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MODULO III Objetivos Especficos

Aplicar el diagnstico de laboratorio adecuado a cada parsito. Elementos no parasitarios Diagnstico de laboratorio de las parasitosis Recoleccin de heces con conservante Tcnicas de concentracin Mtodos de diagnstico Coloraciones

ELEMENTOS NO PARASITARIOS
En un anlisis parasitolgico los restos o elementos no parasitarios deben diferenciarse de los parsitos. Hay muchos y diferentes elementos microscpicos de restos alimenticios o restos no parasitarios, de origen endgeno o exgeno que estn presentes en las heces. Podemos citar varios ejemplos: -Tejido conjuntivo: las fibras se entrecruzan en una red muy fina. -Carne: las fibras musculares estn unidas por trabculas. Las fibras de carne insuficientemente digeridas son de tamao variable, de forma rectangular, de ngulos bien marcados, de color marrn con una neta estriacin doble, longitudinal y transversal; las fibras de carne bien digeridas presentan formas ms redondeadas, de color marrn ms claro a amarillo plido y sin estras. -Grasas: grasas neutras se ven como gotas muy refringentes y los cidos grasos con aspecto de finas agujas a veces agrupadas. -Elementos vegetales: los grnulos de almidn estn agrupados en masas celulsicas. El grado de digestin del almidn se determina por la coloracin que toma con el lugol, violeta oscura cuando el almidn est intacto, rosa plido cuando est totalmente digerido y tonos de marrn para los distintos grados de degradacin. -Celulosa no digerible: los vasos espiralados de legumbres verdes aparecen como resortes cuando estn de perfil y de frente se presentan como elementos redondeados de doble contorno cuyo interior puede estar lleno o vaco, los pelos vegetales, alargados, que tienen un polo irregular y el otro agusado, muy refringentes y en el medio un canal que puede confundirse con el intestino, restos de plenes y esporas de hongos con 24

estructuras semejantes a huevos de parsitos de los que hay que distinguir; tejidos de revestimiento de los vegetales aparecen con formas complejas como son las clulas en empalizada, etc. -Cristales: de oxalato de calcio, de fosfato amnico-magnsico, de Charcot-Leyden o agujas de brjula. -Clulas endgenas: leucocitos, que pueden estar aislados o en grupos denominados piocitos, hemates, clulas epiteliales, clulas rectales, bacterias, etc. Existen muchsimas figuras microscpicas de restos que no pueden ser identificadas con precisin y sera una tarea intil tratar de reconocerlas. Lo ms importante es poder diagnosticar correctamente a los diferentes parsitos que pueden hallarse en el intestino humano. Los parsitos no constituyen flora normal en el ser humano. Teniendo en cuenta que puede darse un estado de latencia que no se traduce ni exterioriza sintomticamente y que slo es posible descubrirlo por el anlisis parasitolgico de rutina, debemos realizar siempre un correcto estudio parasitolgico y ejecutar un tratamiento adecuado, para eludir el peligro de la diseminacin parasitaria y liberar a los pacientes de los parsitos como agentes potencialmente patgenos y agresivos y evitar su propagacin en la naturaleza. DIAGNSTICO DE LABORATORIO DE LAS PARASITOSIS El diagnstico de las infecciones parasitarias puede establecerse de dos maneras fundamentales: por mtodos directos, diseados para observar o detectar el parsito o alguno de sus elementos identificables y/o por mtodos indirectos, dirigidos a hacer evidente la respuesta inmune del hospedero frente al parsito. Los mtodos indirectos de diagnstico tienen fundamental importancia para el diagnstico de parasitosis en que es imposible o muy difcil la visualizacin directa del parsito o de alguno de sus elementos o para controlar la evolucin post-teraputica de la infeccin. Dentro de los mtodos directos se encuentra el anlisis parasitolgico de heces, el cual consta de un examen microscpico directo, con y sin coloraciones, examen macroscpico por tamizado y mtodos de concentracin.

