Guias Lab BioMol

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
ESCUELA DE MICROBIOLOGÍA
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Y AMBIENTAL
MICROBIOLOGÍA Y BIOANÁLSIS
LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
PRACTICA 1. EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO MICROBIANO
INTRODUCCIÓN
La extracción y purificación de los ácidos nucleicos, como el ácido
desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN) es el primer paso en la
mayoría de los estudios moleculares. Para manipular los ácidos nucleicos, es
necesario eliminar otros componentes celulares que pueden interferir con los
experimentos, como proteínas y lípidos, sin alterar el ADN o el ARN. El primero en
aislar y purificar el ADN fue el químico suizo Johan Friedrich Miescher, quien en el
año 1869 aisló a partir del núcleo de los glóbulos blancos varias moléculas ricas en
fosfatos, a las cuales les llamó nucleínas (ácidos nucleicos). El protocolo original de
Miescher era burdo y el ADN obtenido no era puro. La contaminación con proteínas
era una de sus preocupaciones, por lo que modificó su protocolo agregando pepsina,
una proteasa, para digerir de esta manera las proteínas presentes.
Actualmente existen varios métodos para la extracción y purificación de los ácidos

nucleicos, los cuales son seleccionados de acuerdo con:
• El tipo de ácido nucleico a extraer: ADN genómico, ADN plasmídico, ARN

total, ARN mensajero, etc.
• El organismo de donde se extraerá el ácido nucleico: Células animales,
células vegetales, parásitos, mohos, levaduras, bacterias, virus, etc.
• El material de extracción: Órganos completos, tejidos, cultivos celulares,
fluidos corporales, muestras ambientales, alimentos, etc.
• Los resultados deseados: Rendimientos, pureza y tiempo de purificación de
los ácidos nucleicos, etc.
1
• La aplicación posterior: Amplificación, clonación, transcripción reversa, etc.
Los métodos de extracción de ácidos nucleicos, sin importar el tipo de ácido nucleico
a extraer o la procedencia del material a utilizar, siguen siempre tres etapas básicas:
a) Lisis de células e inhibición de nucleasas:
La extracción de los ácidos nucleicos a partir de materiales biológicos requiere la

homogeneización de los tejidos y el lisado de las células, de tal forma que las
paredes y/o membranas de la célula sean degradadas, alteradas o perforadas y de
esta manera todos los ácidos nucleicos sean liberados. Los principales
componentes de las paredes y membranas que son alterados son los lípidos,
carbohidratos y proteínas; y el método de lisis utilizado depende de la naturaleza de
cada célula, por ejemplo, las células bacterianas son lisadas generalmente por la
acción de detergentes, mientras que las levaduras, son tratadas con enzimas que
afectan la integridad de su pared celular; y las células sanguíneas son lisadas por
presión osmótica con altas concentraciones de sales. También es posible realizar
la ruptura mecánica de pared y membranas de una amplia variedad de
microorganismos mediante procedimientos mecánicos, como por ejemplo la
utilización de perlas de vidrio.
Estos procesos deben ser lo suficientemente fuertes para romper la pared y las
membranas celulares, pero de tal forma que no alteren la integridad de los ácidos
nucleicos. En esta etapa se deben inactivar las nucleasas celulares que podrían
digerir los ácidos nucleicos. Esto asegura que la cantidad de ADN o ARN integro
obtenido sea la máxima. La ruptura celular y la inactivación de nucleasas
intracelulares deben de ser procesos combinados. Se puede utilizar una solución
con detergentes para solubilizar las membranas celulares y sales caotrópicas
fuertes para inactivar las nucleasas. El DNA y otros componentes celulares como
lípidos, azúcares y proteínas, se disuelven en la solución de lisis. El DNA tiene carga
neta negativa debido a los grupos fosfato de su estructura, y esta carga eléctrica es
lo que hace soluble a esta molécula.
2
Los procesos más comúnmente utilizados son:
• Disrupción mecánica, por ejemplo, ruptura mecánica con perlas de vidrio,
ruptura hipotónica, o congelación-descongelación.
• Tratamiento químico, por ejemplo, la lisis con detergentes o agentes
caotrópicos.
• Digestión enzimática, por ejemplo, con proteasas, lisozima o mutanolisina, o
enzimas específicas que digieran la pared de los microorganismos.
b) Extracción y purificación de los ácidos nucleicos:
Posterior a la liberación de los ácidos nucleicos mediante lisis celular, es necesario

separarlos de las múltiples proteínas que están íntimamente relacionadas con él y
de todo el detritus celular. La centrifugación permite remover la mayor cantidad de
restos celulares presentes en la muestra, pero las proteínas permanecen asociadas
al ADN, lo cual puede interferir con posteriores análisis.
La extracción de estas proteínas con solventes no miscibles permite eliminar las

proteínas contaminantes de los ácidos nucleicos, para ello, se utiliza una
combinación de fenol y cloroformo. Después de agregar estos agentes
desnaturalizantes, se separa la suspensión por medio de centrifugación,
obteniéndose dos fases: una orgánica y una acuosa, separadas entre sí por una
interfase de proteínas desnaturalizadas; en la fase acuosa se encuentran los ácidos
nucleicos. De otro lado, también es posible precipitar las proteínas mediante la
utilización de altas concentraciones de sal o cambios en el pH.
c) Precipitación de ácidos nucleicos:
Los ácidos nucleicos de la fase acuosa se recuperan por precipitación. Para ello se
utilizan alcoholes, como el etanol o el isopropanol, que deshidratan la molécula y la
adición de sales, como el acetato de sodio o de potasio, neutraliza las cargas
negativas, lo que potencia el efecto deshidratante, haciéndola insoluble y conlleva
3
a la precipitación reversible del ADN por medio de la centrifugación. El ADN o ARN
precipitado forma finas hebras blancas u ocres, mientras que el resto de las
sustancias permanecen disueltas. Posteriormente, el ADN o el ARN se disuelve en
volúmenes pequeños de agua o en buffer TE, y se almacenan para utilizarlo en
experimentos posteriores (Figura 1).
Figura 1. Método básico para la extracción del DNA. (Tomado de:

https://openstax.org/books/biology-2e/pages/17-1-biotechnology)
OBJETIVOS
• Realizar la extracción de ADN de bacterias y levaduras utilizando un kit

comercial.
• Identificar los pasos básicos necesarios para la extracción de ADN
genómico.
• Reconocer la función de los principales reactivos empleados en cada
método de extracción de ADN.
4
MATERIALES Y EQUIPOS
• Medio YPD
• Medio líquido Luria Bertani
• Agua destilada estéril
• Solución stock ampicilina
• Proteinasa K (20mg/ml)
• lisozima (45mg/ml)
• Solución de lisis T
• Solución de lisis C
• Solución I (pH 8): Sorbitol 0,9 M, EDTA 0,1 M, DTT 50 mM (preparar fresca)
• Solución enzima Liticasa (0,5mg enzima/40 µl sorbitol 0,9 M) (preparar
fresca)
• Sorbitol 2 M
• Solución de lavado I
• Solución concentrada de lavado
• Buffer ATL
• Buffer AL
• Buffer AW1
• Buffer AW2
• Buffer AE
• Etanol absoluto frío
• Viales de 1,5 ml
• Centrífuga
• Microcentrífuga
• Vortex
• Incubadora
• Shaker
• Micropipetas 100, 200 y 1000 µl
• Puntas estériles para micropipetas
• Bloque de calentamiento
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METODOLOGÍA
1. Protocolo Sigma
Lisis
Lisis células Gram negativas:
1. Inocular 3ml de caldo Luria Bertani (LB) con una colonia de E. coli e incubar
a 37°C durante toda la noche.
2. Transferir 2 ml del caldo turbio a un tubo de 2 ml. Centrifugar a 12000 g por
2 minutos, posteriormente descartar el sobrenadante.
3. Resuspender el pellet en 180 µl de solución de lisis T y mezclar con vórtex.
4. Adicionar 20 µl de proteinasa K (20mg/ml). Mezclar con vórtex e incubar a
55°C por 30 min.
5. Adicionar 200 µl de solución de lisis C. Mezclar con vórtex por 15 seg e
incubar a 55°C por 10 min.
Lisis células Gram positivas:

1. Inocular 3ml de caldo LB + ampicilina con una colonia de B. cereus e
incubar a 37°C durante toda la noche.
3. Resuspender el pellet en 200 µl de lisozima (45mg/ml). Mezclar con vórtex.
Incubar a 37°C por 30 min.
4. Adicionar 25 µl de proteinasa K (20mg/ml) y 200 µl de solución de lisis C.
Mezclar con vórtex e incubar a 55°C por 30 min.
Lisis Levadura:
1. Inocular 3ml de caldo YPD con una colonia de C. albicans e incubar a 37°C
durante toda la noche.
3. Lavar el pellet con 1ml de agua destilada estéril y centrifugar a 12000 g por
6
4. Resuspender el pellet en 500 µl de solución I y adicionar 40 µl liticasa
(0.0125 mg/µl). Incubar a 37°C por 20 min con agitación ocasional.
5. Centrifugar a 1500 g por 5 minutos, posteriormente descartar suavemente
el sobrenadante.
6. Resuspender el pellet en 180 µl de solución de lisis T y mezclar con vórtex.
7. Adicionar 20 µl de proteinasa K (20mg/ml). Mezclar con vórtex e incubar a
55°C por 30 min.
8. Adicionar 200 µl de solución de lisis C. Mezclar con vórtex por 15 seg e
incubar a 55°C por 10 min.
Extracción y purificación protocolo Sigma (Después de la lisis de todos los

tipos de células)
1. Unir una columna a un tubo de colección. Adicionar 500 µl de solución de

preparación de la columna y centrifugar a 12000 g por 1min. Descartar el
líquido del tubo de colección.
2. Adicionar 200 µl de etanol absoluto al lisado y mezclar utilizando vórtex.
3. Transferir el lisado a la columna y centrifugar a 6500 g por 1min. Descartar
el líquido del tubo de colección.
4. Adicionar 500 µl de solución de lavado I y centrifugar a 6500 g por 1min.
5. Adicionar 500 µl de solución concentrada de lavado y centrifugar a 14000 g
por 3min.
6. Transferir la columna a un nuevo tubo de 1.5ml.
7. Adicionar 75 µl de solución de elución en el centro de la columna. Incubar a
temperatura ambiente 5 min y centrifugar a 6500 g por 2 min.
8. Repetir el paso anterior con 75 µl de solución de elución adicionales.
2. Protocolo Qiagen
Lisis
Lisis células Gram negativas:
7
1. Inocular 3 ml de caldo LB con una colonia de E. coli e incubar a 37°C
durante toda la noche.
3. Resuspender el pellet en 180 µl de buffer ATL y mezclar con vórtex.
4. Adicionar 20 µl de proteinasa K (20mg/ml), mezclar con vórtex e incubar a
55°C por 30 min.
5. Adicionar 200 µl de buffer AL y mezclar con vórtex.
6. Adicionar 200 µl de etanol absoluto y mezclar con vórtex.
Lisis células Gram positivas:

