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Sesión nº 6
M. Somma, M. Querci
WELTGESUNDHEITSORGANISATION
REGIONALBÜRO FÜR EUROPA Ь
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 2
Índice
Sesión nº 6
Introducción 3
Bibliografía 32
Introducción
La invención de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por K. Mullis y sus
colaboradores en 1985 ha revolucionado la biología molecular y la medicina
molecular (Saiki et al., 1985). La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica
in vitro utilizada para amplificar enzimáticamente una región determinada de ADN
situada entre dos regiones de ADN cuya secuencia se conoce. Mientras que antes
solo podían obtenerse cantidades mínimas de un gen específico, ahora incluso un
único ejemplar de un gen puede amplificarse con la PCR hasta un millón de
ejemplares en tan solo unas pocas horas.
Las técnicas de PCR se han hecho indispensables para muchos procedimientos
comunes, como la clonación de fragmentos específicos de ADN, la detección e
identificación de genes para diagnóstico y medicina legal, y en la investigación de
modelos de expresión de los genes. Más recientemente, la PCR ha permitido la
investigación de nuevos campos, como el control de la autenticidad de los alimentos,
la presencia de ADN modificado genéticamente y la contaminación microbiológica.
Para comprender los principios de la PCR y sus aplicaciones, debe atenderse en
primer lugar a la naturaleza de la molécula del ADN, por lo que en la sección
siguiente se describen la estructura y la replicación del ADN.
Para mayor facilidad, estos cuatro nucleótidos se denominan dNTP (por las siglas en
inglés de desoxinucleósido-trifosfato). Un nucleótido está formado por tres grandes
partes: una base púrica (adenina, A, o guanina, G), o una base pirimidínica (citosina,
C, o timina, T), un azúcar pentosa (desoxirribosa) y un grupo trifosfato. Como se
muestra en la figura 1, una base púrica o pirimidínica está unida a un anillo de
pentosa por un enlace N-glucosídico, y un grupo fosfato está unido al átomo de
carbono 5' del azúcar por un enlace diéster. En el ácido ribonucleico, ARN, la timina
está sustituida por el uracilo (U) y la molécula de desoxirribosa por la ribosa.
Desoxicitidina - Desoxitimidina -
trifosfato : dCTP trifosfato = dTTP
Estructura. La figura 2 indica cómo forman los nucleótidos una cadena de ADN. El
ADN se forma uniendo los nucleótidos entre el grupo fosfato de un nucleótido (que
se sitúa en el átomo de C nº 5 de la molécula de azúcar) y el hidroxilo del átomo de
C nº 3 de la molécula de azúcar del nucleótido anterior. Para efectuar este enlace,
se separa un grupo difosfato, con liberación de energía. Los nuevos nucleótidos se
añaden siempre en el extremo 3’ de la cadena. Como se indica en la figura 3, el
ADN es bicatenario (excepto en algunos virus) y las dos cadenas o hebras se
aparean entre sí de forma muy precisa. Cada base de una cadena se aparea con un
solo tipo de base de la cadena contraria, formando un par de bases (pb): A siempre
Extremo 5’
Extremo 3’
Las bases forman un núcleo hidrófobo dentro de la doble hélice. Los azúcares y los
grupos fosfato (en su forma aniónica) constituyen la capa hidrófila exterior de la
molécula. En condiciones fisiológicas, la hélice de ADN bicatenario es más estable
que una hélice de ADN monocatenario.
Gen
Puente de hidrógeno
Base
Figura 3. Estructura del ADN de una célula (imagen: Andy Vierstraete, 1999).
Hebra original
Hebra nueva
Cebador de ARN
Hebra
retrasada Hebra adelantada
Fragmento de Okazaki
Para desenrollar la doble hélice y sintetizar una nueva hebra de ADN hacen falta
varias enzimas. La topoisomerasa y la helicasa se encargan de desenrollar el ADN
rompiendo la estructura superenrollada y cortando una sola hebra de ADN. A
continuación, una primasa (parte de un agregado de proteínas denominado
primosoma) une un pequeño cebador de ARN al ADN monocatenario, para actuar
como extremo 3'OH a partir del cual la ADN polimerasa inicia la síntesis. Este
cebador de ARN es eliminado finalmente por la ribonucleasa H y el hueco se rellena
mediante la ADN polimerasa I. En esta fase, la ADN polimerasa avanza a lo largo de
una molécula monocatenaria de ADN (una hebra sencilla), recogiendo dNTP libres
para unirlos mediante puentes de hidrógeno a los dNTP complementarios situados
en dicha hebra sencilla de ADN (A con T y G con C), y mediante un enlace
fosfodiéster covalente al nucleótido anterior de la propia hebra nueva. La energía
conservada en el trifosfato se utiliza para unir covalentemente cada nuevo nucleótido
a la segunda hebra en crecimiento. Hay diferentes formas de ADN polimerasa, pero
es la ADN polimerasa III la que se encarga de la síntesis progresiva de nuevas
hebras de ADN. La ADN polimerasa actúa solo desde el extremo 5’ hacia el 3’.