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La concentracin y la separacin de los quistes de protozoos y huevos de helmintos de otros elementos de la muestra fecal pueden ser de gran ayuda para el diagnstico. Se consiguen por sedimentacin, flotacin o una combinacin de ambos. La sedimentacin se lleva a cabo suspendiendo la muestra fecal en agua o en una solucin acuosa para que sedimente de forma natural o acelerando el proceso por centrifugacin. La flotacin consiste en suspender la muestra en un medio de densidad superior a la de los quistes y los huevos, que por su capacidad de flotacin se concentran en la superficie. El diagnstico de las infecciones parasitarias intestinales puede establecerse por mtodos directos o indirectos como sealamos anteriormente. La seleccin de una o ms tcnicas depender de qu especie parasitaria y en qu fase de su ciclo evolutivo es necesario diagnosticar, dadas las diferentes cualidades de cada mtodo. Examen parasitolgico de heces: Las muestras de heces pueden ser recogidas de varias maneras: Heces frescas sin conservantes: Si el paciente presenta deposiciones lquidas o heces con moco y sangre, se debe examinar rpidamente una muestra de las mismas siempre que no haya tomado carbn, crema de bismuto, sustancias baritadas o est medicado con hierro. Heces con conservantes: El paciente debe colocar en un frasco con conservante (formol 10%, SAF, etc.), una pequea cantidad de materia fecal de todas las deposiciones del da y durante 8 das seguidos. Heces despus de tomar un purgante salino: El paciente durante 2 das no debe ingerir verduras de hoja, legumbres o ctricos. Puede ingerir bananas o manzanas peladas, es decir, frutas que no tengan hollejo. La noche anterior a la recoleccin de la muestra deber tomar un purgante salino (no oleoso) y luego recoger la 2 deposicin en un frasco limpio, preferentemente de tapa a roscas. Los distintos modos de recoleccin presentan ventajas y desventajas. Las heces frescas permiten ver la movilidad de los protozoos y larvas de helmintos. Las que

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tienen conservantes permite obtener parsitos que se eliminan de manera intermitente, aunque Trichomonas hominis no se detecta con conservantes. Las heces recogidas luego de la administracin de un purgante salino, permiten el diagnstico ms rpido, pero no puede realizarse en personas con dolores intestinales, diarrea o en quienes estn contraindicados los purgantes. La muestra debe ser procesada rpidamente. Permite ver la movilidad de los protozoos y se logra una mejor visualizacin de los macroparsitos dado que en el tamizado aparecen pocos restos debido a la no-ingestin de verduras, legumbres y frutas. La recoleccin seriada de las heces puede darse a todos los pacientes y al recoger durante 8 das aumenta la posibilidad de hallar los parsitos que tengan un ciclo ms largo y que puedan completarlo durante la recoleccin. Esta recoleccin es engorrosa para el paciente; el formol inmoviliza a los protozoos pero conservan su morfologa lo que hace posible su diagnstico. Una vez remitidas al laboratorio las muestras obtenidas como se ha sealado anteriormente se procede al Anlisis Parasitolgico: Las muestras de heces deben ser homogeneizadas. Si las heces son formadas se agrega agua o solucin fisiolgica hasta obtener una muestra semi-lquida. Se realiza primero un: a) Examen microscpico directo, con objetivos de 100x y 400x aumentos para la bsqueda de trofozoitos, quistes, ooquistes, huevos y/o larvas de parsitos intestinales. Esta observacin microscpica puede hacerse sin coloracin o con coloraciones hmedas como lugol, eosina, azul de metileno, etc. b) Concentracin de huevos, larvas y quistes en heces ha llegado a ser un procedimiento de rutina como parte de un examen completo para la deteccin de los parsitos intestinales, que se puede realizar como complemento del examen directo. c) Examen macroscpico: consiste en tamizar la muestra una vez concluido el examen microscpico directo, para identificar la morfologa de los helmintos macroscpicos.

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d)

Con las heces llegadas al laboratorio u obtenidas por mtodos de concentracin se pueden preparar extendidos para ser fijados y teidos con coloraciones especficas para cada parsito que se quiera investigar.

e)

el anlisis parasitolgico se debe completar, sobre todo en los nios, con un hisopado anal seriado:

f)

Es una tcnica especfica para la deteccin de Enterobius vermicularis, nematode cuya hembra coloca los huevos en la zona perianal. Los exmenes microscpicos y macroscpicos de heces presentan poca sensibilidad para este parsito. La tcnica consiste en pasar 8 gasas estriles por la zona perianal, por la maana y sin higiene previa. Se realiza durante ocho das, recogiendo las gasas en un frasco con formol al 10%. Obtenida la muestra, se centrifuga durante 10 minutos a 3.000 rpm, se descarta el sobrenadante y el sedimento se observa por examen microscpico directo con 100x y 400x aumentos para la bsqueda de huevos del parsito. Debe agotarse el sedimento antes de dar por negativo el anlisis.