1. Inocular 3 ml de caldo LB + ampicilina con una colonia de B. cereus e
incubar a 37°C toda la noche.
2. Transferir 2 ml del caldo con biomasa a un tubo de 2 ml. Centrifugar a
12000 g por 2 minutos, posteriormente descartar el sobrenadante.
3. Resuspender el pellet en 180 µl de lisozima (45mg/ml de buffer enzimático)
y mezclar con vórtex. Incubar a 37°C por 30 min.
4. Adicionar 25 µl de proteinasa K (20mg/ml) y 200 µl de buffer AL. Mezclar
con vórtex e incubar a 55°C por 30 min
Lisis Levadura:
1. Inocular 3 ml de caldo YPD con una colonia de C. albicans e incubar a 37°C
toda la noche.
2. Transferir 2 ml del caldo con biomasa a un tubo de 2 ml. Centrifugar a
12000 g por 2 minutos, posteriormente descarte el sobrenadante.
3. Lavar el pellet con 1ml de agua destilada estéril y centrifugar a 12000 g por
2 minutos, posteriormente descarte el sobrenadante.
4. Resuspender el pellet en 500 µl de solución I y adicionar 40 µl liticasa
(0.0125 mg/µl). Incubar a 37°C por 20 min con agitación ocasional.
8
5. Centrifugar a 1500 g por 5 minutos, posteriormente descartar suavemente
el sobrenadante.
6. Resuspender el pellet en 180 µl de buffer ATL y mezclar con vórtex.
7. Adicionar 20 µl de proteinasa K (20mg/ml), mezclar con vórtex e incubar a
55°C por 30 min.
8. Adicionar 200 µl de buffer AL y mezclar con vórtex.
Extracción y purificación protocolo Sigma (Después de la lisis de todos los

tipos de células)
1. Transferir el lisado a la columna y centrifugar a 6500 g por 1min. Descartar

2. Adicionar 500 µl de buffer AW1 y centrifugar a 6500 g por 1min. Descartar
3. Adicionar 500 µl de buffer AW2 y centrifugar a 14000 g por 3min.
4. Transferir la columna a un nuevo tubo de 1.5ml.
5. Adicionar 75 µl de buffer AE en el centro de la columna. Incubar a
temperatura ambiente 5 min y centrifugar a 6500 g por 1min.
6. Repetir el paso anterior con 75 µl de buffer AE adicionales.
PREGUNTAS
1. ¿Cuál es la importancia de realizar la extracción de DNA?

2. ¿Qué son las nucleasas?
3. ¿Cuál es la acción que ejercen la lisozima y la liticasa?
4. ¿Qué función cumplen los siguientes reactivos en el proceso de extracción
de ácidos nucleicos?
• Proteinasa K
• Solución I (pH 8)
9
5. Cuál es la importancia de las siguientes etapas del proceso de extracción:
• Lavado de las células
• Adición del buffer de lisis
• Adición de etanol
BIBLIOGRAFÍA
Clark MA, Choi J, Douglas M. (2020). Biology 2ed. OpenStax. Houston, Estados
Unidos. https://openstax.org/books/biology-2e/pages/17-1-biotechnology
Bravo AL, González CH, Le Borgne S. (2012). Manual de prácticas de laboratorio

de Biología Molecular. Universidad Autónoma Metropolitana. Cuajimalpa, México.
Giraldo GA, Loango N, Mejía CM. (2010). Laboratorio de Bioquímica: Una Visión
Práctica. Universidad del Quindio. Armenia, Colombia. Ediciones Elizcom.
Quesada S. (2007). Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica.

Editorial Universidad Estatal a Distancia. San José, Costa Rica.
Sambrook JF, Rusell, DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Tercera
edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA;
vol 1.
10
PRACTICA 2. EXTRACCIÓN DE ADN PLASMÍDICO
INTRODUCCIÓN
Los plásmidos son moléculas de ADN circular, de doble cadena, autorreplicativos y
de localización extracromósomicos que se han encontrado en una amplia variedad
de especies bacterianas. El tamaño de los plásmidos es muy variable y es posible
encontrarlos hasta de 200 kb. Los plásmidos presentan un rango estrecho de
hospedero, por lo que son mantenidos en un grupo limitado de especies
relacionadas y son heredados de forma independiente del cromosoma.
La extracción y purificación del ADN plasmídico es esencial para diversos análisis

moleculares. Los métodos más utilizados para su extracción y purificación incluyen
la lisis alcalina, métodos por calentamiento y purificación con litio. Además, existen
en el mercado diversos kits comerciales, que por medio de la utilización de
columnas de purificación simplifican el procedimiento a unas pocas horas.
El método con el que se realizará la extracción de ADN plasmídico es la extracción

por medio de lisis alcalina; en este procedimiento el ADN plasmídico es aislado de
pequeñas cantidades de cultivos bacterianos. Las células bacterianas son
recolectadas de un cultivo líquido crecido previamente y luego son lisadas al utilizar
una solución de SDS, el cual desnaturaliza las proteínas bacterianas de la
membrana mientras que el NaOH desnaturaliza el ADN tanto el ADN cromosómico
como el ADN plasmídico. Posteriormente, la mezcla es neutralizada con Ácido
acético glacial, el cual es un ácido débil que conlleva a que el ADN de bajo peso
molecular se renaturalice, por ello el ADN plasmídico se reasocia rápidamente,
mientras que el ADN cromosómico permanece precipitado debido a su alto peso
molecular. El acetato de potasio además ayuda a que las proteínas permanezcan
11
insolubles. Finalmente, tanto el ADN cromosómico como las proteínas son
removidas rápidamente por centrifugación.
Los alcoholes, como el isopropanol y el etanol absoluto, son ampliamente utilizados

para la precipitación de ácidos nucleicos, por ello, la fase acuosa obtenida después
de separar las proteínas y el ADN cromosómico, es precipitada con un volumen de
isopropanol o dos volúmenes de etanol absoluto y posteriormente se realiza un
lavado con etanol al 70%, el cual tiene dos funciones, iniciar el proceso de
rehidratación de los ácidos nucleicos y extraer las sales utilizadas en el proceso de
extracción y que pueden estar unidas a los ácidos nucleicos. Una vez resuspendido
el ADN plasmídico en buffer TE o en agua milliQ, se realiza un tratamiento con la
ribonucleasa ARNasa para digerir el ARN residual que pudo haberse extraído en el
proceso, ya que este ácido nucleico también es de bajo peso molecular y puede ser
renaturalizado.
OBJETIVOS
• Desarrollar un protocolo de extracción de ADN plasmídico de una cepa de
E. coli.
• Comprender cada uno de los pasos en el proceso de extracción de ADN
plasmídico.
• Reconocer la función de cada uno de los reactivos utilizados en el proceso
de extracción de ADN plasmídico.
• Medio Luria Bertoni + ampicilina (100 ug/ml)
• Solución I
o 50 mM Glucosa
o 25 mM Tris-Cl (pH 8.0)
o 10 mM EDTA (pH 8.0)
o Prepararla y esterilizarla en autoclave. Almacenar a 4°C.
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• Solución II
o 0.2 N NaOH (A partir de una solución stock 10 N)
o 1% SDS (A partir de una solución stock 10%)
o Prepararla en el instante a partir de soluciones stock
• Solución III
o 5M Acetato de Potasio 60 mL
o Ácido acético glacial 11.5 ml
o Agua 28.5 ml
o Almacenar a 4°C.
• Isopropanol
• Etanol absoluto
• Etanol 70%
• ARNasa A 10 mg/ml
• Viales de 2.0 y 1.5 ml
• Micropipetas 1, 10, 20,100, 200 y 1000 µl
• Puntas para micropipetas estériles
• Vortex
• Nevera con hielo
• Centrífuga refrigerada
• Termoblock
METODOLOGÍA
1. Inocular 2 colonias de E. coli las cuales presentan plásmidos en 5 ml de caldo

LB con ampicilina.
2. Incubar a 37 ºC durante toda la noche en agitación vigorosa,
aproximadamente 220 rpm.
3. En un tubo de 2.0 ml, dispensar 2 ml de cada uno de los caldos y centrifugar
a 12000 rpm y 4°C por 2 min. Descartar el sobrenadante por inversión.
Repetir este paso una vez más para obtener un botón de células
correspondiente a 4 ml de caldo.
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4. Resuspender el botón de células en 100 μl de solución I. Asegúrese que las
células están totalmente resuspendidas aplicando agitación en vortex.
5. Preparar en el momento la solución II y adicionar 200 µl a cada tubo. Mezclar
cuidadosamente por inversión e incubar en hielo por 10 min. No utilizar vortex.
6. Adicionar 150 μl de la solución III y mezclar por inversión durante un minuto.
Incubar en hielo por 10 minutos.
7. Centrifugar a 12000 rpm y 4 °C por 10 min para precipitar el detritus celular
y el ADN cromosómico.
8. En un tubo de 1.5 ml y con micropipeta de 100 o 200 µl transferir
delicadamente todo el sobrenadante obtenido en el paso anterior. Descartar
el tubo con el detritus celular.
9. Adicionar un volumen de isopropanol frio o dos volúmenes de etanol absoluto
frio e incubar por 1 hora a -20°C. (En este paso se detiene el procedimiento).
10. Centrifugar a 12000 rpm y 4°C por 30 min para precipitar el DNA plasmídico.
11. Descartar el sobrenadante cuidadosamente por inversión, sin perder el botón.
12. Lavar el botón de ADN con 1000 µl de etanol 70%. Inmediatamente
centrifugar a 12000 rpm y 4°C por 5 min.
13. Descartar el etanol al 70% cuidadosamente por inversión sin perder el botón
de ADN. Permitir que el etanol se evapore completamente a temperatura
ambiente.
14. Resuspender el botón de ADN en 30 µl de agua milliQ estéril.
15. Adicionar 1 µl de ARNasa A 10 mg/ml e incubar a 37°C por 1 hora.
16. Almacenar a -20°C.
PREGUNTAS
1. Describa un método rápido de extracción de ADN plasmídico de kits

comercial.
2. Mencione y explique las diferentes isoformas que puede adoptar el ADN
plasmídico al ser extraído de una célula.
14
BIBLIOGRAFÍA
Ausbel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman J.G., Smith J.A. and
Struhl, K. Current protocols in molecular biology. 1994-20051 - USA 5 vols. Different
Chapter.
Primrose S.B, Twyman R.M. Principles of gene manipulation and genomics. Edition
17. Blackwell Publishing.2007.
vol 1.
15
PRACTICA 3. VALORACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS: INTEGRIDAD,

CALIDAD Y CONCENTRACIÓN
INTRODUCCIÓN
Una vez los ácidos nucleicos son extraídos de la célula, estos deben de ser
evaluados para analizar si el proceso de extracción fue efectivo, valorando así la
integridad, la calidad y la concentración de ellos. La integridad de los ácidos
nucleicos hace referencia al estado de conservación de la molécula y generalmente
se evalúa mediante electroforesis en gel de agarosa, mientras que la calidad, o
grado de contaminación con proteínas y la concentración, se valoran a través de
mediciones espectrofotométricas.
Electroforesis en gel para ácidos nucleicos

