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INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES RESPIRATORIAS ISMAEL COSO VILLEGAS

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICO DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE

FEBRERO, 2008

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES RESPIRATORIAS ISMAEL COSO VILLEGAS

Cdigo: NCDPT 06 Rev. 1 Hoja: 1 De: 129

NDICE HOJA I. INTRODUCCIN II. OBJETIVO DEL MANUAL III. MARCO JURDICO IV. PROCEDIMIENTOS 1. MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BANCO DE SANGRE. 2. LAVADO DE MATERIAL 3. METODOS PARA OBTENER MUESTRAS DE SANGRE. 4. FLEBOTOMIAS DE 500 ML. EN BOLSAS COLECTORAS. 5. CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS. 6. DETERMINACION DE GRUPOS SANGUINEOS ABO. 7. DETERMINACION DE GRUPOS SANGUINEOS RH. (D) 8. PRUEBAS CRUZADAS DE COMPATIBILIDAD. 9. IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES. 10. TCNICA DEL DESPEGADO DE ANTICUERPOS 11. ESTUDIOS OBLIGADOS DE HEMODERIVADOS. 12. BRUCELLA. 13. DETERMINACION DEL TREPONEMA PALLIDUM 14. DETERMINACIN DE ANTICUERPOS ANTI-VIH. 15. HEPATITIS VIRAL B 16. HEPATITIS C 17. IDENTIFICACIN DE CHAGAS 18. FRACCIONAMIENTO DE SANGRE V. GLOSARIO DE TRMINOS CONTROL DE EMISIN Elabor: Nombre
DR. LUIS MALDONADO NORIEGA C. LILIANA MORALES SUAREZ

2 3 4 12 13 16 21 24 26 34 39 43 48 62 67 70 75 81 92 102 112 120 128

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LIC. DR. JOS R. DR. ENRIQUE MARGARITA S. VELZQUEZ BALTAZARES DEL VALLE SERRATOS LIPP CASTILLO

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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES RESPIRATORIAS ISMAEL COSO VILLEGAS I. INTRODUCCIN

Cdigo: NCDPT 06 Rev. 1 Hoja: 2 De: 129

El manual de procedimientos tcnicos del Servicio de Banco de Sangre integra las polticas y normas que el personal adscrito a este servicio deber tomar en cuenta para el buen desempeo de las actividades.

La integracin de este documento ha sido logrado con la participacin del titular del mismo y sancionado por el Departamento de Planeacin antes de ser presentado para su aprobacin a la Subdireccin de Servicios Auxiliares de Diagnstico y Paramdicos y posteriormente por la Direccin Mdica.

Este manual deber ser revisado y actualizado peridicamente segn las necesidades del servicio y/o por cambio en los lineamientos dictados por autoridades superiores.

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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES RESPIRATORIAS ISMAEL COSO VILLEGAS II. OBJETIVO DEL MANUAL

Cdigo: NCDPT 06 Rev. 1 Hoja: 3 De: 129

Conducir de forma ordenada el desarrollo de las actividades de servicio de Banco de Sangre. Uniformar criterios en los procedimientos que permitan el correcto desempeo de las actividades. Establecer los mecanismos bsicos para contribuir al objetivo institucional del INER.

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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES RESPIRATORIAS ISMAEL COSO VILLEGAS III. MARCO JURDICO

Cdigo: NCDPT 06 Rev. 1 Hoja: 4 De: 129

Constitucin Poltica de los Estados Unidos Mexicanos. D.O.F. 07-IV-06

LEYES

Ley Orgnica de la Administracin Pblica Federal D.O.F. 02-VI-2006

Ley Federal del Trabajo D.O.F. 17-I-06

Ley Federal de las Entidades Paraestatales D.O.F. 21-VIII-06

Ley de los Institutos Nacionales de Salud D.O.F. 26-V-06 Ref. 22-VI-06

Ley Federal de Responsabilidades Administrativas de los Servidores Pblicos D.O.F. 21-VIII-06

Ley Federal de Presupuesto y Responsabilidad Hacendara D.O.F. 03-05-06

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Cdigo: NCDPT 06 Rev. 1 Hoja: 5 De: 129

Ley Federal de Transparencia y Acceso a la Informacin Pblica Gubernamental D.O.F. 06-06-2006

Ley General de Salud D.O.F. 19-IX-2006

Ley Federal de los Trabajadores al Servicio del Estado Reglamentaria del apartado B del Artculo 123 Constitucional D.O.F. 03-V-06

Ley de Informacin, Estadstica y Geografa D.O.F. 27-12-2006

Ley de Amparo, Reglamentaria de los artculos 103 y 107 de la Constitucin Poltica de los Estados Unidos Mexicanos D.O.F. 24-IV-06

Ley Federal para la Administracin y Enajenacin de Bienes del Sector Pblico D.O.F. 23-II-05

Ley de Planeacin D.O.F. 13-VI-06

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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES RESPIRATORIAS ISMAEL COSO VILLEGAS REGLAMENTOS

Cdigo: NCDPT 06 Rev. 1 Hoja: 6 De: 129

Reglamento de la Secretaria de Salud D.O.F. 12-I-04

Reglamento de la Ley Federal de Presupuesto y Responsabilidad Hacendara D.O.F. 28-VI-06.

Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Prestacin de Servicios de Atencin Mdica. D.O.F. 14-V-1986

Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Investigacin para la Salud. D.O.F. 16-I-1987.

Reglamento General de Seguridad Radiolgica. D.O.F. 22-XI-1988, Aclaracin: D.O.F. 14-XII-1988

Reglamento de la Ley de Informacin, Estadstica y Geografa D.O.F. 24-03-2004

Reglamento de la Ley Federal de Entidades Paraestatales D.O.F. 26-I-1990, Ref. D.O.F. 7-IV-1995

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Cdigo: NCDPT 06 Rev. 1 Hoja: 7 De: 129

Reglamento para la Proteccin de los No Fumadores en el Distrito Federal D.O.F. 6-VIII-1990.

Reglamento Interior de la Secretara de Salud D.O.F. 6-VIII-1997, Ref. D.O.F. 4-VIII-1999

Reglamento de Insumos para la Salud D.O.F. 4-II-1998

Reglamento de Procedimientos para la Atencin de Quejas de la Comisin Nacional de Arbitraje Mdico D.O.F. 29-IV-1999

Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios D.O.F. 9-VIII-1999

Reglamento sobre consumo de tabaco D.O.F. 27-VII-01

CONVENIOS

Convenio relativo a las Estadsticas de las causas de defuncin D.O.F. 23-II-1938 Decreto de Promulgacin y Protocolo de firma.

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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES RESPIRATORIAS ISMAEL COSO VILLEGAS DECRETOS

Cdigo: NCDPT 06 Rev. 1 Hoja: 8 De: 129

Decreto por el que se da a conocer la forma oficial de los certificados de defuncin y muerte fetal D.O.F. 21-XI-1986

Decreto del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias D.O.F. 4-VIII-1988

Decreto por el que se da a conocer en forma oficial el nombre del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias Ismael Coso Villegas D.O.F. 22-VI-2006

Decreto por el que se establece la Cartilla Nacional de Salud de la Mujer D.O.F. 6-III-1998

PROGRAMAS

Plan Nacional de Desarrollo 2007-2012

ACUERDOS DEL EJECUTIVO FEDERAL

Acuerdo por el que se dispone que el Archivo General de la Nacin ser la entidad central y de consulta del Ejecutivo Federal en el manejo de los archivos administrativos e histricos de la Administracin Pblica Federal D.O.F. 14-VIII-1978 CONTROL DE EMISIN Elabor: Nombre
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Acuerdo nmero 71 por el que se crea el Sistema de Capacitacin y Desarrollo del Sector Salud D.O.F. 20-IV-1987

Acuerdo nmero 79 relativo a la aplicacin, instrumentacin y actualizacin del manual para la referencia y contrarreferencia de pacientes y envo de muestras y especimenes

CODIGOS

Cdigo civil para el Distrito Federal en materia comn y para toda la Repblica en materia federal D.O.F. 26-V-1928 y sus reformas.

Cdigo Federal de Procedimientos Civiles D.O.F. 24-II-1943

NORMAS OFICIALES

Norma Oficial Mexicana NOM-168-SSA1-1998 del expediente clnico D.O.F. 14-IX-1999

Norma Oficinal Mexicana para la Prctica de la Anestesiologa NOM-170-SSA1-1998 D.O.F. 1-VII-1994

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Norma Oficial Mexicana NOM-019-SCFI-1993. Seguridad de equipo de procesamiento de datos D.O.F. 20-X-1993

Resolucin por la que se modifica la Norma Oficial Mexicana NOM-168-SSA1-1998 del expediente clnico D.O.F 22-08-2003

Norma Oficial Mexicana NOM-017-STPS-1993, Relativa al equipo de proteccin personal para los trabajadores en los centros de trabajo D.O.F. 24-V-1994 y sus reformas

Norma Oficial Mexicana NOM-002-STPS-1994 relativa a las condiciones de seguridad para la prevencin y proteccin contra incendio en los centros de trabajo D.O.F. 20-VII-1994 y su aclaracin

Norma Oficial Mexicana NOM-019-SCFI-1994 Seguridad de equipo de procesamiento de datos D.O.F.27-III y su aclaracin.

Norma Oficial Mexicana NOM-010-SSAS2-1993, para la prevencin y control de la infeccin por virus de la inmunodeficiencia humana D.O.17-I-1997

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Proyecto de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-040-SSA2-2003 en materia de informacin en salud D.O.F. 04-03-2004

OTRAS DISPOSICIONES ADMINISTRATIVAS

Oficio circular que fija las normas a que se sujetar la administracin de los bienes muebles y el manejo de almacenes D.O.F. 21-VI-1988

LINEAMIENTOS

Lineamientos Generales para la organizacin y conservacin de archivos de las dependencias y entidades de la Administracin Pblica Federal D.O.F. 20-02-2004

Lineamientos Generales para la clasificacin y desclasificacin de la informacin de las dependencias y entidades de la Administracin Pblica Federal D.O.F. 18-08-2003

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IV. PROCEDIMIENTOS

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 1. Medidas de Seguridad en el Laboratorio de Banco de Sangre Rev. Hoja: 13

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1. MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BANCO DE SANGRE

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 1. Medidas de Seguridad en el Laboratorio de Banco de Sangre Rev. Hoja: 14

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MEDIDAS GENERALES 1. Usar bata. 2. Utilizar guantes cuando se maneja sangre y otros lquidos corporales. 3. Lavarse las manos con los guantes puestos y otra vez al quitrselos, e inmediatamente despus del contacto de la piel sana con productos contaminados. 4. Se deben identificar con una etiqueta especial todos los productos que pudieran estar contaminados. 5. Evitar punciones con agujas u objetos punzocortantes. 6. No reinstalar el protector en la aguja despus de haberla autorizado, depositarla en un recipiente rgido. 7. No pipetear con la boca, utilizar perilla o pipeta manual. 8. No maquillarse en el rea de laboratorio. 9. No correr, comer, fumar o llevarse objetos a la boca en el laboratorio. 10. El material contaminado (jeringas, agujas, cajas de Petri, toallas de papel, etc.) previamente identificado con la etiqueta especfica, se deber depositar en un contenedor para ser desechado.

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MEDIDAS PARA LIMPIAR LIQUIDOS CORPORALES

Los lquidos corporales que se hayan derramado en superficies inertes (mesa, lavabo, etc.) deben ser limpiados como sigue:

1. La secrecin o lquido corporal que se haya derramado deber diluirse con desinfectante (de preferencia hipoclorito de sodio concentrado). 2. Se debe retirar la secrecin diluida con desinfectante. 3. Limpiar escrupulosamente con un trapo humedecido, de preferencia en hipoclorito diluido del 0.5% al 1% en caso de utilizar alcohol deber limpiarse varias veces, dado que ste se evapora rpidamente. 4. Utilizar guantes gruesos durante todo el procedimiento.

MANEJO DEL MATERIAL CONTAMINADO

1. Sumergir el material contaminado en desinfectante qumico (por ejemplo en hipoclorito de sodio diluido del 0.5% al 1%, por lo menos durante media hora). 2. Lavar cuidadosamente el material con agua y jabn utilizando guantes gruesos para retirar todas las partculas orgnicas. 3. Someter el material al mtodo de esterilizacin o desinfeccin seleccionado.

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 2. Lavado de material Rev. Hoja: 16

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2. LAVADO DE MATERIAL

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 2. Lavado de material LAVADO DE MATERIAL Rev. Hoja: 17

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La limpieza escrupulosa e impecable del material que se utiliza en el banco de sangre es fundamental, ya que la presencia de restos de jabn o protena en el material puede dar resultados falsos negativos, tanto en pruebas de escrutinios a donadores como en pruebas de escrutinio a donadores como en pruebas de inmunohematologa y control de calidad, con la consecuencia fatal par la vida de los pacientes.

Por esto tenemos que valorar que el trabajo de servicios bsicos es vital para obtener resultados confiables aunque este personal no se encuentre aparentemente tan cerca del paciente.

A Continuacin se presenta en forma de grficas de flujo los pasos fundamentales del lavado de material y su control de calidad.

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 2. Lavado de material Rev. Hoja: 18

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MATERIAL GENERAL
INICIO

Reposo 12 horas . Remojo en agua ms cloro comercial para obtener una dilucin final del 2%

Cepillado con escobilln adecuado al tamao de material al chorro del agua aproximadamente 6 veces .

15 enjuagues a chorro de agua corriente .

Hervir con agua bidestilada 15 a 20 minutos . Verificacin visual de la limpieza.

Clasificacin en canastillas . Clasificacin por tamaos y clase de material en cubetas de acero inoxidable .

Secado en horno a 200C durante 2 horas . Control de calidad . Remojar en detergente de Ph neutro al 2% calentar sin llegar a ebullicin.

Material listo para su uso.

Reposo 12 horas .

FIN

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 2. Lavado de material MATERIAL LIBRE DE HIERRO Rev. Hoja: 19

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INICIO

Remojo en HCL 1N, durante 4 horas .

Enjuague con agua bidestilada desmineralizada de Fe .

Deposito en cubetas plsticas y secado a temperatura ambiente y cubierto con gasa .

FIN

CONTROL DE CALIDAD a. Observar la presencia de residuos o manchas dentro y fuera del material. b. Comprobar la eliminacin de detergente y agentes limpiadores, agregando una gota de solucin indicadora y gah.

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 2. Lavado de material Rev. Hoja: 20

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Jabn lquido neutro .

Agua bidestilada

Prueba de consumo de GAH

Prueba de fenolftaleina

Ph por lote o por cambio de marca.

Ph y conductividad mensual previo enjuague y ltimo enjuague .