Montaje hmedo directo: Este mtodo sigue siendo el gold standard para el diagnstico de la enfermedades parasitarias. Se usa principalmente para observar las caractersticas morfolgicas de los protozoos y detectar la movilidad de los mismos en su forma de trofozoito. El preparado directo se realiza con una pequea cantidad (una gota) de heces entre porta y cubreobjeto; no debe ser mayor porque resultara demasiado espesa para el examen, ni menor porque disminuira la posibilidad de encontrar parsitos. La observacin se realiza utilizando un objetivo de 10x aumentos y ante un elemento sospechoso se examina con 40x aumentos. Para poder observar con ms detalle la morfologa de los protozoos (especialmente los ncleos) se puede hacer un montaje hmedo coloreado, colocando una gota de colorante en el borde del portaobjeto o se prepara un nuevo montaje. Varias soluciones de yodo son recomendadas, por ejemplo Lugol y de Dobell y O Connor; otras como solucin de eosina o azul de metileno.

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Los trofozoitos y quistes de protozoos, huevos o larvas de helmintos y ooquistes de Isospora belli pueden ser identificados en el extendidos directo. Los ooquistes de Cryptosporidium difcilmente son observados, salvo en grandes infecciones, al igual que las esporas de Microsporidium que son muy pequeas y de forma semejante a restos en materia fecal. Extendidos coloreados permanentes La deteccin y la correcta identificacin de la mayora de los protozoos intestinales dependen del examen de estos extendidos observados con un aumento de 100x. La utilizacin de extendidos permanentes no solamente nos proporciona un archivo durable de los protozoos, sino que pueden ser utilizados, cuando la identificacin es dificultosa, para consultar con especialistas. El mtodo ms clsico es la hematoxilina frrica de Heidenhain, pero la generalidad de los laboratorios seleccionan tcnicas ms breves como la coloracin Tricrmica. Es importante mencionar que la mayora de las dificultades en las coloraciones de trofozoitos y quistes se deben a una fijacin inadecuada, al uso de preparados muy densos o por heces muy viejas. RECOLECCIN DE HECES CON CONSERVANTES Muestras conservadas. Muestra con PVA: debe tener una relacin de una parte de heces y 3 partes de conservante. Mezclar inmediatamente. Deben recogerse 6 muestras en das no consecutivos, en recipientes individuales. Las heces con PVA se filtran con una gasa en un tubo de centrfuga (preferentemente de plstico). Se centrifugan 10 minutos a 1500 rpm. Se descarta el sobrenadante que contiene el exceso de conservante. Se secan las paredes del tubo con gasa. El sedimento se utiliza para realizar los extendidos para su coloracin posterior. Se deposita una gota del sedimento sobre un portaobjeto y con un cepillo de dientes se

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distribuye, en ambos sentidos, hasta lograr un extendidos fino. Se realizan por lo menos 3 a 5 extendidos. Se procede a realizar la coloracin permanente (Tricrmica o Hematoxilina frrica) Muestra en formol al 10%: se recogen durante 7 u 8 das. Se realiza el examen directo. Las heces se concentran por el mtodo de sedimentacin (acetato de etilo) Se utiliza el sedimento para realizar los extendidos para su posterior coloracin. Se deposita una gota de ese sedimento sobre un portaobjeto y con un cepillo de dientes se distribuye, en ambos sentidos, hasta lograr un extendidos fino. Se realizan por lo menos 3 a 5 extendidos. Se procede a realizar la coloracin permanente. Muestra con SAF: se trabaja de la misma manera que el anterior. Antes de depositar la gota de sedimento sobre el portaobjeto para realizar los extendidos para su posterior coloracin, se coloca una gota de albmina de Mayer para fijar las heces al preparado por la escasa capacidad de fijacin que tiene el conservante SAF. Se realizan por lo menos 3 a 5 extendidos. Conservante: Ventajas: Buen fijador. Fcil de preparar. Buena preservacin de la morfologa de huevos de helmintos, larvas, quistes de protozoos y coccidios. Adecuado para las tcnicas de concentracin y de la microscopa de epifluorescencia Adecuado para las coloraciones cido-alcohol resistentes (safranina). Compatible con inmunoensayos y microscopa de epifluorescencia. Desventajas: No es aconsejado para coloraciones permanentes como Tricrmica. Conservante inadecuado para la morfologa de trofozoitos. Puede interferir con PCR, especialmente luego de un tiempo prolongado de fijacin. Conservante: Ventajas: Los componentes fijan y colorean al mismo tiempo. MIF Formol al 10%

