KDCE Tinciones especiales.......................... Tinciones de inmunofluorescencia ... ( aplalo 4. CULTIVO DF.

I AS BACTERIAS 27 27 29

Medios de cultivo ............................. 29 Clases de medios de cultivo ............. 29 Crecimiento de las bacterias en lo* medios de cultivo Componentes usuales de los medios de cultivo 31 Preparacin de medios de cultivo .... 32 Medros de cultivo mi* frecuentes en Microbiologa Clnica Capitulo 5. PRINCIPALES BACTERIAS DE INTERES CLINICO ... Bacteria de inters clnico .............. 45 Cocos grampositivos ........................ 45 Cocos gramnegativos ........................ 48 Bacilo* grampositivos ...................... 49 Bacilos gramnegativos ...................... 53 Bacterias que no se tiften por la tincin de Gram Capitulo 6. MICROBIOLOGA CLINICA DIAGNOSTICA

30

34 45

60

Importancia actual de la Microbiologa Clnica 63 El laboratorio de Microbiologa Onicn 64 Organizacin de un laboratorio de Microbiologa 65 Nomus de seguridad en un laboratorio de Microbiologa Consideraciones generales sobre el anlisis Microbiotgico Normas para la recogida y transporte de muestras microbioliJgjcas .. Envases para la recoleccin y transpone de muestras 6$ Captulo 7. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS MICROBIOLOGIAS Cultivo y aislamiento de las hacterias Tcnicas de inoculacin ................... 71 74

65 67 67

71

Incubacin de medios inoculado* .... 77 Procesamiento de muestras para aislamiento primario

X

79 89

Capitulo 8. CARACTERIZACIN TAXONMICA DE LAS BACTERIAS Diagnstico miaobiolgico convencional Metabolismo de carbohidratos ......... 96 Metabolismo de protenas ................ 98 89

1 Generalidades sobre estructura y metabolismo de las bacterias

MICROBIOLOGA Y MICROORGANISMOS Es la ciencia que estudia los microbios, seres infinitamente pequeos, invisible a simple vista y slo preciables mediante aparatos de gran amplificacin como el microscopio. I.O* microbios abundan enormemente en la naturaleza. Unas veces son vestales demntales: bacterias y hongos inferiores, unicelulares las primeras (Bacteriologa) y pluricelulares generalmente los hongos (Mioologa); otras veces son animales unicelulares: protozoos (Parasitologa). Todava ms sencillos y pequeos son los viras, molculas proteicas con vida propia (Virologa). Las bacterias, hongos, protozoos y virus, visen en la naturaleza como parsitos y ejercen sobre el hospedador una accin que nunca sera inofensiva o indiferente, sinoperjudicial en grado variable, til conocimiento de estos microbios ha permitido determinar el verdadero origen y desarrollo (etiologa y patogenia) de un gran nmero de enfermedades que tienen carcter infeccioso o contagioso, de gran morbilidad y mortalidad: se transmiten en general de forma epidmica afectando simultneamente a un gran nmero de poblacin, con una trascendencia social de mximo inters. Actualmente, las enfermedades infecciosas han cobrado un inusitado inlcrxS por lu aparicin de nuevos procesos y la reaparicin de otros clsicos ya cau olvidados-, el progreso de la Medicina con la introduccin de nuevas y eficaces tcnicas diagnosticas y teraputicas ha multiplicado la frecuencia de las lla madas infecciones nosocomiales.

