla 1S

Cebadores y sondas para estudios de qRT-PCR

Interacciones
bacterianas Secuencia cebadores (5’- 3’) Sondas Taqman Referencias
(Ab105-2ϕ )
methyltransferase-SAM or Fow GGTGATGTTCGTGATGTGTTG
88/CATCCTCC Este estudio
adoMet-MTase (ORF27) Rev CAACGATTGCCAGCTACAGA
Fow ATAAGGCACGAATTCATCAGG
mazG-like (ORF06) 136/TGATGAGC Este estudio
Rev GATTTTCGCTGCGTGGTTAG
Fow TCGGCGGAAGTATGTATCAA
umuC (ORF93) 116/AGCCTGGT Este estudio
Rev TTTTTAGCATACCCTCAAGAGTAAAAT
Quorum sensing Secuencia cebadores (5’- 3’) Sondas Taqman Referencias
Fow ACCTCTTGTTTGGTCGAGTCA
abaR 96/ACAGGCAG Este estudio
Rev CGTGCTTCCTCCCAAAAAT
6FAM-
Fow CCGCTACAGGGTATTTGTTGAAT
abaI TGGATTCTCTGTCTTGAGCCACGACA- Este estudio
Rev GCAGGGAATAGGCATTCCATTG
BBQ
Fow CTTTGGTCTAGTGTGGTCATGC
pilT 102/TGGCTGAG Este estudio
Rev AAACAAAGTCGCGCAAATG
Quorum quenching Secuencia cebadores (5’- 3’) Sondas Taqman Referencias
Fow GGGAACTTCTTTCGGTGGAG
145/CAGCCACC Este estudio
Rev AACAGCAGCAAGTCGATTATCA
aidA
Fow GGGACTTCTTTCGGTGGAG
145/ CAGCCACC Este estudio
Rev GCAGCAAGCCGGTTATCA
Gen de referencia o
Secuencia cebadores (5´-3´) Sondas Taqman Referencias
housekeeping
Fow CGTGTATCTGCGCTTGG (C. Rumbo et
rpoB 131/CTGGTGGT
Rev CGTACTTCGAAGCCTGCAC al., 2013)
 116 CAPÍTULO V

Tabla 2S

ORF Inicio Final Hebra Tamaño Protein Blast (Cobertura ≥50%) Base de datos PHASTER
ORF01 1 1263 + 1263 Integrasa PHAGE_Pseudo_PMG1_NC_016765:integrase;phage (gi374531680)
ORF02 1269 1538 - 270 Dominio proteico hélice-giro-hélice PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage (gi423262035)
ORF03 1539 1796 - 258 Molibdopterina HP
ORF04 1800 2084 - 285 - HP
ORF05 2081 2290 - 210 - HP
ORF06 2281 2538 - 258 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage (gi423262038)
ORF07 2540 3541 - 1002 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage (gi423262039)
ORF08 3538 4659 - 1122 ATPasa tipo AAA PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: phage nucleotide-binding protein (gi423262040)
ORF09 4671 4994 - 324 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage (gi423262041)
ORF10 4997 5437 - 441 - HP
Represor transcripcional de la PHAGE_Pseudo_vB_PaeP_Tr60_Ab31_NC_023575: Cro/CI transcriptional regulator; phage
ORF11 5635 6390 - 756
familia Cro/Cl (gi589286922)
Represor transcripcional de la
ORF12 6491 6706 + 216 PHAGE_Escher_HK75_NC_019541: regulatory protein Cro; phage (gi356870715)
familia Cro/Cl
Represor transcripcional de la
ORF13 6717 7073 + 357 PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage (gi423261985)
familia Cro/Cl
ORF14 7136 7408 + 273 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage (gi423261986)
ORF15 7405 7701 + 297 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage (gi423261987)
ORF16 7698 8054 + 357 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage (gi423261988)
ORF17 8054 8983 + 930 - PHAGE_Thalas_BA3_NC_009990: HP; phage (gi160700630)
ORF18 8976 9725 + 750 - PHAGE_Erwini_PEp14_NC_016767:HP; phage (gi374531902)
ORF19 9722 10144 + 423 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541:HP; phage (gi423261991)
ORF20 10134 10556 + 423 - PHAGE_Acinet_LZ35_NC_031117: exonuclease; phage (gi100082)
ORF21 10549 10773 + 225 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage (gi423261992)
ORF22 10773 11168 + 396 Familia del tipo endonucleasa PHAGE_Acinet_vB_AbaS_TRS1_NC_031098: holing; phage (gi100062)
ORF23 11165 11665 + 501 - HP
ORF24 11960 12511 + 552 - HP
ORF25 12773 13531 + 759 - HP
ORF26 13626 14273 + 648 Transposasa PHAGE_Pectob_ZF40_NC_019522: transposase; phage (gi422936679)
ORF27 14321 14830 + 510 - PHAGE_Pectob_ZF40_NC_019522: HP; phage (gi422936680)
ORF28 14827 16485 + 1659 Terminasa TerL PHAGE_Salmon_SEN34_NC028699: Terminase; phage (gi966201419)
ORF29 16496 17908 + 1413 Proteína asociada a fago HI1409 PHAGE_Salmon_SEN34_NC_028699: Portal protein; phage (gi966201420)
Proteína asociada a la morfogénesis
ORF30 17931 18566 + 636 PHAGE_Salmon_SEN34_NC_028699: Head morphogenesis (gi966201421)
de la cápside
ORF31 18628 18714 + 87 - HP
Posible proteína de la cápside
ORF32 PHAGE_Salmon_SEN34_NC_028699: HP; phage (gi966201422)
18855 20171 + 1317 (proteasa)
 CAPÍTULO V 117

