Identificacin de las levaduras y test de resistencia a los antifungicos 8 test (Ref. 44008) 30 test (Ref.

44030) Test de rsistance des levures aux antifongiques 30 test (Ref. 44130)

CANDIFAST

6 - TOMA DE LAS CEPAS La identificacin y el test de resistencia deben realizarse a partir de colonias.: - jvenes (24 a 48 horas) - perfectamente aisladas a temperatura ambiente o a 37 C sobre un medio agarosado, de preferencia en placa de Petri. Se recomienda efectuar el aislamiento sobre medios especficos de las levaduras (3). 7 - CONSERVACION DE LOS REACTIVOS Los reactivos conservados a 2-8 C en su estado de origen, son estables hasta la fecha de caducidad indicada en el estuche. La mitad de la galera CANDIFAST ES Twin sin utilizar puede conservarse durante 7 das a 2-8 C en su envase original hermticamente cerrado y junto a su bolsa deshidratante. 8 - REACTIVO Y MATERIAL REQUERIDO PERO NO SUMINISTRADO Aceite de parafina Pipetas estriles Estufa a 37 C Recipiente para desechos contaminados

CANDIFAST ES TWIN

ES-2006-09

1 - FINALIDAD El estuche CANDIFAST permite identificar las principales levaduras de inters medico y testar su resistencia a diversos antifngicos. El estuche CANDIFAST ES TWIN permite testar la resistencia de las levaduras a diversos antifngicos.

CANDIFAST ES TWIN

Galera CANDIFAST ES Twin : Galera 2x10 pocillos, lista para su uso. Las dos series de pocillos corresponden al test de resistencia de la galera CANDIFAST. Cada galera permite testear dos muestras (tests de resistencia nicamente). Reactivo 1 : Frasco de 4 ml de medio agarosado tamponado para el dilucin y la identificacin. Extracto de buey 1,3g/l, Peptona de casena 1,8g/l, Extracto de levadura 0,8g/L, Aminocidos, vitaminas, minerales 5,75g/l, Urea 20g/L, Agar 0,52g/L, Antibiticos 1,12g/L. pH : 6,05 0,1. Reactivo 2 : Frasco de 2 ml de medio para el test de resistencia. Extracto de buey 1,3g/L, Peptonoa de casena 1,8g/L, Extracto de levadura 0,8g/L, Aminocidos, vitaminas, minerales 8,75g/L, Urea 20g/L, Glucosa 8,5g/L, Rojo de fenol 0,052g/L,Antibiticos 1,16g/l. pH : 7,3 0,1. Control de turbidez : Frasco de 4 ml de sulfato de bario para el control de dilucin.

5 - PRECAUCIONES DE EMPLEO Los reactivos de este estuche son nicamente para uso in vitro por personas autorizadas. Las muestras y los reactivos sembrados son potencialmente infecciosos; deben ser manipulados con precauciones de uso y desecharse a continuacin respetando las reglas de higiene y la reglamentacin vigente para este tipo de productos en el pas de utilizacin. Los reactivos que contienen materias primas de origen animal deben ser manipulados con las precauciones de uso correspondientes. No utilice los reactivos pasada la fecha de caducidad. No utilice los reactivos deteriorados o mal conservados antes de usar.

10 - LECTURA E INTERPRETACION DE LA GALERIA Leer el conjunto de la galera, nicamente si el pocillo de control (C+ : Pocillo 1 de la serie para el test de resistancia) se observa un cambio de color en el medio: - Paso al amarillo, o al amarillo-anaranjado, o al fucsia* (*generos ureasa positiva) 10.1 Serie para la identificacin Pocillo 1 (ACT) Un carcter es positivo cuando en el pocillo ACT se observa un cambio de color en el medio: - Paso al amarillo, o al amarillo-anaranjado, o al fucsia Un carcter negativo se traduce por una ausencia de cambio de color al amarillo, o al amarillo-anaranjado, o al fucsia. Pocillos 2 al 8 (GLU al RAF) Un carcter es positivo cuando en el pocillo se observa un cambio de color en el medio: - paso al amarillo, o al amarillo-anaranjado, o al fucsia Un carcter negativo se traduce por una ausencia de cambio de color al amarillo o al amarillo-anaranjado, o al fucsia. La identificacin de la levadura se realiza con ayuda de la galera y de los caracteres morfolgicos de las colonias. Para la interpretacin, referirse al cuadro siguiente o a la hoja incluida en el estuche. Es igualmente posible ayudarse de las indicaciones inscritas sobre el adhesivo de la galera: leer el pocillo actidiona (ACT), despues localizar el ultimo pocillo positivo a la derecha. El nombre del germen se indica sobre el adhesivo en la interseccion del carcter positivo ( fila inferior ) o negativo (fila superior) de la actidiona y el azucar localizado. Levadura ACT GLU GAL TRE MAL CEL RAF LAC Candida albicans + + + v + Candida albicans (var stellatodea) + + v + Candida glabrata v + + Candida kefyr + + + v + Candida krusei v + Candida lusitaniae + + + v + Candida parapsilosis + + v Candida tropicalis + + + + Saccharomyces + + v v v + Gneros Cryptococcus o Trichosporon o Rhodotorula v ureasa positiva

9.3. Incubacin Incubar la galera a 37 C durante 24 horas, si es necesario y segn las cepas continuar la incubacin hasta 48 horas o 72 horas.