El término electroforesis se usa para describir la migración de una partícula cargada
bajo la influencia de un campo eléctrico. Muchas moléculas importantes
biológicamente poseen grupos ionizables y existen en solución como especies
cargadas, bien como cationes, o bien como aniones. Estas especies cargadas se
van a separar en función de su carga cuando se aplica un voltaje a través de los
electrodos.
La electroforesis es una técnica de separación de ácidos nucleicos tales como el

ADN y ARN de acuerdo con su tamaño y reactividad. Se basa en el principio que,
bajo la influencia de un campo eléctrico aplicado, las moléculas cargadas migran en
dirección al ánodo, debido a la carga neta negativa del ADN por los grupos fosfatos
en su composición estructural. La separación de los fragmentos está influenciada
por la movilidad con la cual moléculas de diferente tamaño son capaces de pasar a
través del gel. El tamaño y la forma de las moléculas afecta su movilidad, por ello,
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las moléculas de mayor tamaño migran más lentamente debido a que sufren más
resistencia al interior del gel mientras que las moléculas de menor tamaño se
desplazan más rápidamente.
La electroforesis de ADN utiliza como soporte agarosa, la cual es un polímero

derivado de un polisacárido neutro, extraído inicialmente de algas marinas.
Específicamente está formada por aproximadamente 400 unidades repetitivas de
agarobiosa, que forman largas cadenas de fibras helicoidales que se agregan en
estructuras super enrolladas con radio de 20-30 nm. La polimerización de la agarosa
resulta en una red tridimensional de canales con diámetros entre 50 – 200 nm.
Debido a sus propiedades fisicoquímicas, a su facilidad de preparación y poder de
gelificación, es el soporte más comúnmente utilizado para electroforesis en el área
de la biología molecular. Además, los geles de agarosa no son tóxicos y están
prácticamente libres de cargas iónicas, lo cual es importante para evitar que la
solución buffer se desplace por el gel cuando se activa el campo eléctrico.
Los geles de agarosa permiten un amplio rango de separación (200 a 50.000 pb),
pero relativamente tienen bajo poder de resolución. En contraste, los geles de
poliacrilamida, para los mismos fines, tienen pequeño rango de separación (5 a 50
pb), pero alto poder de resolución; de esta manera, bajo condiciones apropiadas,
pueden diferenciarse fragmentos de ADN que difieren en un par de bases.
Las moléculas de ADN de doble cadena lineal migran a través del gel a una
velocidad que es inversamente proporcional al logaritmo del número de pares de
bases que conforman dicha molécula. Esto permite calcular el tamaño en pares de
bases de un ADN con base en la migración electroforética. Los fragmentos de ADN
lineal migran una cierta distancia en un tiempo definido, a través de geles que
contienen concentraciones variables de agarosa, las cuales pueden variar entre 0,5
a 2 %. De esta manera, utilizando geles de agarosa de diferentes concentraciones,
es posible separa un amplio rango de tamaños de moléculas de ADN.
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Las moléculas de ADN circular covalentemente cerrado (cccDNA) que tienen el
mismo tamaño en pares de bases, pero diferentes estados de enrollamiento se
denominan topoisómeros de ADN. A pesar de que tienen el mismo peso molecular,
se separan unos de otros mediante una electroforesis en gel de agarosa, debido a
que las moléculas que están superenrolladas migran más que las moléculas que
están enrolladas y que las moléculas que están relajadas. El fundamento de esta
separación es que cuanto mayor es el superenrollamiento, más compacta es la
forma de un cccDNA, y por lo tanto, mayor será la facilidad con que puede migrar
por la matriz del gel. En consecuencia, un cccDNA relajado por completo migra con
más lentitud que un toposiómero muy superenrollado del mismo DNA circular.
Para poder analizar el ADN en gel de agarosa, es necesario utilizar el buffer de

carga, el cual desempeña varias funciones importantes en la electroforesis en gel
de agarosa:
• Dado que el ADN es muy poco denso, puede difundirse en el buffer de corrido.
Es necesario que el ADN permanezca en el fondo del pozo, para ello, el buffer
de carga contiene Ficol o glicerol, los cuales le dan densidad al ADN, así el
ADN no se difundirá y migrará en el fondo del gel.
• Debido a que el ADN es incoloro, no es posible monitorear su migración en
el gel de agarosa. Por ello, el buffer de carga además está constituido por
uno o varios colorantes químicos que migran por encima del ADN y así
permiten monitorear su migración en el gel de agarosa. El colorante más
utilizado es el azul de bromofenol.
Así mismo, cuando se analiza una muestra de ADN en gel de agarosa, debe de
emplearse un marcador de peso molecular, el cual permite estimar el tamaño de los
fragmentos de ADN. Existe una amplia variedad de marcadores de peso molecular
y su selección depende de la muestra a analizar, si se analiza un ADN genómico,
generalmente se utiliza un marcador de peso de alto peso molecular, mientras que
para productos amplificados se utilizan marcadores de peso de 1 kb.
18
Para poder visualizar el ADN en el gel de agarosa es necesario utilizar un colorante
fluorescente, el cual se intercala en las bases del ADN y cuando el gel es sometido
a luz ultravioleta, se observan las bandas de ADN. El colorante más utilizado es el
Bromuro de etidio, pero debido a que es mutagénico, se empleará el colorante EZ-
vision, el cual no es mutágeno ni tóxico.
Factores que afectan la movilidad electroforética del ADN:
• Voltaje aplicado
A voltajes bajos, la migración de las moléculas lineales de ADN es proporcional al

voltaje aplicado. Sin embargo, si la fuerza iónica del campo es elevada, la movilidad
de los fragmentos de alto peso molecular se incrementa diferencialmente, esto
quiere decir que las moléculas no se separan completamente a pesar de aumentar
la velocidad de la electroforesis. Por lo tanto, el rango de separación efectiva en los
geles de agarosa decrece cuando se eleva el voltaje aplicado.
• Buffer de corrido
La movilidad electroforética del ADN es influenciada por la composición y la fuerza

iónica del buffer de electroforesis. En ausencia de iones (agua desionizada), la
conductividad eléctrica es mínima y el ADN migra lentamente. Por otro lado, en un
buffer con una fuerza iónica demasiado alta, la conductividad eléctrica es alta, aún
con voltajes moderados y se generan grandes cantidades de calor, lo que podría
fundir el gel y desnaturalizar el ADN. Actualmente se utilizan diferentes buffers, los
más utilizados son el buffer Tris Acetato EDTA (TAE) el cual tiene una baja carga
iónica mientras que el buffer Tris Borato EDTA (TBE) tiene una alta carga iónica.
• Tamaño del ADN
Las moléculas de ADN lineal de doble cadena migran a través del gel a velocidades
que son inversamente proporcionales al logaritmo de su número de bases. Debido
19
a la fricción que impone la malla del gel de agarosa, las moléculas de mayor tamaño
se retrasan con respecto a las de menor tamaño.
• Conformación del ADN
El ADN puede presentar diferentes topoisómeros que afectan la movilidad en el gel

de agarosa. El ADN circular de doble cadena superenrollado migra a mayor
velocidad que el ADN circular enrollado y circular relajado que migran más
lentamente. Otros factores pueden influenciar la migración de estos topoisómeros
como la corriente eléctrica aplicada, la fuerza iónica del buffer o la concentración de
agarosa.
• Concentración de agarosa
Dependiendo de la concentración de agarosa, las muestras migran con mayor

facilidad o no en el gel. Para permitir una mejor resolución de las bandas se han
determinado concentraciones de agarosa de acuerdo con el tamaño de las muestras
de ADN, tal como se muestra en la siguiente tabla.
Concentración de Tamaño de la
agarosa (%) en el gel molécula de ADN (kb)
0.3 5 – 60
0.6 1 – 20
0.7 0.8 – 10
0.9 0.5 – 7
1.2 0.4 – 6
1.5 0.2 – 3
2.0 0.1 – 2
Existen algunas variantes de la tradicional electroforesis de ADN en geles de

agarosa para análisis más complejos, como son la electroforesis bidimensional,
electroforesis capilar y electroforesis en campo pulsado.
20
Evaluación espectrofotométrica de los ácidos nucleicos
El análisis espectrofotométrico de ADN o ARN es uno de los análisis más

empleados para determinar la calidad o pureza del ADN así como también su
concentración. El análisis espectrofotométrico se basa en el principio de que los
ácidos nucleicos absorben luz ultravioleta. En el caso del ADN y el ARN, la muestra
es expuesta a la luz ultravioleta a una longitud de onda de 260 nanómetros (nm) y
un fotodetector mide la luz que pasa a través de la muestra. Una parte de la luz
ultravioleta pasará a través de la muestra y otra parte será absorbida por el
ADN/ARN. A mayor cantidad de luz absorbida, mayor será la concentración de
ADN/ARN en la muestra. Por lo cual, el efecto resultante es que menos luz será
detectada por el fotodetector y esto producirá una mayor densidad óptica (DO).
Empleando la ley de Beer-Lambert es posible relacionar la cantidad de luz

ultravioleta absorbida con la concentración de la molécula absorbente. A una
longitud de onda de 260 nm, el coeficiente de extinción promedio para ADN de doble
cadena es 0.020 (μg/ml)−1 cm−1, mientas que para ADN de cadena sencilla es 0.027
(μg/ml)−1 cm−1 , para ARN es de 0.025 (μg/ml)−1 cm−1 y para oligonucleótidos
depende de la longitud y de la composición de bases. De esta manera, una
absorbancia de 1 corresponde a una concentración de 50 μg/ml para ADN de doble
cadena. Este método de calculo es válido solo hasta una absorbancia de 2.
Al realizar un proceso de extracción de ADN o ARN, comúnmente los ácidos

nucleicos pueden estar contaminados con otras moléculas como proteínas,
compuestos orgánicos o solventes utilizados en el proceso de extracción. El
beneficio de utilizar el análisis espectrofotométrico para determinar la concentración
es que también es posible estimar la calidad o pureza del ADN al utilizar la relación
de absorbancia a 260 nm y a 280 nm. Esta relación es ampliamente utilizada para
evaluar la cantidad de proteína contaminante que queda del proceso de extracción
de ácidos nucleicos, ya que las proteínas absorben a 280 nm. Se ha considerado
que el ADN puro, presenta una relación 260/280 de ~1.8 mientras que para el ARN
puro la relación 260/280 es ~2.0. Se ha encontrado que una relación 260/280 baja
21
es indicativa de que la muestra de ADN o ARN puede estar contaminada con
solventes orgánicos, los cuales se han empleado en el proceso de extracción de los
ácidos nucleicos, o con concentraciones muy bajas de ADN incluso por debajo de
10 ng/ µl, mientras que una relación 260/280 por encima de 2, normalmente no son
sugestivas de ningún problema.
OBJETIVOS:
• Evaluar la utilidad de la electroforesis en gel de agarosa para la detección