ORF33 20175 20651 + 477 - PHAGE_Salmon_SEN34_NC_028699: HP; phage (gi966201423)

ORF34 20716 21741 + 1026 Cápside de fago PHAGE_Salmon_SEN34_NC_028699: HP; phage (gi966201424)
Polinucleótido
ORF35 21751 22182 + 432 HP
fosforilasa/poliadenilasa
ORF36 22186 22572 + 387 - PHAGE_Salmon_SEN34_NC_028699: HP; phage (gi966201426)
ORF37 22569 23129 + 561 - PHAGE_Salmon_SEN34_NC_028699: HP; phage (gi966201427)
ORF38 23116 23484 + 369 Adaptador cápside-tallo PHAGE_Salmon_SEN34_NC_028699: HP; phage (gi966201428)
ORF39 23487 24026 + 540 - PHAGE_Salmon_SEN34_NC_028699: HP; phage (gi966201429)
ORF40 24030 25505 + 1476 - PHAGE_Salmon_SEN34_NC_028699: HP; phage (gi966201430)
ORF41 25520 25963 + 444 - PHAGE_Salmon_SEN34_NC_028699: HP; phage (gi966201431)
ORF42 25963 26424 + 462 - PHAGE_Salmon_SEN34_NC_028699: HP; phage (gi966201432)
ORF43 26620 28644 + 2025 Proteína de la base de la cola PHAGE_Salmon_SEN34_NC_028699: Tail tape measure; phage (gi966201433)
ORF44 28641 28997 - 357 - HP
ORF45 28997 29224 - 228 - HP
ORF46 29229 29417 + 189 - HP
ORF47 29584 30180 + 597 - PHAGE_Salmon_SEN34_NC_028699: HP; phage (gi966201434)
ORF48 30183 30479 + 297 - PHAGE_Salmon_SEN34_NC_028699: HP; phage (gi966201435)
ORF49 30476 31435 + 960 - PHAGE_Salmon_SEN34_NC_028699: HP; phage (gi966201436)
Proteína del tipo pJ de ensamblaje a
ORF50 31438 32100 + 663 PHAGE_Salmon_SEN34_NC_028699: Baseplate assembly protein; phage (gi966201439)
la placa basal
ORF51 32135 32488 + 354 - PHAGE_Salmon_SEN34_NC_028699: HP; phage (gi966201441)
Proteína del tipo pJ de ensamblaje a
ORF52 32491 33675 + 1185 PHAGE_Salmon_SEN34_NC_028699: HP; phage (gi966201442)
la placa basal
ORF53 33675 34265 + 591 - PHAGE_Psychr_pOW2O_A_NC_020841: HP; phage (gi472339849)
ORF54 34258 34866 + 609 Proteína fibrilar de la cola PHAGE_Aeromo_25_NC_008208: gp36 small distal tail fiber; phage (gi109290197)
ORF55 34930 36984 + 2055 Proteína fibras del tallo PHAGE_Acinet_IME_200_NC_028987: Tail fiber protein; phage (gi971763488)
ORF56 36986 37213 + 228 - HP
ORF57 37291 37680 + 390 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage (gi423262030)
ORF58 37723 38268 + 546 Familia glicosil hidrolasas PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage (gi423262031)
ORF59 38458 39138 + 681 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage (gi423262032)
ORF60 39149 39796 + 648 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage (gi423262033)
ORF61 39803 40396 + 594 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage (gi423262034)
ORF62 40401 40550 - 150 ADN polimerasa UmuC HP
ORF63 40642 41496 - 855 Transposasa PROPHAGE_Escher_CFT073: Transposase insF; phage (gi26249410)
 118 CAPÍTULO V