SITUACIN TAXONOMICA DE LAS BACTERIAS Se define como taxonoma la teora y prciica de clasificar organismos. La clasificacin es el modo de ordenar los organismos, que puede hacerse de forma sis-

MtCftOftOUXfr CuroCA APUCMM tcmiica o racional, de acuerdo con sus caracteres feiiotipicos y genotfpicos. la nomenclatura es la asignacin de un nombre siguiendo las reglas taxonmicas establecidas. La taxonoma se ordena por escalones jerrquicos; reino, divisin, clase, orden, tribu, familia, genero y especie. Es el concepto de especie el que predomina: d gnero engloba a una sene de especies que presentan afinidad, la nomenclatura es binomial. contempla el gnero y la especie latinizados. El gnero va delante empezando en mayscula, y la e?*>ecie detrs coincidiendo en gnero (masculino, femenino o neutro), en cursiva o subrayados (ejemplo. Esclterichia cot). Por debajo de In especie se encuentran kw ttxones infraespeci fieos (tipos o variedades) de cieno inters epidemiolgico: fciovariedad (bioqumica), scrovariedad (antignica). fago- variedad. morfovariedad. ecovariedad. Las variedades se escriben tambin en lati y comenzando son mayscula (ejemplo, Salmow'Ila entfrtca serovariedad o sero- tipo Knienlidis\ El libro Ber/iey's Manualof determi'iar kacteriofozy recoge la clasificacin y sistemtica oficial de las bacterias, con sus nombres latinizados. Estos nombres se rigen por un cdigo internacional y son reviradas por organismos cientficos. En 1984 se public la dcima edicin. las bacterias se consideran pcotistas (unicelulares) pertenecientes ul reino de los Procariotas. seres caracterizados por no poseer un verdadero ncleo, sino una for acin nuclear sin m membrana, pero si tienen pared celular (prcticamente todos); los hongos, algas unicdularcs y protozoos, se incluiran dentro de los Encanlas. El reino Procarioia tiene dos divisiones; 1. Cianobocierios, son las bacterias verde azuladas que poseen pigmentos similares a la clorofila. 2. Bacterias, donde se engloban cuatro divisiones: Gracilicutes: pared celular de contenido lipidioo (gramnegativas). Firmacutcs: pared celular firme (grampositivas). MoJlkutes: pared cdular blanda (sin pared celular). Meisdocutes: pared incompleta.

LA CLULA BACTERIANA 3 la estructura de las bacterias es similar a la de cualquier otra clula vegetal. Desde un punto de vista didctico, se pueden distinguir unas estructuras internas: pared celular, membrana citoplasmtica. citoplasma y formacin nuclear, todas necesarias para la vida, y otras estructuras externas: capsula, fimbrias o pili. flagelos y esporas, no imprescindibles. PARED CELULAR Da consuma y rigidez a la bacteria, aunque tiene suficiente elasticidad para permitir deformaciones espontneas reversibles. Su espesor oscila entre 10-25 rop. ms

generalidades sobre estructura y metabolismo de las bacterias delgada en los gramnegativas, y representa el 20%dd peso seco de la bacteria. Tiene poros de 1-2 mu que la hacen permeable. En ella se localizan los antigenos O (somticos). Qumicamente est constituida por glcidos. lpidos y protenas. El principal componente es un polmero mixto llamado peptidoglucano, que contiene dos he- xosas: N-acetilglucosamina y N-acetilmurtmico, y varios aminocidos: Acido meso- diaminopmlioo. D-glutmico y D-alanina. Las bacterias gramnegativas poseen una capa delgada de peptidoglucano, reforzada con lipoprotenas y lipopolisacridos (10 veces ms lpidos que las grampositivas), donde se localizan los antigenos O y las endotoxinas; las grampositivas poseen una capa espesa de peptidoglucano. cidos teicoico y tcicuronico (antigenos de superficie). Jo que las hace ms sensibles a la lisozima y a la penicilina, que actan sobre el polme Al ser ro. disgregada la pared celular por la liso/ima, la clula se transforma en una estructura llamada proto- plasto (esferoplasto). que se desintegra rpidamente. MEMBRANA CITOPLASMTICA Separa la pared celular del citoplasma. Es muy fina, de unas 15 m de espesor. Est u constituida por un complejo lipoprotcico y representa el 10 % del peso seco de la bacteria. E* semipermeable y selectiva, responsable de la regulacin osmtica y mctablica. Constitu>e una eficaz proteccin contra el medio externo, los anticuerpos y las enzimas liticav Fn ella se localizan enzimas respiratorias (citocromo- oxidasas) y unas invaginaciones que constituven los mesosornas, sin funcin concreta. CITOPLASMA Limitado por la membrana, es una masa heterognea que contiene inclusiones y organoides de la clula. Est integrado por un complejo coloidal compuesto por agua en gran proporcin, principios inmediatos, minerales y enzimas. En el se localizan vacuolas, inclusiones slidas constantes, como las mitocondrias necesarias para la funcin respiratoria, y otras inconstantes constituidas por materiales nutritivo de reserva (almidn, glucgeno, azufre, grasas, carbonato calcico, etc.). entre las que se encuentran las granulaciones metacromticas (Babes-Emsi). En el citoplasma se encuentran los ribosomas. estructuras complejas compuestas de un 40 % de protenas y un 60 % de molculas de ARN.