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Fcil de preparar. til para trabajos de campo. Vida media prolongada. Adecuado para tcnicas de concentracin. No es aconsejado para coloraciones permanentes como Tricrmica. Conservante inadecuado para la morfologa de trofozoitos. Yodo interfiere con otros colorantes y la fluorescencia. Yodo puede distorsionar a los protozoos. Conservante: Ventajas: Buen conservante de la morfologa de trofozoitos y quistes. Fcil de preparar las coloraciones permanentes como Tricrmica. Las muestras conservadas permanecen estables por mucho tiempo. Desventajas: Inadecuado para la conservacin de la morfologa de huevos, larvas, coccidios y microsporidia. Contiene compuestos mercuriales. Difcil de preparar en el laboratorio. Difcil y caro de eliminar. No sirve para tcnicas de concentracin. No puede usarse para tcnicas de ELISA. No es adecuado para coloraciones cido-alcohol resistentes (safranina). Soluciones Conservadoras Formol al 10% Reactivos Formaldehdo al 40% 100 ml Agua destilada SAF Reactivos Acetato de sodio cido actico glacial Formaldehdo al 40% 1,5 g 2 ml 4 ml 900 ml PVA

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Agua destilada PVA Reactivos PVA Alcohol etlico Cloruro de mercurio, acuoso saturado cido actico glacial Glicerina

92,5 ml

10 g 62,5 ml

125 ml 10 ml 3 ml

Solucin saturada de Cloruro de Mercurio Cloruro de Mercurio Agua destilada Preparacin 1- Mezclar los ingredientes lquidos. 2- Agregar el PVA (no agitar) 3- Cubrir el erlenmeyer con papel aluminio, dejarlo toda la noche en contacto. 4- Al da siguiente calentar hasta 75 C. Luego agitar hasta obtener una solucin homognea ligeramente lechosa (30 segundos) Solucin merthiolate-yodo-formaldehdo (MIF) Solucin I (solucin MF): Glicerina 2 ml, Formaldehdo 10 ml, Tintura de merthiolate 1:1000ml. 80 ml, Agua destilada 100 ml Solucin II (solucin de yodo-lugol): Yodo cristales 5 g, Yoduro de potasio 10 g, Agua destilada 100 ml. El yoduro de potasio se disuelve en agua y el yodo es adicionado lentamente hasta su completa disolucin. Se filtra y se mantiene la solucin en frasco color mbar. Tcnicas de Concentracin La concentracin de huevos, larvas y quistes en heces ha llegado a ser un procedimiento de rutina como parte de un examen completo para la deteccin de los parsitos intestinales y se puede realizar como complemento del examen directo. 110 g 1000 ml

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Los procedimientos de concentracin permiten la deteccin de protozoos y/o helmintos emplendose dos mtodos: de sedimentacin y flotacin, o una combinacin de ambos, para separar los protozoos y los huevos de helmintos de las heces, utilizando las diferencias en el peso especfico. Se deben emplear cuando la cantidad de muestra fuera pequea, en un control de tratamiento o cuando se deba transportar poca cantidad de muestra a un lugar distante. Concentracin por Sedimentacin Los parsitos se concentran por accin de la gravedad, suspendiendo las heces en agua corriente, agua destilada o solucin salina y dejando que sedimenten naturalmente o por centrifugacin. Estos mtodos son principalmente tiles para la concentracin de quistes, ooquistes y huevos. Ventajas: es fcil de realizar, no requiere observacin microscpica inmediata y se puede aplicar a la concentracin de la mayora de los parsitos intestinales. Desventajas: la observacin microscpica puede dificultarse por concentracin de elementos no parasitarios. Existen varios mtodos de sedimentacin: a) Sedimentacin espontnea: mtodo de sedimentacin sencilla mtodo de sedimentacin simple de Lumbreras mtodo de Baermann- Moraes b) Sedimentacin por centrifugacin: mtodo de Charles- Batherlemy mtodo de formol-ter o Ritchie mtodo de Acetato de Etilo (macro y micro tcnica) Tcnicas de Flotacin El mtodo de flotacin emplea un medio lquido ms pesado que los parsitos permitiendo que los mismos suban a la superficie y puedan ser recuperados de la pelcula superficial. Ventajas: el preparado es ms lmpido, facilitando la observacin microscpica. Desventajas: debe hacerse la observacin microscpica en menor tiempo debido a que la pelcula superficial puede destruirse y los parsitos caer al fondo del tubo, a su vez, los parsitos de mayor peso que la solucin empleada no flotarn. Existen varios mtodos de flotacin:

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a) mtodo de Faust o de sulfato de Zinc al 33% b) mtodo de Willis Molloy o de solucin saturada de cloruro de sodio c) mtodo de Sacarosa de Sheather