Como una de las hebras de la doble hélice tiene el sentido 5’-3’ y la otra el 3’-5’, la
ADN polimerasa sintetiza una segunda copia de la hebra 5’-3’ (hebra retrasada) a
tramos (fragmentos de Okazaki) (Ogawa y Okazaki, 1980). La síntesis de las nuevas
copias de la hebra 5’-3’ se muestra en la figura 4. La otra hebra, la hebra
adelantada, puede avanzar directamente con la síntesis, desde el extremo 5' al 3',
según se va desenrollando la hélice. La ADN polimerasa no puede empezar la
síntesis ex novo a partir de una hebra sencilla desnuda, sino que necesita la
presencia de un cebador con un grupo 3’OH libre al que pueda unir un dNTP.
Una ligasa cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre un extremo 3’OH y
un 5’fosfato, libres y adyacentes. Así puede rellenarse el hueco que queda cuando
se elimina el cebador de ARN. Ha de señalarse la importancia de la presencia de
proteínas de unión a ADN monocatenario para mantener la estabilidad de la
horquilla de replicación. El ADN monocatenario es muy lábil, o inestable, y estas
proteínas se unen a él mientras es monocatenario, protegiéndolo así de la
degradación.
Principios de la PCR
La PCR se basa en el mecanismo de la replicación in vivo del ADN: el ADN
bicatenario se desenrolla y pasa a ADN monocatenario, se duplica y se vuelve a
enrollar. Esta técnica consiste en ciclos repetitivos de:
• desnaturalización del ADN por fusión a temperatura elevada, a fin de convertir el
ADN bicatenario en ADN monocatenario;
• unión (anillamiento) de dos oligonucleótidos, utilizados como cebadores, al ADN
diana;
• extensión de la cadena de ADN por adición de nucleótidos a partir de los
cebadores utilizando ADN polimerasa como catalizador, en presencia de iones
Mg2+.
Fase 1: desnaturalización
Fase 2: unión
Cebadores directos
e inversos
Fase 3: extensión
Sólo dNTPs
Tras cada ciclo, las hebras de ADN recién sintetizadas pueden servir de ADN molde
para el ciclo siguiente. Como se indica en la figura 6, el producto principal de esta
reacción exponencial es un segmento de ADN bicatenario cuyos extremos vienen
definidos por los extremos 5’ de los oligonucleótidos cebadores y cuya longitud viene
dada por la distancia entre los cebadores. Los productos de una primera ronda de
amplificación efectiva son moléculas de ADN de diferentes tamaños, cuyas
longitudes pueden superar la distancia entre los sitios de unión de los dos
cebadores. En la segunda ronda, estas moléculas generan hebras de ADN de
longitud definida que se acumulan de forma exponencial en rondas posteriores de
amplificación y constituyen los productos dominantes de la reacción. Así, la
amplificación, que es el número final de ejemplares de la secuencia diana, se
expresa con la siguiente ecuación:
(2n-2n)x (1)
donde n es el número de ciclos, 2n es el número de moléculas del primer producto
obtenidas tras el primer ciclo y de los segundos productos obtenidos tras el segundo
ciclo con longitud indefinida, x es el número de ejemplares del ADN molde original.
Teóricamente, al cabo de 20 ciclos de PCR habrá una amplificación de 220 veces,
suponiendo que cada ciclo tiene un rendimiento del 100 %. El rendimiento de una
PCR varía de un ADN molde a otra y depende del grado de optimización que se
haya conseguido.
En los párrafos siguientes se encuentra una descripción pormenorizada de las tres
fases de la amplificación por PCR (desnaturalización del ADN molde, anillamiento
del cebador y extensión) (Sambrook et al., 1989).