Diario material Listo para su uso .

Diario material Listo para su uso .

PRODUCTO

LOTE Y MARCA

CADUCA

PH

GAH

FENOLFTALEINA

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 3. Mtodos para obtener muestras de sangre Rev. Hoja: 21

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3. MTODOS PARA OBTENER MUESTRAS DE SANGRE

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 3. Mtodos para obtener muestras de sangre Rev. Hoja: 22

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Extraccin Capilar:

Se utiliza fundamentalmente en recin nacidos e infantes, para obtener volmenes pequeos de sangre.

El sitio de eleccin en el recin nacido suele ser el taln, mientras que en nios ms grandes y en adultos, se recomienda el pulpejo del dedo o en lbulo de la oreja.

Tcnica:

Se desinfecta la superficie elegida para la puncin con una torunda de algodn empapada en una solucin de alcohol yodado, alcohol etlico o ter (de ser necesario calentar ligeramente la zona para evitar la vasoconstriccin y favorecer la vasodilatacin).

Mediante un movimiento rpido y seguro, dar un pinchazo con una lanceta estril, enjuagando la primera gota de sangre, para despus colectar las siguientes en una pipeta o tubo capilar heparinizado, sin realizar presin.

Extracciones venenosas:

Proporcionan de forma sencilla volmenes suficientes de sangre. Los lugares habituales de extraccin son de las venas del pliegue del codo.

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 3. Mtodos para obtener muestras de sangre Rev. Hoja: 23

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Tcnica:

Despus de colocar un torniquete, se procede a desinfectar la superficie cutnea, realizndose la puncin con una aguja hipodrmica montada en una jeringa de plstico se va tirando lentamente del mbolo, hasta obtener la cantidad necesaria de sangre, posteriormente se retira primero el torniquete y despus la aguja.

Actualmente se emplea tambin el sistema Vacutainer, cuya modificacin consiste en que la aguja tiene doble punta, una en cada extremo, se introduce una de ellas a la vena y la otra est montada en un soporte de plstico, en el cual se introduce un tubo de ensaye al vaco con tapn de plstico, de manera que al empujarlo sea perforado por el otro extremo de la aguja y mediante el vaco, la sangre penetre libremente al tubo. La ventaja de esta tcnica consiste en que es posible la toma sucesiva de varios volmenes de sangre en diferentes tubos, a partir de un mismo paciente, en una sola puncin.

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 4. Flebotomas de 500 ml en bolsas colectoras Rev. Hoja: 24

NCDPT 06 1 De: 129

4. FLEBOTOMAS DE 500ML. EN BOLSAS COLECTORAS

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 4. Flebotomas de 500 ml en bolsas colectoras Rev. Hoja: 25

NCDPT 06 1 De: 129

1. No usar ninguna bolsa si la solucin anticoagulante no est transparente.

2. Identificar la unidad con el paciente.

3. Colocar un torniquete unos tres centmetros por arriba del pliegue del brazo; palpar bien la vena.

4. Se procede a desinfectar la superficie cutnea con torundas con jabn quirrgico, isodine o alcohol.

5. Tomar la bolsa colectora y pinzar el tubo piloto para evitar la entrada de aire contaminado, una vez hecho esto, se quita el protector de la aguja en forma vertical y se realiza la puncin en el rea desinfectada, dar posicin y fijar la aguja con una tela adhesiva, despinzar el tubo piloto para que fluya la sangre hacia la bolsa colectora.

6. Homogenizar el conservador de la bolsa colectora con la sangre.

7. Pesar la bolsa y una vez que tenga el volumen adecuado (para el caso de Baxter, triple ACD, 630 grs.), pinzar la bolsa por el tubo colector y quitar el torniquete al paciente, retirar la aguja y colocar una torunda con alcohol en el sitio donde se puncion, indicar al paciente que doble el brazo y lo mantenga as por 15 minutos.

8. Dirigir la sangre dentro del tubo colector hacia la bolsa, con la pinza rodillo. mezclar y permitir que el tubo se llene nuevamente. Sellar las marcas X sobre el tubo colector colector con un sellador dielctrico para preparar alicuotas numeradas de sangre anticoagulada para tipificacin o pruebas cruzadas.

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 5. Control de calidad de reactivos Rev. Hoja: 26

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5. CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS

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NCDPT 06 1 De: 129

Los reactivos que se utilizan en el Banco de Sangre deben controlarse cotidianamente con clulas y sueros testigos antes de efectuar cualquier prueba como son: grupos sanguneos o pruebas cruzadas, etc. Para dicho control es ideal usar clulas y sueros testigos enviados por el Banco Central de Sangre. Este control consiste en enfrentar los antisueros con clulas control conocidas, y los parmetros a evaluar son especificidad, avidez y potencia.

Material:

Tubos 10x75, pipetas pasteur, gradillas.

Sueros anti-A, anti-AB, anti-B, leticinas anti-A, anti-H, anti-D (Rho), Suero de coombs, albmina bovina.

Clulas conocidas A1, A2, B, O. al 3%.

Clulas sensibilizadas con anti-D al 3%.

Clulas no sensibilizadas al 3%.

Clulas R1r y rr al 3%.

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 5. Control de calidad de reactivos Mtodo: Rev. Hoja: 28

NCDPT 06 1 De: 129

A) Para control de sueros ABO, leticinas anti-A, anti-H.

1. Colocar tres series de cuatro tubos de 10x75 en una gradilla. 2. A la primera serie adicionar 2 gotas de suero anti- A, a la segunda serie 2 gotas de anti-AB, a la tercera serie 2 gotas de suero anti-B. 3. - Adicionar una gota de clulas, A1, A2, B, O, a los tubos de cada serie (Ver fig. 1). 4. Homogenizar y centrifugar 30 seg. A 3000 rpm 5. Leer y reportar en hoja de control de calidad de reactivos (INER-BS-06).

B) Control de Lectinas Anti A1 y Anti H

1. Colocar dos series de dos tubos de 10x75 en una gradilla. 2. Adicionar una gota de anti-A a cada tubo de la primera serie. 3. Adicionar una gota de anti-H a cada tubo de la segunda serie. 4. Adicionar una gota de clulas A1 al primer tubo de las dos series. 5. Adicionar una gota de clulas A2 al segundo tubo de las dos series. 6. Homogenizar y centrifugar a 3000 rpm. (Ver figura 2). 7. Leer y reportar en formato INER-BS-06.

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 5. Control de calidad de reactivos FIGURA 1 CONTROL DE CALIDAD DE SUELOS ABO A1 A2 B O Rev. Hoja: 29

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FIGURA 2 A1

CONTROL DE CALIDAD DE LECTINAS A2

FIGURA3

CONTROL DE CALIDAD DE ANTI-D Y ALBUMINA Rir rr

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A) Para control de Anti-D y albmina.

1. Colocar dos series de dos tubos de 10x75 mm. en una gradilla. 2. A la primera serie, adicionar una gota de reactivo Anti-D (Rho). 3. Ala segunda serie adicionar dos gotas de albmina al 33% (auto T). 4. Al primer tubo de cada serie, adicionar una gota de clulas R1 al 5%. 5. Al segundo tubo de cada serie, adicionar una gota de clulas rr al 5%. 6. Homogenizar, centrifugar a 3000 rpm durante 90 segundos, leer y reportar en la forma BS06 (Figura 3). 7. Para control de sueros de Coombs. (antiglobulina humana) 8. Preparar diluciones del suero de Coombs al doble de la siguiente manera: 9. Numerar tres series de tubos de 10x75 mm. o de 12x75 mm. de la siguiente manera.

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Fig. 4

FILA

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 5. Control de calidad de reactivos Fila S. A. H.: (Suero Antiglobulina Humana) 1. Rev. Hoja: 32

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Coloque en los tubos No. 1 y 2, 6 gotas de suero de Coombs. (Fig. 4), los reactivos sern utilizados de acuerdo al fabricante.

2. 3.

Coloque en el tubo No. 9, 6 gotas de solucin salina. A partir del tubo No. 2, de la primera serie hasta el No. 8, colocar 6 gotas de solucin salina

4.

Mezcle el contenido del tubo No. 2 y pase 6 gotas al tubo No. 3 y as sucesivamente hasta el nmero 8 de donde se descartan 6 gotas.

5. 6. 7.

Del tubo No. 8, pasar con una pipeta limpia 2 gotas de los tubos 8 C. S. y 8 N. S. Saque la pipeta Pase del tubo No. 7, 2 gotas a los tubos 7 CS y 7NS, y del No. 6, a los tubos 6 CS, 6 NS y as sucesivamente hasta los tubos No. 2 CS Y 2 NS.

8.

Con otra pipeta, pase del tubo, No. 1, 2 gotas de suero de Coombs a los tubos (de la serie 1) 1CS y 1CNS.

9.

Cambie de pipeta y coloque del tubo NO. 9, 2 gotas de solucin salina a los tubos de la serie 9.

10. 11. 12. 13. 14.

Agregue a la fila CS, una gota de eritrocitos sensibilizados al 3% a todos los tubos. Una gota de eritrocitos no sensibilizados a la fila CNS. Mezcle cuidadosamente. Centrifugar a 3000 rpm. Durante 30 segundos. Leer y reportar en formato BS-06.

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 5. Control de calidad de reactivos Reportar Rev. Hoja: 33

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Titulo Donde 4+ 3+ 2+ 1+ G = = = = =

Computo 10 puntos 8 puntos 5 puntos 3 puntos 1 puntos

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 6. Determinacin de grupos sanguneos ABO Rev. Hoja: 34

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6. DETERMINACIN DE GRUPOS SANGUNEOS ABO

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1. Fundamento: Los grupos sanguneos son sustancias antignicas que se encuentran en membrana eritrocitaria.

En la actualidad se han descrito ms de 400 antgenos de diferentes sistemas de grupos sanguneos en la membrana eritrocitaria.

Es de primordial importancia la determinacin de la presencia o ausencia de los antgenos del sistema A B O, ya que en este sistema se encuentran de manera natural anticuerpos antitticos a los antgenos eritrocitarios.

Por lo anterior debemos entender que una determinacin correcta de grupos sanguneos debe constar de:

Grupo Directo: Determinacin de los antgenos eritrocitarios con antisueros conocidos, Anti-A, Anti-AB, Anti-B.

Grupo Inverso: Determinacin de anticuerpos antitticos, con clulas de fenotipo conocido, A1, A2, B, O.

TECNICA EN TUBO

Material:

Sueros hemoclasificadores Anti-A, Anti-AB. Eritrocitos de fenotipo conocido, A1, A2, B, O, suspendidos al 5%. CONTROL DE EMISIN Elabor: Revis:
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Tubos de vidrio de 10x75 mm, Pipetas Pasteur, Centrfugas serolgicas, Centrfugas clnicas. Gradillas, soluciones fisiolgicas. (Salina al 0.9%)

Material Biolgico:

(-7) ml. De sangre venosa del paciente sin anticoagulante.

Mtodo:

1. Extraer la sangre por puncin venenosa y colectarla en un tubo de 13x10 sin anticoagulante, dejar que se coagule.

2. Retraer cuidadosamente el cogulo y centrifugar la muestra a 3000 rpm. Durante 5 minutos para separara el suero de los eritrocitos.

3. Colocar en una gradilla 8 tubos en sentido horizontal y colocar 2 gotas de antisueros Anti-A, Anti-AB, y Anti-B en los primeros tres tubos (grupo directo), el cuarto tubo autotestigo AT.

4. Adicionar una gota de eritrocitos al 5% conocidos A1, A2, B, O, en los siguientes cuatro tubos, (grupo inverso)

5. Con la misma pipeta tomar de la muestra del suero sobrenadante de la muestra problema y colocar dos gotas en los tubos A1, A2, B, O, (grupo inverso) y en el tubo nmero 4 autotestigo (AT) fig. 5

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6. Con la misma pipeta preparar una suspensin al 5% de eritrocitos problema con su propio suero o con solucin salina fisiolgica.

7. Adicionar una gota de esta suspensin en los primeros cuatro tubos Anti-A, Anti-AB, Anti-B, y Auto T.

8. Homogenizar suavemente los tubos y centrifugar a 3000 rpm durante 30 segundos.

9. Leer aglutinacin y/o hemlisis.

4+ 3+ 2+ 1+ (+) G

Botn compacto. Botn con Grnulos satlites. Grnulos separados. Grnulos separados ms pequeos. Grnulos ms pequeos. Grnulos muy pequeos.

Prueba Directa

Prueba Indirecta (inversa)

Anti A

Anti AB

Anti B

AT

A1

A2

Gpo Sanguneo

+ +

+ + +

+ +

+ + -

+ + -

+ + -

A B O AB

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 6. Determinacin de grupos sanguneos ABO DETERMINACION DEL GRUPO SANGUINEO ABO ESTUDIO EN ERITROCITO (PRUEBA DIRECTA) ESTUDIO EN SUERO (PRUEBA INVERSA) RESULTADO (GRUPO) Rev. Hoja: 38

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ANTI ANTI ANTI AUTO A AB B T

CEL A1

CEL A2

CEL B

CEL O

AB

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 7. Determinacin de grupos sanguneos RH (D) Rev. Hoja: 39

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7. DETERMINACIN DE GRUPOS SANGUNEOS RH (D)

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 7. Determinacin de grupos sanguneos RH (D) Rev. Hoja: 40

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El siguiente sistema sanguneo en importancia por su frecuencia en la poblacin mundial es el sistema Rh-Hr, el cual consta de ms de 40 antgenos eritrocitarios de los cuales el mosaico CcDEe, reviste mayor importancia. Dentro de estos, el antgeno D (Rho) tiene relevancia porque ste nos permite clasificar a los individuos en Rh positivos cuando esta presente, y Rh negativos cuando est ausente. Una mala tipificacin de este antgeno nos podra provocar una sensibilizacin en un individuo Rh negativo y la probabilidad de que est antgeno provoque una respuesta de anticuerpo es muy alta, est antgeno tambin ha sido asociado con mayor frecuencia en la enfermedad hemoltica del recin nacido.

Material y Equipo:

Tubos de 10 x 75 mm. Gradillas Pipetas Pasteur Aplicadores de madera Solucin fisiolgica Centrifuga sexolgica Centrifuga clnica Suero Anti D (Rho) Control albuminoso

Material Biolgico:

7 ml. De sangre venosa sin anticoagulante.