y análisis de ADN.
• Realizar la electroforesis del ADN genómico y plasmídico previamente
extraído de un microorganismo.
• Interpretar los datos obtenidos del análisis espectrofotométrico de
muestras de ADN.
• Agarosa en polvo
• Buffer TBE 10X
• Buffer de carga 6X
• Marcador de peso molecular (λ DNA / HindIII)
• Ez vision 1000X
• Micropipetas de 2, 10 y 20 µl
• Puntas estériles para las micropipetas de 2, 10 y 20 µl
• Papel parafinado
• Plancha de calentamiento
• Cámara de electroforesis horizontal
• Fuente de poder
• Transiluminador/ Fotodocumentador
22
METODOLOGÍA
1. Preparación del gel de agarosa
a. Preparar una solución de agarosa al 1% en buffer TBE 1X; mantenga en la

plancha de calentamiento hasta que la solución este completamente
transparente y haya hervido.
b. Permita que la temperatura de la agarosa disminuya hasta 40 °C y adicione el
volumen necesario de intercalante de ADN Ez visión 1000X, de tal forma que
en solución de agarosa tenga una concentración de 1X. Mezcle suavemente sin
generar burbujas.
c. Ensamble la cámara de electroforesis y vierta la agarosa. Insertar el peine
inmediatamente después de verter la agarosa en la cámara, para permitir la
formación de los pozos, como se observa en la figura 1.
Figura 1. Preparación del gel de agarosa
d. Cuando la agarosa este completamente gelificada retire el peine, e introduzca

el gel en su soporte en la cámara de electroforesis.
e. Vierta suficiente buffer de corrido TBE 1 X, de tal forma que cubra el gel.
2. Preparación de la muestra a cargar en el gel de agarosa
a. En papel parafinado mezcle 0.2 volúmenes del buffer de carga 6X con 1

volumen de la muestra de ADN (1 µl de buffer de carga 6X por cada 5 µl de
23
muestra), mezcle completamente el buffer de carga con la muestra utilizando la
pipeta, pero sin generar burbujas.
b. Proceda a dispensar la mezcla en cada pozo utilizando micropipeta de 10 o 20
µl con mucho cuidado de no perforar el gel. Tenga en cuenta la localización de
los pozos en la cámara. Recuerde que el ADN tiene carga neta negativa y por
tanto migra hacia el polo positivo en la cámara. Los pozos deben de localizarse
en el polo negativo, como se observa en la figura 2.
Figura 2. Cámara de electroforesis
c. Realice el mismo procedimiento para el marcador de peso molecular λ DNA/

HindIII.
d. Cierre la cámara de electroforesis y conéctela a la fuente de poder,
seleccione el voltaje a utilizar y el tiempo de corrido. Para análisis de ADN
genómico, el voltaje a utilizar puede ser entre 50 y 80 voltios, por no más de
45 minutos.
e. Vigile el frente de corrido de acuerdo con la migración de los colorantes del
buffer de carga.
f. Una vez las muestras hayan corrido, apague la fuente de poder, desconecte
los cables, abra la cámara de electroforesis y retire el gel. Tome el gel en su
soporte y transpórtelo hasta el transiluminador, visualice el marcador de peso
molecular y las muestras corridas. Registre fotográficamente, si es posible.
PREGUNTAS:
1. ¿Qué otras macromoléculas pueden ser separadas por electroforesis en gel?

¿Cuál es el polímero más utilizado para cada una de esas macromoléculas?
24
2. ¿Cuál es la función del glicerol en el buffer de carga?
3. ¿Además del azul de bromofenol, qué otros colorantes se utilizan en los

buffers de carga?
4. Consulte 3 reactivos no tóxicos para observar el ADN en un gel de agarosa

posterior a una electroforesis. Explique su fundamento.
BIBLIOGRAFÍA
Padilla CA, Diez J, Martínez E, Bárcena JA, García C. (2018-2020). Universidad de

Córdoba. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Recuperado de:
https://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/17%20ELECTROFORESIS%20ACS%20NUCLEICOS%20GELES%20A
GAROSA.pdf
Pinilla G. (2019) Biología molecular: ADN recombinante y sus aplicaciones. Bogotá,

Colombia. Editorial El Manual Moderno.
Puerta C, Urueña C. (2005). Prácticas de biología molecular. Editorial Pontificia

Universidad Javeriana
vol 1.
Watson J, Baker T, Bell S, Gann A, Levine M, Losick R. (2006). Biología molecular
del gen. 5 edición. Editorial Médica Panamericana.
25
PRACTICA 4. PCR
INTRODUCCIÓN
La Reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés Polymerase
chain reaction) es una técnica descrita por Kary Mullis en 1985, lo que le hizo
merecedor al premio Nobel de química en el año 1993. El objetivo de esta
metodología es la amplificación directa in vitro de un gen o un fragmento de ADN.
La amplificación del ADN se produce de forma exponencial, de esta manera a partir
de una sola molécula se obtiene más de un millón de moléculas, luego de 30 ciclos
de amplificación. Además de su simplicidad, la PCR es una metodología robusta,
rápida, sensible, específica y muy flexible.
Para llevar a cabo una reacción de PCR, se necesita un ADN molde, un par de
cebadores (primers) los cuales delimitan la región a amplificar, una cantidad
suficiente de desoxiribonucleótidos trifosfato (dATP, dTTP, dCTP y dGTP), los
cuales son el sustrato de la enzima, una enzima ADN polimerasa, su buffer, cationes
divalentes, como cofactores de la enzima ADN polimerasa (Mg 2+) en un ambiente
acuoso y las condiciones para una eficiente reacción.
Los cebadores o primers son secuencias cortas de ADN de cadena sencilla

complementarios a la secuencia de inicio de la síntesis de cada una de las dos
hebras del ADN a amplificar. Los cebadores deben ser específicos, de forma que
se hibriden exclusivamente con la región complementaria en el fragmento de ADN
que se desea amplificar y no se unan a ninguna otra secuencia de ADN similar. Los
cebadores tienen un tamaño entre 18 y 30 nucleótidos (cuantos más nucleótidos,
más especificidad). Los cebadores deben tener una composición equilibrada de
CGs (bases Citosina y Guanina) y ATs (bases Adenina y Timina) y, sobre todo, no
26
deben formar estructuras secundarias ni complementarse de forma interna o con el
otro cebador, ya que se plegarían sobre sí mismos o se alinearían entre sí formando
dímeros.
De los muchos factores que influyen en la eficiencia y especificidad de la PCR,

ninguno es tan crucial como el diseño de los cebadores. Es necesario un diseño
cuidadoso de ellos para obtener los productos amplificados con alta cantidad y
calidad, impidiendo la amplificación de secuencias no deseadas. Posteriormente,
los productos amplificados deben de ser secuenciados para verificar la identidad del
producto amplificado.
La enzima ADN polimerasa extiende los cebadores en dirección 5´→ 3´. Si se

empleara una DNA polimerasa convencional, la proteína se desnaturalizaría junto
con el ADN durante el primer paso de calentamiento y debería sustituirse después
de cada ciclo. La clave que condujo a la automatización de la PCR fue el
descubrimiento de una enzima ADN polimerasa termoestable poco común, que se
aisló por primera vez de procariotas que viven en manantiales calientes (Thermus
aquaticus) y pueden soportar las altas temperaturas que se producen al comienzo
de cada ciclo.
Como ya se ha mencionado, la PCR es un proceso cíclico y, tras una etapa inicial

de desnaturalización del ADN molde, la cual se lleva a cabo a 94 ºC durante 4 a 6
minutos, se realizan entre 30 a 35 ciclos, cada uno de ellos tiene 3 etapas:
• Desnaturalización: En esta etapa se da la ruptura de los puentes de

hidrógeno que mantienen la estructura de doble cadena del ADN, por medio
de un tratamiento térmico a 95°C y obtener hebras sencillas. Se lleva a cabo
a 94 °C por 30 a 40 segundos.
• Hibridación o alineamiento: Los cebadores se hibridan a la secuencia
complementaria en el ADN molde. Generalmente la temperatura de
27
alineamiento se encuentra entre 50 y 60°C dependiendo de la composición
de los cebadores.
• Elongación: La enzima ADN polimerasa (Taq ADN polimerasa) a partir del
primer específico cataliza la incorporación de cada uno de los dNTP’s de
acuerdo con la secuencia de la cadena molde. Se lleva a cabo a 72°C y el
tiempo depende de la longitud del fragmento a amplificar y la procesividad de
la enzima ADN polimerasa utilizada.
Tras los ciclos de desnaturalización, alineamiento y elongación, la reacción termina

con una etapa de extensión final que suele ser de cinco minutos a 72°C. Una vez
completados los ciclos de la PCR, los productos amplificados son analizados por
electroforesis en gel de agarosa entre el 1 y 2%, que permite la separación del ADN
de acuerdo con su tamaño.
El éxito de una amplificación por medio de PCR depende de la calidad de ADN

utilizado como templado o molde, la mezcla exacta de reactivos, el diseño de los
cebadores o primers y la temperatura de alineamiento de éstos.
Existen diferentes variaciones de la PCR convencional de acuerdo con las

necesidades propias de cada investigación, entre las más usadas están: PCR
anidada, PCR múltiple, PCR en tiempo real, y la transcripción reversa acoplada a la
PCR (RT-PCR), etc.
OBJETIVOS
• Amplificar por medio de la reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) un

fragmento conservado de una secuencia de un espaciador interno (ITS).
• Identificar la función de cada uno de los reactivos en la reacción de
amplificación.
• Desarrollar habilidades y destrezas para la amplificación de un fragmento de
ADN mediante PCR.
28
• Buffer 10X
o (NH4)2SO4
o KCl
• MgCl2 25 mM
• dNTPs (10mM)
• Primers forward y reverse 10 uM
o Bacterias
▪ Primer F CAAGGCATCCACCGT
▪ Primer R GAAGTCGTAACAAGG
o Levaduras
▪ Primer ITS-4 TCCTCCGCTTATTGATATGC
▪ Primer ITS-1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG
• Enzima Taq DNA polimerasa 5 U/ µl
• Agua desionizada estéril
• ADN genómico previamente extraído de bacterias y levaduras
• Micropipetas de 1, 2, 10, 20 y 100 µl
• Tubos de PCR de 0.2 ml
• Termociclador
METODOLOGÍA
1. Para calcular el volumen de cada uno de los reactivos para el máster mix
final, incluya dos reacciones más (uno control positivo y un control negativo),
de tal manera que el volumen final será 150 µl.
29
Tabla 1. Composición del master mix para amplificación de ITS de bacterias
Master Master
Componente Cinicial Cfinal Vinicial Vinicial Vfinal Mix Mix
(NH4)2SO4 KCl (NH4)2SO4 KCl
Agua - -
Buffer 10X 5 --------
(NH4)2SO4 --
Buffer KCl 10X --------- 5
MgCl2 25 2 2 50
mM
dNTPs 10 2 2
mM
Primer F 10 µM 1 1
Primer R 10 µM 1 1
Taq 5 U/µl 0.25 0.25
Polimerasa
DNA molde -- -- 100 ng 100
ng
150 µl
30
Tabla 2. Composición del master mix para amplificación de ITS de mohos y
levaduras
Master Master
Componente Cinicial Cfinal Vinicial Vinicial Vfinal Mix Mix
(NH4)2SO4 KCl (NH4)2SO4 KCl
Agua - -
Buffer 10X 5 --------
(NH4)2SO4 --
Buffer KCl 10X --------- 5
MgCl2 25 2 2 50
mM
dNTPs 10 2 2
mM
Primer ITS-4 10 µM 2 2
Primer ITS-1 10 µM 2 2
Taq 5 U/µL 0.4 0.4
Polimerasa
DNA molde -- -- 200 ng 200
ng
150 µl
2. En condiciones de completa esterilidad preparar la mezcla de reacción o