ACT GLU GAL TRE MAL CEL RAF LAC 2 pocillos

vacos

AB NY FCT ECZ KTZ MCZ FCZ 2 pocillos

CANDIFAST ES TWIN

CANDIFAST

vacos

AB NY FCT ECZ KTZ MCZ FCZ

AB NY FCT ECZ KTZ MCZ FCZ

3 - PRINCIPIO La identificacion de la levadura se basa sobre : La sensibilidad o no de la cepa a la actidiona, visualizada por el virage al amarillo, o al amarillo-anaranjado, o al fucsia del indicador coloreado; El estudio de la fermentacin de siete azucares, visualizada por el viraje al amarillo o al amarillo-anaranjado del indicador coloreado debido a la acidificacion del medio; La deteccion de una actividad ureasica que alcaliniza el medio y hace virar el indicador coloreado al fucsia. La determinacin de la resistencia de las levaduras a los antifngicos se basa en el crecimiento o no de estas levaduras en presencia de diferentes antifngicos. Este crecimiento se visualiza por un cambio de color del medio: La fermentacin de la glucosa por las levaduras lleva consigo una acidificacin del medio que hace virar el rojo de fenol presente en el medio del rojo anaranjado al amarillo.o al amarillo-anaranjado, La hidrlisis de la urea por las levaduras ureasa positiva, libera amoniaco que alcaliniza el medio y hace virar el rojo de fenol del rojo anaranjado al rosa fucsia. 4 - REACTIVOS Envasado Reactivo Cantitad #44008 #44030 #44130 Galera CANDIFAST 8 30 Galera CANDIFAST ES Twin 15 R1 : Frasco de Reactivo 1 10 35 35 8 30 30 R2 : Frasco de Reactivo 2 TC : Frasco de control de turbidez 1 1 1 Description Galera CANDIFAST: Galera 20 pocillos, lista para su uso. Cada galera permite testear una muestra (identificacin + test de resistencia) Serie para la identificacin Serie para el test de resistencia El pocillo 1 contiene actidiona (ACT), glucosa y rojo de fenol. El pocillo 1 es un pocillo de control (C+). Los pocillos 2 a 8 contienen diferentes azucares y rojo de Los pocillos 2 a 8 contienen diferentes antifngicos. fenol. pocillo 2 (AB): anfotericina B (4 g/ml) pocillo 2 (GLU): glucosa pocillo 3 (NY): nistatina (200 unidades/ml) pocillo 3 (GAL): galactosa pocillo 4 (FCT): flucitosina (35 g/ml) pocillo 4 (TRE): trealosa pocillo 5 (EC): econazol (16 g/ml) pocillo 5 (MAL): maltosa pocillo 6 (KTZ): ketoconazol (16 g/ml) pocillo 6 (CEL): celobiosa pocillo 7 (MCZ): miconazol (16 g/ml) pocillo 7 (RAF): rafinosa pocillo 8 (FCZ): fluconazol (16 g/ml) pocillo 8 (LAC): lactosa Los pocillos 9 y 10 estn vacos Los pocillos 9 y 10 estn vacos

2 - INTRODUCCIN La frecuencia de las infecciones fngicas y en particular la de las provocadas por levaduras ha aumentado considerablemente a lo largo de los 10 ltimos aos (5). Las levaduras son agentes oportunistas. La mayora son saprofitas, pero pueden convertirse en patgenas cuando existen en el husped condiciones favorables , Estas condiciones son principalmente los factores psicolgicos : recin nacidos, personas de edad, mujeres encintas; los factores locales : frotamientos, maceraciones; los factores patolgicos : cncer, insuficiencia inmunitaria, trastornos metablicos ....los factores iatrgenos : antibioterapia, pldoras anticonceptivas, inmunosupresores, radiaciones ionizantes, ciruga,....Los cuadros clnicos provocados por estas levaduras son muy variados: afecciones cutneas (intrtrigo, onyxis......), afecciones de las mucosas (muget, esofagitis, colitis, vaginitis...), afecciones viscerales y septicemias. El aumento del numero de productos antifngicos as como la proliferacin de micosis resistentes a los tratamientos, justifican la evaluacin del comportamiento de las levaduras frenta a los antifngicos (1,2)