Tcnicas para el recuento de huevos de helmintos Se basan en la cuantificacin del nmero de huevos por gramo o miligramo de heces. Existen varios mtodos para el recuento de huevos: Tcnica de Beaver de recuento directo de huevos Tcnica de recuento de huevos por dilucin de Stoll- Hausheer Tcnica de Kato- Katz

MTODOS DE DIAGNSTICO
Sedimentacin espontnea Mtodo de Sedimentacin sencilla 1- Homogeneizar unos 10 gramos de heces en 10 veces su volumen de agua corriente. 2- Verter la materia fecal en copas de vidrio o vasos de precipitado de 250 a 500 ml 3- Dejar que sedimente durante 1 hora. 4- Eliminar por sifn los dos tercios superiores, o verterlos con cuidado, para eliminar los detritus. 5- Agregar agua hasta llenar casi el recipiente y resuspender las heces con varilla. 6- Repetir la operacin 1 o 2 veces ms hasta que el sobrenadante quede relativamente lmpido. 7- Eliminar el lquido y con una pipeta obtener una pequea porcin del sedimento para 8- Observacin microscpica. Es un mtodo lento y de poca concentracin para los protozoos intestinales. Los huevos de helmintos sedimentan en el fondo del recipiente en un estado viable y sin deformacin. Mtodo de Lumbreras modificado Se utiliza para la bsqueda de huevos de Fasciola heptica en heces o bilis. No se puede utilizar un mtodo de centrifugacin porque los huevos se rompen ni de flotacin porque son muy pesados. 1- Colocar 2 ml de la muestra (heces o bilis) en una copa de Lumbreras o tubo de centrfuga.

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2- Agregar 5 ml de solucin detergente al 10% para emulsionar las grasas. 3- Agregar 0,5 ml de alumbre frrico al 1% para favorecer el gradiente de densidad. 4- Homogeneizar suavemente. 5- Dejar en reposo 30 minutos. 6- Sacar con pipeta pasteur una gota del fondo de la copa. 7- Observar con microscopio. Mtodo de Baermann-Moraes Se utiliza para la separacin de larvas, especialmente en estrongyloidiosis, para concentrarlas a partir de heces, cultivos o tierra. 1- Colocar un embudo en un soporte vertical, agregando al vstago del embudo una goma de caucho cerrada con una pinza. 2- Verter agua en el embudo, a temperatura de 37- 42, hasta cerca del borde. 3- Colocar sobre el embudo una malla metlica o colador, cubierto con gasa doble de tal forma que haga contacto con el agua tibia. 4- Poner sobre la gasa 8 a 10 gramos de materia fecal, tierra o material de cultivo. 5- Puede colocarse una bolsa con hielo en la parte superior del colador para acelerar el proceso. 6- Dejar de 60 a 90 minutos. 7- Las larvas migran por diferencia de temperatura y sedimentan en la porcin de.la goma de caucho de donde se colectan en un tubo por apertura de la pinza. Sedimentacin por centrifugacin Mtodo de Charles Barthelemy modificado por Bacigalupo y Rivero 1-Mezclar 10 gramos de heces con 50 ml de solucin fisiolgica, o agua de la canilla. 2-Tamizar a travs de un colador metlico. 3-Filtrar sobre gasa en un embudo. 4-Recoger 10 ml del filtrado en un tubo de centrfuga. 5-Centrifugar 5 minutos a 1500 rpm. Descartar el sobrenadante. 6-Repetir esta operacin 3 veces o hasta que el sobrenadante quede lmpido. 7-Resuspender el sedimento con solucin fisiolgica o agua de la canilla ms 2 ml de ter sulfrico. Tapar con tapn de goma y agitar vigorosamente para extraer las grasas.