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 7. Determinacin de grupos sanguneos RH (D) Rev. Hoja: 41

NCDPT 06 1 De: 129

Mtodo:

1. Centrifugar la muestra problema a 3000 rpm. 2. hacer suspensin al 3% de eritrocitos problema con el mismo suero del paciente. 3. Colocar dos tubos de 10 x 75 mm en una gradilla. 4. Al primer tubo debidamente rotulado (D), adicionar una gota de reactivo anti D (Rho) ver fig. 6. 5. Al segundo tubo agregar 2 gotas de control albuminoso (AT). 6. Adicionar a ambos tubos una gota de la suspensin preparada en el punto 2. 7. Homogenizar ambos tubos (D) y /AT) y centrifugar a 3000 rpm, durante 90 segundos. 8. Agitar el tubo suavemente para resuspender el botn formado, observar si existe aglutinacin. 9. Anote sus resultados. 10. Si obtiene una prueba negativa, realizar la prueba D para descartar esta variable.

Variante D dbil

Antes llamado Du. A todas las muestras que den negativos o un positivo muy dudoso, se le debe realizar la prueba de la antiglobulina humana.

1. Agregue una gota de AntiD en un tubo debidamente marcado. 2. Agregar una gota de suspensin al 3% de eritrocitos problema. 3. Mezclar, e incubar el tubo a una temperatura de 37 por 15 minutos, centrifugar a 3000 rpm por 90 seg. Leer. 4. Si el resultado anterior es negativo, lavar 3 veces con solucin salina. 5. Agregar suero de Coombs, homogeneizar, centrifugar a 3000 rpm. Leer. 6. Agregar una gota de eritrocitos sensibilizados al 3% para observar el consumo. 7. Reportar en la forma de grupo sanguneo. CONTROL DE EMISIN Elabor: Nombre
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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 7. Determinacin de grupos sanguneos RH (D) Rev. Hoja: 42

NCDPT 06 1 De: 129

DETERMINACION DE Rho (D) Figura 6 Muestra sin Anticoagulante

Anti- D

Auto testigo Albuminoso

Rh Positivo

Rh Negativo

Rh Negativo

Rh Positivo

(+)

(-)

(-)

(-)

(-)

(-)

(+)

(+)

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 8. Pruebas cruzadas de compatibilidad Rev. Hoja: 43

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8. PRUEBAS CRUZADAS DE COMPATIBILIDAD

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 8. Pruebas cruzadas de compatibilidad Rev. Hoja: 44

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Fundamento:

El objeto de las pruebas cruzadas de compatibilidad, es investigar anticuerpos especficos activos a 37 C en el suero del paciente contra los eritrocitos del donador y viceversa.

La Prueba Cruzada se divide en tres partes:

1. Prueba mayor.- Que contiene el suero del paciente y eritrocitos del donador (D). 2. Prueba menor.- Que contiene el suero del donador y los eritrocitos del paciente. (R). 3. El autotestigo.- Que contiene el suero y eritrocitos del paciente (AT).

Material:

Tubos de 13x100 mm Tubos de 10x75 mm Solucin salina isotnica (0.9%). Suero antiglobulina humana (AGH, suero de Coombs). Albmina bovina al 22%. Bao mara para incubacin a 37C

Material Biolgico:

Sangre del donador. -Todas las bolsas de sangre para transfusin, llevan segmentos de tubos de plstico (pilotos) de la sangre que est en la bolsa, (sangre anticoagulada con ACD CPDA).

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 8. Pruebas cruzadas de compatibilidad Sangre del Receptor: Rev. Hoja: 45

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De 5 a 10 ml de sangre fresca sin anticoagulante en un tubo rotulado con nombre completo del enfermo, expediente, fecha, edad, pabelln, cama y hora de extraccin.

TCNICA

Preparacin:

Centrifugar el tubo del receptor 5 minutos a 3500 rpm., para separar completamente el suero de los eritrocitos del coagulo. Deben de anotarse los datos completos del paciente en la hoja de reporte y anotar sus resultados como se indicar mas adelante y separar el suero en un tubo rotulado con los datos del paciente como se indic anteriormente.

Cortar un segmento del tubo piloto de la bolsa de sangre, pasar todo el contenido de 12x75 mm. y centrifugarlo a 3500 rpm durante tres minutos, este tubo contiene plasma y eritrocitos del donador.

Colocar las 2 o 3 gotas de sangre remanente del tubo piloto en otro tubo de 12x75 mm. y adicionar la solucin salina. Realizar tres lavados por un tiempo de tres minutos a 3000 rpm. Decantando y volviendo a centrifugar. Despus de los lavados, hacer una solucin de eritrocitos al 5% con solucin salina. (Este tubo contiene eritrocitos lavados de la sangre del donador) Colocar en una gradilla 3 tubos de 10x75 mm previamente rotulados como se indica en la figura No. 7.

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Figura 7.

Receptor

Donador

Solucin de eritrocitos al 5%.

Prueba Mayor (D)

Prueba Menor (R)

Autotestigo (T)

Con una pipeta Pasteur colocar 2 gotas de suero del paciente. En el tubo de prueba mayor (D), una gota de eritrocitos del donador previamente lavados. Con otra pipeta Pasteur, colocar 2 gotas de suero o plasma del donador y una gota de clulas o eritrocitos del paciente en el tubo de la prueba menor (R). Colocar con una pipeta en el tubo del autotestigo (T), dos gotas de suero del paciente y una gota de eritrocitos del mismo (paciente). Mezclar perfectamente el contenido de los tubos. Centrifugar durante 30 segundos a 3400 rpm. Leer y reportar en la hoja de anotaciones (SR) salina rpida.

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 8. Pruebas cruzadas de compatibilidad Rev. Hoja: 47

NCDPT 06 1 De: 129

Si en algunos de los tubos (D. R. A. T.) se observa hemlisis o aglutinacin, debe rectificarse de inmediato el grupo sanguneo, tanto del donador como del receptor. Si las lecturas son negativas, continuar con el procedimiento e incubar los tubos (D. R. A.T.) en el bao mara a 37C durante una hora (checar la temperatura cada 5 o 10 minutos). Una vez terminada la incubacin, centrifugue rpidamente todos los tubos durante 30 segundos a 3400 RPM. Leer y reportar los resultados en la hoja de reporte BS-7, BS-5, (Pruebas Cruzadas). Si se observa aglutinacin o hemlisis, la prueba es incompatible, si el resultado es negativo: Lavar los tubos tres veces con solucin salina: decantando y secando despus de cada centrifugacin (tiempo de centrifugacin, 3 minutos a 3400 RPM). Resuspender suavemente el botn (agitando el tubo). Agregar a cada tubo, 1 gota de suero de Coombs (AGH), mezclar y centrifugar durante 30 segundos a 3400 RPM. Leer los resultados y anotarlo en la hoja de reporte (S/C). Si se observa aglutinacin la prueba es incompatible, si es negativa: Adicionar 1 gota de clulas sensibilizadas, centrifugar durante 30 segundos a 3400 RPM. Leer y reportar en la hoja de reporte (CONS)

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 9. Identificacin de cuerpos irregulares Rev. Hoja: 48

NCDPT 06 1 De: 129

9. IDENTIFICACIN DE ANTICUERPOS IRREGULARES

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 9. Identificacin de cuerpos irregulares Rev. Hoja: 49

NCDPT 06 1 De: 129

La deteccin de un anticuerpo y su identificacin constituyen una de las prcticas ms importantes en el campo de la inmunohematologia.

Se le llama anticuerpo irregular porque en contraste con los anticuerpos del sistema ABO, el cual se encuentra regularmente en todos los individuos sanos, estos anticuerpos solo se encuentran en algunos. La incidencia de estos anticuerpos irregulares se ha calculado entre un 0.3 a2%, dependiendo del grupo de individuos examinados y de las tcnicas utilizadas para la investigacin.

La investigacin de anticuerpos irregulares nos sirve para:

1. Aclarar discrepancias sricas en el sistema ABO. 2. En mujeres embarazadas, para detectar anticuerpos que puedan causar enfermedad hemoltica del recin nacido o discrepancias en la prueba cruzada para el momento del parto, en caso de que la paciente requiera ser trasfundida. 3. En el estudio de reacciones hemolticas transfusionales. 4. En el estudio de anemias hemolticas auto inmunes.

Por lo tanto los anticuerpos irregulares sen encuentran como hemolizantes, aglutinantes y sensibilizantes. Aquellos anticuerpos llamados irregulares como Lea , Anti P, Anti M, no estn relacionados ni con transfusiones, ni con embarazos, en cambio los llamados irregulares inmunes como el anti D, anti C, anti F, s lo estn.

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 9. Identificacin de cuerpos irregulares Rev. Hoja: 50

NCDPT 06 1 De: 129

La presencia de anticuerpos irregulares se evidencian a diferentes temperaturas in Vitro y pueden requerir para su observacin, substancias que favorezcan su demostracin como: medios de alta concentracin proteica, medios enzimticos, de baja fuerza inica, con la prueba de la antiglobulina indirecta o suero de Coombs.

La albmina ha sido usada para potenciar la aglutinacin de los glbulos rojos por anticuerpos de la clase IgG. Las soluciones de fuerza inica baja (LISS) acortan el tiempo de incubacin e incrementan la captacin de anticuerpos.

La utilizacin de substancias que contengan enzimas, son tiles para potenciar la reactividad de algunos anticuerpos como los pertenecientes a los sistemas Rh, Lewis, Kidd; pero las enzimas tambin modifican o destruyen otros antgenos como: MNS, Duffy Pr, Xga , Yta, Csa y Cha, propiedad que facilita la identificacin de los correspondientes anticuerpos.

La observacin de la reaccin antgeno anticuerpos se lleva a cabo slo en condiciones ptimas segn la naturaleza del anticuerpo, ( cantidad del reactivo, tcnica apropiada, etc. ) debiendo considerar que cuando se demuestra la presencia de un anticuerpo irregular en el suero de una persona, podemos afirmar que existe un problema, en cambio en caso negativo no se puede asegurar, an en condiciones ptimas, que el paciente pudo haber sido estimulado y producir un anticuerpo en el momento de la investigacin. Por esta razn se debe tener comunicacin entre el servicio clnico y el laboratorio. Para saber si el paciente ha tenido embarazos o ha sido sometido a hemoterapias.

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NCDPT 06 1 De: 129

En la bsqueda de los anticuerpos irregulares fuera del sistema ABO, se emplean varias clulas de grupo sanguneo o a las que se les ha tipificado los siguientes sistemas de grupo sanguneo:

Rh-Hr MN SS P Duffy Kell-cellano Kidd Diego Lewis Lutheran

a) Prueba de Pantalla (Semipanel)

Las muestras de sangre con los siguientes fenotipos como:

PANEL I R1R1, MN, SS, P, Fy (a+b- ), Di (a b), Le ( a-+, b- ) Lub.

PANEL II R2R2, MN, SS, P-Fy ( a-b+ ) KK, JK (a-b+ ) Di ( a- b+ ) Lub.

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NCDPT 06 1 De: 129

PANEL III rr, MN, SS, P, Fy (a+ b+) KK JK (a+ b+) Di (a- b+) Lub.

b) En el caso de que en la prueba de pantalla se obtuvieran resultados positivos se estudiar la especificidad del anticuerpo contra 10 muestras separadas (panel) con las mismas tcnicas que se emplearon en la prueba de pantalla.

Material y Reactivos:

1. 8 ml. de muestra fresca de sangre del problema, de menos de 2 horas de extrada, sin anticoagulante. 2. Clulas de los paneles 1,2,3, al 2% en solucin salina isotnica. 3. Clulas de los paneles 1,2,3, suspendidas al 5% en Buffer de baja fuerza inica ( Liss ). 4. Clulas del panel (10 clulas) suspendidas al 2% en solucin salina. 5. Clulas del panel (10 clulas) suspendidas al 5% en Buffer (Liss). 6. Suero antiglobulina humano (suero de Coombs). 7. Albmina bovina al 22% y/o al 30%. 8. Medio enzimtico (ejemplo, Bromelina). 9. Pipeta Pasteur. 10. Tubos de ensaye de 10x75mm. 11. Bao mara 20C. 12. Bao mara o estufa a 37C. 13. Solucin amortiguadora de baja fuerza inica (Liss).

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NCDPT 06 1 De: 129

Mtodo:

1. Colocar y marcar los tubos de 10x75mm. como se indica en el cuadro No. 1. 2. Poner en cada uno de los tubos de las series I, II, III, 2 gotas de suero problema, ms 1 gota de los eritrocitos correspondientes, suspendidos al 2% en solucin salina. 3. En las serie IV, poner 1 gota de suero, ms 1 gota de eritrocitos, correspondientes, suspendidos al 5% en Buffer de Liss y llevar a cabo la siguiente tcnica:

SERIE I

1. Mezclar y centrifugar 30 a 3400 rpm. Leer aglutinacin y/o hemlisis.

Anotar = sr

2. Colocar todos los tubos a 37C durante 60, centrifugar 30 a 3400 rpm. Leer aglutinacin y/o hemlisis y anotar = S 37C. 3. Al contenido negativo de los tubos, lavarlo 3 veces (tubo lleno) con solucin salina estril, secando los eritrocitos despus de la tercera lavada. 4. Agregar de 1 a 2 gotas (segn instructivo) de suero de coombs. 5. Mezclar, centrifugar 30 a 3400 rpm, leer y anotar = s/coombs. 6. A los tubos negativos, obligatoriamente agregarle 1 gota de eritrocitos testigo coombs positivo. 7. Mezclar, centrifugar 30 a 3400 rpm y leer. 8. Este resultado debe ser positivo = consumo de la antiglobulina humana, (coombs).

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SERIE II

1. Agregar a todos los tubos 1 gota de Bromelina. 2. Mezclar y dejar reposar a temperatura ambiente 15. 3. Centrifugar 30 a 3400 rpm, leer aglutinacin y/o hemlisis, anotar = Br. 4. Colocar todos los tubos a 37C por 15. 5. Centrifugar todos los tubos a 30 a 3400 rpm y leer, anotar = Br 15 = 37C.

SERIE III

1. Agregar a todos los tubos de 2 a 3 gotas de albmina (segn instructivo del proveedor). 2. Mezclar perfectamente. 3. Centrifugar 90 a 3400 rpm. ( segn instructivo del proveedor ) 4. Leer aglutinacin y/o hemlisis, anotar = Ar. 5. Colocar todos los tubos a 37C durante 60, centrifugar y reportar =A 37C 6. Lavar todos los tubos negativos 3 veces con solucin salina y continuar como en la tcnica s/coombs= A Coombs

SERIE IV

1. Colocar todos los tubos 10 a 37C. 2. Centrifugar 30 a 3400 rpm, leer y anotar = Liss 10 37C. 3. Lavar todos los tubos negativos 3 veces con solucin salina y continuar como en la tcnica s/coombs = Liss/coombs.