Tabla 3S

ORF Inicio Final Hebra Tamaño Protein Blast (Cobertura ≥50%) PHASTER base de datos
ORF01 190 1326 - 1137 Integrasa PHAGE_Entero_HK022_NC_002166: integrase; phage(gi9634144)
ORF02 1331 1594 - 264 - -
PHAGE_Gordon_Nymphadora_NC_031061: DNA polymerase III subunit epsilon;
ORF03 1658 2140 - 483 Metiltransferasa-SAM
phage(gi100067)
ORF04 2137 2346 - 210 - -
ORF05 2343 2876 - 534 Proteína de fago -
ORF06 2873 3208 - 336 Proteína tipo MazG PHAGE_Citrob_Moon_NC_027331: HP; phage(gi849248535)
ORF07 3205 3516 - 312 - PHAGE_Roseob_1_NC_015466: HP RDJLphi1_gp43;phage(gi331028097)
ORF08 3516 3779 - 264 - -
PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: putative phage nucleotide-binding protein;
ORF09 3772 4896 - 1125 ATPasa tipo AAA
phage(gi423262040)
ORF10 4908 5231 - 324 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423262041)
ORF11 5234 5674 - 441 - -
ORF12 5903 6145 + 243 - -
ORF13 6152 6355 - 204 - -
ORF14 6667 7059 - 393 Posible proteína de membrana -
ORF15 7062 8063 - 1002 - PHAGE_Shigel_SfIV_NC_022749: HP; phage(gi557307575)
ORF16 8114 8329 - 216 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423261982)
PHAGE_Burkho_BcepC6B_NC_005887: putative prophage repressor protein;
ORF17 8350 9024 - 675 Proteína de la familia LexA
phage(gi48697234)
Regulador transcripcional de la familia
ORF18 9126 9326 + 201 -
XRE (repressor)
ORF19 9337 9699 + 363 Regulador transcripcional PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423261985)
ORF20 9901 10074 + 174 - -
ORF21 10071 10847 + 777 Dominio proteico hélice-giro-hélice PHAGE_Acinet_LZ35_NC_031117: HP; phage(gi100053)
ORF22 10847 12172 + 1326 Helicasa PHAGE_Acinet_AP22_NC_017984: putative replicative DNA helicase; phage(gi388570844)
ORF23 12169 12393 + 225 - -
ORF24 12390 12617 + 228 Integrasa -
ORF25 12614 12865 + 252 Helicasa tipo ADN-B -
ORF26 12862 13038 + 177 - -
ORF27 13035 13691 + 657 Metiltransferasa-SAM PHAGE_Cellul_phi18:1_NC_021790: HP; phage(gi526177063)
ORF28 13688 14011 + 324 - PHAGE_Acinet_LZ35_NC_031117: nucleoside triphosphate hydrolase; phage(gi100081)
ORF29 14011 14208 + 198 - -
Posible chaperona DnaJ con dominio PHAGE_Acinet_AP22_NC_017984: DnaJ-class molecular chaperone with C-terminal Zn finger
ORF30 14219 14392 + 174
dedo de zinc domain, putative; phage(gi388570792)
ORF31 14394 14807 + 414 - PHAGE_Acinet_vB_AbaS_TRS1_NC_031098: hemolysin XhlA; phage(gi100061)
ORF32 14804 15256 + 453 - PHAGE_Marino_P12026_NC_018269: HP; phage(gi399528341)
ORF33 15256 15336 + 81 - -
ORF34 15345 15821 + 477 - -
ORF35 15882 16211 + 330 - -
ORF36 16345 16731 + 387 - -
 CAPÍTULO V 119

ORF37 16744 17097 + 354 - -

ORF38 17148 17615 + 468 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423261997)
ORF39 17584 18225 + 642 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP;; phage(gi423261998)
ORF40 18285 18842 + 558 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: phage protein; phage(gi423261999)
ORF41 18826 20142 + 1317 Terminasa PHAGE_Pseudo_YMC11/02/R656_NC_028657: HP; phage(gi966197881)
ORF42 20182 21528 + 1347 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423262001)
PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: phage putative head morphogenesis protein;
ORF43 21538 22644 + 1107 Morfogénesis de la cápside del fago
phage(gi423262002)
ORF44 22803 23081 + 279 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423262003)
ORF45 23180 23422 + 243 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423262004)
ORF46 23639 23830 + 192 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423262005)
ORF47 23938 24693 + 756 - PHAGE_Caulob_rogue_NC_019408: HP; phage(gi414088930)
PHAGE_Entero_phiFL3A_NC_013648: coat protein;
ORF48 24707 25657 + 951 Metiltransferasa
phage(gi281416261)
ORF49 25702 26037 + 336 Dominio proteico HeH-LEM PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423262008)
ORF50 26041 26421 + 381 Proteína de union periplásmica PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423262009)
ORF51 26422 26790 + 369 Glutamato 5-quinasa PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423262010)
ORF52 26799 27203 + 405 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423262011)
ORF53 27217 27543 + 327 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423262012)
ORF54 27545 27943 + 399 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423262013)
ORF55 27945 28163 + 219 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423262014)
Activador transcripcional de unión al
ORF56 28257 28610 + 354 HAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423262015)
ADN MhpR
ORF57 28610 29707 + 1098 Proteína del tallo -
ORF58 29617 33480 - 3864 Proteína 1 del extremo de la cola PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: tail tape measure protein; phage(gi423262023)
ORF59 33541 33888 - 348 - -
Regulador transcripcional de fago
ORF60 34035 34550 - 516 PHAGE_Acinet_vB_AbaS_TRS1_NC_031098: replication protein DnaD; phage(gi100014)
(familia Rha)
Proteína del dominio N-terminal
ORF61 34968 35906 - 939 PHAGE_Endosy_APSE_1_NC_000935: P43; phage(gi9633590)
(familia BRO)
ORF62 36049 36429 + 381 - -
ORF63 36446 37369 - 924 - -
ORF64 37433 37957 - 525 - PHAGE_Flavob_1H_NC_031911: HP; phage(gi100008)
Regulador transcripcional
ORF65 38062 38520 - 459 -
ORF66 38529 38828 - 300 - -
ORF67 39330 39845 - 516 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423262018)
ORF68 39915 40832 - 918 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423262017)
ORF69 40885 43965 - 3081 Proteína del bacteriófago PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423262029)
ORF70 43958 44320 - 363 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423262028)
ORF71 44317 44823 - 507 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423262027)
ORF72 44823 45221 - 399 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423262026)
ORF73 45271 45762 - 492 Proteína de la base de la cola PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: tail tape measure protein; phage(gi423262023)
ORF74 45762 46814 - 1053 Proteína de la base de la cola PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: tail tape measure protein; phage(gi423262023)
ORF75 46894 49326 - 2433 Proteína 1 del extremo de la cola PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: tail tape measure protein; phage(gi423262023)
 120 CAPÍTULO V