9 - PROCEDIMIENTO Llevar los reactivos a temperatura ambiente (18-25 C ) antes de su empleo 9.1. Preparacin de la inoculacin Tomar una colonia aislada con ayuda de una Oese o de una pipeta Pasteur taponada. Despus descargar la muestra en un frasco de Reactivo 1. Homogeneizar. La estandarizacin de la inoculacin puede realizarse de diferentes formas: Con relacin a un frasco de Control de turbidez Ajustar la opacidad del Reactivo 1 sembrado a la del frasco TC de control de turbidez ayudndose de las rayas negras de las etiquetas del frasco. Si el Reactivo 1 es mas claro, (inoculacin insuficiente), resembrar el frasco hasta la obtencin de una opacidad igual a la del frasco de control de turbidez. Si el Reactivo 1 es mas turbio, (inoculacin demasiado rica), diluir con ayuda de un nuevo frasco de Reactivo 1 hasta la obtencin de una opacidad correcta. Con ayuda de un densitmetro Verificar con la ayuda de un densitmetro que la turbidez del Reactivo 1 sembrado es igual a 1 Mac Farland. Si es necesario actuar como se indic precedentemente para ajustar la turbidez. Numeracin en clula de Malassez Es posible estandarizar la inoculacin efectuando una numeracin de las levaduras en clula de Malassez. Se debe obtener una solucin de 2500 a 3500 levaduras por mm3. 9.2a. Inoculacin de la Galera CANDIFAST 9.2b. Inoculacin de la Galera CANDIFAST ES Twin Serie de pocillos para la identificacin Serie para una primera muestra Identificar bien la galera. Levantar el adhesivo, despus Inocultar el reactivo R2 con 100 l de reactivo R1 sembrado distribuir en cada uno de los 8 primeros pocillos. y estandarizado. - 100 l de R1 sembrado y estandarizado Identificar correctamente cada uno de los lados de la - 2 gotas de aceite de parafina galera. Cubrir la serie de pocillos con el adhesivo Despegar la pelcula adhesiva y distribuir en cada uno de Serie para el test de resistencia los ocho pocillos de la primera serie: En un primera fase, inocular el Reactivo 2 por 100 l de - 100 l de Reactivo 2 ya sembrado Reactivo 1 sembrado y estandarizado (prrafo 9.1). - 2 gotas de vaselina lquida. Despus en una segunda fase levantar el adhesivo y Serie para una segunda muestra distribuir en cada uno de los 8 primeros pocillos de la serie Sembrar del mismo modo la segunda serie utilizando otro para el test de resistencia : frasco de Reactivo 2 ya sembrado procediendo como se - 100 l de R2 previamente sembrado indica ms arriba. - 2 gotas de aceite de parafina Recubrir la serie de pocillos con el adhesivo. Volver a cubrir la galera con la pelcula adhesiva.

Diagnostico Diferencial Cryptococus, Trichosporon y las especies Rhodoturola podran ser diferenciadas mediante su examinacion morfologica. - La especie Rhodoturola origina colonias distintivas con coloracion anaranjado-rojo creciendo sobre el medio agar dextrosa de Sabourauds . Algunas cepas de la especie Cryptococcus podran tambien producir una pigmentacion rojiza, es por esto que las especies de Cryptococcus deberan ser examinadas para observar la presencia capsular mediante la utilizacin de la preparacin de tinta india. -Especies Trichosporon producen un crecimiento Seudohifa sobre el medio agar PCB . Nota Estre las especies de Saccharomyces, Saccharomyces cerevisiae es la principal especie patogenica en humanos. Las cepas de Saccharomyces boulardii o Saccharomyces cerevisiae podran ser aisladas de pacientes bajo un tratamiento de secado de la levadura. La examinacion microscopica puede diferenciar entre estas dos especies : -S. cerevisiae produce celulas grandes de levaduras -S. boulardii son de un tamao menor, con apariencia de huevo o alargadas. Con el metodo CANDIFAST algunas cepas de la especie Cryptococcus podran crecer en presencia de actidiona, a la concentracin analizada. 10.2 Serie para el test de resistencia Pocillos 2 al 8 (AB al FCZ) Un cambio de color del medio al amarillo o al amarillo-anaranjado, o al fucsia traduce la capacidad de la cepa testada para desarrollarse en presencia del antifngico. En este caso, la cepa se ha vuelto resistente. Por el contra, el color rojo anaranjado del medio indica que la cepa se ha inhibido por el antifngico contenido en la cpula. 11 - CONTROL DE CALIDAD Para verificar la estandarizacin del mtodo, se recomienda realizar un control de calidad en forma peridica utilizando las cepas de referencia Candida albicans ATCC 90029 y Candida parapsilosis ATCC 22019. Cepa Incubacin Resultados esperados ACT GLU GAL TRE MAL CEL RAF LAC C+ AB NY FCT ECZ KTZ MCZ FCZ C. albicans 24 horas + + + + + - - + (ATCC 90029) C. parapsilosis 48 horas + + + - (ATCC 22019) 12 - CAUSAS DE ERRORES Preparacin de un inculo demasiado rico o demasiado dbil. Preparacin del inculo a partir de una mezcla de cultivos o con colonias aisladas por ms de 48 horas. Lectura de la galera en ausencia de viraje de color en el pocillo de control del crecimiento. Lectura de la galera 24 48 horas despus del viraje de color en el pocillo de control del crecimiento. Y, de manera general, el incumplimiento de las recomendaciones de las presentes instrucciones de uso.