master mix adicionando los reactivos en el orden que se presentan en la tabla
1 y 2, excepto el ADN molde.
3. Tome 3 tubos de PCR, los cuales serán rotulados como CN; Control negativo;
CP: Control positivo y su muestra con el número o letra respectivo. A cada
uno de los tubos adicione el volumen respectivo del master mix.
31
4. Adicione la muestra de ADN a cada uno de los tubos. El CP será inoculado
con ADN de una cepa de referencia, el CN no será inoculado con ADN y el
ADN extraído previamente será inoculado en el tubo marcado con número o
letra.
5. Asegurarse que todos los reactivos y el ADN molde estén en solución y en el
fondo del tubo.
6. Incubar los tubos en el termociclador en el programa respectivo:
Tabla 3. Programa para la amplificación por PCR de una secuencia ITS de

bacterias
Paso N° ciclos Temperatura Tiempo
Desnaturalización inicial 1 94°C 3 min
Desnaturalización 35 94°C 15 seg
Ciclo Hibridación 35 53°C 20 seg
Extensión 35 72°C 1.5 min
Elongación final 1 72°C 5 min
Incubación 1 4°C 60 min
Tabla 4. Programa para la amplificación por PCR de una secuencia ITS de

levaduras
Extensión 35 72°C 1.5 min
Incubación 1 4°C 60 min
32
7. Una vez el programa finalice, almacenar los tubos de PCR en nevera a 4°C
hasta su visualización por electroforesis.
PREGUNTAS
1. ¿Qué criterios se debe seguir a la hora de diseñar cebadores para este tipo
de análisis?
2. Suponga que se utiliza la PCR para realizar el diagnóstico de una infección,
¿Qué se debería realizar si observa amplificación en muestras que se sabe
que no están infectadas?
3. ¿Se podría descartar completamente una infección si en una muestra se
observa ausencia de amplificación al realizar la PCR?
4. Describa cual es el fundamento de la PCR en tiempo real para ser catalogada
como una técnica cuantitativa.
BIBLIOGRAFÍA
Bakkali M, et al. Manual de prácticas de genética. Universidad de Granada.

Tomado de: http://wpd.ugr.es/~fperfect/PDFs/2011-ManualdePracticas-
Genetica.pdf
Campbell NA, Reece JB. (2007). Biología. 7ma edición. Estados Unidos. Editorial
Médica Panamericana.
Gonzalez F. (2006). Ensayos médicos sobre genética. Quito, Ecuador. Imprenta

Noción.
Sambrook J, Rusell DW. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ra

edición. Nueva York, Estados Unidos. Cold spring Harbor Laboratory Press.
33
PRACTICA 5. RFLP
INTRODUCCIÓN
El Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP, por su
nombre en inglés, Restriction Fragment Length Polymorphism) es una metodología
que permite diferenciar organismos, debido a que las enzimas de restricción
utilizadas reconocen sitios de restricción específicos, lo cual, a su vez, refleja las
diferencias en la composición de nucleótidos en una secuencia de ADN previamente
amplificada. Las enzimas de restricción reconocen una secuencia de nucleótidos
específica, dentro de una molécula de ADN, y la cortan en un punto particular
conocido como sitio de restricción, generando fragmentos. El tamaño de estos
fragmentos dependerá de la separación entre dos lugares de restricción continuos;
y los cambios, ya sean por recombinación o mutación, conducirán a diferentes
perfiles de restricción. El análisis de los fragmentos de restricción se realiza a través
de electroforesis en gel de agarosa.
Las enzimas de restricción son proteínas de unión al ADN que reconocen sitios
específicos del ADN y cortan. Estas enzimas fueron identificadas y separadas por
primera vez de bacterias, ya que hacen parte del Sistema de restricción y
modificación de las bacterias, como un mecanismo de defensa natural para cortar
el ADN de bacteriófagos. Cuando una enzima de restricción identifica un sitio de
reconocimiento, el ADN es cortado tantas veces como sitios de reconocimiento sean
identificados en una secuencia de ADN, generando así varios fragmentos. Existe
una amplia variedad de enzimas de restricción, y cada una es nombrada de acuerdo
con el organismo del cual fue aislada, por ejemplo: EcoRI fue la primera enzima de
restricción aislada de la bacteria Escherichia coli RY13, mientras que el número
romano hace referencia a que fue la primera enzima descubierta en este
microorganismo.
34
Cada enzima de restricción reconoce sólo un sitio de restricción específico, y corta
dos enlaces fosfodiéster en la doble hebra de ADN. Muchas enzimas dejan un
fragmento corto de nucleótidos sin aparear, el cual es llamado extremo cohesivo.
En general los sitios de restricción son palindrómicos, lo que significa que la
secuencia se lee de igual forma, en dirección 5’ a 3’ en una cadena o en dirección
3’ a 5’ en la cadena opuesta.
A continuación, se muestran algunas enzimas de restricción y los sitios de

restricción donde realizan el corte:
La estructura tridimensional de las enzimas de restricción les permite introducirse

perfectamente en la ranura formada por las dos cadenas complementarias de la
molécula de ADN. Una vez unida al ADN, la enzima literalmente se desliza a lo largo
de la doble hélice hasta reconocer una secuencia específica de pares de bases,
donde separa químicamente o corta a la molécula de DNA.
Respecto a la clasificación de los microorganismos, tradicionalmente, su

identificación y clasificación se realizaba utilizando métodos fenotípicos que se
basan en la determinación de características bioquímicas y/o fisiológicas, que
incluyen la determinación de actividades enzimáticas, la capacidad metabólica y los
determinantes antigénicos y la susceptibilidad a agentes bactericidas. Sin embargo,
estos métodos presentan la desventaja de ser susceptibles a variaciones por las
condiciones de cultivo y características propias de cada cepa de microorganismos,
presentando así resultados falsos positivos o negativos, que resultan en una
identificación errónea.
Posterior al advenimiento de las metodologías moleculares, surgió la posibilidad de

identificar a los microorganismos de acuerdo con su material genético. Los métodos
35
genotípicos de identificación se basan en el estudio de características en el genoma
del microorganismo, las cuales permiten identificarlo a nivel de género, así como
también a nivel de especie. Una de estas metodologías y quizás la más rápida y
sencilla son los Polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP’s).
Por medio de esta metodología es posible distinguir individuos, especies u

organismos de acuerdo con los patrones de restricción obtenidos después de la
digestión con enzimas de restricción de un fragmento específico de ADN
previamente amplificado por PCR. El fragmento amplificado (generalmente un
fragmento correspondiente a espacios internos transcritos (ITS, por sus siglas en
inglés, Internal transcribed spacer), tiene la característica de estar presente ya sea
en todos los mohos y levaduras o en todas las bacterias, por lo cual su amplificación
es posible con un único juego de primers para mohos y levaduras o para bacterias,
sin embargo, la secuencia al interior de dicho fragmento es hipervariable, por lo que
es susceptible de ser identificado con enzimas de restricción, identificando así el
género y especie del microrganismo, de acuerdo a los patrones de restricción
obtenidos. Por ello, los RFLP son ampliamente utilizados para la genotipificación,
huellas de ADN, mapeo de genes, identificación de mutaciones en una secuencia
dada y en diagnóstico de desórdenes genéticos.
En levaduras, se han evaluado los RFLPs de una región altamente conservada

entre el género, pero a la vez hipervariable entre especie, lo que permite hacer una
clasificación confiable de género y especie, basado en el perfil de fragmentos
obtenidos. La región de ADN estudiada corresponde a un gen que codifica para la
subunidad 5S rRNA y los ITS 1-4, como se muestra en la figura 1.
36
Figura 1. Representación esquemática de la region rDNA con la localización de
los primers ITS1 e ITS4
En las bacterias del género Bacillus, los RFLPs también han sido ampliamente
empleados para evaluar la diversidad genómica e identificar especies de este
género, al amplificar la región ITS comprendida entre el rRNA 16S y 23S.
OBJETIVOS
• Obtener el perfil de restricción de un fragmento amplificado previamente por

PCR de una secuencia interna espaciadora (ITS) del microorganismo
asignado, que conduzca a su identificación.
• Identificar los polimorfismos en una secuencia conservada en diferentes

especies de levaduras.
• Reconocer la aplicabilidad de las enzimas de restricción en la clasificación

de microorganismos.
• Producto de PCR previamente amplificado y visualizado en gel de agarosa,

tanto de levaduras como de bacterias.
• Enzimas de restricción:
o CfoI (HhaI)
o HaeIII (BsuRI)
o HinfI
o TaqI
37
• Buffer de cada enzima de restricción
• Micropipetas de 1 a 10 µl
• Puntas para micropipetas estériles
• Baño de agua a 37°C
METODOLOGÍA
RFLP para levaduras
1. Teniendo al menos 30 µl de la reacción de PCR, con el producto amplificado

con buena intensidad de fluorescencia, lo cual es proporcional a su
concentración, tomar 3 tubos de PCR de 0.2 mL para realizar 3 reacciones
de digestión, cada reacción con una de las enzimas de restricción: CfoI (HhaI),
HaeIII (BsuRI) y HinfI.
2. En el tubo de PCR, realizar la mezcla de reacción para cada enzima a utilizar

así:
Componente Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

CfoI (HhaI) HaeIII (BsuRI) HinfI
Producto de PCR 8 µl 8 µl 8 µl
Buffer específico de cada enzima 10X 1 µl 1 µl 1 µl
CfoI (HhaI) 1 µl
Enzima de restricción HaeIII (BsuRI) 1 µl
HinfI 1 µl
Volumen final 10 µl 10 µl 10 µl
38
3. Mezclar cuidadosamente sin generar burbujas e incubar a 37ºC por 12 hrs.
4. Analizar cada una de las digestiones en gel de agarosa al 2.0 % y visualizar
utilizando transiluminador.
RFLP para bacterias
1. Teniendo al menos 10 µl de la reacción de PCR, con el producto amplificado

con buena intensidad de fluorescencia, lo cual es proporcional a su
concentración, tomar 1 tubo de PCR de 0.2 mL para realizar una reacción de
digestión con la enzima de restricción TaqI.
2. En el tubo de PCR, realizar la mezcla de reacción así:
Componente Tubo 1
TaqI
Producto de PCR 8 µl
Buffer específico de la enzima 10X 1 µl
Enzima de restricción TaqI 1 µl
Volumen final 10 µl
3. Mezclar cuidadosamente sin generar burbujas e incubar a 37ºC por 12 hrs.