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Cuadro No. 8 SERIE ERITROCITOS PROBLEMA I ATS ERITROCITOS PANEL No. 1 IS ERITROCITOS PANEL No.2 25 ERITROCITOS PANEL No. 3 35 = Salina

rpida II ATB IB 2B 3B Bromelina III IV ATA ATL 1A 1L 2A 2L 3A = Albmina 3L = Liss =

ATS = Autotestigo en Salina. ATB = Autotestigo en Bromelina. ATA = Autotestigo en Albmina. ATL = Autotestigo en Liss.

Cuando un suero contiene dos o ms anticuerpos, su identificacin puede complicarse. El patrn de aglutinacin del panel se caracteriza por:

1. No define la presencia de un determinado anticuerpo. 2. Todas las clulas del panel o la mayora son aglutinadas. 3. Puede haber variaciones en el grado de aglutinacin, en los diferentes medios. 4. Bajo estas circunstancias se debe considerar que existan: o o Anticuerpos mltiples o bien. Presencia de anticuerpos contra antgenos de alta frecuencia.

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Unas de las tcnicas utilizadas en estos casos son: Absorcin y elucin selectiva.

Absorcin:

La tcnica de absorcin se usa:

1. Para remover anticuerpos y facilitar la identificacin de otro. 2. Confirmar la especificidad (de un anticuerpo).

Las tcnicas de elucin son usadas para confirmar la especificidad de los anticuerpos removidos por absorcin. En este procedimiento las molculas de anticuerpos son liberadas de la membrana del glbulo rojo, ya sea mediante la destruccin del antgeno o cambiando las condiciones que favorecen la disociacin del complejo antgeno anticuerpo.

Existen varias tcnicas de elucin: Por calor, con eter, digitonina acida, congelamiento, xileno y cloroformo.

Interpretacin de resultados:

La interpretacin del panel se hace por exclusin o descarte de posibles anticuerpos, basndose en la no reactividad del anticuerpo con aquellas clulas del panel que poseen determinados antgenos, es decir, si el suero no reacciona con una determinada clula del panel en todas las fases de la prueba.

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Significa que el anticuerpo presente en el suero no est dirigido contra los antgenos presentes en clula. En cambio el anticuerpo tendr especificidad contra el o los antgenos presentes en las clulas que resultan aglutinadas.

Sin embargo es posible llegar a conclusiones errneas, en la identificacin de anticuerpos. Por lo cual para poder determinar la especificidad de un anticuerpo al realizar el panel, lo cual consta de 8 a 10 clulas, por lo menos 3 de ellas que contienen el antgeno correspondiente, deben dar reaccin positiva otras 3 en las cuales el antgeno est ausente, no deben reaccionar.

Si esta regla se cumple, el nivel de probabilidad de certeza es mayor del 95%.

Prueba de la Antiglobunina Humana Directa o Coombs Directo y del Despegado de Anticuerpos

La destruccin precoz de los eritrocitos como en la Enfermedad Hemoltica del Recin Nacido (EHRN), en las reacciones transfusionales hemolticas o en la Enfermedad Hemoltica autoinmune, es debida a anticuerpos (Acs) especficamente dirigidos a Antgenos (Ags), contra los eritrocitos del beb, quien posee Ags heredados del padre y de los que la madre carece. En el segundo caso, los pacientes sometidos frecuentemente a transfusiones de eritrocitos, pueden desarrollar tambin Aloanticuerpos.

Por el contrario en el ltimo de los casos, el paciente afectado por una regulacin defectuosa de su respuesta inmune, es capaz de desarrollar Acs (Autoanticuerpos) contra sus propios eritrocitos.

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Una prueba de laboratorio muy til para demostrar anticuerpos ligados al eritrocito, es la prueba de la antiglobulina humana directa o prueba de coombs directa. Esta cuando es positiva nos indicara solamente la presencia de Acs ligados al eritrocito.

Posteriormente, debe obtenerse al Ac en solucin por medio de las tcnicas del despegado (elusin) para poder estudiar su especialidad. Estas tcnicas se basan en procedimientos fsicos y/o qumicos aplicados al eritrocitos recubierto de Ac y que rompen su unin.

PRUEBA DE LA ANTIGLOBULINA HUMANA DIRECTA (AGHD) O DE COOMBS DIRECTO

Material:

1. Sangre problema anticoagulada con EDTA (EP) 2. Eritrocitos sensibilizados con IgG (testigo positivo de coombs TPC). 3. Eritrocitos no sensibilizados (testigo negativo de coombs TNC) 4. Suero Antiglobulina Humana o Suero de Coombs (SAH)

Preparacin de los eritrocitos:

1. Tome 3 tubos de 13 x 100, en uno coloque 1 gota de EP, en otro 1 gota de TPC y en el tercero 1 gota de TNC. 2. Lvelos con solucin salina isotnica, (SSI), tubo lleno, por 3 veces. 3. Resuspndalos al 2.55 con SSI. 4. Colquelos a 20C mientras prepara el siguiente material.

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Preparar diluciones del suero de Coombs al doble de la siguiente manera:

1. Numerar tres series de nueve tubos de 10 x 75 mm., como se indica en la figura 8.

Donde: SAH= Suero Antihumano EP= Eritrocitos problema TPC= testigo positivo de Coombs TNC= Testigo negativo de Coombs.

FILA S.A.H.:

1) 2) 3) 4)

Coloque en los tubos No. 1 y 2, 8 gotas de suero de coombs. Coloque en el tubo No. 9, 8 gotas de solucin salina. A partir del tubo No. 2 hasta el No. 8, coloque 8 gotas de solucin salina. Mezcle el contenido del tubo No.2 y pase 8 gotas al tubo No.3 y as sucesivamente hasta el No.8 en donde se descartan 8 gotas.

5) 6) 7)

Del tubo No.8, pasar con una pipeta limpia 2 gotas a los tubos 8 EP, 8 TPC y Saque la pipeta.

8 TNC.

Pase del tubo No.7, 2 gotas a los tubos 7 EP, 7 TPC, 7 TNC y del No. 6, a los tubos, 6 EP, 6 TPC y 6 TNC, y as sucesivamente hasta los tubos No. 2 EP, 2 TPC y 2 TNC.

8) 9)

Con otra pipeta, pase del tubo No.2, 2 gotas de suero de coombs a los tubos de la serie 1. Cambie de pipeta y coloque de tubo No.9, 2 gotas de solucin salina a los tubos de la serie 9.

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10) 11) 12) 13) 14)

Agrege a la serie EP 2 gotas de eritrocitos EP al 2.5% a todos los tubos. 1 gota de eritrocitos TPC a la serie TPC y 1 gota de eritrocitos TNC a la serie TNC. Mezcle cuidadosamente. Centrifugue todos los tubos. Lea.

Ejemplo de resultados:

Diluciones del Suero de Coombs

1 1/1 E.P. T.P.C. T.N.C. 4+ 2+ -

2 1/2 4+ 2+ -

3 1/4 3+ 1+ -

4 1/8 2+ (+) -

5 1/16 1+ g -

6 1/32 (+) -

7 1/64 g -

8 1/128 -

9 1/256 -

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Preparacin de Sueros de Coombs Numere tres series de tubos de 10 x 75 mm o de 12 x 74 mm de la siguiente manera.

FILA

S. A. H.

E. P.

T. P. C.

T. N. C.

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10. TCNICA DEL DESPEGADO DE LOS ANTICUERPOS

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TECNICA DEL DESPEGADO DE LOS ANTICUERPOS CON CLOROFORMO (ELUIDO)

Material:

1) El habitual en el laboratorio. 2) Sangre total del problema, anticoagulada con EDTA

Despegamiento con cloroformo

Reactivos:

1) Cloroformo 2) Albmina bovina al 22% 33% 3) Solucin salina isotnica (NaCL 0.9%) (SSI)

Mtodo:

Coloque el volumen necesario de eritrocitos en un tubo de 13 x 100 de acuerdo con la intensidad de la reaccin del coombs directo, (cmputo).

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NCDPT 06 1 De: 129

EJEMPLOS: No.1 COMPUTO No.2 COMPUTO

S/P 2+ 8 4+ 12

1/2 2+ 8 4+ 12

1/4 + 5 3+ 10

1/8 + 5 2+ 8

1/16 (+) 3 + 5

1/32 (+) 3 (+) 3

1/64 g 1 g 1

1/28 0 0

1/256 0 0 = 51 puntos = 33 puntos

La intensidad de la reaccin nos indica, aunque de manera gruesa, la cantidad de anticuerpos pegados al eritrocito. Se necesitar una mayor cantidad de eritrocitos del ejemplo No. 1 que del No. 2 para obtener una cantidad apropiada de anticuerpo despegado, ejemplo: Del No. 1, 0.2 ml. de paquete de eritrocitos y del No. 2, 0.1.

Tcnica:

1) 2) 3)

Lavar 3 veces los eritrocitos problema con SI a 4C. Preparar una solucin de albmina al 6% con solucin salina. En un tubo 13 x 100, poner volumen a volumen la solucin anterior y el paquete eritrocitos lavados. Agregar un volumen equivalente de cloroformo. de

4)

Tapar con tapn de caucho, mezclar vigorosamente por 15 seg., mezclar por inversin durante un minuto.

5)

Destapar con mucho cuidado para que no se proyecte el contenido. Poner el tubo a 56C durante 5 minutos exactos, mezclando constantemente con un aplicador (pipeta pasteure). Centrifugar 5 minutos, pasar el sobrante a un tubo de 12x 75, centrifugar 2 minutos, decantar el sobrante.

6)

Coloque el total del eluido, distribuido equitativamente en los tubos donde se va a probar su especialidad. CONTROL DE EMISIN Elabor: Revis:
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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 10. Tcnica del despegado de los anticuerpos 7) 8) 9) 10) 11) 12) 13) 14) Agrege las clulas de fenotipo conocido al 2.5% en SSI. Incube a 37C de 30 a 60. Lave 3 veces con SSI (tubo lleno). Seque los eritrocitos. Suspndalos suavemente. Agregue el suero antiglobulina humana. Centrifugue y lea aglutinacin. Rev. Hoja: 65

NCDPT 06 1 De: 129

Si los resultados son negativos, agregar una gota de eritrocitos control positivo de Coombs. (Consumo)

Tcnica del Despegado de los Anticuerpos A 45C (Bao Maria)

1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) 9) 10) 11) 12) 13)

Los eritrocitos problema se lavan como en el caso de la tcnica del cloroformo. Agregue la mitad del volumen de eritrocitos de SSI o albmina bovina a 6% en SSI. Mezcle perfectamente bien. Coloque el tubo en un bao mara de 45C durante 20. Agite la mezcla vigorosamente de 4 a 5 veces durante este tiempo de incubacin. Centrifugue la mezcla durante 5 a 4000 R.P.M. Separe cuidadosamente el sobrenadante (Ac eluido o despegado). Recentrifugue el sobrenadante durante 3 a 4000 R.P.M. Decntelo sobre un tubo limpio. Reparta de inmediato y equitativamente todo el eluido en tubos de 10 x 75 12 x 75 mm. Agregue los eritrocitos de fentipo conocido necesario y, Lleve la prueba hasta coombs. Realizar consumo de coombs.

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 10. Tcnica del despegado de los anticuerpos DESPEGADO POR TRICLOROETILENO-CLOROFORMO Rev. Hoja: 66

NCDPT 06 1 De: 129

1) 2)

Lavar 3 veces los eritrocitos problema con SI a 4C. En un tubo de 13 x 100 poner volumen a volumen con solucin salina eritrocitos lavados, agregar igual volumen del reactivo, tapar el tubo, incubar a 37C durante 5 a 10 minutos rotando constantemente con una inclinacin de 45C hasta que se observe la hemlisis total.

3)

Centrifugar 5 minutos, con pipeta pasteure recuperar el sobrenadante procurando no tocar la interfase ni el reactivo porque entonces todo se hemiolizar.

4)

Centrifugar nuevamente por 2 minutos, decantar y realizar el estudio de anticuerpos ( como en el paso No. 5 de la tcnica de cloroformo).

5)

Reportar resultados en INER-BS 18 98.

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 11. Estudios obligados de hemoderivados Rev. Hoja: 67

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11. ESTUDIOS OBLIGADOS DE HEMODERIVADOS

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NCDPT 06 1 De: 129

A todas las unidades de sangre y hemoderivados se les tienen que practicar obligatoriamente las pruebas siguientes:

A. -Prueba serolgica para identificacin de reaginas contra sfilis ( RPR ) B. -Determinacin de Brucella mediante la tcnica de Rosa de Bengala. C. -Prueba serolgica para el antgeno de superficie de la hepatitis B (HbsAg). D. -Prueba serolgica para la determinacin de anticuerpos anti-HIV. E. -Prueba serolgica para la determinacin de anticuerpos anti-HCV.

A continuacin se describir cada una de las tcnicas detalladamente; son en general pruebas de floculacin, aglutinacin e inmunoensayo enzimticos y antes de empezar la ejecucin de cada tcnica es necesario hacer las siguientes consideraciones.

Recomendaciones Generales

Todas las tcnicas son sumamente sensibles y para tener la fiabilidad de los resultados depende en gran parte del correcto cumplimiento de las normas de laboratorio establecidas.

No utilizar reactivos caducados. No mezclar reactivos de diferentes lotes en una serie de pruebas determinadas. Antes de comenzar temperatura ambiente. Reconstruir los reactivos cuidadosamente. Verificar las pipetas y el equipo para una operacin correcta y precisa. las pruebas, esperar 30 minutos para estabilizar los reactivos a

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 11. Estudios obligados de hemoderivados Acerca de las Muestras: Rev. Hoja: 69

NCDPT 06 1 De: 129

1. 2. 3.

Obtener las muestras de acuerdo con las prcticas habituales. Se deben separar lo antes posible las muestras para evitar hemlisis. No usar muestras lipmicas, hemolizadas y que visiblemete presenten contaminacin (bacteriana), si no se puede obtener una muestra fresca, las muestras existentes deben ser clasificadas mediante filtracin.(0.45um).

4.

No se deben utilizar muestras que se hayan congelado y descongelado en mltiples ocasiones.

5.

Toda las muestras y controles de origen humano deben manejarse como potencialmente infectantes.

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 12. Brucella Rev. Hoja: 70

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12. BRUCELLA

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NCDPT 06 1 De: 129

Las brucelas son cobacilos gram negativos. El gnero comprende 3 especies importantes patgenos para el hombre, que se diferencian originalmente sobre la base de sus principales reservorios animales: Cabras y ovejas para B. mellitensis, ganado vacuno para B. abortus y los cerdos para B. suis. Esta divisin ha sido apoyada por diferencias metablicas y antignicas. El hombre se infecta a travs de la ingestin de leche no pasteurizada o de queso, o bin del contacto con los tejidos de animales infectados.