2 pocillos vacos

2 pocillos vacos

13 - LMITES DEL MTODO Este mtodo de determinacin in vitro de la resistencia de los antifngicos tiene un valor indicativo sobre la interaccin de la pareja antifngico - levadura durante los tratamientos in vivo (2,4) El mtodo CANDIFAST se ha desarrollado para detectar la resistencia de cepas de origen cutneo-mucosas, no se recomienda por tanto para cepas aisladas de micosis sistmicas. El mtodo CANDIFAST no permite una clasificacin en Sensible-Intermedio-Resistente. Cepas termosensibles aisladas a 20 C crecen de una forma diferente a 37 C ; en este caso, o bien las levaduras no crecern o crecern mal y la resistencia a ciertos antifngicos no se podr detectar. Para ciertas cepas de C. lusitaniae un retraso de crecimiento en el pocillo TRE no permite la identificacin por medio de la lectura de la tabla. Tener en cuenta la lectura de la etiqueta. Para ciertas cepas de C. glabrata la dificultad de lectura del carcter GAL no permite la identificacin por la tabla. Tener en cuenta la lectura de la etiqueta. La interpretacin de la lectura de los tests de resistencia no debe tener en cuenta la turbidez: en los antifngicos azolados puede aparecer una pelcula o velo tras la incubacin.

IM IM

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14 - PERFORMANCES En cepas de coleccin El estudio fue realizado sobre 80 cepas de coleccin (31 Candida albicans, 17 C. glabrata, 11 C. tropicalis, 6 C. lusitaniae, 3 C. parapsilosis, 2 C. kefyr, 2 C. krusei, 5 Saccharomyces spp., 2 Cryptococcus neoformans y 1 Trichosporon cutaneum. De todas las cepas estudiadas, 78 fueron correctamente identificadas por la lectura de la etiqueta, es decir, 97,5% de concordancia con respecto al mtodo FUNGICHROM de INTERNATIONAL MICROBIO o el API 32C de Biomrieux. La concordancia global del test de resistencia, en comparacin con el FUNGITEST de Biorad y la galera ATB Fungus de Biomrieux, es de 87,4%. Estudio en cepas clnicas El estudio fue realizado sobre 100 cepas recientemente aisladas provenientes de muestras clnicas recogidas en medicina de ciudad (72 Candida albicans, 9 C. glabrata, 8 C. parapsilosis, 5 C. tropicalis, 3 C. krusei, 1 C. kefyr, 1 C. inconspicua y 1 Saccharomyces spp). De todas las cepas estudiadas, 98 fueron correctamente identificadas con respecto al mtodo VITEK de Biomrieux. La concordancia global del test de resistencia, en comparacin con el FUNGITEST de Biorad y con la galera ATB Fungus de Biomrieux, es de 98.5%. Entre las 10 discordancias, 3 son discordancias mayores y 7 son discordancias menores. Estas discordancias afectan a 4 cepas (2 C. glabrata, 1 C. parapsilosis y 1 C. tropicalis) y 3 antifngicos: econazol (2 R/I y 1 R/S), ketoconazol (1 R/I y 2 R/S) y miconazol (4 R/I). 15 - ELIMINACIN DE LOS DESECHOS Los desechos deben ser eliminados respetando las reglas de higiene y la reglamentacin en vigor para este tipo de productos en el pas de utilizacin.

16 - BIBLIOGRAFIA 1. DUPONT B. 1987. Rsistance de Candida aux antifongiques. Encyclopdie Mdico-Chirurgicale, Chap. 4, 23-26. 2. DUPOUY-CAMET J., M.-E. BOUGNOUX, I. VICENS et C. TOURTE-SCHAEFER. 1989. Intrts et limites de lantifongigramme. Rev. Fr. Lab. 197: 69-72. 3.GRILLOT R., B. LEBEAU et I. SELBMANN. 1989. Isolement et identification des levures, donnes rcentes et perspectives. Rev. Fr. Lab. 197:24-32. 4.PAUGAM A.. 1996. Intrt de ltude in vitro de la sensibilit des levures aux antifongiques. Rev. Fr. Lab. 282: 157-159. 5. KOENIG H., J. WALLER et M. KREMER. 1989. Diagnostic et aspects pidmiologiques de 70 000 levures isoles en 8 ans. Rev. Fr. Lab. 197: 34-38.