4° ciclo
gen deseado
3er ciclo
2° ciclo
ADN plantilla
68000 millones de
4 8 16 32 ejemplares
ejemplares ejemplares ejemplares ejemplares
Instrumentos
Fase 1 :
Desnaturalización de la ADN
Fase 3 :
Extensión
del cebador
Temperatura (°C)
Fase 2 :
Hibridación del
cebador
Un « ciclo »
Minutos
Para que la PCR tenga éxito son fundamentales los parámetros ya mencionados de
los ciclos térmicos, en sus fases de desnaturalización, anillamiento del cebador y
extensión del cebador, así como los componentes utilizados y el número de ciclos
descritos en los párrafos siguientes.
ADN diana
Cebadores
ADN polimerasa
Taq/ Deep-
Vent Pfu Tth UITma
AmpliTaq Vent
Thermo-
Thermus Pyrococcus Pyrococcus Thermus Thermotoga
Fuente coccus
aquaticus GB-D furiosus thermophilus maritima
litoralis
Taq: natural
AmpliTaq: Para Para Para Para
para ingeniería ingeniería Natural ingeniería ingeniería
Aplicación
ingeniería genética genética genética genética
genética
T½ de actividad
40 1380 400 >120 20 > 50a
a 95 ºC (min)
Actividad
exonucleásica
Sí No No No Sí No
de 5’ a 3’
Actividad
exonucleásica
No Sí Sí Sí No Sí
de 3’ a 5’
Procesividad 50-60 ? 7 ? 30-40 ?
Velocidad de
extensión 75 ? >80 60 >33 ?
(nt/s)
Extremos de
> 95 % > 95 %
ADN 3’A ? 3’A Romos
romos romos
resultantes
PM en kDa 94 ? ? 92 94 70
ADN polimerasas Vent, DeepVent, Pfu y UITma. Estas enzimas tienen actividad
exonucleásica de 3’ a 5’, que les permite eliminar los residuos mal apareados hasta
que se forme un extremo con bases correctamente unidas. Sin embargo, la actividad
exonucleásica de 3’ a 5’ puede provocar la degradación de los cebadores. Por tanto,
la enzima solo debería añadirse una vez iniciada la reacción, o bien habría que
utilizar cebadores modificados químicamente.
Desoxirribonucleósido-trifosfatos
Al diseñar cebadores para PCR hay que tener en cuenta diversas variables. Entre
ellas cabe destacar:
• la longitud del cebador;
• la temperatura de fusión (Tf);
• la especificidad;
• las secuencias complementarias del cebador;
• el contenido de G/C y los tramos de polipirimidina (T, C) o polipurina (A, G);
Es importante no olvidar que son dos los cebadores que se añaden a una PCR en
relación con un sitio o diana. Los dos cebadores oligonucleotídicos deben diseñarse
de forma que tengan temperaturas de fusión similares. Si los cebadores no se
ajustan bien en cuanto a su Tf, la amplificación será menos eficaz o incluso podrá no
darse en absoluto, ya que el cebador con la Tf más elevada funcionará mal a
temperaturas más bajas y es posible que el cebador con la Tf más baja no trabaje a
temperaturas más elevadas. La forma más precisa de calcular las temperaturas de
fusión de los oligonucleótidos es utilizar cálculos termodinámicos del vecino más
próximo con la fórmula:
4 12°C 22 66°C
6 18°C 24 72°C
8 24°C 26 78°C
10 30°C 28 84°C
12 36°C 30 90°C
14 42°C 32 96°C
16 48°C 34 102°C
18 54°C 36 108°C
20 66°C 38 114°C
conseguir una PCR más eficaz, aunque no siempre es necesario para que la PCR
tenga éxito. En general, los productos que tienen entre 100 y 600 pares de bases se
amplifican de forma eficaz en muchas PCR. En caso de duda, la Tf del producto
puede calcularse con la fórmula siguiente:
Especificidad
PCR especializada
Además de la amplificación de una secuencia diana de ADN por los procedimientos
normales de PCR que se han descrito, se han desarrollado varios tipos
especializados de PCR para aplicaciones específicas.
PCR anidada
PCR Múltiplex
Mientras que la PCR normal utiliza en general un solo par de cebadores para
amplificar una secuencia específica, la PCR Múltiplex utiliza múltiples pares de
cebadores para amplificar muchas secuencias simultáneamente. La presencia de
muchos cebadores de PCR en un solo tubo puede causar muchos problemas, como
el aumento de la formación de productos de PCR con errores de cebado, dímeros de
cebadores y la discriminación de la amplificación de fragmentos más largos de ADN
(Atlas y Bey, 1994).