La respuesta inicial de los anticuerpos es la aparicin de IgM, seguida despus de IgG. Las pruebas de aglutinacin se realiza con suspensiones fenoladas de bacilos lisos, muertos por el calor, Se utiliza para esto una cepa normalizada de B. abortus (n 456), que es avirulenta para el hombre; detecta igualmente bien los anticuerpos frente a las tres especies principales.

Interpretacin: Los ttulos superiores de 1:80 se considera una indicacin de la existencia de una infeccin o de una infeccin anterior.

Material y Equipo:

1 placa de vidrio Aplicadores Antgeno de Brucella Abortus Suero control positivo para Brucella Abortus Suero control negativo para Brucella Abortus 1 agitador rotatorio

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Procedimiento:

1. Colocar 1 gota de suero problema en cada divisin de la placa de vidrio, colocar tambin 1 gota de suero control positivo y de control negativo respectivamente. 2. Depositar en el lado opuesto donde est la gota de suero , 1 gota de antgeno de B. Abortus. 3. Con un aplicador, unir las dos gotas de cada divisin y homogenizar la mezcla. 4. Agitar durante 6 minutos a velociada media. 5. Interpretar resultados.

Se utiliza antgeno Brucella Abortus 99 inactivado por calor y fenol en buffer de lactato de sodio y teido con Rosa de Bengala.

Material:

Gradilla Placa-soporte desechable Pipeta-agitador desechable Rotor Cronmetro

Material Biolgico:

Muestra (s) de sangre venosa sin anticoagulante centrifugada y separada en suero y paquete globular.

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NCDPT 06 1 De: 129

Reactivos:

Antgeno rosa de bengala Control positivo (suero) Suero control negativo

Procedimiento:

1. Llevar reactivos a temperatura ambiente. 2. Con ayuda de las pipetas, tomar una gota de suero problema y colocarla en la placa desechable. Hacer lo mismo con cada uno de los controles. 3. Homogenizar perfectamente el antgeno de rosa de bengala y adicionar una gota en la placa desechable que contiene la muestra problema y proceder del mismo modo con cada uno de los controles. 4. Mezclar ambas gotas con la punta de una pipeta desechable. 5. Colocar en el rotor y accionarlo durante 4 minutos 6. Observar, leer y reportar. 7. Interpretacin de resultados. Aglutinacin: Prueba positiva. No Aglutinacin : Prueba negativa

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NCDPT 06 1 De: 129

Interpretacin de resultados para rosa de bengala.

1. Control positivo mas antigeno rosa de bengala. (4+) 2. Control negativo mas antigeno rosa de bengala. ( - ) 3. -6 suero problema mas antigeno rosa de bengala. ( - )

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 13. Determinacin de treponema pallidum Rev. Hoja: 75

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13. DETERMINACIN DE TREPONEMA PALLIDUM

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Determinacin de Treponema Pallidum Sifilis por el Mtodo de Reagina Rapida (RPR).

La sfilis, principal enfermedad venrea del hombre, encausada por la espiroqueta (treponema pallidum) y suele transmitirse por contacto sexual, aunque la entrada estragenital est demostrada. bin

La respuesta inmune a esta invasin se divide en :

1) Anticuerpos reagnicos biolgicamente no especficos. 2) Anticuerpos especficos a treponema pallidum que producen aglutinacin, adherencia inmune, fijacin de complemento.

Para la determinacin de estos anticuerpos existen dos tipos de pruebas: Las no treponmicas (VDRL y RPR) que utilizan como antgenos cardiolipinas sensiblizadas por colesterol para

detectar anticuerpos reagnicos y las treponmicas que s utilizan antgeno o extractos de treponema pallidum para detectar anticuerpos especificos (las ms frecuentes son: la prueba de inmovilizacin de treponema pallidum TPI la prueba de fijacin de proteinas complemetarias de Reiter (RPCF).

Sin embargo hablaremos aqu especficamente de la prueba reagnica de RPR .

Esta prueba se basa en la floculacin visible (macroscpica) del antgeno artificial combinacin de cardiolipina, colesterol, lecitina y colorante en solucin alcohlica estabilizado con cido benzico ante la presencia del anticuerpo en el suero del paciente.

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Material:

Gradilla Placa de reaccin con anillos grabados Pipetas desechables Aguja sin bisel Agitadores Rotor

Material Biolgico:

Muestra (s) de sangre venosa sin anticoagulante, centrifugada y con suero separado.

Reactivos:

Antgeno en suspensin. Control positivo. Suero control negativo. Agitador Rotatorio

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NCDPT 06 1 De: 129

Mtodo cualitativo:

1.

Depositar con ayuda de la pipeta desechable una gota (0.05ml) de suero problema, en un anillo de la placa de reaccin . Se proceder del mismo modo con cada una de las muestras y controles. Extender perfectamente la gota sobre la superficie del anillo.

2.

Aadir con la ayuda de la aguja sin bisel una gota de la suspensin del antgeno una vez homogenizado a cada una de las muestras.

3. 4.

Colocar la placa en el rotor y agitar por un espacio de 8 minutos a 180 rpm. Leer resultado.

Interpretacin de resultados:

Presencia de flculos (grumos)- Positivo. No presencia de flculos (grumos)- Negativo. DIAGRAMA

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Mtodo Cuantitativo:

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Seleccionar los sueros positivos obtenidos en la prueba cualitativa. Colocar en una gradilla 4 tubos de 12X75mm y numerarlos. Agregar a cada uno de ellos 0.5ml de solucin salina. Depositar 0.5ml. de suero problema en el tubo No. 1 y mezclar. Pasar 0.5ml. del tubo No.1 al tubo No. 2 y mezclar. Continuar esta operacin hasta el tubo No.4. Depositar 0.05ml de cada una de las diluciones sobre anillos diferentes de la placa de reaccin . Extender la muestra sobre la superficie del anillo.

8.

Aadir una gota de la suspensin de antgeno , previamente resuspendido utilizando el frasco gotero al que se le ha insertado la aguja sin bisel.

9. 10.

Colocar la placa de reaccin sobre el rotador mecnico a 180 RPM durante 8 minutos. Leer resultados microscpicamente.

Interpretacin:

El ttulo de suero problema ser la ltima dilucin que presente grumos, ejemplo:

Tubo # 1 2 3 4

Dil. Suero 1:2 1:4 1:8 1:16

Resultado positivo positivo positivo negativo

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 13. Determinacin de treponema pallidum El ttulo del suero problema ser 1:8 Rev. Hoja: 80

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NOTA: Las limitaciones del procedimiento sern con : Sueros extremadamente turbios o hemolizados son insatisfactorios para realizar la prueba.

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14. DETERMINACIN DE ANTICUERPOS ANTI-VIH

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Pruebas para detectar la presencia de anticuerpos anti-VIH, por el mtodo de Hemaglutinacin pasiva y el ensayo inmunoenzimtico (ELISA)

Hemoaglutinacin Pasiva

Dicha prueba es un procedimiento sencillo que no requiere de instrumentos especiales para su realizacin; esta prueba utiliza antgeno de VIH obtenido por cultivo del virus en clulas linfoides (VIH I). El virus es inactivado y desintegrado y con el se cubren partculas que actan como soporte (eritrocitos humanos estabilizados, partculas de gelatina). El principio de esta prueba se basa en que estas partculas sensibilizadas son aglutinadas por la presencia de anticuerpos de HIV en muestras de suero o plasma.

Material:

Tubos de 13X100. Pipetas graduadas de 1ml. Micropipeta de 25ml. Puntas para micropipeta. Agitador rotatorio. Placas con fondo en U. Reactivo del Kit en uso.

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Procedimiento:

1.

El kit serodia cuenta con dos viales; uno de partculas control y otro con patculas sensibilizadas, ambos viales vienen liofilizados. Reconstituir ambos frascos con Buffer (reconstituyente). Dejar hidratar durante 30 minutos. (Adicionar el volumen necesario de Buffer de acuerdo a la presentacin del Kit).

2.

Se manejan 3 pozos por cada muestra; se agregan 75 Microllitros de diluyente de muestras en el primer pozo y 25 Microlitros en el segundo y tercer pozo

3. 4.

Agregar 25 Microlitros de muestra al primer pozo. Homogenizar la muestra en el primer pozo y transferir 25 Microlitros al segundo pozo, homogenizar con una micropipeta y transferir ltimos 25 Microlitros. al pozo 3, homogenizar y descartar los

5. 6. 7.

Proporcionar en el pozo 2, 25 Microlitos. de partculas no sensibilizadas. Colocar en el pozo 3,25 Microlitos de partculas sensibilizadas. Homogenizar en un agitador rotatorio durante 5 minutos (a 180 rpm), cubrir e incubar 2 horas a temperatura ambiente (15-25C) en una superficie libre de vibraciones.

8. 9. 10.

Correr un control positivo en cada ensayo. Leer resultados. Registrar nmero de lote del reactivo y fecha de caducidad.

Interpretacin de resultados:

Resultado negativo: Resultado positivo:

Formacin de un botn compacto. Formacin de un Halo (anillo) aglutinado.

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El VIH como cualquier otro agente infeccioso estimula la respuesta inmune provocando la formacin de anticuerpos especficos. Entre los mtodos comunes de detenccin de estos anticuerpos se encuentra el ensayo ELISA . Dicha prueba se basa en la reaccin inmunolgico que se presenta entre un antgeno y su anticuerpo especfico ; el antgeno de VIH se encuentra fijo en una superficie (fase slida), el cual reacciona con el anticuerpo especfico al adicionar alguna muestra seropositiva. Posteriormente se lleva a cabo una segunda reaccin en la cual se adiciona un anticuerpo marcado con una enzima (conjugado), dicho anticuerpo va dirigido al primer anticuerpo; enseguida se adiciona un sustrato el cual desarrolla color para visualizar la reaccin positiva.

Principio de la prueba

HIV Antgeno en fase slida

Anti-HIV Muestra Positiva

(Ig anti-humano)-HRP+ sustrato Anticuerpo marcado con enzima

Material:

Reactivos del Kit en uso. Incubador. Lavador de microtiras. Lector. Micropipetas. (50-200 Microlitos). Puntas para micropipeta. Tubos de 13X100 para muestra. CONTROL DE EMISIN Elabor: Revis:
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PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA

Seguir estrctamente el procedimiento propuesto. Utilizar los controles negativos, positivos y el valor umbral en cada serie de pruebas, para validar los resultados. Seguir estrictamente las normas de laboratorio establecidas:

1. Cuidadosamente establecer la distribucin de las muestras y el plan de identificacin. 2. Preparar la solucin de lavado. (concentrada 10X) 3. Sacar la placa soporte con los mdulos de la bolsa de proteccin. 4. Distribuir directamente sin lavados previos de la microplaca y en serie: 4.1- 80 l. de diluyente en cada pocillo. 4.2- 20 l. de suero control negativo en los pocillos a A - 20 l. de suero valor umbral en los pocillos B1, C1 y D1 - 20 l. de suero contro positivo en el pocillo E1. - 20 l. de la muestra No.1 en el pocillo F1. - 20 l. de la muestra No.2 en el pocillo G1, etc. 4.3 Adicionar dos muestras control interno negativo y positivo

Aspirar y explsar al menos tres veces para homogenizar la mezcla. Tambin es posible, distribuir 100 l. de la muestra previamente diluida 1:5.

5. Cubrir la microplaca con plstico adhesivo. Apretar firmemente sobre toda la microplaca para asegurar una firme adhesin. 6. Incubar la microplaca en un bao mara a 40C 1 durante 30 minutos 5.

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7. Quitar el plstico adhesivo. Aspirar el contenido de los pocillos a un recipiente de residuos desechables ( contenido hipoclorito sdico ), aadir 0.3 l. de la solucin de lavado en cada pocillo. Aspirar otra vez. Repetir este procedimiento dos veces ( ej. un total de 3 lavados ), a continuacin secar la microplaca volteando hacia abajo sobre papel absorvente. Si se utiliza un lavador automtico, seguir el mismo procedimiento. 8. Distribuir 100 l. de la solucin de conjugado en todos los pocillos. Agitar el frasco del conjugado antes de utilizarlo. Cubrir con un plstico adhesivo nuevo e incubar durante 30 minutos a 40C 1. 9. Quitar el plstico adhesivo, vaciar todos los pocillos por aspiracin y lavar cuatro veces como se indica en el prrafo No. 7. A continuacin secar la microplaca volteando hacia abajo sobre un papel absorbente. 10.Preparar la solucin de substrato justo en el momento de usarlo. (Una tableta de OPD en 10ml de Buffer). Esta solucin no deber exponerse a la luz directa, y no usarla despus de 10 minutos. 11.Evitando la luz directa distribuir rpidamente 100 l. de la solucin de revelado (preparada en el punto 10), en todos los pocillos. Dejar que se desarrolle la reaccin en un lugar oscuro durante 30 5 minutos a temperatura ambiente. (18-25C)

No utilizar el plstico adhesivo durante esta incubacin.

12.Aadir 50 l. de la solucin de parada (H2SO44N) utilizando la misma secuencia de distribucin a la empleada para la solucin de revelado.

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13.Secar cuidadosamente la base de la microplaca. Realizar la lectura de las densidades pticas a 492/620 nm, utilizando un lector de microplacas dentro de los 30 minutos despus de la parada de la reaccin (los mdulos se debern mantener fuera del alcance de la luz intensa antes de la lectura). 14.Verificar todos los resultados y la correspondencia entre la lectura y la distribucin de la muestra y el plan de identificacin. 15.Guardar registro de lecturas.

OBSERVACIONES

Precauciones:

EVITAR LA CONTAMINACION DURANTE EL ENSAYO


EN CASO DE CONTAMINACION (derrames, generales...) Los derrames no cidos, se debern limpiar a fondo con solucin de hipoclorito sdico a 5%. Los derrames cidos, se debern limpiar en seco. El rea derramada se deber limpiar con una solucin de hipoclorito sdico al 5%. El material utilizado para limpiar, se deber desechar en un contenedor para material contaminado y desechar de acuerdo con las normas de seguridad establecidas. NUNCA USAR EL MISMO CONTENEDOR PARA DISTRIBUIR EL CONJUGADO Y LA SOLUCION DE REVELADO. RESPETAR EL NUMERO DE CICLOS DE LAVADO PRESCRITOS. CONTROL DE EMISIN Elabor: Nombre
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VERIFICAR LA SOLUCION DE REVELADO ENZIMATICA. (tampn sustrato y cromgeno) ANTES DE DISTRIBUIR deber estar incolora , a lo mximo amarillo plido.

La aparicin de un color amarillo-naranja a los pocos minutos despus de la reconstitucin, indica que el reactivo no puede utilizarse y se deber reemplazar.

El tampn sustrato, el cromgeno, la solucin de revelado y la solucin de parada, pueden contaminarse por iones metlicos.