Sitio de fabricacin : ELITech France Parc dactivits Alle dAthnes 83870 SIGNES (FRANCE)

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305, alle de Craponne 13300 SALON DE PROVENCE (FRANCE) Tl. : 33 (0)4 90 17 54 50 Fax : 33 (0)4 90 17 54 51

CANDIFAST
Ide ntif ica o d e lev eduras e t este de res ist nci a aos anti fng icos 8 testes (Ref. 44008) 30 testes (Ref. 44030)

CANDIFAST ES TWIN
Tes te d e res ist nci a da s l eved uras a os a nti fngi cos 30 testes (Ref. 44130)
PT-2006-09 1 UTILIZAO PREVISTA O kit CANDIFAST permite identificar as principais leveduras patognicas para o ser humano, e testar a respectiva resistncia a diversos agentes antifngicos. O kit CANDIFAST ES TWIN permite testar a resistncia das leveduras a diversos antifngicos. 2 - INTRODUO Nos ltimos dez anos, verificou-se um aumento considervel da frequncia das infeces fngicas e, mais especificamente, das infeces causadas por leveduras(5). As leveduras so agentes oportunistas. A maior parte so saprfitas, mas transformam-se em agentes patognicos, se o hospedeiro apresentar condies favorveis. Estas condies so, essencialmente as seguintes: factores fisiolgicos: recm-nascidos, idosos, grvidas; factores locais: abrases, maceraes; factores patolgicos: cancro, imunodeficincia, perturbaes metablicas...; factores iatrognicos: antibioterapia, anticoncepcionais, imunosupressores, radiaes ionizantes, cirurgias...Os quadros clnicos provocados pelas leveduras so extremamente variados: doenas cutneas (intertrigo, onixia...), doenas das mucocutneas (candidase oral, esofagites, colites, vaginites...), infeces viscerais e septicmia. O aumento do nmero dos agentes antifngicos disponveis bem como o surgimento de micoses resistentes aos tratamentos justificam a avaliao da resposta das leveduras aos ant-fngicos (1, 2). 3 - PRINCPIO A identificao da levedura baseia-se: na sensibilidade ou no da estirpe actidiona visualizada pela passagem do indicador corante a amarelo, amareloalaranjado ou a fuchsia, na fermentao de sete acares visualizada pela passagem do indicador para amarelo ou amarelo alaranjado, devido acidificao do meio, na demonstrao da actividade urease, que alcaliniza o meio e faz passar o indicador corante para fuchsia. A determinao da resistncia das leveduras aos ant-fngicos baseia-se no crescimento ou da sua ausncia, das leveduras na presena de diferentes antifngicos. Este crescimento visualiza-se atravs de uma alterao da cor do meio: a fermentao da glicose pelas leveduras conduz a uma acidificao do meio, com o vermelho de fenol presente que se torna amarelo ou amarelo-alaranjado. a hidrlise da ureia pelas leveduras urease-positivas liberta amnia que alcaliniza o meio e o vermelho de fenol do meio altera-se para rosa fuchsia 4 - REAGENTES Acondi cionam ento Qua nti dade Re a g e n te #44008 #44030 44130 Galeria CANDIFAST 8 30 Galeria CANDIFAST ES Tw i n 15 R1 : Frasco de Reagente 1 10 35 35 R2 : Frasco de Reagente 2 8 30 30 TC : Frasco de controlo da turvao 1 1 1 De sc ri o Galeria CANDIFAST : Galeria de 20 poos, pronta a utilizar. Cada galeria permite testar uma amostra (identificao + teste de resistncia) Srie para a idenficao Srie para o teste de resistncia O poo 1 contm actidiona (ACT), glicose e vermelho de O poo 1 consiste num poo de controlo de crescimento fenol. (C+) Os poos 2 a 8 contm diferentes acares e vermelho Os poos 2 a 8 diferentes anti-fungicos : poo 2 (AB): anfotericina B (4 g/ml) de fenol poo 3 (NY): nistatina (200 unidades/ml) poo 2: (GLU) glicose poo 4 (FCT): flucitosina (35 g/ml) poo 3: (GAL) galactose poo 5 (ECZ): econazol (16 g/ml) poo 4: (TRE) trealose poo 6 (KTZ): cetoconazol (16 g/ml) poo 5: (MAL) maltose poo 7 (MCZ): miconazol (16 g/ml) poo 6: (CEL) celobiose poo 8 (FCZ): fluconazol (16 g/ml) poo 7: (RAF) rafinose Os poos 9 e 10 esto vazios poo 8: (LAC) Lactose Os poos 9 e 10 esto vazios Galeria CANDIFAST ES Tw i n : Galeria de 2x10 poos, pronta a utilizar. As duas sries de poos so idnticas srie do teste de resistncia da galeria CANDIFAST. Cada galeria permite testar duas amostras (apenas testes de resistncia) Reagente 1 - Frasco de 4 ml de meio agar tamponado para a diluio e a identificao. Extracto de bovino 1,3g/L, Peptona de casena 1,8g/L, Extracto de levedura 0,8g/L, Aminocidos, vitaminas, minerais 5,75g/L, Ureia 20g/L, Agar 0,52g/L, Antibiticos 1,12g/L. pH: 6,05 0,1. Reagente 2: Frasco de 2 ml com meio YNB (base azotada para leveduras) com ureia e vermelho de fenol. Extracto de bovino 1,3g/L, Peptona de casena 1,8g/L, Extracto de levedura 0,8g/L, Aminocidos, vitaminas, minerais 8,75g/L, Ureia 20g/L, Glicose 8,5g/L, Vermelho de fenol 0,052g/L, Antibiticos 1,16g/L. pH: 7,3 0,1. Co nt ro l o da tu rv a o: Frasco de 4 ml de sulfato de brio para o controlo da diluio. 5 - PRECAUES Os reagentes desta embalagem foram concebidos apenas para utilizao in vitro, s devendo ser manipulados por tcnicos especializados. As amostras e os reagentes inoculados so potencialmente infecciosos; logo, devem ser manipulados de acordo com as precaues de utilizao implementadas, respeitando as normas em termos de higiene bem como a legislao em vigor no pas de utilizao para este tipo de produto. Os reagentes que contm matrias-primas de origem animal devem ser manipulados de acordo com as precaues de utilizao. No utilize os reagentes que estejam fora do prazo de validade. No utilize os reagentes danificados ou indevidamente conservados antes do respectivo uso.