ORF76 49388 50329 - 942 - -

Proteína antirepresora del fago PHAGE_Salmon_SPN3UB_NC_019545: putative antirepressor family protein;
ORF77 50381 51133 - 753
(familia BRO) phage(gi423262399)
ORF78 51130 51516 - 387 - -
PHAGE_Salmon_vB_SemP_Emek_NC_018275: transcriptional repressor protein;
ORF79 51596 51820 - 225 Proteína de union al ADN
phage(gi399498811)
ORF80 51880 52146 + 267 Proteina reguladora Mnt PHAGE_Pseudo_phi3_NC_030940: HP; phage(gi100009)
ORF81 52175 52315 - 141 - -
ORF82 52693 53208 - 516 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423262018)
ORF83 53278 54195 - 918 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423262017)
ORF84 54249 54536 - 288 Proteína del tallo PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: putative tail fiber; phage(gi423262016)
ORF85 54665 55294 + 630 Proteína del bacteriófago PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423262029)
ORF86 55363 55752 + 390 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423262030)
ORF87 55951 56271 + 321 Lipasa extracelular, familia Pla-1/cef PHAGE_Pseudo_YMC11/02/R656_NC_028657: HP; phage(gi966197843)
ORF88 56374 57117 + 744 - PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423262021)
ORF89 57131 57415 - 285 - -
ORF90 57557 58504 + 948 α/β hidrolasa PHAGE_Endosy_APSE_1_NC_000935: P43; phage(gi9633590)
ORF91 58633 58782 + 150 Posible proteína de membrana -
ORF92 58843 59385 + 543 Glicosil hidrolasa PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541: HP; phage(gi423262031)
Subunidad UmuC, ADN polimerasa V, PHAGE_Salmon_vB_SosS_Oslo_NC_018279: error-prone lesion bypass DNA polymerase V;
ORF93 59621 60814 - 1194
reparadora de errores phage(gi399528790)
 CAPÍTULO V 121

Figura 1.
122 CAPÍTULO V

Figura 2.
 CAPÍTULO V 123

Figura 3
 124 CAPÍTULO V

2,5

1,5
DO600

Ab105 mitomicina
1 Ab105 Ø

0,5

0
-2 -1 0 1 2 3 4 5 6
Tiempo (h)

Figura 4.
 CAPÍTULO V 125

Figura 5.
126 CAPÍTULO V

Figura 6.
DISCUSIÓN
 DISCUSIÓN 129

DISCUSIÓN

El QS otorga a las bacterias la capacidad de comunicarse de manera efectiva y

coordinar su comportamiento bajo diferentes ambientes. Gracias a esta
interacción, las poblaciones bacterianas pueden coexistir, competir e
intercambiar información (5). En bacterias como P. aeruginosa, este sistema
controla la regulación transcripcional de muchos genes de virulencia así como la
formación de biofilm o la movilidad (124). Clemmer y colaboradores, demostraron
en A. baumannii ATCC17978 que el operón A1S_0112-A1S_0118 está asociado
con la activación del sistema QS mientras que el gen pilT se ha relacionado con
la movilidad, el cual a su vez está regulado por la sintasa autoinductora AbaI. La
cepa mutante A. baumannii M2, defectiva para el gen abaI, mostró una
disminución significativa de la movilidad en comparación con su forma salvaje,
esta fue restaurada al incorporarse de forma exógena la señal 3-OH-C12-HSL
demostrando la influencia del QS en la movilidad. (121). En aislados clínicos de
A. baumannii poco se conoce acerca de la red quorum (sensing/quenching) y sus
expresiones fenotípicas. En el estudio desarrollado en el primer capítulo, la
mayor parte de las cepas no presentaban movilidad y en las que sí mostraban
este fenotipo, se manifestó la implicación del gen pilT. La expresión de este gen
estaría regulada por el QS ya que, al realizar ensayos en presencia de la enzima
lactonasa Aii20J en ambos medios de LB (cepa Ab5 en LB normal y cepa Ab7 en
LB-LN modificado), se observó una disminución de su ER. La inhibición de la
movilidad superficial se analizó también en presencia de otras moléculas con esa
capacidad inhibitoria del QS, como las furanonas (inhibidores no enzimáticos y
análogos estructurales de las AHLs) o las AHLs no nativas, en concreto la 3-oxo-
C12-HSL de P. aeruginosa, pero no resultaron tan efectivas en su actividad QQ
como la lactonasa Aii20J procedente de la bacteria marina Tenacibaculum sp.
20J (125). La secuencia de aminoácidos y la arquitectura de las enzimas QQ son
diversas, especialmente en las lactonasas (126). La enzima Aiia, es la lactonasa
mejor caracterizada, producida por varias especies del género Bacillus, otros
ejemplos son BlcC y AiiB presentes en Agrobacterium tumefaciens (127) que son
capaces de hidrolizar su propia señal AHL inactivando así su sistema QS. Este
proceso también ocurre en otras bacterias como Pseudomonas, en las cuales
son las acilasas PvdQ y QuiP las que están involucradas en el equilibrio del nivel
 130 DISCUSIÓN

