Tema 3

pretratamiento

t Pretratamiento de cultiv
de os
sangre
.
P re f r at am i e n to

?
tutilizadas t me
jores

.
t dificil

anticoagulent
14
I Suspensión

.
- Plo nonúckeo -

Tubo

b
.
Eriy
Concentrar levcocitus 3- centrifugo
-

sdias
-

Elimino sobren
-

Lavamos pleliminar restos

I Lisis de hematies 2

Monocapa
.
- con lisis -

Despegar M
Tratamiento
.M
-

Centrifugo -

cogemos tubo t
buffer
-

Elimino sobren -

Lavamos pl eliminar restos

.
.
-
Leucocitos en el sedimento
2. Aislamiento de leucocitos 3. Pretratamiento de teiidos frescos
.
.
- sangre
Centrifuga
Recupero tabón levco - tejido para liberar

romper
-

- -

; tob s
de geles separadores células
Dificil
.
.
1. H Mecánica
.
- Manual
o auto
4. Pretratamiento Parafina -

Libera enzimas malas

rápido
eliminarla -
Frío
-

- 2. H Química
cortar
.
-

transferir -

t enzimas
betergentes
-

tratamiente enzimático -

Incubar 24-22
h
- k
proteinas
EXTRACCION DEACIDOS NUCLEICOS

- NÜCLEOS P CELULAS
ROMPER
GENETICEV
- QUE SE DEGRADE EL MATERIAL
ITAR
I SOLOLIONES DE LISIS 2. TRATAMIENTO PARA CELULAS CON PARED
.
- Desestabilizan y rompen membranas - Degradacion con enzimas
.
Enzimático:
Detergentes:
.
Lisozimas para gramnt
.
Liticasas
Quelante veg lev hongos
- de ca para cels
yug
EDTA:
.
,
,
Union irreversible aiones
.
Mg es cofactor necesario de DNAsas - Rompen lan pared
Mecárico:
.
EDTA inhibe BNAgaS Ebullicios
.
ciclos
- Enzimas que digieren proteínas ultrasonidos
Proteasas:
.
.
Rompen memb hist enzimas
.
,
,
- Detergente afecta a los azicares
CTAB:
de la pared
.
 PURIFICACION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS

DISOLVENTES ORGANICOS SALES

I

I Eliminación de compuestos que no interesan 7. Precipitación con proteinas

.
.
.
de FI C ALIL sal a la muestra
D i s o l ve n t e

(2 -

Añado
-
2GJ
a)
100 añado F C
Mezcla ALe
centrifogo
-

-
ms
)
15O)
148)
- sobrenadante ADN
centrifugo
-

nod en suspensión Pellet Proteinas

ac.
=
-

.
t P en el pellet
y
-

- sobrenadante
v
.
ESFERAS MAGNETIGAS
2 Precipitación del ABN

- a esferas

Unionain
-

recojo sobrenadante -

Pesca

- etanos -
Añado
Lavamos.
-

Alcohol se deshidrata one al ADN

,
-

Centrifugo
-

Gobrenadante = X

Pellet
- ESTUDIO DE LA CALIDAD ACIDOS
ADN
BE LOS NUCLES

3. Lavado de ADN A INTEGRIDAD

-
Pellet resuspende alcohol - tam
se con
que el mat gen mantenga so
-
Determina
.
- insoloble alcohol Electroforesis
ADN
en
-
.
- soluble
= smear
-
Degradación
.
S,P.L
-

Centrifogo
-

sobrenadante B
-PUREZA
=x
-- =
ADN
Pellet
-

Determina ausencia de contaminantes

4. Resuspensión del ADN

- 2 6 0

1280 nm

- alcohol
ADN
con 1,7 - Z
-

se evapora prot y fenoles

-

Se resuspende con tampón o

aguad - Prot K repito pors
s
.
.
.
,
-

2601 230 nm

d
,5-2.2
Carbo y
Sales

-2 Lavar
mat
.g
-

320 nm

se resta a 260 no
.
CONCENTRACION

Bi =50
nglue (
ngime)
Ho = 33

ARN = 40