4. Analizar las digestiones en gel de agarosa al 2.0 % y visualizar utilizando
transiluminador.
Tabla 1. Sitios de reconocimiento de enzimas de restricción utilizadas
Enzima de restricción Sitio de restricción
39
CfoI (HhaI)
HaeIII (BsuRI)
HinfI
TaqI
PREGUNTAS:
1. Diseña una secuencia de 8 nucleótidos que tenga la característica de ser

palindrómica.
2. Observa las secuencias de las dos muestras de DNA mostradas a

continuación,
Muestra 1: CAGTGATCTCGAATTCGCTAGTAACGTT
GTCACTAGAGCTTAAGCGATCATTGCAA
Muestra 2: TCATGAATTCCTGGAATCAGCGAATTCA
AGTACTTAAGGACCTTAGTCGCTTAAGT
Si ambas muestras fueran tratadas con una enzima de restricción cuyo sitio de
reconocimiento fuera G↓ AATTC, indica qué tipo de corte se provoca (romo o
cohesivo), el número de fragmentos generados y el tamaño de los fragmentos que
se obtendrían para cada muestra.
Muestra 1 Muestra 2
Tipo de corte: Tipo de corte:
Nº de fragmentos: Nº de fragmentos:
40
Tamaño de cada fragmento: Tamaño de cada fragmento:
3. A continuación, se encuentra un plásmido con sitios de restricción para las

enzimas BamHI y EcoRI. Se realizaron varios tipos de digestiones utilizando
una de las dos enzimas o la combinación de ambas.
¿Cuál carril del gel muestra la digestión con BamHI solamente?
¿Cuál carril del gel muestra la digestión con EcoRI solamente?
¿Cuál carril muestra los fragmentos producidos cuando el plásmido fue digerido
con ambas enzimas?
BIBLIOGRAFÍA:
Górriz IA. (2012). Utilidad el genotipado PCR-RFLP (coa-spa-clfB) como

herramienta epidemiológica en el estudio de Staphylococcus aureus. Universidad
Cardenal Herrera. Valencia, España.
Merchán MA, Torres MI, Díaz AK. (2017). Técnicas de Biología Molecular en el
desarrollo de la investigación. Revisión de literatura. Revista Habanera de Ciencias
Médicas. 16(5): 1100- 1111.
41
Mittal B, Chaturvedi P, Tulsyan S. (2013). Restriction Fragment Length
Polymorphism. Brenner´s Encyclopedia of Genetics. Second Edition (190-193).
vol 1.
Segal CA, Ortega GJ. (2005). Manual de Practicas Biología Molecular de la Célula
I. Publidisa. México.
42
PRACTICA 6. RT-PCR
INTRODUCCIÓN
La transcripción reversa es un procedimiento muy importante, ya que permite
manipular ácidos nucleicos de tipo ARN por medio de la enzima transcriptasa
reversa (RT por sus siglas en ingles Reverse Transcriptase). Esta enzima, también
conocida como ADN polimerasa dependiente de ARN, emplea moléculas de ARN
monocatenario como molde y un primer o cebador para realizar la adición de
desoxinucleótidos al extremo 3´ de la cadena en crecimiento, de tal manera que la
extensión de la cadena se realiza en dirección 5´→3´ para producir una cadena de
ADN sencilla (ADNs) que es complementaria a la cadena molde de ARN. Una vez
se obtiene esta cadena híbrida ARN-ADNs, la cadena de ARN es degradada
parcialmente por la enzima Ribonucleasa, dejando así pequeños primers o
cebadores para que posteriormente sean empleados por la ADN polimerasa para
sintetizar la cadena de ADN complementaria utilizando como molde la cadena de
ADNs, y de esta manera se obtiene una doble hélice de ADN conocida como ADN
complementario (ADNc) o ADN copia, que no es susceptible a degradación por
RNasas, por lo que esta molécula es mucho más estable que la molécula de ARN.
De esta manera, el ADNc es un ADN copia sintetizado a partir de una molécula de
ARN mensajero por medio de una enzima transcriptasa reversa.
La enzima transcriptasa reversa es una enzima multifuncional ya que posee 3

actividades diferentes: ADN polimerasa dependiente de ARN, Exoribonucleasa
(ARNasa H) dependiente de una molécula híbrida ADN-ARN y ADN polimerasa
dependiente de ADN. IN vivo, la combinación de éstas 3 actividades permite la
transcripción de una cadena sencilla de ARNm en una molécula de ADN de doble
cadena para que el virus pueda replicarse en una célula. Para la transcripción
43
reversa in vitro, las primeras 2 actividades son utilizadas para producir el ADNc de
cadena sencilla:
• Actividad ADN polimerasa dependiente de ARN (transcripción reversa)

transcribe ADNc a partir de un templado de ARN. Esta actividad permite la
síntesis de ADNc.
• Actividad ARNasa H específicamente degrada solo el ARN en el híbrido ARN:
ADN. Por lo tanto, la actividad ARNasa H digiere el ARN hibridizado al ADNc,
pero no afecta al ARN puro. Por ello, se genera una molécula sencilla de
ADN (ADNs), la cual posteriormente se convertirá en una molécula de ADN
de doble cadena.
A pesar de que la enzima RT fue inicialmente descubierta en retrovirus a principios

de la década de 1970, actualmente se conoce que esta enzima se encuentra en
organismos procariotas y eucariotas, y además se encuentran de forma abundante
en los genomas de plantas y animales. En el gráfico se describe el proceso de
transcripción reversa para obtener el ADNc en organismos eucariotas.
44
La enzima RT es utilizada para realizar la reacción de transcripción reversa
acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR, por sus siglas en
inglés Reverse transcription - polymerase chain reaction). La reacción de RT-PCR,
generalmente es realizada en dos pasos, primero se realiza la transcripción reversa
utilizando el primer Oligo-dT en organismos eucariotas, con lo que se genera un
ADNc representativo de todos los transcriptos expresados en las células objeto de
estudio, ya que el ARN mensajero (ARNm) eucariota posee una cola poli(A) en el
extremo 3’. El ADNc generado durante el proceso de RT tiene también otro uso
importante. Debido a que en el ADN genómico los genes eucariotas están formados
por intrones y exones, no pueden ser expresados en bacterias, ya que éstas
carecen de la maquinaria para cortar los intrones del transcripto primario y
45
posteriormente realizar el empalme de los exones. Por lo tanto, el ADNc al ser una
copia del ARNm maduro y una molécula de ADN de doble cadena y estable, puede
ser posteriormente amplificado por PCR e insertado en vectores de expresión de
tipo plasmídico en bacterias para que se lleve a cabo la expresión de las proteínas
correspondientes.
De otro lado, debido que los organismos procariotas no poseen en sus transcritos
la cola poli(A) en el extremo 3’, se utiliza el o los primers reversos específicos del
gen o los genes de interés, de esta manera, se obtienen tantos ADNc específicos
como primers reversos se hayan incorporado a la reacción. Posteriormente, el
ADNc obtenido previamente es utilizado como molde, para llevar a cabo una
reacción de PCR convencional y solo con los pares de primers de interés.
La reacción de RT-PCR es ampliamente utilizada para evaluar la presencia,

ausencia, así como también la cantidad de ARNm en células o tejidos en una
muestra de ARN total, por lo cual es una metodología fundamental para la
comprensión de la regulación génica. De esta manera, es posible determinar el
momento y el nivel de expresión génica en las células a través de la determinación
de los ARNm específicos de cada gen. La RT-PCR también ha sido muy útil para la
identificación y cuantificación de virus cuyo genoma sea ARN.
OBJETIVOS
• Comprender la fundamentación teórica de la metodología de transcripción

reversa acoplada a la PCR.
• Realizar la transcripción reversa de un ARN eucariota previamente extraído
utilizando oligodT.
• Realizar la reacción de PCR utilizando como templado un ADNc sintetizado
previamente.
• Evaluar la expresión de un gen eucariota por medio de electroforesis en un
gel de agarosa.
46
• Enzima ADNasa
• Buffer de la enzima transcriptasa reversa (RT) 5X con dNTPs
• Enzima RT
• Primer Oligo-dT
• Agua desionizada estéril libre de RNAsas
• ARN total previamente extraído y valorado
• Micropipetas de 1, 2, 10, 20 y 100 µl
• Termociclador
• Vortex
• Microcentrífuga
• Baño María o bloque de calentamiento
• Hielo
METODOLOGÍA
1. Descongele la muestra de ARN total en hielo.

2. Descongele a temperatura ambiente (15-25°C) los reactivos como buffers,
enzima RT, oligo-dT y agua libre de ARNasas
3. Mezclar por inversión los reactivos, centrifugar de forma breve y
posteriormente incubar en hielo hasta su utilización.
4. Para la eliminación del ADN genómico:
Reactivo Volumen (µl)

Buffer ADNasa 7X 2
ARN total (hasta 1 ug) 10
Agua libre de ARNasa 2
Volumen final 14
5. Mezcle y mantenga el tubo en hielo hasta su incubación.
47
6. Incube a 42°C por 2 a 10 minutos. Posteriormente, incube el tubo en hielo.
7. Para la reacción de transcripción reversa:

Enzima Transcriptasa reversa, RT 1
Buffer de la RT 5X 4
Primer (oligo-dT o Reverso específico) 1
ARN total (Reacción anterior) 14
Volumen final 20
8. Mezcle y mantenga el tubo en hielo hasta su incubación.

9. Incube a 42°C por 20 minutos para que se lleve a cabo la reacción de
transcripción reversa.
10. Incube a 95°C por 3 minutos para inactivar la enzima RT.
11. Almacene a -20°C hasta que se realice la reacción de PCR.
12. Realice la reacción de PCR, tanto para el gen control como el gen analizado,
en un tubo de PCR independiente. Recuerde incluir los respectivos controles
tanto para el gen control como para el gen analizado.