de señales de AHLs (48). Recientemente, en P. aeruginosa, se identificó un anti-

activador denominado QslA, el cual se une al receptor LasR e interrumpe su
capacidad para activar la expresión de genes y provocar una respuesta QS
(128). En relación a Acinetobacter, se ha identificado una acilasa, AmiE, en la
cepa Ooi24, que presenta una actividad similar a las acilasas ya descritas,
degradando con mayor efectividad a las AHLs con cadenas acilo que presentan
más de ocho carbonos (51). Sin embargo, este mecanismo no está bien descrito
en aislados clínicos de A. baumannii. En nuestro estudio (Capítulo 1), se
identificó, en presencia de la señal 3-oxo-C12-AHL, una nueva enzima con
actividad lactonasa perteneciente a la familia α/β hidrolasa, la cual fue
denominada AidA. Esta enzima fue encontrada en todos los aislados clínicos de
A. baumannii que no presentaban movilidad superficial. Además, se observó
cómo la actividad QQ de esta proteína inhibía la movilidad superficial y la
formación de biofilm. Esta actividad fue confirmada con la hiperexpresión de AidA
en la cepa E.coli BL21(DE3), que no sintetiza moléculas de señalización del tipo
AHL pero es capaz de detectar las producidas por otras especies de bacterias
(129). Se observó que AidA podría intervenir en la competencia bacteriana al ser
capaz de hidrolizar moléculas de señalización mediando entre especies.

Estudios recientes sugieren que la respuesta ROS está controlada por el sistema
QS en A. baumannii (57). En la especie D. radiodurans, conocida por su
resistencia al estrés oxidativo, se observó una inducción inmediata de la enzima
que sintetiza AHLs (DsqI) en presencia de H2O2. El sistema QS en este patógeno
(DsqIR) se encarga de mediar la estrategia de adaptación en respuesta al estrés
oxidativo (59). De manera similar, los resultados del presente estudio, mostraron
una disminución de la enzima AidA (atenuación del sistema QQ) y un aumento
de la sintasa autoinductora, AbaI (activación del sistema QS), en presencia de
H2O2 en todos los aislados clínicos. Otros investigadores han sugerido que los
miembros de la familia de proteínas glutatión-S-transferasa son importantes para
proteger a las células frente al estrés oxidativo (130). El glutatión proporciona a la
célula múltiples defensas no sólo contra ROS, sino también contra sus productos
tóxicos (131). Los análisis de datos de microarrays mostraron la hiperexpresión
de la glutatión-S-transferasa y de AidA en la cepa clínica Ab1 (A. baumannii ST-
 DISCUSIÓN 131

2_clon-2010) en presencia de 3-oxo-C12-HSL, observando la activación del QQ

así como la atenuación del QS (54).

Otros mecanismos relacionados con el sistema QS son las bombas de expulsión

de tipo RND. Especies como P. aeruginosa pueden controlar el QS expulsando
las moléculas AIs a través de los sistemas MexAB-OprM y MexEF-OprN (29).
Estudios similares realizados en Burkholderia cenocepacia muestran,
aproximadamente, un 30% menos de acumulación de AIs en comparación con la
cepa salvaje al inactivar dos sistemas de tipo RND (132). Además, pueden
desempeñar otras funciones como proporcionar resistencia a compuestos
antimicrobianos y antisépticos, participar en la mediación de la homeostasis
celular y en el tráfico de señales intercelulares además de estar implicadas en
virulencia bacteriana (68). En A. baumannii, el principal sistema de eflujo de tipo
RND implicado en resistencia antimicrobiana es la bomba AdeABC (69). Sin
embargo, el 25-30% de los aislados clínicos de esta especie no presentaban esta
bomba (133, 134). En el proyecto Ab GEIH-REIPI-2010, estudio multicéntrico
español en el que participaron 45 hospitales, se analizó la cepa clínica
Ab421_GEIH-2010, perteneciente al clon ST79/PFGE-HUI-1 (formado por 17
aislados clínicos más). Mediante secuenciación masiva (estudio desarrollado en
el segundo capítulo), se observó que la bomba AdeABC no estaba presente,
además de sus genes reguladores, adeR y adeS, aunque sí fueron encontrados
los genes que codificaban las bombas AdeFGH y AdeIJK asociados con el perfil
de resistencias a múltiples fármacos. Se observó una interrupción en el gen
regulador de la bomba AdeFGH, adeL, debido a la presencia de una mutación
que llevó a la introducción de un codón de parada (Met7→stop) (135). Todos los
pacientes de los cuales se aislaron las cepas del clon ST79/PFGE-HUI-1 de A.
baumannii, presentaron infección y cinco de ellos desarrollaron bacteriemia. Esto
contrasta con las observaciones usuales para A. baumannii, en las que
aproximadamente la mitad de los pacientes colonizados normalmente no
presentaban infecciones debido a este pátogeno (86, 136), y que la prevalencia
de bacteriemia en pacientes infectados es normalmente menor al 10%. Thom y
colaboradores, observaron que en el 86% de los pacientes de las UCIs que
presentaban el tracto gastrointestinal colonizado por cepas clínicas de A.
baumannii, desarrollaron bacteriemia a través de cepas genéticamente similares
 132 DISCUSIÓN

(89). Este podría ser un posible foco de colonización, aunque no frecuente, para
A. baumannii. Como se comentó anteriormente, para que un patógeno pueda
colonizar el intestino humano, tiene que superar varias barreras, siendo una de
ellas la de las sales biliares. Estas actúan como detergentes, presentando una
actividad permeabilizante de las membranas bacterianas que da lugar a la
pérdida de la homeostasis bacteriana, y por lo tanto a la muerte. Para sobrevivir
en este ambiente, las bacterias desarrollaron mecanismos de tolerancia como las
bombas de expulsión o los transportadores de glutamato (72-74). En el trabajo
desarrollado en el tercer capítulo, se analizaron los mecanismos de respuesta
adaptativa a sales biliares en las cepas isogénicas de A. baumannii ATCC17978,
A. baumannii ΔadeB ATCC17978 y A. baumannii ΔadeL ATCC17978. En la cepa
clínica Ab421 GEIH-2010 se observó una elevada capacidad de movilidad
superficial y de formación de biofilm al ser cultivada en presencia de sales
biliares.