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8-Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. Descartar el tapn graso de un golpe seco, conservando el sedimento. 9-Examinar con microscopio el sedimento. Mtodo de formol- ter o de Ritchie 1- Filtrar 10 ml de suspensin de heces por un embudo con una capa de gasa. 2- Recoger 10 ml del filtrado sobre un tubo de centrfuga. 3- Centrifugar 5 minutos a 2000 -2500 rpm. Descartar el sobrenadante. 4- Repetir esta operacin 3 veces o hasta que el sobrenadante quede lmpido. 5- Resuspender el sedimento con formol 10%. Dejar 5 a 10 minutos en reposo. 6- Agregar 3 ml de ter sulfrico. Tapar con tapn de goma y agitar vigorosamente 30 segundos para extraer las grasas. 7- Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. Se forman cuatro capas: 1) capa de ter, 2) tapn de restos fecales, 3) capa de formol, 4) sedimento. Descartar las 3 capas primeras, conservando el sedimento. 8- Examinar con microscopio el sedimento. Mtodos de Acetato de Etilo Macro tcnica 1- Mezclar 10 ml de una suspensin de heces en agua. 2- Centrifugar 2 minutos a 2.000-2500 rpm. Descartar el sobrenadante. 3-Agregar 9 ml de formol al 10% y mezclar. 4- Agregar 4 ml de acetato de etilo. 5-Agitar 30 segundos y centrifugar 2 minutos a 1.800-2.000 rpm. Las capas formadas son: solvente, capa de restos, formol y sedimento. 6-Examinar con microscopio el sedimento. El acetato de etilo es menos inflamable, preserva la morfologa de los parsitos y la concentracin es comparable con la de otras tcnicas. Micro tcnica 1- Colocar en un tubo eppendorf 0,5 ml de una suspensin de heces en formol al 10%. La proporcin formol-heces es de 3:1 a 5:1. 2- Agitar la muestra, agregar 0,25 ml de acetato de etilo. 3- Tapar el tubo y agitar para extraer las grasas.

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4- Centrifugar 1 minuto a 1800-2.000 rpm. Descartar el tapn graso de un golpe seco, conservando el sedimento. 5- Examinar entre porta y cubreobjetos el sedimento. Esta tcnica se propone como alternativa cuando se cuenta con pequeas cantidades de heces, para aplicar en neonatos, nios inmunodeficientes y tambin cuando se necesita transportar el material de un lugar a otro existiendo limitaciones de peso. Mtodos de Flotacin Mtodo de Faust o de Sulfato de Zinc al 33% La concentracin de sulfato de zinc para hacer flotar los elementos parasitarios tiene un peso especfico de 1.180. Solucin acuosa de sulfato de zinc puro: 333 g. Agua destilada c.s.p.: 1.000 ml 1-Mezclar 10 gramos de heces con 50 ml de solucin fisiolgica o agua de la canilla. 2-Tamizar a travs de un colador metlico. 3-Filtrar sobre gasa en un embudo. 4-Recoger 10 ml del filtrado sobre un tubo de centrfuga. 5-Centrifugar 5 minutos a 1500 rpm. Descartar el sobrenadante. 6-Repetir esta operacin 3 veces o hasta que el sobrenadante quede lmpido. 7-Agregar al sedimento final 2 o 3 ml de solucin de sulfato de zinc al 33% y homogeneizar con varilla. 8-Completar con sulfato de zinc el tubo de centrfuga sin volver a homogeneizar. 9-Centrifugar 1 o 2 minutos a 1500 rpm. Extraer con aro de alambre unas gotas de la pelcula superficial sin retirar el tubo de la centrfuga o hacindolo con sumo cuidado para evitar que por agitacin se destruya la pelcula. Solucin saturada de Sulfato de Zinc al 33% Sulfato de zinc puro Agua destilada 333 gramos CSP 1000 ml

Mtodo de Willis-Molloy o de solucin saturada de Cloruro de Sodio 1-Disolver sal de cocina en agua caliente hasta que haya saturacin; la solucin debe tener como mnimo una densidad de 1,20. 2-Mezclar aproximadamente 1 gramo de heces con 10 o 20 ml de la solucin saturada. 3-Trasladar la mezcla a un tubo o probeta y llenar con la solucin hasta el borde. 4-Tomar 1 o 2 gotas de la pelcula superficial con aro de alambre o pipeta pasteur.

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5-Observar al microscopio.

Mtodo de Sacarosa de Sheather Solucin de Sacarosa de Sheather Sacarosa Fenol Agua destilada Metodologa 1-Filtrar 1 a 2 ml de heces con gasa en un tubo de centrfuga. 2-Lavar con agua de la canilla o agua destilada por centrifugacin hasta sobrenadante lmpido. 3-Agregar al sedimento la solucin de Sheather hasta el borde del tubo. 4- Mezclar suavemente con varilla de vidrio. 5-Dejar reposar 3 minutos o centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. 6-Retirar 1 o 2 gotas de la pelcula superficial. 7-Observar al microscopio. Tcnicas para recuento de huevos Tcnica de Beaver de recuento directo de huevos Se prepara un extendidos directo de heces de aproximadamente 2 mg. La cantidad de huevos en los extendidos se informan como huevos por extendidos y se pueden efectuar los clculos para determinar el nmero de huevos por gramo de heces. Tcnica de recuento de huevos por dilucin de Stoll- Hausheer Se utiliza un matraz aforado con la marca que indique 56 y 60 ml para facilitar el llenado con hidrxido de sodio y heces. 1- En ese matraz poner hidrxido de sodio 0,1 N hasta la marca que indique 56 ml. 2- Agregar heces hasta la marca de 60 ml. Esta cantidad de heces equivale a 4 gramos. 3- Agregar perlas de vidrio para homogeneizar y mezclar. Dejar unas doce horas, puede colocarse en la heladera durante la noche, invertir varias veces hasta obtener una suspensin homognea. 4- Con pipeta tomar 0,15 ml de suspensin y colocarla en un portaobjeto. 5- Colocar un cubreobjeto y contar los huevos del preparado en el microscopio. 500 gramos 6,5 gramos 320 ml

