Procedimiento para la Validación de Métodos Analíticos

1. Propósito
Establecer el procedimiento a seguir para realizar la validación del método
de ensayo.

2. Responsabilidad
Se debe establecer a los responsables de la ejecución y de la supervisión; así,
por ejemplo:
Ejecución: analistas debidamente entrenados del Laboratorio de Control de
Calidad
Supervisión: jefe de la Sección Analítica y jefe de Control de Calidad

3. Referencias
Se debe indicar la relación de documentos consultados o sobre los que se
está trabajando el procedimiento de validación, ejemplo:
Métodos de Ensayos
Procedimientos estadísticos, etc.

4. Definiciones
Indicar todas las definiciones que se van a utilizar dentro del procedimiento,
ejemplo: analito, blanco, especificidad o selectividad, exactitud, linealidad,
límite de detección, etc.

5. Procedimiento
5.1 Selección de parámetros a validar
Debe considerarse lo siguiente:
- Métodos de identificación: selectividad
- Métodos de cuantificación de principios activos principales: exactitud,
repetibilidad, reproducibilidad, especificidad, linealidad, rango.
- Métodos de cuantificación de impurezas y sustancias relacionadas:
exactitud, repetibilidad, reproducibilidad, especificidad, linealidad, límite
de cuantificación y rango.

5.2 Preparación de equipos y muestras

Debe indicarse las siguientes verificaciones:
- Los estándares, soluciones y reactivos deben ser los adecuados y de
calidad comprobada.
- Calibración de los equipos y materiales a emplear.
- Preparación de las muestras y estándares de acuerdo a las instrucciones
de trabajo del método analítico a validar.

5.3 Determinación de los parámetros de validación

5.3.1 Especificidad o selectividad
Implica:
- La recolección de información sobre la matriz de la materia prima
o producto a evaluar y determinar los posibles productos de
degradación o impurezas.
- La preparación de un placebo conteniendo todos los elementos de
la matriz excepto el analito y hacer la determinación siguiendo el
método analítico (verificar respuesta del equipo, interferencias,
etc)
- La adición de analito al placebo que recién se ha preparado y
comparación de la respuesta del análisis con la de un patrón puro
del analito. Verificar la concordancia de los resultados.
- El análisis de una muestra pasada de producto o insumo que haya
caducado o con fecha de vencimiento próxima y comparación
con la respuesta de un patrón puro de analito (este dato se utiliza
para estudios de estabilidad química)

5.3.2 Linealidad
• Especificación
Hay que recordar que el intervalo lineal del sistema
instrumental que se utilice sea más amplio que el intervalo de
concentraciones a estudiar.

• Linealidad del sistema

Preparar cinco soluciones de concentraciones crecientes a
partir de una misma solución patrón; el intervalo de
concentraciones debe estar entre el 50% y 150% de la
concentración final de trabajo. Cada muestra debe trabajarse
por duplicado como mínimo.

• Linealidad del método

Preparar una serie de soluciones patrones de analito de por lo
menos tres concentraciones diferentes (80%, 100% y 120%)
adicionando a cada uno de ellos el placebo del producto en
forma proporcional a su contenido.
Cada muestra debe prepararse como mínimo por duplicado y
los datos deben tomarse por triplicado en cada una de ellas.

• Evaluación
En ambos casos, determinar la curva de calibración que
relacione respuestas (áreas, alturas, absorbancias, gastos, etc)
con concentraciones o cantidad de analito.

Halle la recta de regresión por el método de ajuste por

mínimos cuadrados (lineal) o determine matemáticamente la
función que relaciona la respuesta con la concentración del
analito que se evalúa.

Si se trata de una función lineal de la forma: y = ax + b

Con,
x = concentración o cantidad de analito (variable independiente)
y = respuesta (áreas, alturas, absorbancias, gastos, etc), (variable
dependiente)
a = valor de la pendiente
 b = término independiente (ordenada en el origen)
n = número de muestras

 xy −  x y
b=
 y − b x ; a= n
 x − ( x )
2
n 2

Haga la representación gráfica de la recta de regresión

Realice la interpretación estadística de la regresión lineal
calculando el coeficiente de regresión y el coeficiente de
variación de los factores de respuesta.
No olvidar realizar los registros respectivos en un formato
establecido para este fin.

Cálculo del coeficiente de correlación ( r):

 xy −  x y
r= n

 x −
2
( x) 
2

  y −
2
( y) 
2


 n 

n 


Cálculo del coeficiente de variación de los factores de

respuesta:

y
f =
x

Compare con la especificación establecida

- “r” mayor de 0,990
- valor de “a”: cercano a cero (dentro del error
experimental)
- C.V. del f : menos de 5%

5.3.3 Exactitud
Trabajar con las mismas muestras preparadas para determinar la
linealidad del método. Cada muestra debe analizarse por triplicado.
Registrar los resultados en un formato establecido para tal fin.

Cálculo del porcentaje de recuperación (R) de cada concentración:

cantidadrecuperada
%R = x100
cantidadagregada

Especificación: por ejemplo, del 98% al 102 %

Se debe determinar la recuperación media global y su coeficiente de
variación.
Registrar los resultados en un formato establecido para tal fin.

5.3.4 Precisión (repetibilidad y reproducibilidad)

Para la determinación de la repetibilidad, preparar la muestra a la
concentración propuesta por el método analítico y analizar en forma
independiente 6 alícuotas.

Para la determinación de la reproducibilidad, repita el desarrollo del

método en diferente día y con diferente analista. Para esto, preparar
una muestra homogénea y se analizan independientemente 6
alícuotas siguiendo el método analítico desde el principio.

Expresar los resultados de Repetibilidad y Reproducibilidad por la

desviación estándar, por el coeficiente de variación, límites de
confianza (de los resultados individuales o de los resultados
promedios). Registrar los resultados en un formato establecido para
tal fin.