Los mecanismos asociados a la respuesta frente a sales biliares no son muy

conocidos en A. baumannii. Varios estudios han demostrado cómo los factores
de virulencia asociados al sistema QS pueden ser regulados de manera diferente
por las bacterias comensales presentes en el intestino (70, 71). En nuestro caso,
se observó hiperexpresión de genes QS (del A1S_0112 al A1S_0116) en cepas
carentes de la bomba AdeABC (A. baumannii ΔadeB ATCC17978 y cepas
clínicas pertenecientes al clon ST79/PFGE-HUI-1) cultivadas en presencia de
sales biliares. Clemmer y colaboradores, mediante análisis transcriptómicos,
confirmaron que este cluster de genes fue inducido por la molécula 3-OH-C12-
HSL, nativa de A. baumannii (121). El gen A1S_0116 codifica un transportador
de la superfamilia RND el cual podría estar involucrado en el eflujo de moléculas
procedentes del sistema QS (121). En cuanto a los estudios de microarrays
llevados a cabo en la cepa mutante A. baumannii ΔadeB ATCC17978 y los
estudios de qRT-PCR en las cepas clínicas del clon ST79/PFGE-HUI-1,
incluyendo la cepa Ab421_GEIH-2010, se observó la implicación del
transportador de glutamato aspartato (relacionado con la tolerancia al ácido) y de
proteínas que intervienen en la adaptación a sales biliares (137, 138). Este
transportador (operon glnQHMP) también ha sido implicado con la tolerancia al
ácido en la especie Streptococcus mutans (64). Además, también se observó
 DISCUSIÓN 133

hiperexpresión en otros genes implicados en factores de virulencia modulados

por el sistema QS, como movilidad superficial, formación de biofilm (A1S_2218 y
A1S_1510) (121, 139) y en el sistema de secreción tipo VI (T6SS) (del A1S_1292
al A1S_1296) (140).

Zheng y colaboradores investigaron el papel del sistema QS en V. cholerae en la

modulación de la expresión de los factores de virulencia tales como T6SS (71).
Estos autores establecieron que una elevada densidad bacteriana es crítica para
la expresión del T6SS de la cepa pandémica V. cholerae C6706. El T6SS puede
ser un potente mediador de la supervivencia del patógeno o de los comensales
en ambientes multibacterianos, biofilm y en infecciones polimicrobianas, tales
como aquellas encontradas en las vías respiratorias de pacientes con fibrosis
quísticas (70, 139) y en la colonización gastrointestinal en dichos pacientes (70).
Tres T6SS (H1, H2 y H3-T6SS), con funciones en diferentes etapas del proceso
infeccioso, han sido descritos en la cepa PAO1 de P. aeruginosa (141, 142).
Además, H2-T6SS es regulado por QS en este patógeno (140).

Varios estudios han mostrado el papel del sistema T6SS en cepas de A.

baumannii. Repizo y colaboradores, describieron el primer caso en la cepa
ambiental DSM30011 de A. baumannii en la cual el sistema T6SS estaba
implicado en colonización (143). Recientemente, Weber y colaboradores,
demostraron la expresión del sistema T6SS en cepas clínicas de A. baumannii
sensibles a varios antibióticos (144) y confirmaron que es un sistema
antibacteriano usado por bacterias Gram negativas con el fin de eliminar posibles
competidores. Las cepas clínicas de A. baumannii portan represores del T6SS
(reguladores de tipo TetR) en plásmidos portadores de genes de resistencia que
previenen la expresión de estos sistemas (144, 145). Cuando las cepas MDR de
A. baumannii no están expuestas a antibióticos, como ocurre en ambientes
hospitalarios inanimados o en infecciones polimicrobianas no tratadas, estas
pierden los plásmidos que portan los genes de resistencia asi como los genes
reguladores de tipo tetR, por lo que existe una mayor probabilidad de encontrar
competidores que activarán los sistemas bacterianos T6SS (144). En cuanto al
estudio Ab GEIH-REIPI-2010, el clon ST79/PFGE-HUI-1 resultó ser no portador
del plásmido con la β-lactamasa OXA24/40 o el sistema toxina-antitoxina AbKAB
(94, 101). En el presente estudio, la resistencia a antimicrobianos
 134 DISCUSIÓN

(aminoglucósidos, quinolonas y glicinas) en el aislado Ab421_GEIH-2010 y en el

mutante A. baumannii ΔadeL ATCC17978, fue asociada a una hiperexpresión de
la bomba AdeFGH y no a la presencia de plásmidos con genes de resistencia.