responsables de la sntesis de proconstituido por dos subunidades con de 30S y 50S (unidades Svcdbcrg). El concentra en el citoplasma. El colorantes y se tifie uniformemente. NUCLEOIDE

tenas: cada ribosoma est coeficiente de sedimentacin material nuclear o ADN se citoplasma retiene los

El ADN o cromosoma bacteriano consta de una larga molcula circular de do banda. En ble algunas bacterias un escaso porcentaje de ADN permanece extracro-

wcnoekx.ogw clnica aplicada mosmico formando pequeas molculas circulares llamadas psrokk*. Cuando estos ptsmidos se pueden volver a integrar en el cromosoma se les llama cptsomas. CPSULA Muctuis ballenas se rodean de una capa mucosa constituida principalmente por polisacridos complejos, de tamao variable, llamada cpsula, que no se tiftc con colorantes (se observa como un halo transparente alrededor de la clula). En ella se localizan los antigenos capsulares (K) y de virulencia (Vi). La cpsula no interviene en la permeabilidad celular y su eliminacin no afecta a la vitalidad de la bacteria. FIMBRIAS O PILI Son apndices finos y rgidos que nocen de ta membrana celular de muchas bacter ias gramnegativas constituidos por una protena (prima), responsables del fenmeno de adherencia y hemaglutinacin. Cienos pili tienen un carcter sexual (I V) y pueden poner en contacto dos bacterias para transferir el material gentico de una a otra (conjugacin). FLAGELOS Son filamentos helicoidales largos (15-25 mu) y finos que nacen de la membrana celular, constituidos por una proteina contrctil (llagclina) aniigenica (antigeno II). Constituyen un rgano de locomocin. Segn su nmero y disposicin, se diferencian: Bacterias monotricas: un solo llagelo en un polo. Bacterias anfitric-as: un llagelo en cada polo. Bacterias lofotncav un penacho de latelos en uno o ambos polos. Bacterias periiricas: flagelos distribuidos poT toda la periferia. ESPORAS Son oranos de resistencia que forman algunas bacterias (HatUlui y Oostri- dtutn. sobre todo), generalmente en el interior (endosporas). Pueden localizarse centrales, subterminalcs

o terminales, con aspecto refringente. ms o menos ovaladas Estn constituidas por ADN, 4 ARN y principios inmediatos. MORFOLOGA Y AGRUPACIONES DE LAS BACTERIAS La morfologa bacteriana es diferente de unas especies a otras, pero resulta muy poco variada. Se diligencian tres morfologas fundamentales: formas esfricas o co-