6 - COLHEITA DAS AMOSTRAS As colnias utilizadas para a identificao da levedura e para o teste de resistncia devem ser recentes (com 24 horas a 48 horas) e perfeitamente isoladas temperatura ambiente ou a 37 C num meio de agar, numa placa de Petri. aconselhvel que se proceda ao isolamento em meios especficos para leveduras (3). 7 - CONSERVAO DOS REAGENTES Os reagentes conservados a 2-8 C no estado original permanecem estveis at ao fim do prazo de validade indicado na embalagem. A metade da galeria CANDIFAST ES Twin no utilizada, pode ser conservada durante 7 dias temperatura de 2-8C, na embalagem de origem resselada e com o dessecante. 8 - REAGENTE E MATERIAL NECESSRIO MAS NO FORNECIDOS leo de parafina Pipetas estreis Estufa a 37 C Recipiente para resduos contaminados 9 - MODO DE FUNCIONAMENTO E s t a b i l i z e os re a g e nt e s t e m p e r at u r a a m b i e n t e ( 1 8 -2 5 C ) an t e s d a s u a u t i l i z a o. 9.1. P r epa ra o do i n c ul o Com a ajuda de uma ansa ou de uma pipeta Pasteur com a extremidade fundida, proceda colheita de uma colnia isolada. De seguida, inocule num frasco de reagente. Misture bem. A padronizao do inculo pode ser efectuada de diferentes maneiras: Re l a ti va m e n te a o fr a sc o C T d e co n t r o lo d a tu r va o Ajuste a opacidade do Reagente 1 inoculado de acordo com a do frasco CT, com a ajuda das linhas pretas na etiqueta do frasco. Caso o Reagente 1 seja mais claro (inculo insuficiente), proceda re-inoculao do frasco at obter uma opacidade igual do frasco CT. Se o Reagente 1 se apresentar mais turvo (inculo demasiado rico), proceda sua diluio com um frasco de Reagente 1 aberto de novo, at conseguir uma opacidade correcta. Co m a a ju d a d e u m d e n si t m e tr o Com a ajuda de um densitmetro, certifique-se de que a turvao do Reagente 1 inoculado corresponde a 1 Mac Fa rland. Caso se mostre necessrio, proceda conforme previamente indicado de modo a ajustar a turvao. N u m e r a o e m c l ul a M a l as s e z possvel padronizar o inculo procedendo a uma contagem das leveduras em clulas de Malassez. Deve obter-se uma soluo de 2500 a 3500 leveduras por mm3. 9.2a. Inoculao da galeri a CANDIFAST 9.2b. Inoculao da galeria CANDIFAST ES Tw i n Srie de identificao Srie para primeira amostra Identifique devidamente a galeria em relao amostra Inocule o reagente R2 com 100 l de reagente R1 testada. Retire o revestimento adesivo e, distribua em cada inoculado e padronizado. um dos 8 primeiros poos: Identifique devidamente cada uma das filas da galeria. - 100 l de R1 inoculado e padronizado Retire o revestimento adesivo e, de seguida, distribua - 2 gotas de leo de parafina. em cada um dos 8 primeiros poos: Volte a tapar a srie de poos com o revestimento adesivo. - 100 l de Reagente 2 previamente inoculado Srie para o teste de resistncia - 2 gotas de leo de parafina. Primeiro, proceda inoculao do Reagente 2 com 100 l de Volte a tapar a galeria com o revestimento adesivo. Reagente 1 inoculado e padronizado (ver 9.1). Depois, Srie para a segunda amostra retire o revestimento adesivo e distribua em cada um dos 8 Inocule a segunda srie segundo o mesmo processo primeiros poos: com a ajuda de um outro frasco de Reagente 2 - 100 l de R2 previamente inoculado previamente inoculado. Volte a tapar a galeria com o - 2 gotas de leo de parafina. revestimento adesivo. Volte a tapar a srie de poos com o revestimento adesivo.
C AB NY FCT ECZ KTZ MCZ FCZ C AB NY FCT ECZ KTZ MCZ FCZ 2 poos vazios 2 poos vazios