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6- Multiplicar el resultado por 100 para obtener la cantidad de huevos por gramo de heces. 7- Frmula: N de huevos contados x 100. 8- La estimacin de huevos por gramo variar segn la consistencia de las heces. Los valores de correccin son: x 1,5 para deposicin formada, x 2 para deposicin semiformada, x 3 para deposicin semilquida, x 4 para deposicin lquida. Mtodo de dilucin de Stoll modificado 1- Llenar un tubo de centrfuga de 15 ml, graduado, hasta la marca de 14 ml con hidrxido de sodio 0,1 N. 2- Agregar heces hasta alcanzar la marca de 15 ml. 3- Mezclar con varilla. 4- Si la deposicin es dura, dejar la suspensin en reposo durante varias horas. 5- Agitar el tubo hasta que el contenido se mezcle por completo y extraer rpidamente 0,15 ml de suspensin. 6- Transferir el material a un portaobjeto, cubrirlo con un portaobjeto y contar los huevos en toda la preparacin. 7- Multiplicar el nmero de huevos contados por 100 y aplicar las correcciones como en el mtodo anterior. Tcnica de Kato-Katz El mtodo es til para el recuento de huevos de helmintos, pero es poco sensible para infecciones leves. Se coloca 1 gramo de heces sobre un trozo de papel de aluminio. Sobre la muestra se dispone una malla metlica o plstica fina, y se raspa sobre el tamiz con una jeringa de tuberculina sin punta hasta que la deposicin llegue a una marca hecha previamente y que corresponde a un volumen de 35 mm3 (aproximadamente 50 gramos de heces) La deposicin se coloca sobre un portaobjeto y se cubre con papel celofn empapado en solucin de verde de malaquita (verde de malaquita al 3%, glicerina 50 ml y agua destilada 100 ml) El portaobjeto se invierte y sobre una superficie dura se presiona suavemente para extender la muestra. Posteriormente se deja clarificar la preparacin durante una hora a temperatura ambiente. Los huevos se cuentan recorriendo toda la preparacin. El nmero de huevos se calcula con la siguiente frmula: Huevos/ g de heces = Nmero huevos contados x 20x Factor de consistencia

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El factor de consistencia es 1 para deposicin slida; 2 para semislida y 3 para la lquida. Cultivo en tira de papel de filtro (Mtodo de Harada Mori) Para detectar e identificar larvas de Ancylostoma duodenale-Necator americanus y Strongyloides stercoralis. Material necesario: 1) Tubos de centrfuga de 15 ml. 2) Gradilla. 3) Tiras de papel de filtro de 15 cm de largo por 1 cm de ancho, con un extremo ligeramente aguzado. 4) Agua destilada. Procedimiento: 1) Centrifugar las heces incgnitas. 2) Volcar el sobrenadante. 3) Colocar con pipeta Pasteur, 0.5 a 1 g de heces a una distancia de 4 cm del extremo aguzado y dejar secar un poco. 4) Agregar a cada tubo 4 ml de solucin Locke, colocarlos en la gradilla. 5) Introducir las tiras con las heces en los tubos de centrfuga. 6) Dejar a temperatura de 24 C-28 C. Reponer la solucin que se haya evaporado a las 24 y luego a las 48 horas. 7) Observar los tubos a partir del tercer da en adelante, tomando una gota del lquido y colocndolo entre porta y cubreobjeto observando con 40x. 8) Se podrn distinguir los rasgos morfolgicos de las diferentes larvas.