generauoac s s08re estructura y wctabcltsmo d6 cas bacterias eos (de 0,4-1 i de dimetro). formas cilindricas recias o bacilos (de lamarto muy variable, desde 0,5 x 1,5 m a I x 4 p), y formas cilindricas incurvadas o cspirilos. Tambin podemos encontrar bacterias filamentosas y ramificadas (Actinomice- tos). semejantes a micelios de hongos, bacterias largas y finas enrolladas en espiral (Leptospira) y bacterias con un gran pleomorfismo. Al dividirse las bacterias, las clulas hijas quedan unidas o prximas unas a oirs dando lugar a agrupaciones tpicas que ayudan a diferenciarlas: los cocos se agrupan en parejas (Neustri.). en cadenas (SirrpitKocxii*).en racimos (Staphrfocac- cus) y en tetradas o paquetes cbicos (.V/ICTOCOCCUT); los bacilos se agrupan en parejas. en cadenas {Badllus anthraty). en empalizada {Lsieria), letras y caracteres chinos (Corywhacterium)-.los cspirilos no suelen formar agrupaciones pero se distinguen con una sola curvatura (Vibrio), con varias y con forma ondulada (Espiroquetas). Cuando las bacterias son viejas o estn sometidas a condiciones desfavorables no presentan su morfologa y agrupaciones tpicas: surgen las llamadas formas de involucin que presentan una morfologa deformada.

REPRODUCCIN BACTERIANA Las bacterias se reproducen habiiualmcnic de forma asexual por divisin trans versal o esquizognesis (divisin binaria), originndose por estrangulamiento de la clula madre dos clulas hijas. Tambin pueden reproducirse sexualmente mediante conjugacin, en la cual la ba cteria dadora o macho (F+) se une mediante un pili a la receptora (F-) c introduce en sta un ADN lineal, transformndola en clula diploide (doble cromosoma) que. posteriormente, dar origen a dos clulas hijas. Otra forma asexual de reproduccin presente en algunas bacterias es la espo- rulacin: la espora formada da lugar a una futura clula hija. Las bacterias se consideran como agregados, ms que como individuos aisla dos. Al reproducirse, aumentan en cantidad y masa celular de manera exponen cial. La curva de crecimiento se divide en cuatro fases bien diferenciadas:

Fase de latcncia o de inactividad inicial, necesaria al adaptare al medio.

 Fase de crecimiento logartmico o exponencial, con S velocidad mxima le divisin celular y de incremento de la poblacin. Fase estacionaria, debida a la desaparicin de nutrientes y equilibrio entre crecimiento y muerte de la poblacin. Fase de declive o muerte, a causa de lisis bacteriana y disminucin gradual de la poblacin, provocada por represin de sus propios catabolitos.

FISIOLOGA BACTERIANA El ambiente apropiado para el desarrollo bacteriano requiere una gran variedad de elementos nutricionales

2 Poder patgeno de las bacterias

FLORA NORMAL Y PATOLGICA IA relacin del hombre con los microorganismos da lugar a una interaccin que puede ser beneficiosa o nociva Segn la naturaleza de csia interaccin, los microorganismos *e clasifican en: Comensales. Cuando colonizan las superficies corporales sin causar da o. Patgenos. Los que daan al husped por invasin directa y lesin o por la produccin de sustancias txicas. la colonizacin microbiana del neonato comienza cuando el nio posa a tra del canal vs uterino y es expuesto a la flora vaginal de la madre. Posteriormente entra en contacto con los microorganismos presentes en el ambiente y en otros individuos. hasta que. en poco tiempo, desarrolla su propia flora microbiana nativa (llora normal o comensal), que experimenta cambios constantes acordes con el es tilo de vida y el ambiente en que se desenvuelve. La piel normal de los humanos es habitada generalmente por numerosos mi roorganismos. c lu llora predominante induje Staph)iococcui epidernudii, especies de Micrococcus y difteroides. Otras bacterias como Staphykxocau aureut.estreptococos alfa y gammahemoliticos y levaduras, colonizan transitoriamente la piel En la conjuntiva se encuentran los mismos microorganismos de la piel, t-a accin mecnica del parpadeo y la lisozima previenen las infecciones Las fosas nasales, nasofaringe y senos accesorios estn fuertemente colonizados por bacterias, debido a la filtracin del aire a travs de la nasofaringe. Se trata de una mezcla de estreptococos del grupo viridans. especies no patgenas de \eisseria y Siaph)iococnu