D ia g n s ti c o d i fe r e n ci a l Os gneros Cryptococcus, Trichosporon e Rhodotorula podem ser diferenciados por exame morfolgico. - As espcies Rhodoturola caracterizam-se por colnias distintas de cor vermelho-salmo cultivadas em meio Sabouraud. -Algumas espcies de Cryptococcus tambm produzem uma colorao avermelhada. Devem ser examinadas na presena de uma cpsula com uma preparao de tinta da china. - Trichosporon forma pseudohifas em meio agar PCB. No ta No gnero Saccharomyces, a Saccharomyces cerevisiae a principal espcie patognica para o ser humano. possvel isolar estirpes de Saccharomyces boulardii ou de Saccharomyces cerevisiae de doentes com tratamento base de leveduras. Um exame ao microscpio permite diferenciar as duas espcies: - S. cerevisiae so leveduras esfricas de grandes dimenses. - S. boulardii so leveduras ovides a alongadas de dimenses mais reduzidas. Com a galeria CANDIFAST, determinadas estirpes Cryptococcus podem crescer na presena de ctidiona. 10.2 S ri e para o teste de resi stnci a Poo 2 a 8 (AB a FCZ) Uma mudana de cor do meio para amarelo ou amarelo-alaranjado ou fuchsia, traduz a capacidade da estirpe testada para se desenvolver nesse poo, na concentrao testada do antifngico, qual resistente. Pelo contrrio, a cor vermelhoalaranjada do meio indica que a estirpe foi inibida pelo antifngico presente no poo 11 - CONTROLO DE QUALIDADE Para verificar a padronizao do mtodo, recomenda-se a realizao de um controlo de qualidade, periodicamente, com estirpes de Referncia, Candida albicans ATCC 90029 e Candida parapsilosis ATCC 22019. E s ti r pe In cu ba o Re sul t ado s e spe rad os ACT GLU GAL TRE MAL CEL RAF LAC C+ AB N FCT ECZ KTZ MCZ FCZ + + + + + - + + + + -

C. albicans 24 horas (ATCC 90029) C. parapsilosis 48 horas (ATCC 22019)

IM
2 poos vazios ACT GLU GAL TRE MAL CEL RAF LAC

CANDIFAST ES TWIN

AB NY FCT ECZ KTZ MCZ FCZ 2 poos vazios

9.3. I nc ub a o Incube a galeria a 37 C durante 24 horas se necessrio e, consoante o tipo de estirpes, prossiga com a incubao at 48 horas ou, inclusivamente, 72 horas. Leia a galeria quando as leveduras tiverem crescido no poo controlo. 10 - LEITURA E INTERPRETAO Lei a toda a galeria, apenas se observar, no po o cont rol o (C +: Poo 1 da srie para tes te de resi stncia), a seg ui nte m udan a d e co r do m ei o: - p a s s a g e m a a ma r e l o o u a a m a r e l o - a l a r a n j a d o o u a o f u c h s i a * ( *p a r a o s g n e r o s u r e a s e - p o s i t i v o s ) 10.1 S rie para a ident ifi cao Poo 1 (ACT) A reaco positiva quando, no poo ACT, se observar uma mudana da cor do meio: - P as s a g e m a o a m a r e l o ou a o a m a r e l o - a l a r a n j a d o o u a o f u c h s i a Uma reaco negativa traduz-se por uma inexistncia de passagem ao amarelo ou ao amarelo-alaranjado ou ao fuchsia. Poo 2 a 8 (GLU a RAF) A caracterstica positiva quando, num desses poos, se observa uma mudana da cor do meio: - P a s s ag e m a o am a r e l o ou a a m a re l o -a l a ra n j ad o o u a f u c h s i a Uma caracterstica negativa quando no h passagem a amarelo ou a amarelo-alaranjado ou a fuchsia. A identificao da levedura efectuada com a galeria CANDIFAST e com a anlise em paralelo das caractersticas morfolgicas das colnias. Para a interpretao, consulte a tabela seguinte ou o quadro em anexo na embalagem. igualmente possvel consultar as marcaes inscritas no revestimento adesivo da galeria: lei a pri mei ro o poo de act idi ona (A CT) e, de se gu id a, l oc al i z e o l t i m o po o pos i t i vo d i rei t a. O nome do microrganismo vem indicado no revestimento adesivo, na interseco da reaco positiva (fileira inferior) ou negativa (fileira superior) da actidiona e do acar localizado. Levedura ACT GLU GAL TRE MAL CEL RAF LAC Candida albicans + + + v + Candida albicans (var stellatodea) + + v + Candida glabrata v + + Candida kefyr + + + v + Candida krusei v + Candida lusitaniae + + + v + Candida parapsilosis + + v Candida tropicalis + + + + Saccharomyces + + v v v + Gneros Cryptococcus ou Trichosporon ou Rhodotorula v urease positiva