Cálculo de la desviación estándar:

 (x )
2
−x
DS = S =
n

n −1

donde:
DS = S : desviación estándar
xn : cada uno de los valores individuales
x : valor promedio
n – 1 : grados de libertad (número de mediciones menos 1)

Cáculo del coeficiente de variación o desviación estándar relativa

(distribución de los resultados analíticos alrededor de su media)

S • 100
C.V. =
x

Límite de confianza:

a) De los resultados individuales:

L.C. = x  St n −1

Donde, t = t de Student para (n-1) grados de libertad y un grado de

confianza del 95 %.

b) De los resultados promedio:

 L.C. = x  t n −1 • Sx

Donde, Sx = desviación estándar de la media = S/n

Especificación:
- C.V. de repetibilidad es menor de 2%
- C.V. de reproducibilidad es menor del doble del C.V. de
repetibilidad

5.3.5 Límite de Cuantificación

Si el placebo da respuesta, medir la magnitud de ella 5 veces. Sacar
el promedio de las respuestas y la desviación estándar. Con estos
valores determinar el límite de cuantificación aplicando la ecuación
(I), obteniéndose la cantidad de analito mínima que puede ser
cuantificable.
Preparar una serie de muestras por la adición de la cantidad calculada
de analito al blanco.
Analizar un mínimo de 6 muestras y determinar su exactitud y
precisión. Si los resultados cumplen con estos parámetros se puede
decir que el valor determinado corresponde al límite de
cuantificación del método.

Si el placebo no da respuesta, calcular a partir de la curva de

regresión calculada en la determinación de linealidad y la
preparación de una nueva curva de regresión empleando soluciones
de concentraciones menores al 50% de la concentración final del
principio activo en el método.

Determine la pendiente de la curva de calibración (concentración vs

respuesta) en el rango apropiado: b.

Se obtiene otra curva de calibración, inyectando cada punto por

triplicado pero en este caso para concentraciones menores al 50 %
del analito, determinándose la ecuación de esta nueva recta de
calibración y se extrapola la respuesta a concentración cero,
obteniéndose un estimado de la respuesta del blanco: Ybl.

Se determina la desviación estándar correspondiente a cada

concentración en la determinación del límite de cuantificación; se
calcula la recta correspondiente a concentración en función de la
desviación S y se extrapola como en el caso anterior la desviación
estándar a concentración cero, obteniéndose el estimado S bl,
correspondiente a la desviación estándar del blanco. Para la
determinación se emplea la fórmula (II).

Fórmulas para determinar el límite de cuantificación:

(I) LC = Bl + 10S
 Ybl + 10Sbl
(II) LC =
b

Límites: C.V.  2%
%R 90% - 110%

5.3.6 Comprobar la exactitud y precisión del límite de

cuantificación analizando muestras preparadas en el rango
correspondiente.

Consideraciones finales.
Se debe evaluar los resultados obtenidos en cada uno de los
parámetros, si estos cumplen con las especificaciones presentadas en
el ANEXO, el método se considera válido.
Se debe preparar un resumen de los resultados llenados en los
formatos correspondientes y adjuntarlos al informe técnico que
deberá entregarse a la Gerencia o Dirección de Aseguramiento de la
Calidad o Jefatura de Garantía de Calidad, dependencia que aprobará
los reportes de validación.

6 Formatos
Codificar los formatos de Validación de métodos analíticos.

7 Anexos
Anexo 1: Criterios de Aceptación para cada tipo de método analítico.
Anexo 2: Tabla t de Student.

Anexo 1: Criterios de Aceptación para los diferentes tipos de método

analítico

• Métodos cromatográficos (por ejemplo, puede ser cualquier otro

método instrumental) para cuantificación de componentes
principales

-Exactitud del método: 98,0 % - 102,0% de recuperación

con respecto a valor teórico.

- Repetibilidad: CV menor o igual al 5%

- Precisión: CV menor o igual al 5%

- Coeficiente de determinación: Mayor o igual a 0,9800

- Especificidad No debe haber interferencia, el

tiempo de retención debe ser
específico del analito.

- Identificación El tiempo de retención del analito

debe ser entre 0,98 y 1,02 del
tiempo de retención del estándar.
• Métodos cromatográficos para cuantificación de impurezas y
sustancias relacionadas

-Exactitud del método: 90,0 % - 110,0% de recuperación

con respecto a valor teórico.

- Repetibilidad: CV menor o igual al 15%

- Precisión: CV menor o igual al 15%

- Coeficiente de determinación: Mayor o igual a 0,9700

- Especificidad No debe haber interferencia, el

tiempo de retención debe ser
específico del analito.

- Identificación El tiempo de retención del analito

debe ser entre 0,98 y 1,02 del
tiempo de retención del estándar.

- Límite de cuantificación: Menor a la especificación

- Límite de detección: Informativo

• Métodos espectrofotométricos para cuantificación de componentes

principales

-Exactitud del método: 98,0 % - 102,0% de recuperación

con respecto a valor teórico.

- Repetibilidad: CV menor o igual al 2%

- Precisión: CV menor o igual al 2%

- Coeficiente de determinación: Mayor o igual a 0,9800

- Especificidad Los blancos de reactivos no deben

dar respuesta significativa.

• Métodos titulométricos para cuantificación de componentes

principales

-Exactitud del método: 98,0 % - 102,0% de recuperación

con respecto a valor teórico.

- Repetibilidad: CV menor o igual al 3%

- Precisión: CV menor o igual al 3%

 - Coeficiente de determinación: Mayor o igual a 0,9800

- Especificidad Los blancos de reactivos no deben

dar respuesta significativa.

Beatriz Adaniya H.