cpidcrmidi*. Con frecuencia se encuentran bacterias patgenas como SirepiiKnccw pncwnoniac, Neisseria mcvingindis. Staphylococcus aureus y otras, en individuos portadores. La cavidad oral est expuesta a un gran nmero de bacterias, que varan de unosindividuos a otros. I-os estreptococos del grupo viridans representan el 3<>-60 % de la Dora, junto con anaerobios, levaduras y otros.

UKXCOO-OGlA CMCA APUCADA El tracto urogenital es normalmente estril en las porciones superiores, pero puede contener una gran concentracin de microorganismos en la uretra inferior, meato, vagina y vulva. Predominan Siaphylococcus epidermidis.estreptococos no hcmolticas y difteroides. Myccbaaetium smcgmaUs. iMdobaclus, Ureapiasma. cntcrobaacriBs y escasas levaduras, tambin pueden estar presentes en estas localizaciones. El tracto gastrointestinal es la parte del cuerpo colonizada por la mayor cantidad de microorganismos. El estmago y el leon dd individuo sano no poseen flora nativa; el duodeno y yeyuno contienen lactobarilos. estreptococos y levaduras; el colon es el mayor reservorio de microorganismos, principalmente de anaerobios como tiacentidn y Bilidobticieriitm (90 %>, tlusherii-hia cO y otras entero ha cieas, h'u.wtxKlcrium. Enterocvccus. Eubaarrium. Closlrdium. Stapfiylococats. etc. La sangre y otros tejidos internos son estriles en circunstancias normales. FACTORES DE PATOGENICIDAD EN LAS BACTERIAS Todo microorganismo capaz de producir enfermedad es patge y su pato- gcnicidad puede no tener una intensidad variable segn su virulcnda. entendindose como tal su capacidad de penetracin, invasin, adherencia a los tejidos y multiplicacin en d husped. Existen diversos factores que determinan la patogcnici- dad. presencia de fimbrias o pili (adberenda), de factores antifagocitkus, heterogeneidad antignica. produccin de toxinas y enzimas, etc. El factor antifagocltieo ms comn es el material capsular, rico en polisacridos. que protege a las bacterias capsuladas de la fagocitosis. Las toxinas pueden ser de dos clases:

Exotoxinas: de naturaleza polipcpdica. poco estables, pcscntcs en tas bacerias t gram positivas generalmente, liberadas por veredn. altamente antignicas y txicas (difteria, ttanos, botulismo. gangrena gaseosa, escarlatina, shock txico, clera). Fndotoxinas: de naturaleza lipopoliwcarldica. relativamente estable*, presentes slo en boctcrias gramnegativas. liberadas por lisis. poco antigenicas y moderadamente txicas entcrobacterias).

Las enzimas ayudan a la penetracin de los microorganismos al aduar sobre los tejidos dd 10 husped. Entre ellas tenemos:
Coagulnsa: presente en StaphyloctKiiu aurtrus favorece la formacin de cogulos como proteccin contra la fagocitosis. Colagenasa: propia de ChtJ/idlurn acta sobre tejido muscular, seo y cartilaginoso. Desoxirribonudeasa: pioducida por Sireptooxxiis pivgencs y otros, lica los exudados purulentos. Fibrinolisina: presente en estreptococos patgenos disuelve los cogulos de fibrina. Hemolisinas: las producen diversas especies para liar hemates y ouas clulas tisulares.

POOCR PAIGtNO Ot LAS BACTERIAS

Hialuronidasa: producida por cocos tr impositivos aumenta la permeabilidad de los

tejidos.