Solucin Locke NaCl KCl NaHCO3 H2O 9g 0,42 g 0,20 g 1.000 ml

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COLORACIONES Colorantes para preparaciones hmedas


Solucin de Lugol Yodo (cristales pulverizados) Yoduro de potasio Agua destilada 5g 10 g 100 ml

Disolver el KI en agua e incorporar lentamente los cristales de yodo. Agitar bien. La solucin base filtrada se conserva estable por varios meses. Antes de usar, diluir cinco veces con agua destilada. Guardar las soluciones en botellas de cristal oscuro. Solucin de Dobell y O Connor Yodo (cristales pulverizados) Yoduro de potasio Agua destilada Colorante eosina Eosina Alcohol 96% Agua destilada 1g 10 ml 90 ml 1g 2g 100 ml

Coloraciones Permanentes
Coloracin Tricrmica Colorante de Gomori: 2R cromotropo SF verde claro cido fosfotngstico cido actico glacial Agua destilada 0.6 g 0.3 g 0.7 g 1 ml 100 ml

Agregar 1 ml de cido actico glacial a los componentes secos. Dejar reposar de 15 a 30 minutos y luego agregar 100 ml de agua destilada. Procedimiento para la coloracin -Alcohol etlico al 70% -Alcohol etlico al 70% que contiene 41 5 minutos (*)

solucin de Lugol (hasta color mbar) -Alcohol etlico al 70% -Alcohol etlico al 70% -Colorante de Gomori -Alcohol etlico al 90% acidificado con cido actico al 1 % -Alcohol etlico al 100% -Alcohol etlico al 70% -Alcohol etlico al 70% -Xileno o Tolueno -Montar con cubreobjetos.

2 a 5 minutos 5 minutos 2 a 5 minutos (*) 30 minutos

3 segundos humedecer 2 a 5 minutos 2 a 5 minutos 2 pasos de 2 a 5 minutos (*)

(*) En estos pasos los portaobjetos pueden mantenerse varias horas o durante toda la noche. Coloracin con Safranina al 1% Preparacin de los colorantes: Safranina al 1%: 1 g de safranina y 100 ml de agua destilada. ClH 3%: 3 ml de HCl y 97 ml de metanol Azul de Metileno 1%: 1 g de Azul de Metileno y 100 ml de agua destilada. Procedimiento para la coloracin 1- Cubrir con metanol 5 minutos. 2- Agregar Safranina 1%. 3- Calentar hasta desprendimiento de vapores. Dejar en reposo 5 minutos. 4- Lavar con agua destilada o de la canilla. 5- Agregar HCl 3% en Metanol, 3 a 5 segundos. 6- Lavar con agua. 7- Contrastar con azul de metileno 1% durante 1 minuto. 8- Lavar con agua corriente y dejar secar.

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Coloracin de Ziehl Neelsen modificada Preparacin de los colorantes Carboxifucsina: disolver 1g de fucsina bsica en 10 ml de etanol al 95%. Disolver 5 g de cristales de fenol en 100 ml de agua destilada. Mezclar ambas soluciones. Es estable un ao a temperatura ambiente. Sulfrico al 5%: 5 ml de cido sulfrico en 95 ml de agua destilada. Procedimiento para la coloracin 1-Cubrir el preparado con carboxifucsina. 2-Calentar hasta desprendimiento de vapores. Dejar en reposo 5 minutos. 3-Lavar con agua destilada o de la canilla. 4-Decolorar con sulfrico al 5%, 5- Lavar con agua destilada o de la canilla. 6-Cubrir con azul de metileno al 1% Coloracin May Grunwald Giemsa Procedimiento para la coloracin 1-Cubrir con May Grunwald 2-Agua estabilizada 1/50 3-Cubrir con Giemsa diluido (15 gotas de Giemsa en 10 ml de agua destilada) 4-Lavar con agua. Procedimiento para la Coloracin de Giemsa 1-Cubrir con Giemsa diluido (1gota de Giemsa por ml de agua estabilizada) 2- Lavar con agua. La coloracin de Ziehl Neelsen modificada permite colorear ooquites de Cryptosporidium, Cyclospora e Isospora, debido al comportamiento cido resistente de la cubierta qustica de estos parsitos. La coloracin de Safranina permite colorear ooquites de Cryptosporidium y Cyclospora. El examen microscpico es todava considerado el gold standard para el 15 a 20 minutos 5 minutos 2 a 3 minutos 1 minuto. 1 minuto.

diagnstico de las enfermedades parasitarias, pero si una correcta identificacin del parsito no puede ser realizada, las muestras de heces pueden ser analizadas usando tcnicas moleculares tales como la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), (RFLP) o secuenciacin de DNA si fuera necesario una mayor caracterizacin. 43