Por esta razn, es preferible utilizar contenedores y equipos de distribucin de plstico o vidrio, previamente lavados con cido clorhdrico 1N y enjuagados cuidadosamente con agua destilada y secados.

CALCULO E INTERPRETACION DE RESULTADOS

La presencia o ausencia de anticuerpos frente a VIH-1 y/o VIH-2, se determina comparando la lectura de absorbancias para cada muestra contra el Valor Umbral calculado.

1) Calcular la media de absorbancias del Suero Control del Valor Umbral: DOR4 = DO (B1)+DO (C1)+DO (D1) 3

2) Calcular el Valor Umbral El Valor Umbral viene dado por

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Valor umbral = DO 10

= V.U.

3) Validacin de la prueba El suero control Negativo, deber ser inferior al 70% del Valor Umbral:

D.O. (Control Negativo)< 0,7 V.U

La medida del Suero Control Valor Umbral, deber ser superior a 0.6:

DO > 0,6

El Valor D.O. Control pos fuerte / D.O. DO de V.U deber ser igual o superior a 1.3:

DO > 1,3 DO

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4) Interpretacin de los resultados

Las muestras con un valor de absorbancias inferiores al Valor Umbral, deben considerar negativas por la prueba de GENELAVIA MIXT.

Los resultados con un valor justo inferior al Valor Umbral: D.O. VU - 10% < D.O. UV, debern ser interpretados con mucha precaucin y a las muestras correspondientes, se les repetir la prueba en duplicado.

Las muestras con valor de absorbancias igual o superior al Valor Umbral, inicialmente se consideran positivas por la prueba GENELAVIA MIXT. Se deber repetir la prueba por duplicado antes de emitir el resultado final.

Si despus de repetir una muestra, los valores de absorbancias de la prueba por duplicado son inferiores al Valor Umbral, el resultado inicial no es considerado reproducible y la muestra se declara como negativa.

Reacciones no reproducibles son a menudo causadas por: Lavado insuficiente Contaminacin de las muestras negativas por sueros con un ttulo alto de anticuerpos. Contaminacin de la solucin de revelado por agentes oxidantes (leja, iones metlicos, etc..) Contaminacin de la solucin de parada.

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Si despus de repetir, las absorbancias de uno de los duplicado es igual o superior al Valor Umbral, el valor inicial es reproducible, y la muestra se declara positiva. Un resultado negativo indica que la muestra ensayada no contiene anticuerpos VIH.

REALIZACION

La sensibilidad de HIV-1 es 100% para 300 pacientes diagnosticados de SIDA y con complejos de SIDA (ARC).

La sensibilidad para HIV-2 es 100% para 67 muestras confirmadas por Western Blot.

La sensibilidad de HIV-1 subtipo 0 es 100% para 9 muestras.

La especificidad es 99.82% (5545/5555) en una poblacin de donantes. No ha sido observada en muestras hemolizadas o pacientes con otras enfermedades virales o autoinmunes.

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15. HEPATITIS VIRAL B

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Hepatitis Viral

Introduccin y Fundamento:

La Hepatitis Viral es una de las enfermedades en las que se desarrolla un cuadro clnico comn , pero los agentes causantes son etimolgicamente y epidemiolgicamente distintos.

Los diferentes tipos de Hepatitis tienen importancia significativa en la salud pblica, no solo en trminos de morbilidad y mortalidad, tambin en trminos de consecuencias econmicas (CDC de ATLANTA).

La Hepatitis B ha sido reconocida y estudiada desde los 40S y en el laboratorio es diagnosticada por pruebas serolgicas especficas. El agente causal es un virus con ADN de filamento doble y miembro de la familia Hepadnaviridae, mide 40nm.

El VHB posee una parte central que es el corazn , rodeado de una cubierta viral que contiene la protena de superficie el Ag HBS. El ADN viral y una Polimerasa participantes en su replicacin se encuentran dentro del Ncleo. La transmisin ocurre, en especial por va parenteral o sexual.

La Hepatitis B puede presentarse como aguda o crnica. Se calcula que 50 a 60% de los individuos infectados se mantienen asintomticos, mientras que el resto presenta signos clnicos de hepatitis aguda. Los pacientes con sntomas ms importantes en la fase aguda pueden

presentar una respuesta inmunitaria ms exitosa que provoca la eliminacin del virus.

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La mayora de los pacientes que desarrollan hepatitis B crnica presentan una enfermedad inicialmente asintomtica o relativamente leve. Es por eso la importancia de conocer e interpretar los marcadores del VHB en el laboratorio desde el punto de vista clnico. (Para llegar a un diagnstico).

HBsAG es la protena predominante de la cubierta viral, presente en suero indica infeccin viral aguda crnica. Puede ser detectado en suero 30 a 60 das despus de la exposicin al virus es el primer marcador serolgico, precede a los sntomas. Alcanza una concentracin mxima durante los estados agudos de la infeccin por hepatitis B despus declina, de manera gradual a niveles no perceptibles en un lapso de cuatro a seis meses en infecciones de curacin espontnea.

El HBeAg se libera durante periodos de replicacin viral activa y se relaciona con aumento de infectividad. Aparece simultneamente con el HBsAg y disminuye justo antes de que se reduzcan los ttulos de HBsAg. Cuando el resultado de la prueba de HBeAg es positivo , el riesgo de transmisin perinatal es de 75 a 90%, sin embargo existe un riesgo de 5% cuando el resultado es negativo.

El antgeno (HbcAg), es un componente protenico de la (nucleocpside) y se encuentra cubierto por el HBsAg, no penetra en suero y no se cuenta con alguna prueba comercial para determinarlo. El husped , al reconocer al HBcAg como extrao producir anticuerpos

especficos IgM contra esta protena (ANTI-HBc).

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El ANTI-HBc

IgM es el primer parmetro serolgico visible de la respuesta inmunitaria del

husped contra el VHB y suele presentarse entre la 6 y 10 semana despus de la infeccin inicial. Por lo que se le considera un indicador de Hepatitis Aguda y desaparece despus de la recuperacin.

El ANTI Hbc IgG, aparece despus y es visible indefinidamente. El ANTI Hbc IgG es el mejor indicador de una exposicin previa con el VHB y sobre todo es de suma importancia durante el perodo de VENTANA ya que se ausenta el HBsAg de circulacin y por lo tanto se le considera como un indicador de previo contacto.

El ANTI Hbs los anticuerpos especficos contra el HBs Ag se forman unos seis meses despus de la infeccin inicial. En un porcentaje reducido de pacientes (5 a 15%) no se presenta anti HB. Estos anticuerpos tambin se forman como respuesta a la vacuna de Hepatitis B y podra persistir despus de una inmunizacin con gamaglobulina inmune.

Podemos resumir, la presencia de HBsAg y ANTI HBc-IgM son indicadores de una infeccin aguda causada por el VHB.

La prdida de HBsAg y HBeAg y la presencia de anti Hbs son indicadores de inmunidad. Los individuos no inmunizados contra el virus y expuestos al VHB, incluida la exposicin a piquete de aguja, maternoneonatal y sexual deben recibir una combinacin de inmunoterapia pasiva y activa. La inmunoglobulina de hepatitis B (HBIG) debe administrarse lo antes posible durante los siete das despus de la exposicin y de nuevo a los (14 a 30 das, junto con la administracin de la vacuna de hepatitis B.

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Principio y Procedimiento Microplaca sensibilizada con un anticuerpo monoclonal

Lavar la placa. Dispensar 100 ul. de muestras y controles. Dispensar 50 ul. de conjugado. Incubar por 90 minutos a 40C Lavar 5 veces.

Dispensar 100ul de solucin reveladora. - Incubar 30 minutos en la oscuridad. - Dispensar 50 microlitos de H2SO4 4N

Leer a 492/620 nm.

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 15. Hepatitis Viral B MTODO Rev. Hoja: 97

NCDPT 06 1 De: 129

Tres mtodos para la deteccin de Ags HB son disponibles.

Para cada mtodo 1,2 3 el procedimiento es el siguiente:

1. 2.

Preparar la solucin de lavado Tomar de la bolsa el nmero de tiras necesarias, las restantes dejarlas dentro de la bolsa y sellar.

3.

Llenar los pozos con 370ml. de solucin de lavado. 3.1 Aspire el contenido de los pozos dentro de un recipiente. 3.2 Repita el procedimiento una vez ms y seque la placa sobre papel absorbente. 3.3 Si se emplea sistema de lavado automtico, realizar los mismos ciclos de lavado.

4.

Distribuir los pozos en el siguiente orden: Pozos A1, B1 C1 y D1: 100 microlitros de control negativo. Pozos E1 y F1: 100 microlitros de control positivo Pozos G1, H1, etc.: 100 microlitros de muestras no conocidas.

5.

Distribuidas 50 microlitros de solucin de conjugado en los pozos, cubrir con un tira adhesiva.

6.

Mtodo 1.- Incubar por 90 minutos a 40C en bao mara. Mtodo 2.- Incubar por 90 minutos a 40C en un incubador seco con agitacin. Mtodo 3.- Incubar por 45 minutos a 40C en un incubador seco con agitacin.

7. 8. 9.

Remover la tira adhesiva y vaciar los pozos lavar 5 veces como indica en el punto 3. Preparar la solucin de desarrollo enzimtico unos minutos antes. Dispense 200 microlitros de la solucin de desarrollo en cada pozo, incubar 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.

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10. 11.

Adicionar 50 microlitros de solucin de paro 4N en cada pozo. Leer la placa a una densidad ptica de 492/620 nm. dentro de los 30 minutos siguientes de la interrupcin de la reaccin.

12.

Guardar registro de resultados.

Segn Tcnica del Fabricante

Material y Equipo:

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Reactivos del Kit en uso. Lavador de Microplacas. Micropipeta para toma variable. Punta para Micropipetas. Incubadora para 40C. Lector de tiras Microelisa. Impresora

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 15. Hepatitis Viral B CALCULO E INTERPRETACION DE RESULTADOS Rev. Hoja: 99

NCDPT 06 1 De: 129

1.

Calcular el promedio de la densidad ptica de los controles negativos: DO EJEMPLO:

Control negativo D.O.

1 2 3 4

0.010 0.011 0.012 0.015

D.O TOTAL = 4

0.048 = 0.012 = D.O. 4

2.

Calcular el promedio de la densidad ptica de los controles positivos D.O. EJEMPLO:

Control positivo D.O.

1 2

0.980 0.964

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Hoja: 100 De: 129

D.O TOTAL = 2

1.944 = 0.972 =D.O 2

3.

Calcular el valor de corte. Para cada mtodo el valor de corte es igual a : D.O + 0.025 EJEMPLO: D.O = 0.012 VALOR DE CORTE = 0.012 + 0.025 = 0.037

4.

Condiciones de validacin de la prueba.

Todos los valores de los controles negativos deben ser menores que 0.100 unidades de densidad ptica.

Si el valor promedio de los controles negativos (D.O) es mayor que 0.010, es posible eliminar cuando ms un valor aberrante cuando el valor se desva ms de un 40% con respecto al valor promedio.

Si el valor promedio de los controles negativos (D.O) es menor igual a 0.010, todos los valores individuales de control negativo deben estar dentro del intervalo de -0.005 a +0.005 promedio. Es posible eliminar cuando ms un valor aberrante. del

Cuando el valor aberrante se ha eliminado, calcular nuevamente el valor promedio de los controles negativos (D.O) con lo otros tres valores.

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Hoja: 101 De: 129

El valor promedio de los controles positivos (D.O) deben ser mayor 0.400 para los mtodos 1 y 3 y mayor que 0.800 para el mtodo 2.

5.

Interpretacin de resultados. Muestras con una densidad ptica menor que el valor de corte son negativos. Muestras con una densidad ptica mayor igual que el valor de corte son positivas.

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Hoja: 102 De: 129

16. HEPATITIS C

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Hoja: 103 De: 129

La primera vez que se identific el virus de hepatitis C (VHC), cuya clasificacin formal es no A, no B, fue en 1988. Existen dos clases, siendo la ms comn la encontrada en sangre que se relaciona en forma estrecha, con transfusiones.

Tambin se describi una variedad existente en agua y se le relaciona con epidemias en India, Asia y Amrica Central. Desde el punto de vista epidemiolgico, el VHC ocasiones se le denomina hepatitis entrica o VHE. semeja el VHA y en

Los anticuerpos aparecen entre el primero y tercer mes del surgimiento del antgeno HCaG. La infectividad es reducida por contacto personal, razn por la que se le relaciona, en especial , con transfusin sangunea. El periodo de incubacin vara entre dos semanas y seis meses. las pruebas que en forma directa identifican el virus estn en desarrollo pero encuentran el

obstculo de resultados falsopositivos y falsonegativos desproporcionados.

Antigeno Codificado del Virus de la Hepatitis C (Recombinantes c22-3, c200y NS5), ORTHO

En el sistema de prueba ELISA ORTHO HCV 3.0, se utilizan tres antgenos recombinantes codificados del virus de la hepatitis C. Los tres antgenos recombinantes, desarrollados por Chiron Corporation , son los c22, c200 y NS5.

Procedimiento de la Prueba - Incubacin ESTANDAR:

1. Treinta minutos antes del comienzo del procedimiento, aproximadamente, deje que

los

componentes del equipo adquieran la temperatura de la habitacin ( de 15 a 30C ). Voltee suavemente los reactivos varias veces, pero evite que se forme espuma. temperatura del incubador: mantngala a 37C + 1C. CONTROL DE EMISIN Elabor: Nombre
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Compruebe la

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Hoja: 104 De: 129

2. Determine el nmero total de micropocillos necesarios para el ensayo. Adems de las muestras, en cada placa o en cada placa parcial, se deber incluir un sustrato blanco, tres controles negativos y dos controles positivos. Si no se necesita la tira entera, puede separarse el nmero adecuado de pocillos que se vayan a utilizar. Los pocillos que no se utilicen debern almacenarse entre 2 y 8C en la bolsa de aluminio que se suministra, con desecante, firmemente sellada y habrn de usarse dentro de los cuarenta y dos das siguientes a la apertura de la bolsa de aluminio. Anote en el espacio destinado para ello en la bolsa de aluminio la fecha en la que se abre la misma y la fecha de caducidad de los pocillos que no se usen. La realizacin de la prueba en una placa ms pequea que la placa entera se permite

siempre y cuando se cumplan las siguientes condiciones:

Las tiras de micropocillos de diferentes placas pueden mezclarse para formar placas completas o parciales siempre y cuando pertenezcan a un mismo lote, no hayan caducado y provengan de placas que han demostrado con anterioridad una respuesta adecuada a los controles del equipo.