Lecitinasa: como la alfa-toxina producida por Clouridium que destruye k tejidos y lisa los hemates. Lcucocidina: producida por cocos grampwsitivos destruye leucocitos polimorfonuclearcs. La virulencia o paiogentcidad de una especie bacteriana se determina mediante la llamada dosis Icial mnima (DLM), es decir. la mnima cantidad de microorganismos capaz de producir la muerte a un animal de experimentacin de unas caractersticas determinadas. La DLSO es aquella capaz de malar al 50 % de los animales. INFECCIN Existe en el husped un sistema multifactorial de mecanismos protectores que funcionan para impedir la entrada de los microorganismos a regiones normalmente estriles y que limitan la diseminacin de los invasores una vez que se ha producido el ingreso. E stos mecanismos proveen barreras que pueden debilitarse por diversos factores, incluyendo traumatismos liseos directos, enfermedades sis- tmicas. drogas y toxinas. Cuando las defensas normales son afectadas en el proceso de competencia husped-microorganismo sobreviene la infeccin, estado caracterizado por un conjunto de signos y sntomas que pueden ocurrir de forma aguda o desarrollarse gradualmente. Para aceptar que un microorganismo es el agente etiolgico de una enfermedad se han de cumplir los postulados de Koch: El microorganismo debe encontrarse presente en el individuo enfermo y ais larse a partir de sus productos patolgicos. Inoculado al hombre o animales sanos susceptibles debe producir una en fermedad similar y aislarse de las lesiones provocadas experimentalmente. Debe estimular una reaccin de inmunizacin en ci enfermo y animales in fectados experimentalmente. La enfermedad debe remitir al aplicar un tratamiento teraputico especifico antimicrobiano.

Las infecciones pueden ser generalizadas cuando, a partir de 1t una lesin inicial, el atente causal pasa a la sangre y difunde a los tejidos (bacteriemia o septicemia de la fiebre tifoidea, estafilococias) o localizadas, si el agente no posee capacidad invasora y solamente se multiplica en la pue rta de entrada, pudiendo producir toxinas que difunden a travs de la sangre dando lugar a toxemia (ttanos, difteria). EPIDEMIOLOGIA I.os microorganismos patgenos no slo son capaces de producir infeccin, sino que ademas pueden ser transmisibles, es decir, pueden llegar a otros huspedes por

WCBCWOIOGIA CUNCA AEJCAOA

diversos mecanismos y difundir la enfermedad en la poblacin. La epidemiologa es la ciencia que se ocupa de las enfermedades transmisibles y de los factores que determinan su frecuencia y distribucin en la poblacin. Para que una infeccin transmisible se produzca es necesaria In existenrin de los llamados factores epidemiolgicos primarios: Reservorio. Fuente de infeccin. Mecanismo de transmisin. Husped o poblacion susceptible. Los factores epidemiolgicos secundarios incluyen: factores de tipo social, factores econmicos, polticos, religiosos, etc. RESERVORIO-FUENTE DE INFECCIN Los agentes infecciosos son variados: bacterias, virus, bongos, protozoos, y por lo general no se encuentran aislados, sino en seres visos que los eliminan al exterior. por lo que tambin pueden localizarse en objetos inanimados que les sirven de soporte. Se considera reservorio donde el microorganismo vive habitualmcntc y se multiplica en condiciones normales: la fuente de infeccin constituye el lilbt- tat ocasional a partir del cual se transmite. A veces el reservorio y la fuente sJe infeccin coinciden en determinados procesos (sarampin, fiebre tifoidea), si bien pueden darse perfectamente por separado (peste, ttanos). Reservorio y fliente de infeccin pueden ser el hombre, los animales y objetos inanimados (fmites). Cuando la fuente de infeccin es el hombre se habla de infecciones homlogos (meningitis, gripe): cuando es un animal, de infecciones heierlogus (zoonosis; an- tropozoonosis) (brucclosis. rabia); el suelo es a menudo reservorio Itelilricol (gangrena. ttanos) El hombre puede ser fuente de infeccin como enfermo y portador, sano (meningitis), en el periodo de incubacin (tosferina) y en la convalecencia (fiebre tifoidea). Los animales como fuente de infeccin pueden ser vertebrados (hidatd<wis) e invertebrados (artrpodos) (nckeltsiosis). MECANISMO DE TRANSMISIN