Agua 8.8
Buffer de la enzima ADN polimerasa 10X (NH4)2SO4 2
MgCl2 25 mM 1
dNTPs 10 mM 1
Primer forward 10 uM 1
Primer reverse 10 uM 1
ADN polimerasa 5 U/ µl 0.2
Templado ADNc 5
Volumen final 20
48
13. Realice la PCR de acuerdo con el siguiente programa de amplificación

Extensión 35 72°C 30 seg
Incubación 1 4°C 60 Min
14. Realice un gel de agarosa al 2% para analizar las reacciones de PCR.
PREGUNTAS:
1. ¿Por qué a la enzima transcriptasa reversa se le denomina una enzima

multifuncional?
2. Explique por qué es necesario hacer una transcripción reversa para el estudio
de expresión génica.
3. Señale cual es la razón para que, en el análisis de expresión génica en
organismos eucariotas, solo sea necesario un solo tipo de primer para
realizar la transcripción reversa mientras que para organismos procariotas es
necesario incorporar cada primer reverso específico de los genes a estudiar.
4. Explique por qué el análisis de la expresión de genes en organismos
procariotas demanda una rigurosa eliminación del ADN genómico.
BIBLIOGRAFÍA:
Bakkali M, et al. Manual de prácticas de genética. Universidad de Granada. Tomado

de: http://wpd.ugr.es/~fperfect/PDFs/2011-ManualdePracticas-Genetica.pdf
49
Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L. (2002). Biochemistry. 5° edición. Nueva York,
Estados Unidos.
Devlin TM. (2004). Bioquímica: Libro de texto con aplicaciones clínicas. 4° edición.
Nueva Jersey, Estados Unidos. Editorial Reverté.
Koneman EW, Allen S. (2008). Diagnostico Microbiológico. 6° Edición. Madrid,

España. Editorial Médica Panamericana.
QuantiTect® Reverse Transcription Handbook. For cDNA synthesis with integrated

removal of genomic DNA contamination. For use in real-time two-step RT-PCR.
March, 2009.
vol 1.
Tropp BE. (2012). Molecular Biology: Genes to Proteins. 4° edición. Nueva York,
Estados Unidos.
50
Universidad de Antioquia
Escuela de Microbiología
Biología Molecular y Laboratorio
Taller Número 1: Extracción, valoración e integridad de ácidos nucleicos
A continuación, se presentan situaciones con un problema de aplicación práctica.

Para resolver las preguntas es necesario conocer previamente los fundamentos
teórico-prácticos de cada una de las metodologías.
Situación 1:
Un profesional de la Microbiología debe de realizar algunas tareas en el laboratorio

de Microbiología molecular. Antes de realizar alguna prueba molecular, debe de
evaluar la calidad de 5 muestras de ADN, las cuales fueron extraídas por otro
profesional. Las muestras fueron marcadas únicamente en el cuerpo del tubo, pero
al realizar la limpieza de la superficie con alcohol, este también impregnó los tubos
borrándoles la marca. Al limpiar la superficie del laboratorio “sin querer” se le han
borrado los rótulos de las muestras a analizar. Para solucionar este primer problema
el profesional decidió analizar en un gel de agarosa al 1%, las muestras, las cuales
fueron corridas a 120 V por 1h. En la imagen se muestran los resultados obtenidos:
51
1. De acuerdo con la imagen ¿Puede identificar qué tipo de material genético
contiene cada muestra según las bandas que se presentan en cada carril?
Justifique su respuesta.
2. Asocie si la banda que se presenta en cada carril de corrido corresponde a

ADN genómico, ADN plasmídico superenrollado, ADN circular abierto o lineal
según cada una de las flechas que se encuentran a la izquierda del gel de
electroforesis. (coloque el nombre al lado de cada una de las flechas, de
acuerdo con el peso molecular que considere que tiene cada uno de estos
ADN en el gel). Justifique cada una de sus respuestas.
3. ¿Qué puede ser la mancha que se observa en la parte inferior de los carriles
1,2,3 y 5?, ¿por qué no se observa en el carril 4? Explique.
4. Evalúe la integridad de cada una de las muestras corridas en la electroforesis

y explique su respuesta.
5. ¿Hay presencia de ADN degrado en alguna de las muestras? Justifique su

respuesta.
6. ¿Qué papel cumple la muestra que se corre en el carril número 6?
7. ¿Qué ocurre si al final de la extracción de ADN no se utiliza un medio de

preservación? ¿Cómo se vería un ADN degradado?
8. ¿Cuánto tiempo puede durar una muestra de ADN plasmídico o genómico?
El profesional, decide corroborar los resultados de la primera electroforesis de la

muestra 4 y por ello trata de replicar el mismo montaje de la primera electroforesis
y corre en el carril número 1 su muestra y en el carril número 2 el marcador de peso
molecular. Después de 50 minutos de corrido a 120 V y 1 hora, observa el gel y
encuentra lo siguiente:
52
9. ¿Cuál sería la mejor explicación para este resultado?
Luego de caracterizar por electroforesis cada una de las muestras, el estudiante

procede a analizarlas por espectofotometría. En este caso decide también evaluar
un control positivo CP y uno negativo CN. Los siguientes son los resultados de las
lecturas de diluciones 1:10
Muestra Absorbancia 260/280 260/230 Concentra

230 nm 260 nm 280 nm ción final
de la
muestra
CP 0,035 0,071 0,038
Muestra 1 0,64 1,39 0,64
Muestra 2 2,44 3,94 2,51
Muestra 3 2,59 3,83 2,59
Muestra 4 1,21 2,47 1,29
Muestra 5 1,97 5,02 2,97
CN 0,0 0,0 0,0
10. Según las proporciones obtenidas a 260/280 y a 260/230, ¿Qué conclusiones

se pueden obtener sobre la pureza de cada muestra evaluada?
11. ¿Cuál es el objetivo en este caso del uso de un control positivo?
12. ¿Cuál es la importancia del uso de un control negativo?
13. ¿Cuál es el objetivo de hacer las mediciones de la absorbancia de las

muestras a estas tres longitudes de onda diferentes?
14. ¿Con los resultados de las proporciones obtenidas a 260/280 y a 260/230 es

posible establecer el método de extracción más eficiente paralas muestras?
Explique y si es posible, determine con qué metodología pudo haberse
extraído cada muestra.
15. Teniendo en cuenta los resultados de la electroforesis realizada por el

estudiante y los resultados de la espectrofotometría evalúe la calidad de cada
una de las muestras como buena, regular o mala y según esto para qué tipo
de técnicas posteriores en biología molecular es posible emplear o no cada
una de las 5 muestras analizadas.
Otra tarea que debe de realizar este profesional es seleccionar un kit de extracción.
Teniendo en cuenta la información proporcionada en la siguiente tabla, donde se
indican las características de cada uno de los 6 posibles kits a utilizar:
53
Costo Tiempo de Pureza
Cantidad
por procesamiento Rendimiento Abs
Método Principio de células
muestra por muestra Mg (DS) 260/280
requeridas
en USD (han-on-time) (DS)
Columna de
Genomic- intecambio 1.77
8.1 8 h (45 min) 4x109 9.8 (3.5)
tip 20/G aniónico (0.06)
(gravedad)
Perlas
MagAttract
magnéticas 1.83
HMW DNA 4.4 2 h 40 min (1h) 2x109 10.3 (6.6)
con unión al (0.05)
Kit
ADN
MasterPure
DNA 2 h 10 min (35 1.82
Salting-out 1.1 0.4x109 3.3 (1.0)
Purification min) (0.03)
kit
Wizard
Genomic
1.58
DNA Salting-out 2.0 3 h (35 min) 4x109 18.1 (7.5)
(0.01)
purification
kit
Columnas con
DNeasy
membranas de 1.72
Blood & 3.2 3 h (45 min) 2x109 10.9 (1.3)
silica (0.05)
tissue kit
(centrifugación)
Lisis alcalina,
columna de
Plasmid 3 h 50 min (40 1.67
intercambio 5.2 18x109 0.50 (0.2)
mini Kit min= (0.03)
aniónico
(gravedad=
Según la información de la tabla, cuál de los kits sería el más adecuado para la
extracción de
a. ADN genómico bacteriano

b. ADN plasmídico
c. ADN a partir de comunidades bacterianas
Justifique cada una de sus respuestas. Señale cuáles fueron los criterios que tuvo
en cuenta para seleccionar cada kit, si es necesario puede consultar
características adicionales sobre cada kit.
54
Taller Número 2: PCR, RT-PCR y qPCR
A continuación, se presentan situaciones con un problema de aplicación práctica.

Para resolver las preguntas es necesario conocer previamente los fundamentos
teórico-prácticos de cada una de las metodologías.
Situación 2:
El benceno, tolueno, xilenos, fenol, naftaleno y bifenilo son compuestos que tienen
al menos una vía identificada de biodegradación que involucra a la enzima catecol
2,3-dioxigenasa. Por tanto, la detección de los genes correspondientes que
codifican para la enzima catecol 2,3-dioxigenasa puede servir como base para
identificar y cuantificar las bacterias que tienen estas capacidades metabólicas. Uno
de los microorganismos que se conoce que presentan este gen es Pseudomonas
veronii, cuya secuencia del gen tiene un tamaño de 930 pb y dicha secuencia se
presenta a continuación:
ATGGCGATGACAGGTGTATTGCGTCCGGGCCATGCCCAGGTGCGCGTGTTGAACCTTGAAG
AAAGCGTTCATTTCTATCGCAATGTGCTGGGGCTGGTCGAGACCGGGCGTGACGATCAGGG
ACGGGTGTACTTCAAGTGCTGGGATGAGCGCGATCACAACTGCTATGTGATCCGTGAAGCG
GACACTGCCGGTATCGACTTCTTCGGCTTCAAGGTACTGGACAAGGCCACCCTGGAGAAGC
TCGATGCCGACCTGCAGGCCTACGGGCTGGCCACCACCCGCATCCCCGCCGGTGAGTTGCT
GGAAACCGGCGAGCGTGTGCGCTTTGAATTGCCCTCGGGCCATCTGATTGAGCTGTACGCC
GAAAAGAGCTGTGTCGGCAACGGTATTCCTGAAGTCAACCCAGCCCCGTGGAATGCGCTGC
GCGAGCACGGTATTGCGCCGATTCAGTTGGACCACTGCCTGCTGTACGGTCCCAACATTGC
GCAAGTGCAGAAAATCTTCACCGAGGTCCTGGGCTTCTACCTGGTCGAACGCGTCCTCAAC
CCGGAGGGCGACGGTGACGTCGGCATCTGGCTGTCGTGTTCGCACAAGGTCCATGACATCG
CCTTCGTTGAATATCCCGAGAAGGGCAAGCTGCACCACTGTTCGTTCCTGCTCGAGTCCTG
GGAGCAGGTGCTGCGTGCCGGCGACATCATGTCCATGAACGAAGTGAACGTCGATATCGGC
CCCACCCGCCATGGCGTGACCCGCGGTTGCACCATCTATGCCTGGGACCCCTCCGGTAACC
GCTTCGAGACCTTCATGGGCGGCTACCACCCCTATCCGGACTACCAGCCGCTGTCCTGGAC
CTACGACAACTTCGCCCAGGGCCTGGACTACCCGCAACGCAAGTTGCACGAATCGTTCCTG
ACCGTCGTGACTTGA
Las secuencias de los primers que le han sugerido son las siguientes:
Primer Forward: ACCCTGGAGAAGCTCGATG
Primer Reverse: AAGTCACGACGGTCAGGAAC
1. Señale la posición donde hibrida cada uno de los primers
2. ¿Cuál sería la Tm para el paso de hibridación en la PCR por el método de

Wallace?
55
Ecuación de Wallace:
Tm = {2x(A+T)}+ {4x(G+C)}
3. ¿Cuál sería el tamaño del producto de PCR o amplificado utilizando éstos

primers?
4. La concentración de Mg2+ es un factor muy importante al momento de

estandarizar una reacción de PCR, debido a que afecta el funcionamiento de
la enzima Taq polimerasa.
a. Enumere los componentes de la reacción de PCR afectan la cantidad de