Al ensamblar una placa que contengan tiras de una placa recin

abierta y que no se ha

ensayado con anterioridad, deber colocarse una de estas tiras al comienzo de la placa y realizar todos los controles del equipo

ADVERTENCIA: Manipule las tiras de los micropocillos con cuidado. No toque la superficie exterior del fondo de los pocillos. NOTA: Una vez comenzado el ensayo , todos los pasos han de completarse en orden.

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Hoja: 105 De: 129

3. Monte las tiras de micropocillos en el soporte para tiras Las tiras han de estar niveladas en dicho soporte. Aada tiras de micropocillo negras o sin recubrir completa. para formar una microplaca

4. Prepare una ficha en la que se identifique la disposicin de los controles y de las muestras en los micropocillos. Disponga los pocillos de control de ensayo de forma que el pocillo 1A sea el sustrato blanco. Partiendo del pocillo 1A, disponga todos los controles en una configuracin horizontal o vertical, tal y como se indica a continuacin . Esta configuracin depender del soffware.

Pozo 1A

Sustrato Blanco Control Negativo Control Negativo

Control Negativo Control Positivo Control Positivo

5. Aada los controles y las muestras a los micropocillos. Compruebe que el equipo dispensador es capaz de pipetear los volmenes especificados y las diluciones apropiadas tal y como se indican en el procedimiento. Verificar visualmente los pocillos despus de la dispensacin de muestras y sueros de control. Un cambio de color marrn grisceo hacia verde es indicativo de que la muestra o el control ha sido correctamente dispensado en el pocillo. Si no se observa ningn cambio de color el resultado correspondiente a esa muestra o control ( ser invalidado y se le realizar un nuevo ensayo.

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 16. Hepatitis C Para la Adicin de una Muestra Directa: Rev.

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Hoja: 106 De: 129

A) Al utilizar instrumentos automticos para dispensar los controles y las muestras al micropocillo, siga las instrucciones del fabricante para lograr los volmenes y las diluciones precisas.

Cuando se dispensen los controles y las muestras manualmente, debern llevarse a cabo los siguientes pasos:

I) II) III)

Aada 200 l de Diluyente de la Muestra a todos los pocillos, excepto al 1A. Aada 10 l de los controles a los pocillos correspondientes. Aada 10 l de cada muestra de suero o plasma que se vaya a ensayar a los pocillos correspondientes.

IV)

Coloque el soporte para tiras de micropocillos en un agitador de placas para que se mezcle durante 5 10 segundos a menos que utilice el Aparato Automtico Dilutor/Pipeteador ORTHO o material equivalente. El agitador deber utilizarse a una velocidad lenta o moderada , teniendo cuidado de no producir salpicaduras con el contenido de los pocillos de prueba.

Para la adicin de Muestras Prediluidas:

A. Aada 300 l de Diluyente de Muestras a un tubo o recipiente. B. Aada 15l de control de la muestra al tubo. Mzclelo a fondo. C. Transfiera a 210 ml de cada muestra o control , diluidos previamente, al pocillo correspondiente.

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Hoja: 107 De: 129

6. Tape la microplaca con adhesivos de placas e incube a 37C + 1C durante 60 minutos + 5 minutos. 7. Nivele las tiras en el soporte. Utilizando un dispositivo aspirador/lavador, aspire y lave todos los pocillos cinco veces consecutivas con Tampn de Lavado (1X).

ADVERTENCIA: El seguimiento escrito del procedimiento de lavado descrito es crucial para asegurar la realizacin ptima de la prueba. Siga los pasos que se citan con objeto de asegurar un lavado a fondo.

a) Aspire las soluciones de muestra de los micropocillos y proceda a llenarlos con Tampn de lavado (1X). No deje que los pocillos rebosen. Deje transcurrir 20 segundos , aproximadamente, desde el momento en que aada el Tampn de Lavado hasta la aspiracin siguiente.

b) Realice la secuencia completa de aspirado y llenando otras cuatro veces.

c) Aspire los pocillos de manera completa. Dle la vuelta a la placa y golpee firmemente sobre una toallita de papel limpia para eliminar el exceso de Tampn de Lavado.

8. 9.

Aada 200l de Conjugado a todos los pocillos, incluir al 1A Tape el soporte de tiras de micropocillo con adhesivo de placas nuevo e incube a 37C + 1C durante 60 minutos + 5 minutos.

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10.

Prepare suficiente Solucin de Sustrato aproximadamente 10 minutos antes de que termine la segunda incubacin . Djese transcurrir el tiempo suficiente para que las pastillas de OPD se disuelvan adecuadamente. No es correcto utilizar ms de una preparacin de Solucin de Sustrato en una misma placa.

11. 12. 13. 14.

Tras la segunda incubacin , lave los pocillos tal y como se describe en el paso 7. Aada 200l de solucin de Sustrato a todos los pocillos, incluso el 1A. Incube a la temperatura ambiente y en la oscuridad durante 30 minutos + 1minuto. Aada 50l de cido sulfrico (H2SO4) 4N a todos los pocillos, incluido el 1A. El cido ha de aadirse mediante un chorro enrgico y constante poniendo especial cuidado para no producir salpicaduras entre pocillos.

15.

Si existiera humedad, limpie cuidadosamente el fondo de las tiras con un papel absorbente y suave para eliminarla antes de la lectura. Asegrese de que las tiras estn niveladas en su soporte. Lea la placa con una longitud de onda de 490 492nm. En el caso de lectores de longitud de onda duales, ajuste la longitud de onda de referencia 620 630 nm. Ajuste el blanco de lectura en el pocillo 1A de acuerdo con las instrucciones del fabricante del aparato.

16.

Registrar el nmero de lote de los reactivos utilizados y la caducidad de los mismos en la bitcora.

NOTA: Las microplacas han de leerse dentro de los 60 minutos que siguen a la dispensacin del cido sulfrico 4N. Las placas han de conservarse en la oscuridad hasta que sean ledas.

Importante: Al final de cada jornada, limpie el aparato aspirador/lavador con agua destilada o desionizada (aproximadamente fabricante del aparato. 500ml) siguiendo las instrucciones recomendadas por el

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Hoja: 109 De: 129

Procedimientos de Control de Calidad -Incubacin ESTANDAR 20,21.

1. Criterios de Aceptacin del Sustrato Blanco.

Se considera que

una placa es vlida con

respecto al sustrato blanco si el valor de absorbancia del pocillo con el Sustrato blanco (pocillo 1A) es mayor o igual a -0,020 y menor o igual a 0,050.

2. Criterios de Aceptacin del Control Negativo.

a) Los valores individuales del control negativo deben ser menores o iguales a 0,120 y mayores o iguales a -0,005 son vlidas y debern ser redondeadas a 0,000 para los clclos. Si uno de los tres valores control se encuentran fuera de alguno de estos lmites, recalcle el volor medio del control negativo basndose en los dos valores control aceptables. La placa no ser vlida y habr de repetirse la prueba si dos o ms de los tres valores control se encuentran fuera de alguno de los lmites.

b) Halle la media de los valores del control negativo. Ejemplo: Control Negativo 1 2 3 Absorbancia Total = Absorbancia 0,010 0,030 0,020 0,060

NCX = Absorbancia Total = 0,020 3

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Hoja: 110 De: 129

3. Clculo del valor de la lnea de Corte (Cutoff) Valor de la lnea de Corte = NCx + 0,600 Ejemplo:

Control Negativo 1 2 3 Absorbancia Total =

Absorbancia 0,010 0,030 0,020 0,060

NCX = Absorbancia Total = 0,020 3

Valor de la lnea de Corte = 0.020 + 0.600 = 0.620

4. Criterios de Aceptacin del Control Positivo.

El control positivo se utiliza para verificar que los compontentes del Kit son capaces de detectar una muestra reactiva, siempre que se haya seguido estrctamente el procedimiento del ensayo. Una placa se considera vlida con respecto al control positivo si el valor de ambos controles

positivos es mayor o igual a 0.800 y no dfieren entre s ms de 0,600. Cualquier otro resultado para el control positivo es considerado invlido. NOTA: Los resultados por encima del lmite superior del lector pueden aparecer como OVER, *** O .

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Hoja: 111 De: 129

1. Las muestras con valores de absorbancia menores de -0,025 debern ser sometidas de nuevo a la prueba en un nico pocillo. La prueba deber considerarse no reactiva si el valor de absorbancia en la repeticin de la prueba es inferior a 0,025.

2. Las muestras con valores de absorbancia inferiores al valor de la lnea de corte se considera negativos (no reactivos). No es necesario hacer ms pruebas.

3. Las muestras con valor de observancia superiores o iguales al valor de la lnea de corte se consideran inicialmente reactivas y debern ser sometidas a una nueva prueba por duplicado antes de hacer una interpretacin definitiva.

4. Al someter de nuevo a ensayo una muestra inicialmente reactiva, dicha muestra se considerar repetidamente reactiva para el anticuerpo frente al HCV si alguno o los dos

valores de la prueba duplicada es (o son) reactivo (s), es decir mayor(es) o igual(es) al valor de la lnea de corte.

5. Tras la repeticin de la prueba para una muestra inicialemte reactiva, dicha muestra se considerar no reactiva para el anticuerpo frente al HCV si ambos valores de la prueba por duplicado son negativos, es decir, inferiores a la lnea de corte.

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 17. Identificacin de Chagas Rev.

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Hoja: 112 De: 129

17. IDENTIFICACIN DE CHAGAS

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Hoja: 113 De: 129

PRUEBA DE ESCRUTINIO PARA Tripanosoma cruzi

OBJETIVO:

Identificar los anticuerpos (Acs) anti-T cruzi para disminuir, la posible transmisin de la enfermedad de chagas a travs de los componentes sanguneos, determinando los Acs producidos por el individuo (disponente) contra el Tripanosoma cruzi y para dar cumplimiento a la Normatividad vigente.

FUNDAMENTO:

La enfermedad de Chagas es una infeccin parasitaria producida por el Tripanosoma cruz. El diagnostico de laboratorio depende del estadio en el cual se encuentre la enfermedad. Durante la fase aguda, se efecta directamente mediante la comprobacin de los parsitos en sangre o por mtodos inmunolgicos como: reaccin de fijacin de complemento, aglutinacn de ltex,

floculacin, hemaglutinacin, aglutinacin directa, imnunofluorescencia o ELISA.

En sta tcnica cualitativa para la deteccin de anticuerpos anti-T.cruzi, la muestra se diluye en el soporte en el que se encuentran inmovilizados antgenos recombinantes, obtenindole un mtodo de 3. Generacin. Estos antgenos se obtienen por tcnica de ADN recombinante a partir de protenas especficas de los estadios epimastigote y tripomastigote del T.cruzi, correspondientes a zonas altamente conservadas entre distintas cepas. La tecnologa empleada permite asegurar una mezcla antignica de composicin conocida y constante lote a lote, brindando resultados reproducibles, especficos y con una elevada sensibilidad. Si la muestra contiene los anticuerpos especficos, stos formarn un complejo con los antgenos y permanecern unidos al soporte. La fraccin no unida se elimina por lavado tras lo que se agregan anticuerpos anti-inmunogloobina CONTROL DE EMISIN Elabor: Nombre
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NCDPT 06 1

Hoja: 114 De: 129

humana conjugados con peroxidasa. Si se produjo la reaccin en la primera etapa del proceso, se unir el conjugado con peroxidasa. Si se produjo la reaccin en la primera etapa del proceso, se unir el conjugado. Luego de un nuevo lavado se agrega el sustrato enzimtico. En los casos en que se haya unido el conjugado habr aparicin de color celeste. La reaccin se detiene con cido sulfrico, con lo que el color celeste vira al amarillo.

MUESTRA:

Suero o plasma Recoleccin: Obtener de la manera usual. No usar muestras inactivadas por el calor. Sustancias interferentes conocidas: La hemlisis, hiperlipemia y otras causas de turbiedad pueden provocar resultados errneos.

MATERIAL Y EQUIPO: Micropipetas capaces de medir los volmenes indicados. Reloj, alarma o cronmetro. Estufa a 37 C Espectrofotmetro para lectura de policubetas.

ETI-STAR. MARCA DIASORIN

REACTIVOS PROVISTOS:

Policubetas sensibilizadas: policubeta de tiras removiles con pocillos que contienen antgenos recombinantes de T.cruzi inmovilizados. CONTROL DE EMISIN Elabor: Nombre
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Hoja: 115 De: 129

Conjugado: anti-inmunoglobulinas humanas (cabra) conjugadas con peroxidasa. Revelador A: perxido de hidrgeno de hidrgeno 60mmol/l en buffer citrato 50 mmol/l pH 3.2. Revelador A: tetrametilbencidina (TMB) 0.01 mol/l en cido clorhdrico 0.1N. Stopper: cido sulfrico 2N. Buffer de lavado concentrado: cloruro de sodio 1.4 mol/l en buffer fosfatos 100 mmol/l y tensioactivo no inico 0.1 g/l Diluyente de muestras: albmina bovina en solucin fisiolgica tamponada con buffer fosfatos pH 7.2. Control Positivo: dilucin de suero inactivado conteniendo anticuerpos contra Tripanosoma cruzi. Control negativo: dilucin de suero no reactivo, inactivado.

Los reactivos provistos son estables en refrigerador (2 - 10 C) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. No congelar.

PROCEDIMIENTO:

Llevar a temperatura ambiente los reactivos y las muestras antes de iniciar la prueba. Una vez iniciado el procedimiento debe completarse sin interrupcin.

Procesar simultneamente 2 Controles Positivos (CP) 3 Negativos (CN) y los desconocidos (D). Al depositar la muestra y/o Controles sobre el Diluyente de Muestras, debe asegurarse de colocar los mismos en el seno del lquido y no sobre las paredes o el fondo del pocillo. Enjuagar la pipeta con el Diluyente dispensado en el pocillo para asegurar la correcta homogeneizacin.

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Hoja: 116 De: 129

D Diluyente de muestras Control Positivos Control Negativo Muestra 200 ul 10 ul

CP 200 ul 10 ul -

CN 200 ul 10 ul -

Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta durante 10 segundos una vez cargadas las muestras en cada tira. Para evitar la evaporizacin, cubrir la placa e incubar en la estufa 30 minutos a 37 C. Luego espirar cuidadosamente el lquido de cada pocillo recibindolo en un recipiente para desechos biolgicos que contenga 5% de hipoclorito sdico. A continuacin, lavar 5 veces con Buffer de lavado empleando aproximadamente 300 ul/vez/pocillo. Despus de cada lavado, el lquido se descartar tambin en el recipiente con hipoclorito. Opcionalmente, emplear lavador automtico. Al finalizar el ltimo lavado, eliminar por completo el lquido residual, invirtiendo la policubeta y golpendola varias veces sobre papel absorbente, ejerciendo una leve presin con la mano sobre los laterales mayores del soporte, para evitar la cada de las tiras de pocillos. Luego agregar en cada pocillo.