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12 - CAUSAS DE ERROS Preparao de um inculo demasiado rico ou demasiado fraco. Preparao do inculo a partir de uma mistura de culturas ou com colnias isoladas com mais de 48 horas de crescimento. Leitura da galeria na ausncia de mudana da cor no poo de controlo de crescimento. Leitura da galeria 24 ou 48 horas aps a mudana da cor no poo de controlo de crescimento. E, de um modo geral, a inobservncia das recomendaes includas no presente folheto informativo. 13 - LIMITAES Este mtodo de determinao in vitro da resistncia aos anti-fngicos possui um valor indicativo acerca da interaco do par antifngico-levedura, nos tratamentos in vivo (2,4). O mtodo CANDIFAST ou CANDIFAST ES Twin foi desenvolvido com o propsito de identificar e detectar a resistncia aos antifngicos, apenas em estirpes de origem mucocutnea; no , pois, recomendado para estirpes isoladas de micoses sistmicas. O mtodo CANDIFAST no permite uma categorizao em Sensvel-Intermdio-Resistente Algumas estirpes termossensveis isoladas a 20 C crescem de modo diferente a 37 C; Neste caso, as leveduras no crescem ou crescem mal, e tanto a identificao como a demonstrao da resistncia a determinados antifngicos, em termos de fiabilidade, sero muito difceis, se no mesmo impossveis. No caso de determinadas estirpes de C. lusitaniae, um atraso do crescimento no poo TRE torna difcil a identificao atravs da leitura da tabela. A leitura da etiqueta torna possvel a identificao. No caso de determinadas estirpes de C. glabrata, a dificuldade de leitura da reaco GAL torna difcil a identificao atravs da leitura da tabela. A leitura da etiqueta torna possvel a identificao. A interpretao da leitura dos testes de resistncia no deve tomar em considerao a turvao do meio, que pode surgir aps a incubao com antifngicos azis. 14 - DESEMPENHO E st ud o c om e st i rpe s d e c ol h ei ta O estudo foi efectuado com 80 estirpes de colheita (31 Candida albicans, 17 C. glabrata, 11 C. tropicalis, 6 C. lusitaniae, 3 C. parapsilosis, 2 C. kefyr, 2 C. krusei, 5 Saccharomyces spp., 2 Cryptococcus neoformans e 1 Trichosporon cutaneum). 78 estirpes foram identificadas correctamente atravs da leitura com a ajuda da etiqueta, com 97,5% de concordncia relativamente ao mtodo FUNGICHROM da INTERNATIONAL MICROBIO ou API 32C da Biomrieux. A concordncia global do teste de resistncia, em comparao com o FUNGITEST da Biorad e com a galeria ATB Fungus da Biomrieux, foi de 87,4%. E st i r pes c l ni c as O estudo foi efectuado com 100 estirpes recentemente isoladas provenientes de amostras clnicas colhidas em consultrio mdico (72 Candida albicans, 9 C. glabrata, 8 C. parapsilosis, 5 C. tropicalis, 3 C. krusei, 1 C. kefyr, 1 C. inconspicua e 1 Saccharomyces spp). Foram correctamente identificadas 98 estirpes, em comparao com o sistema VITEK da Biomrieux. A concordncia global do teste de resistncia, em comparao com o FUNGITEST da Biorad e com a galeria ATB Fungus da Biomrieux, de 98,5%. Entre as 10 discordncias, 3 so erros maiores e 7 so erros menores. Estas discordncias dizem respeito a 4 estirpes (2 C. glabrata, 1 C. parapsilosis e 1 C. tropicalis) e a 3 anti-fngicos : econazol (2 R/I e 1 R/S), o cetoconazol (1 R/I e 2 R/S) e o miconazol (4 R/I). 15 - ELIMINAO DOS RESDUOS Os resduos tm de ser eliminados, respeitando as normas de higiene bem como a legislao em vigor para este tipo de reagentes no pas de utilizao. 16 - B IB LIOGRAF IA 1. DUPONT B. 1987. Rsistance de Candida aux antifongiques. Encyclopdie Mdico-Chirurgicale, Chap. 4, 23-26. 2. DUPOUY-CAMET J., M.-E. BOUGNOUX, I. VICENS et C. TOURTE-SCHAEFER. 1989. Intrts et limites de lantifongigramme. Rev. Fr. Lab. 197: 69-72. 3.GRILLOT R., B. LEBEAU et I. SELBMANN. 1989. Isolement et identification des levures, donnes rcentes et perspectives. Rev. Fr. Lab. 197:24-32. 4.PAUGAM A.. 1996. Intrt de ltude in vitro de la sensibilit des levures aux antifongiques. Rev. Fr. Lab. 282: 157-159. 5. KOENIG H., J. WALLER et M. KREMER. 1989. Diagnostic et aspects pidmiologiques de 70 000 levures isoles en 8 ans. Rev. Fr. Lab. 197: 34-38. CANDIFAST uma marca registada da ELITech France SAS

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Local de fabrico : ELITech France Parc dactivits Alle dAthnes 83870 SIGNES (FRANCE)

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305, alle de Craponne 13300 SALON DE PROVENCE (FRANCE) Tl. : 33 (0)4 90 17 54 50 Fax : 33 (0)4 90 17 54 51