Para este tipo de amplificación por PCR, se eligen cebadores con temperaturas de
hibridación similares. Las longitudes de los productos amplificados deben ser
similares; si hay grandes diferencias entre las longitudes de los ADN diana se
favorece la amplificación de la diana más corta respecto a la más larga, lo que
implica diferencias en el rendimiento de los productos amplificados. Por otra parte,
los tampones de PCR Múltiplex contienen un aditivo de la polimerasa Taq, que
reduce la competencia entre amplicones y la discriminación de fragmentos más
largos de ADN durante la PCR Múltiplex.
Los productos de la PCR Múltiplex pueden seguir hibridándose con una sonda
específica del gen con fines de verificación.
La PCR en la práctica
Como ya se ha visto en secciones anteriores, la utilización de la PCR está muy
difundida porque se trata de una técnica potente de análisis y preparación. No
obstante, dada la naturaleza de este procedimiento, es posible que cantidades traza
de ADN contaminante sirvan de ADN molde, lo que provocaría la amplificación de un
ácido nucleico distinto del diana (falsos positivos). Así pues, resulta fundamental
realizar la amplificación por PCR en un entorno libre de ADN. El riesgo de
contaminación se reduce si se dispone de zonas de trabajo físicamente separadas y
dotadas de su propio material. El requisito previo más importante para reducir al
mínimo la tasa de falsos resultados positivos es el cumplimiento estricto de las
normas de descontaminación (descontaminación de ácidos nucleicos, prevención de
la formación de aerosoles, etc.). La contaminación de la PCR puede deberse a
fuentes diversas, como las siguientes:
• mesas de laboratorio, equipos y pipetas, que pueden estar contaminados con
preparados anteriores de ADN, o con fragmentos de restricción purificados;
• contaminación cruzada entre muestras;
• productos de amplificaciones anteriores por PCR.
Esta sección recoge algunas recomendaciones, con el fin de definir los requisitos
normales para el establecimiento y mantenimiento de un entorno limpio para
cualquier sistema de ensayo con PCR, independientemente del número de muestras
tratadas (Roth et al., 1997).
Uracil- Calor
ADN ─►
─► pH alcalino
Glucosilasa
A=Adenina
U=Uracilo
G=Guanina
Por supuesto, este método exige que todas las PCR del laboratorio se realicen con
dUTP en lugar de con dTTP.
Ha de tenerse en cuenta lo siguiente cuando se utilicen productos de PCR que
contengan dU en aplicaciones posteriores:
• los productos de PCR que contienen dU funcionan tan bien como los que
contienen dT cuando se utilizan como dianas de hibridación o como ADN moldes
para la técnica del didesoxi;
• los productos de PCR que contienen dU pueden clonarse directamente si se
transforman en hospedadores bacterianos UNG-;
• un sustrato que contenga dU es digerido fácilmente por ciertas enzimas de
restricción comunes (p. ej., EcoR I y BamH I), mientras que otras (p. ej., Hpa I,
Hind II, Hind III) presentan una actividad reducida sobre estos sustratos;
• no se recomienda utilizar ADN con dU en estudios sobre la unión a proteínas ni
sobre la interacción del ADN con proteínas.
Los reactivos fundamentales para la PCR son agua, el tampón de reacción, una
ADN polimerasa termoestable, cebadores oligonucleotídicos, desoxinucleótidos
(dNTP) y ADN molde (diana), así como iones de magnesio (Mg2+). En general, todos
los reactivos (excepto el ADN molde) se mezclan en un solo tubo, con un volumen
suficiente según el número de reacciones que se vaya a realizar (mezcla maestra).
La mezcla maestra se reparte a continuación en alícuotas en varios tubos y se
añade el ADN molde. El uso de una solución maestra reduce el riesgo de
contaminación y mejora el rendimiento de la PCR por los motivos siguientes:
• se garantiza una calidad uniforme de la solución respecto a todos los reactivos
para una serie de análisis;
• disminuye el riesgo de contaminación de la solución original y de las resultantes;
• pueden pipetearse volúmenes mayores;
• hay menos etapas de pipeteado, con lo que se ahorra tiempo.
El éxito en la amplificación de la región de interés depende de la cantidad y de la
calidad del ADN molde. La cantidad de ADN molde necesaria es función de la
complejidad de la muestra de ADN. Teniendo en cuenta que el tamaño del genoma
Controles
Control Método
Contaminación de los reactivos con Control negativo de la PCR sin ADN molde
el ADN diana (solo mezcla maestra)
Controles positivos
preparado de referencia que contenga una concentración conocida del ADN diana
estudiado.
Controles negativos
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