Finalmente, los estudios llevados a cabo en el cuarto y quinto capítulo se centran

en la relación de los fagos y el QS. Se inicia en el capítulo 4, donde se lleva a
cabo la comparación de las secuencias cromosómicas de las cepas ST-2_clon-
2000 y ST-2_clon-2010. En este trabajo destacamos las 212 proteínas que
estaban presentes en ST-2_clon-2010, la mayoría de las cuales eran similares a
proteínas de fagos y su cromosoma, el cual contiene varias secuencias de
bacteriófagos. A raíz de este trabajo surge el quinto capítulo, donde analizamos
los virus que infectan las bacterias (bacteriófagos) así como su capacidad para
influir en la dinámica de la comunidad bacteriana, en la evolución del genoma
bacteriano y en la biogeoquímica del ecosistema. Estas influencias difieren
dependiendo de si los fagos establecen infecciones líticas o lisogénicas (146,
147). En este capítulo, estudiamos la evolución molecular de 18 cepas clínicas
de A.baumannii pertenecientes al clon ST-2 aisladas, después de una década, en
el mismo hospital y en la misma UCI (9 Ab_GEIH-2000s y 9 Ab_GEIH-2010s). Se
observó que los aislamientos de Ab_GEIH-2010s presentaban dos bacteriofagos
conservados (Ab105-1φ y Ab105-2φ) que poseían actividad lítica con la
activación de la respuesta SOS (en presencia de MMC). Los estudios realizados
mediante qRT-PCR, revelaron la hiperexpresión de genes de fagos que codifican
proteínas implicadas en su propia protección como: i) metiltransferasas
dependientes de SAM, que han sido asociadas con una protección del genoma
viral frente a las enzimas de restricción del huésped (148); ii) MazG, una enzima
pirofosfohidrolasa localizada en bacteriófagos de Burkholderia cenocepacia y
fagos marinos (especialmente cianófagos), facilitando así la infección viral en el
medio ambiente (149). En E. coli, la proteína MazG se ha asociado con una
disminución en la actividad de la toxina MazF que forma parte del sistema toxina-
antitoxina MazFG, un mecanismo de defensa que actúa inhibiendo la
propagación del fago P1 (150). Esta proteína puede representar otro mecanismo
de protección de los fagos contra los efectos negativos de la activación de la
toxina (151); y, finalmente, iii) la proteína inductora de mutaciones, UmuC, que
 DISCUSIÓN 135

puede tener implicaciones significativas para la evolución de la virulencia y la

resistencia a los antibióticos (152, 153).

Una de las claves determinantes del tamaño, composición, estructura y

desarrollo de una comunidad microbiana es la presión de depredación por parte
de los bacteriófagos. Como anteriormente se ha comentado, la evidencia de que
la señalización QS puede estar implicada en la regulación de la respuesta
bacteriana a los fagos, está aumentando (154). Por ejemplo, en E. coli en
presencia de señales QS como las AHLs, la bacteria reduce significamente el
número de receptores de fago LamB (155) que lo protege contra el ataque del
fago λ. En Vibrio anguillarum, mutantes que están permanentemente bloqueados,
cuando se encuentran en un estado de alta densidad celular son casi inmunes al
fago KVP40 (156, 157). En otros patógenos, como P. aeruginosa, también se ha
relacionado el sistema QS con poblaciones que han evolucionado en presencia
de fagos (158, 159). Recientemente, Saucedo-Mora y colaboradores,
demostraron que la presencia de bacteriófagos lisogénicos actúa como una
poderosa fuerza motriz para la selección de sistemas de QS funcionales, tanto “in
vitro” como “in vivo” en cepas de P. aeruginosa, estabilizando la cooperación
bacteriana y por lo tanto la virulencia (103). Nuestros resultados mostraron, en
todas las cepas de la colección Ab_GEIH-2010s, la hiperexpresión de una nueva
enzima QQ, la proteína llamada AidA (104) así como de la enzima AbaI bajo
condiones de estrés como la 3-oxo-C12-HSL (compuesto inhibidor del QS) y el
H2O2 (activación de la respuesta ROS). Como resultado, en todas las cepas de la
colección Ab_GEIH-2010s, así como en la cepa Ab177_GEIH-2000, la capacidad
infectiva (UFP/UFC) de los bacteriófagos (Ab105-1φ y Ab105-2φ) fue similiar,
tanto en presencia como en ausencia de la molécula 3-oxo-C12-HSL, lo que
implicaría la existencia de una red quorum funcional. Sin embargo, estas
características moleculares en relación a la red quorum, no estuvieron presentes
en las cepas de la colección Ab_GEIH-2000s. Dos de ellas carecían de la enzima
AidA, otras presentaban bajo nivel de expresión de la misma y, finalmente, dos
mostraban mutaciones en el gen que codifica para la proteína AbaR .Como
resultado, en estas cepas, los bacteriófagos (Ab105-1φ y Ab105-2φ) no fueron
capaces de infectar. Además, hubo una única cepa del estudio que no mostraba
AidA, AbaI ni AbaR y en la que la escasa capacidad infectiva de los bacteriófagos
 136 DISCUSIÓN

(Ab105-1φ y Ab105-2φ) fue significativamente superior (**P<0.05, Prueba t de

Student) en presencia de la molecula externa 3-oxo-C12-HSL. Estos resultados
afirmarían la presencia en estas cepas, de una red quorum no funcional,
incluyendo enzimas QQ como defensa bacteriana (103). Esta enzima, AidA, ha
sido descrita en nuestro grupo de investigación (en cepas clínicas no móviles)
asociada a la competencia bacteriana, ya que es capaz de hidrolizar las
moléculas de señalización (incluyendo la molécula 3-oxo-C12-HSL) que median
entre especies (104). Weiland y colaboradores, describieron varias enzimas QQ
bacterianas con actividad hidrolítica contra señales de AHLs y AI-2 (160, 161).
Por otro lado, varios autores han propuesto la aplicación de moduladores de
quorum, también llamados "quorum quenchers" como podrían ser las AHLs
exógenas o sintéticas con el fin de mejorar la eficacia terapéutica de fagos líticos
(103, 162, 163). Sin embargo, nuestros resultados muestran como en todas las
cepas de la colección Ab_GEIH-2010s, se produjo la activación del sistema QQ
de defensa bacteriana a través de la enzima AidA, la cual formaría parte de una
red quorum funcional que impediría la actuación de las AHLs exógenas, como la
molécula 3-oxo-C12-HSL.