Conjugado

1 gota

1 gota

1 gota

En caso de utilizar micropipeta automtica, dispensar 50 ul. Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta durante 10 seg. Para evitar la evaporizacin, cubrir la placa e incubar 30 minutos en estufa a 37C. luego aspirar el lquido de los pocillos, recibindolo en el recipiente con hipoclorito y lavar segn se indic ms arriba. Al finalizar el ltimo lavado, eliminar por completo el lquido residual, inviertiendo la policubeta y golpendola varias veces sobre papel

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Hoja: 117 De: 129

absorbente, ejerciendo una leve presin con la mano sobre las laterales mayores del soporte, para evitar la cada de las tiras de pocillos. Luego agregar en cada pocillo.

Re velador A Revelador B

1 gota 1 gota

1 gota 1 gota

1 gota 1 gota

En caso de utilizar micropipeta automtica, dispensar 50 ul. Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta durante 10 segundos. Incubar 30 minutos a temperatura ambiente y luego agregar:

Stopper

1 gota

1 gota

1 gota

En caso de utilizar micropipeta automtica, dispensar 50 ul. Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta durante 10 segundos.

Leer en espectrofotmetro a 450 nm o dicromtica a 450/620-650 nm o evaluar el resultado a simple vista por comparacin con los Controles Positivos y Negativos.

ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL

El color de la reaccin es estable durante 30 min., por lo que los resultados deben observarse durante ese lapso.

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Hoja: 118 De: 129

CRITERIOS DE VALIDACION DE LA CORRIDA

La corrida se considera vlida si se cumplen simultneamente las siguientes condiciones:

a) Las lecturas de al menos 2 de los 3 Controles Negativos corregidas contra el Blanco de Reactivos deben ser menores o iguales a 0.150 D.O. b) La lectura media de los Controles Positivos corregida debe ser mayor o igual a 0.600 D.O.

Si una o ambas condiciones no se cumple, repetir la corrida, para ambos casos recordar que las lecturas obtenidas dependern de la sensibilidad del aparato empleado.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS:

a) Con instrumental ptico:

La presencia o ausencia de anticuerpos anti-T.cruzi se determina relacionado la absorbacia de la muestra respecto al valor Cut-off. Cut-off=CN + 0.300 D.O. Donde CN: promedio de las lecturas del Control Negativo. Zona de indeterminacin: Cut-off + 10% Muestras No Reactivas: Se consideran aquellas con absorbancia menores al lmite inferior de la zona de indeterminacin. Muestras Reactivas: se consideran aquellas con absorbacias mayores al lmite superior de la zona de indeterminacin.

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Hoja: 119 De: 129

Muestras indeterminadas: se consideran aquellas con absorbacias que caen dentro de la zona de indeterminacin. Estas muestras deben ser ensayadas nuevamente.

b) Interpretacin visual

Si se opta por este tipo de interpretacin debe considerarse No reactiva toda muestra que no presente una coloracin mayor que la de los Controles Negativos. Por el contrario, una muestra netamente amarilla se considera Reactiva.

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 18. Fraccionamiento de Sangre Rev.

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Hoja: 120 De: 129

18. FRACCIONAMIENTO DE SANGRE

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Hoja: 121 De: 129

FUNDAMENTO:

La eleccin cuidadosa del elemento a fraccionar favorece el aprovechamiento ptimo de la sangre, es decir la donacin de una persona puede beneficiar a cuatro pacientes al separarse en:

Concentrados eritrocitarios, plasma fresco congelado, plasma desprovisto de F-VIII, concentrado plaquetario y concentrado de factor VIII crioprecipitado. La sangre y sus componentes se indican para sustituir el elemento especfico en dficit, los glbulos rojos para transporte de O2, plasma para restituir volumen, protenas pro-coagulantes y poder trombocitopenia y factor VIII en hemofilia. onictico , plaquetas para

MATERIAL Y EQUIPO:

Tijeras Centrfuga Refrigerada. Balanza. Prensa. Hematron. Bolsas de coleccin de sangre. Pinzas Rodillo. Pinzas de Kelly

PROCEDIMIENTO:

A) Preparacin de glbulos rojos (Bolsa doble) y plasma fresco congelado (P.F.C.). Para este procedimento se debe de usar una unidad de recoleccin que tenga una bolsa de transferencia. La separacin del plasma de los glbulos rojos puede ser o hacerse de la siguiente forma: CONTROL DE EMISIN Elabor: Nombre
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Hoja: 122 De: 129

Por centrifugacin entre (3000) RPM Durante 15 minutos la temperatura de la centrfuga debe ser de 4C.

TCNICA DE SEPARACIN:

Una

vez

centrifugadas las bolsas de sangre como se indic anteriormente seguir

los

siguientes pasos: 1. Colocar la bolsa de sangre centrifugada en el extractor de plasma. 2. Libere el mecanismo de presin suavemente. 3. Cierre con una pinza hemosttica el tubo que comunica a una de las bolsas satlite. 4. Romper el sello de la bolsa madre y dejar fluir el plasma en la otra bolsa satlite. Se debe usar una bolsa para medir la cantidad de plasma obtenido. 5. Cerrar con otra pinza hemosttica el tubo de comunicacin , por el cual esta fluyendo el plasma , cuando haya pasado la cantidad estipulada, sellar el tubo piloto con un sellador electrnico (hematrn). 6. Identificar la unidad de plasma con el mismo sistema que se us para la bolsa madre, cortar el piloto despus de haber sellado. 7. Pilotear con una separacin de 5 10 cm. de separacin todo el tubo piloto que qued en la bolsa del concentrado eritrocitario y colocarlo a un costado de la bolsa para pruebas futuras. 8. Del mismo modo para el paquete de plasma como se indic anteriormente , pilotear el tubo y adicionarlo al extremo de la bolsa.

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Cdigo : MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE 18. Fraccionamiento de Sangre 9. El concentrado eritrocitario debe ser Rev.

NCDPT 06 1

Hoja: 123 De: 129 guardado en un refrigerador especial a una

temperatura entre 4 y 6C para su conservacin. 10. El plasma se guarda o se debe mantener a una temperatura de -20C para su conservacin.

Bolsa Triple

B) Preparacin de Concentrados Plaquetarios:

En la recoleccin recomendacin:

de sangre para preparar plaquetas, se debe observar la siguiente

Dejar la sangre a temperatura ambiente que es entre 20-24C , hasta que inicie el proceso de separacin.

Es necesario practicar dos centrifugaciones, la primera a baja velocidad produce el plasma rico en plaquetas (PRP) y la segunda a alta velocidad , produce un concentrado de plaquetas ms una unidad de plasma pobre en plaquetas (PRP).

Se sealan tres factores importantes en este procedimiento: 1. El tiempo y la fuerza gravitacional de centrifugacin . 2. La tcnica de resuspensin de plaquetas despus de la centrifugacin. 3. El pH del plasma.

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Hoja: 124 De: 129

Tcnica de Preparacin. 1. La centrfuga refrigerante debe tener una temperatura de 20C. 2. Centrifugar a 1800 RPM, durante 10 minutos. 3. Colocar la bolsa de sangre en el extractor y separar el plasma rico en plaquetas en una bolsa satlite, pinzar el tubo piloto por donde fluye el plasma o sellar una vez terminado el paso de separacin de PRP y cortar. 4. Anotar datos del donador como son nombre, grupo sanguneo y Rh. sin poner la etiqueta que quedar al final. (Esto es productos a obtener. 5. Centrifugar el plasma rico en plaquetas P.R.P. a una velocidad de 3000 R.P.M. x 10 minutos , a una temperatura de 20C. 6. Colocar la bolsa en el extractor y transferir el plasma sobrenadante a la segunda bolsa satlite, dejar un volumen de conservadas a 20C. 7. Identificar los productos , tanto el PRP, como el C.P. con las etiquetas elevadas sealando la fecha, hora de preparacin y vencimiento. 8. Colocar los concentrados plaquetarios en un agitador para plaquetas a +20C, (es plasma , no menor de 50ml., as las plaquetas sern para tener un mejor control en la identificacin de los

aproximadamente de 1 a 2 horas.) de 3 a 5 das de la bolsa colectora. 9. El plasma pobre en plaquetas se guarda y conserva a una temperatura de -20C para su almacenamiento por un ao.

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OBSERVACIN:

Los C.P. deben cumplir con tres parmetros: 1. Volumen de plasma 50ml. 2. Nmero d plaquetas, no menor de 5.5 x 1010. 3. PH = a 6 por lo menos en el 75% de las unidades preparadas al final del periodo de expiracin.

C) Crioprecipitado de Factor VIII.

El crioprecipitado

de factor VIII o factor antihemoflico (FAH) (es la porcin del plasma que

precipita en frio, despus de que el P.F.C. ha sido descongelado bajo condiciones congeladas.) Contiene la mayor parte del factor VIII y cierta cantidad de fibringeno, de los existentes en la unidad original de plasma.

Es la protena que precipita a temperatura de -120C y posteriormente de descongelar el plasma.

Tcnica de Preparacin:

1. Colocar la sangre total del donador en bolsas triples y una vez obtenida y centrifugar a 3000 RPM durante 15 minutos. 2. Pasar con un extractor el plasma a una bolsa satlite , pesando en una balanza para precisar el volumen, sellar el tubo piloto y separar el P.G. refrigerndolo de 2 a 6C. 3. Poner los datos correspondientes a la bolsa del plasma (no etiqueta). CONTROL DE EMISIN Elabor: Nombre
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Hoja: 126 De: 129

4. Congelar el plasma rpidamente con hielo seco y acetona para que de un proceso de congelacin (completa o dejar congelar a una temperatura de 20C durante toda una noche 14 a 18 Horas) de -120C. 5. Una vez congelado el plasma, descongelarlo a una temperatura de 1 a 6C. 6. Ya que estn descongelados, centrifugar el plasma a 4000 RPM durante 15 minutos, a una temperatura de 4C. 7. Terminada la centrifugacin, colocar la bolsa en un extractor de bolsas y separar el plasma en la segunda bolsa satlite. 8. Separado ya el plasma, etiquetar debidamente los productos ya fraccionados con todos los datos. 9. Los plasmas y crioprecipitados se guardarn a una temperatura conservacin. de -20C para su

CUADRO DE CONSERVACIN DE PRODUCTOS:

PRODUCTO

ANTICUAGULAN

DIAS DE CONSERVACIO

Concentrado Eritrocitario Concentrado Eritrocitario Concentrado Eritrocitario Plasma Fresco Congelado Plasma sin Factor VIII Plasma Pobre en Plaquetas Concentrado Plaquetario Factor VIII o crioprecipitado

ADSOL C.P.D. A.C.D. C.P.D.A.

41 das 21 das 35 das 1 ao 1 ao 1 ao 3 das a 5 das 1 ao

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Hoja: 127 De: 129

Datos del Hospital Instituto

1. Nombre del donador. 2. Grupo y Rh. 3. Fecha de extraccin. 4. Fecha de caducidad. 5. Hematocrito. 6. Volumen. 7. Producto. (C.E., P.F.C., C.P. Y (C.P.D.O.) (CPDO) 8. Nmero de registro. 9. Hora y tiempo de extraccin.

C.E.: P.F..C.: P.P.P.: C.P.: C.P.D.O.:

Concentrado Eritrocitario. Plasma Fresco Congelado. Plasma Pobre en Plaquetas. Concentrado Plaquetario. Crioprecipitado. (Factor VIII).

Las unidades fraccionadas deben mantenerse en una rea perfectamente identificada con la leyenda No usar Falta Liberar, en tanto este tiempo se estarn realizando las pruebas que nos permiten liberar las unidades como son: HBsAg, HCV, HIV, RPR, BRUCELLA, una vez obtenidos estos resultados, siendo negativos y rectificando el grupo sanguneo se procede a etiquetar las unidades con las siguientes etiquetas, y se colocan en su charola de grupo correspondiente.

NOTA: Si alguna prueba serolgica sale positivo, se le dar destino final. CONTROL DE EMISIN Elabor: Nombre
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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TCNICOS DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES RESPIRATORIAS ISMAEL COSO VILLEGAS

Cdigo: NCDPT 06 Rev. 1 Hoja: 128 De: 129

IV. GLOSARIO DE TRMINOS 1. ANTICUERPO IRREGULAR DE IMPORTANCIA CLINICA: Inmunoglobulina inusualmente presente en el plasma (o suero) que puede causar enfermedad a travs de diferentes mecanismos 2. CONCENTRADOS DE PLAQUETAS: Trombocitos recolectados por afresis o preparados mediante fraccionamiento de unidades de sangre fresca. 3. CONCENTRADOS ERITROCITARIOS: Fraccin que contiene principalmente glbulos rojos, como resultante de la remocin casi completa de plasma. 4. CONTROL DE CALIDAD: mtodo que se lleva a cabo para garantizar la efectividad y funcionalidad de equipos, reactivos y tcnicas, as como, la viabilidad y seguridad de la sangre y de los componentes sanguneos. 5. DISPONENTE ALTRUISTA: sujeto que proporciona su sangre o componente de esta, para quien la requiere. 6. DISPONENTE FAMILIAR: persona que proporciona su sangre o componentes de esta, a favor de un paciente vinculado con ella. 7. PACIENTE POLIGLOBULICO: Persona que por un proceso patolgico primario o secundario, tiene un incremento absoluto del volumen eritroctico circulante. 8. PLASMA FRESCO: el que se encuentra en el lapso de las primeras 6 horas despus de la recoleccin. 9. PLASMA FRECO CONGELADO: el que se congela en el lapso de las primera seis horas, despus de la recoleccin y as se conserva. 10. PRUEBAS DE COMPATIBILIDAD: estudio practicado in-vitro empleando muestras de sangre del disponente y del receptor para comprobar la existencia de afinidad reciproca entre las clulas de uno y el suero del otro, para efectos transfusionales. CONTROL DE EMISIN Elabor: Nombre
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Cdigo: NCDPT 06 Rev. 1 Hoja: 129 De: 129

11. SANGRE FRESCA: tejido hemtico no fraccionado, de menos de 6 horas despus de su recoleccin 12. SANGRE TOTAL: Tejido hemtico no fraccionado, de ms de 6 horas despus de su recoleccin 13. TRANSFUSIN AUTOLOGA: aplicacin a un individuo, de la sangre o componentes sanguneos recolectados de el mismo. 14. TRANSFUSION AUTOLOGA MEDIANTE DEPOSITO PREVIO: disposicin de sangre y componentes sanguneos que en forma anticipada se acopian para uso teraputico del propio disponente. 15. UNIDAD: Volumen de sangre o componente sanguneo recolectado de un solo disponente.

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