Mg2+ libre en la mezcla de reacción.
b. Describa como debe ser la estandarización de la cantidad de cloruro de

magnesio en una reacción de PCR y ¿Cuál es el rango de concentración
recomendado?
c. Complete el esquema de un gel agarosa al 1.5% donde se realizó una

electroforesis. De acuerdo con la información que se indica a
continuación, dibujar lo que se observaría en cada carril:
MP: Marcador de peso GeneRuler 1 kb DNA Ladder
1: Amplificado de la 2,3-dioxigenasa con exceso en la concentración de

magnesio.
2: Amplificado de la 2,3-dioxigenasa con déficit en la concentración de

magnesio.
3: Amplificado de la 2,3-dioxigenasa con una concentración de

magnesio ideal de magnesio.
56
MP 1 2 3
5. ¿Qué otros factores además del Mg2+ son cruciales en la estandarización

de una reacción de PCR?
6. Para cada una de las siguientes situaciones, indique qué le sucede a la

reacción de PCR y sus consecuencias en la amplificación del producto.
Justifique su respuesta e indique si existe alguna manera de remediar lo
ocurrido:
a. Aumenta la cantidad de Taq polimerasa
b. Aumenta el tiempo de extensión
c. Aumenta la Tm
d. Disminuye la Tm
e. Aumentó el número de ciclos de PCR
f. Se va la luz a mitad de una PCR de 30 ciclos
g. Se pone más cantidad de un primer que otro
h. Los dNTP´s no se encuentran en concentraciones iguales
i. Si la PCR tiene menos ciclos de los indicados
j. La PCR termina justo antes del paso de extensión final
57
Usted ha aislado 6 microorganismos (A, B, C, D, y E) prevenientes de 5 muestras
ambientales diferentes y han sido identificadas como Pseudomonas y usted desea
conocer los niveles de expresión del gen que codifica para la enzima catecol 2,3-
dioxigenasa. Este análisis se debe realizar mediante un ensayo de qRT-PCR. El
análisis se requiere realizar para identificar si dentro de los microorganismos
aislados hay alguno o algunos que presenten mayores niveles de expresión que el
microorganismo Pseudomonas veronii, el cual se utiliza como control interno.
Control interno y control negativo
Si el valor de Ct de la muestra A es 17,
7. ¿Cuál sería el Ct de cada una de las muestras B a E?

8. Si la muestra utilizada como control interno tiene 0,2 copias/l, indicar
cuantas copias tienen cada una de las muestras de la A a E.
9. ¿A qué se debe que en todas las muestras se alcancen valores finales de
Rn similares?
10. ¿Consideras que este ensayo está basado en el uso de SYBR Green o una
sonda TaqMan? Justifique su respuesta
11. ¿Qué parámetros son fundamentales a la hora de estandarizar una qRT-
PCR?
12. ¿Qué significa el término “normalizar la PCR” y por qué es importante en
una reacción de PCR en tiempo real?
13. ¿Cuál es la diferencia entre una cuantificación absoluta y una cuantificación
relativa? ¿Cuál es la diferencia entre los cálculos que se deben realizar
entre uno y otro?
14. ¿A qué se debe que en todas las muestras se alcancen valores finales de
Rn similares? Explica de forma resumida en 26L tu opinión al respecto de
58
si el ensayo que aquí se comenta está basado en el uso de SYBR Green o
una sonda TaqMan.
59
Taller Número 3: Electroforesis y RFLPs
Los triatominos son insectos que transmiten el parásito Trypanosoma cruzi, agente
causal de la enfermedad de Chagas. Estos insectos en su flora intestinal contienen
bacterias del género Rhodococcus y su estudio es de gran interés. Dada la dificultad
para identificar bacterias de este género por pruebas tradicionales, se estandarizó
una prueba PCR, seguida de un ensayo de longitud de polimorfismo de fragmentos
de restricción para la identificación de Rhodococcus rhodnii. Para ello, usted
amplificó el gen codificante para el ARN 16S ribosomal bacteriano y los productos
obtenidos fueron sometidos a digestión con diversas enzimas de restricción
(GenBank EF108418).
GCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAAGGCCCTTTCGGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTA
ACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACTGGATATGA
CCACTGGTTGCATGGCCTGGTGGTGGAAAGATTTATCGGTGCAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGC
TTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCAC
ACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCG
CAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCGGTAGG
GACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTATAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTA
ATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGT
CGTCTGTGAAATCCCACAGCTCAACTGTGGGCGTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTACTGCAG
GGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAG
GCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACC
CTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTGGGTTTCCTTCCACGGGATCCGTGCCGTA
GCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGG
GGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTT
GACATACACCGGATCGCCTCAGAGATGGGGTTTCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCT
GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTT
GCCAGCACGTAATGGTGGGGACTCGCAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGA
CGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCT
GCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCG
ACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGT
CTTGTACACACTGCCCGT
1. Para la siguiente secuencia, identifique los sitios de corte de las siguientes

enzimas de restricción:
BamHI
PstI
SacI
2. Identifique el tipo de buffer compatible con la mayoría de las enzimas para

realizar la reacción de restricción.
60
3. Elabore los cálculos de la reacción de restricción y estime el tiempo estimado
de incubación de la reacción si cuenta con:
a. Una enzima de restricción convencional que digiere 1 g de ADN con 1ul

de enzima durante una hora y cuenta con una concentración de 1.2 U/l
y requiere digerir 12 g de ADN. De acuerdo con la información
proporcionada, complete la siguiente tabla:
Reactivo Concentración Concentración Volumen l

inicial final
Buffer 10 X 1X
Enzima 10 U/l 1U/l
ADN
H2O
Total 40
Tiempo aproximado de digestión completa: _________
b. Si en lugar de tener una enzima de digestión convencional tiene una “Fast

digestión” (Digiere 1g de ADN en a 15 minutos con 1l de enzima). ¿Cuál
sería el tiempo de digestión de la anterior reacción? ¿Qué diferencia una
enzima “Fast digestión” de una enzima convencional?
4. Complete el siguiente esquema de un gel de agarosa al 2% para realizar una

electroforesis y esquematice en cada carril, lo que obtendría una vez
realizadas las restricciones del ADN, con las diferentes enzimas de
restricción
MP 1 2 3 4 5 6
61
MP: Marcador de peso molecular 50 bp DNA ladder
1: Digestión del fragmento con BamHI
2: Digestión del fragmento con PstI
3: Digestión del fragmento con SacI
4: Digestión doble del fragmento con BamHI y PstI
5: Digestión doble del fragmento con BamHI y SacI
6: Digestión triple del fragmento con BamHI, PstI y SacI
5. Este mismo protocolo lo realizó su compañero, pero al terminar la

electroforesis observa las bandas difusas “como degradación”. ¿Qué pudo
ocurrir en el protocolo de su compañero?
6. Su compañero repite nuevamente el protocolo de digestión y

desafortunadamente incubó la reacción de digestión durante el fin de semana
(dos días aproximadamente). ¿Qué pudo haber encontrado a analizar las
reacciones de digestión en una electroforesis en un gel de agarosa?
7. ¿Qué significa la actividad estrella de una enzima de restricción? ¿Qué

condiciones de reacción pueden producir esta actividad?
A continuación, se muestran fotografías de algunas electroforesis, ¿Puede

identificar cuál es el problema y cómo puede solucionarlo?
8 9 10 11
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UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA

PRACTICA 1. EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO MICROBIANO

Actualmente existen varios métodos para la extracción y purificación de los ácidos

• El tipo de ácido nucleico a extraer: ADN genómico, ADN plasmídico, ARN

a) Lisis de células e inhibición de nucleasas:

La extracción de los ácidos nucleicos a partir de materiales biológicos requiere la

b) Extracción y purificación de los ácidos nucleicos:

Posterior a la liberación de los ácidos nucleicos mediante lisis celular, es necesario

La extracción de estas proteínas con solventes no miscibles permite eliminar las

c) Precipitación de ácidos nucleicos:

Figura 1. Método básico para la extracción del DNA. (Tomado de:

• Realizar la extracción de ADN de bacterias y levaduras utilizando un kit

Lisis células Gram positivas:

Extracción y purificación protocolo Sigma (Después de la lisis de todos los

1. Unir una columna a un tubo de colección. Adicionar 500 µl de solución de

Lisis células Gram positivas:

Extracción y purificación protocolo Sigma (Después de la lisis de todos los

1. Transferir el lisado a la columna y centrifugar a 6500 g por 1min. Descartar

1. ¿Cuál es la importancia de realizar la extracción de DNA?

Bravo AL, González CH, Le Borgne S. (2012). Manual de prácticas de laboratorio

Quesada S. (2007). Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica.

PRACTICA 2. EXTRACCIÓN DE ADN PLASMÍDICO

La extracción y purificación del ADN plasmídico es esencial para diversos análisis

El método con el que se realizará la extracción de ADN plasmídico es la extracción

Los alcoholes, como el isopropanol y el etanol absoluto, son ampliamente utilizados

1. Inocular 2 colonias de E. coli las cuales presentan plásmidos en 5 ml de caldo

1. Describa un método rápido de extracción de ADN plasmídico de kits

PRACTICA 3. VALORACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS: INTEGRIDAD,

Electroforesis en gel para ácidos nucleicos

La electroforesis es una técnica de separación de ácidos nucleicos tales como el

La electroforesis de ADN utiliza como soporte agarosa, la cual es un polímero

Para poder analizar el ADN en gel de agarosa, es necesario utilizar el buffer de

Factores que afectan la movilidad electroforética del ADN:

A voltajes bajos, la migración de las moléculas lineales de ADN es proporcional al

La movilidad electroforética del ADN es influenciada por la composición y la fuerza

• Tamaño del ADN

• Conformación del ADN

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• Evaluar la utilidad de la electroforesis en gel de agarosa para la detección

1. Preparación del gel de agarosa

a. Preparar una solución de agarosa al 1% en buffer TBE 1X; mantenga en la

Figura 1. Preparación del gel de agarosa

d. Cuando la agarosa este completamente gelificada retire el peine, e introduzca

2. Preparación de la muestra a cargar en el gel de agarosa

a. En papel parafinado mezcle 0.2 volúmenes del buffer de carga 6X con 1

Figura 2. Cámara de electroforesis

c. Realice el mismo procedimiento para el marcador de peso molecular λ DNA/

1. ¿Qué otras macromoléculas pueden ser separadas por electroforesis en gel?

3. ¿Además del azul de bromofenol, qué otros colorantes se utilizan en los

4. Consulte 3 reactivos no tóxicos para observar el ADN en un gel de agarosa

Padilla CA, Diez J, Martínez E, Bárcena JA, García C. (2018-2020). Universidad de

Pinilla G. (2019) Biología molecular: ADN recombinante y sus aplicaciones. Bogotá,

Puerta C, Urueña C. (2005). Prácticas de biología molecular. Editorial Pontificia

Los cebadores o primers son secuencias cortas de ADN de cadena sencilla