Otra diferencia genómica de interés entre los aislamientos de ambas colecciones

(Ab_GEIH-2000s versus Ab_GEIH-2010s) fue la presencia de un plásmido, en
todas las cepas del año 2010, con genes que codificaban la ß-lactamasa OXA
24/40 y el sistema toxina-antitoxina AbkA/AbkB (TA). Todos los plásmidos que
portaban la ß-lactamasa OXA 24/40 conferían resistencia a antibióticos
carbapenémicos en las cepas de A.baumannii de los hospitales españoles
participantes en el estudio (101). En cuanto a los sistemas de TA del plásmido,
estos han sido relacionados con la estabilización del mismo (164, 165). Se ha
teorizado que los loci de TA sirven solamente para mantener el ADN plasmídico
a expensas del organismo huésped (166). Otros autores han propuesto que
estos sistemas han evolucionado para favorecer la capacidad competitiva de los
plásmidos en la progenie celular, hipótesis que ha sido corroborada mediante
modelos informáticos (167).
CONCLUSIONES
 CONCLUSIONES 139

CONCLUSIONES

1. Se ha descrito una nueva enzima α/β-hidrolasa, AidA, con función “quorum

quenching” en cepas clínicas de A. baumannii pertenecientes al II Estudio
Multicéntrico Español GEIH-REIPI 2000-2010, las cuales no presentaban
movilidad de superficie.
2. Se ha mostrado la implicación de los sistemas “quorum sensing/quorum
quenching” en la respuesta frente al estrés oxidativo en cepas clínicas de
A. baumannii, al aumentar el nivel de expresión de abaI y disminuir el nivel
de expresión de la enzima QQ, AidA.
3. Se ha descrito el genoma de la cepa Ab421_GEIH-2010 perteneciente al
clon clínico ST79/PFGE-HUI-1 (GenBank CP014266). Esta cepa consta de
3,98 MB, un contenido medio de CG del 39,2% y presentaba 3066
regiones codificantes. Carece de la principal bomba de eflujo de
A.baumannii, AdeABC, y presenta una mutación en el regulador de la
bomba de eflujo AdeFGH, AdeL, que permite su hiperexpresión,
asociándose a un incremento de la CMI a tigeciclina.
4. Se observó una respuesta adaptativa a sales biliares en cepas clínicas de
A. baumannii (pertenecientes al clon ST79/PFGE-HUI-1, carente de la
bomba de eflujo, AdeABC) mediante la expresión del transportador del
glutamato/aspartato y la activación del sistema QS asociado a factores de
virulencia como movilidad superficial, biofilm y sistema de secreción de
tipo VI (T6SS).
5. Cepas clínicas de A. baumannii pertenecientes al clon ST79/PFGE-HUI-1
muestran un nuevo perfil clínico asociado a un mayor desarrollo de
bacteriemia.
6. Se compararon dos genomas de cepas clínicas de A. baumannii aisladas
en el mismo hospital y misma unidad, con diez años de diferencia (2000-
2010), que presentaban una relación clonal del 90 % (mediante PFGE) y
pertenecen al clon ST2 (mediante MLST), pero con diferentes perfiles de
resistencias a antibióticos carbapenémicos. La cepa ST-2_clon-2010
resistente a carbapenémicos presentaba las siguientes proteínas
diferenciales: a) la ß-lactamasa OXA 24/40 y el sistema toxina-antitoxina
 140 CONCLUSIONES

AbkA/AbkB y b) dos bacteriófagos completos, Ab105-1φ (tamaño 41.496

pb; 63 ORFs) así como Ab105-2φ (tamaño 61304 pb; 93 ORFs)
7. Se describieron los genomas completos de los bacteriófagos Ab105-1φ y
Ab105-2 φ, los cuales se encuentran conservados en 9 aislamientos de
A.baumannii procedentes de la colección Ab_GEIH-2010s y no hallándose
en aquellos aislamientos pertenecientes a la colección Ab_GEIH-2000s.
8. Ante la respuesta SOS (en presencia de mitomicina) se activó el estado
lítico de los bacteriófagos, expresándose en el Ab105-2φ, tres principales
mecanismos de defensa de los bacteriófagos frente a las bacterias: las
metiltransferasas-SAM, la proteína MazG y la proteína UmuC.
9. La enzima bacteriana AidA con actividad QQ forma parte del sistema de
red quorum funcional en aislamientos clínicos de A. baumannii.
10. La capacidad infectiva de los bacteriófagos del estudio, fue mayor en las
cepas de la colección Ab_GEIH-2010s portadoras de una red quorum
funcional. Sin embargo, en las cepas de la colección Ab_GEIH-2000s
(portadoras de una red quorum defectiva), los bacteriófagos presentaron
nula o escasa capacidad infectiva.
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