Es el mecanismo que los microorganismos utilizan pura transmitirse desde a fuente de infeccin a la poblacion sana susceptible. Depende de los siguientes factores: va de diminucin (respiratoria, digestiva, urogenital, cutnea), capacidad de superv iven del cia agente, puerta de entrada en el nuevo husped y dosis infectante. Los principales mecanismos de transmisin son: Contagio directo. Desde un sujeto enfermo a un sujeto sano en un plazo de tiempo corto medame, contacto fsico con la fuente (lia, enfermedades sexuales) o con los productos del enfermo (hepatitis) o transmisin congnita de la madre al 30 MCWOWOIOG 1A CUNCA APLICADA

Indefinidos En ellos entran a formar parle sustancias de naturaleza com pleja cuya composicin a difcil de establecer con precisin (peptonas. extracto de levadura, extracto de carne). Estos medios se empican mil que los anteriores.
2.

Segn su estado fsico

Lquidos: Favorecen mucho el desarrollo > multiplicacin de las bacterias porque al difundirse estas por todo el medio encuentran con facilidad las sustancias que necesitan para nutrirse. Solido* En ellos las bacterias crecen con mayor dificultad, pues los nutrien se tes agotan con rapidez en el punto donde se desarrollan: no obstante, son de gran utilidad para el estudio de las caractersticas de crecimiento, de la produccin de hemolisis y otras peculiaridades. ScmtslKks: Se utilizan especialmente para el estudio de algunas propiedades bioqumicas.
3.

Segn su aplicacin

Generales: TambiCn llamados comunes, son apropiados para el cultivo de la mayora de los microorganismos por la facilidad con que se desarrollan en dios. Enriquecidos: Van aftadnlon de nutrientes muy ricos que permiten el crecimiento de ciertas hactenas difciles de cultivar. Especiales: Conocidos tambin como especficos, van dirigidos al cultivo de determinadas especies bacterianas o son utilizados con fines de diferenciacin.

Selectivos: Estos medios contienen componentes que inhiben d desarrollo de ciertos mu-roo rjunismos, lo cual les permite aislar una determinada especie o evitar la presencia de agentes contaminantes.

CRECIMIENTO DE LAS BACTERIAS EN LOS MEDIOS DE CULTIVO Las bacterias se desarrollan en los medios de cultivo formando agregados de millones de edulax o poblaciones bacterianas. Siguen un cido vital con cuatro fases. en relacin con d tiempo de cultivo: fase de latencia o adaptacin al medio, fase de desarrollo exponencial o crecimiento logartmico, fase estacionaria en la que la concentracin bacteriana se mantiene estable y fase de declive o muerte. La velocidad de una poblacin en alcanzar la fase estacionaria de crecimiento depende de la concentracin del inoculo inicial y de la calidad y cantidad de nutrientes. I, Crecimiento en los medios lquidos En los medios lquidos las bacterias poseen una gran libertad de movimiento y se disponen con arreglo a sus necesidades nutritivas y requerimientos de oxigeno; las aerobias estrictas crecen en los primeros 10-15 mm de la superficie del medio. C AP T U L O 32 Tcnicas m icrobiolgicas bsicas

EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA CLNICA El laboratorio clnico de microbiologa tiene por fin proporcionar con rapi ez y exactitud d informacin sobre la presencia o la ausencia de microorganismos que causan infeccin. Adems, debe informar sobre la sensibilidad de esos microorganismos a los antibiticos. El laboratorio microbiolgico utiliza tubos de ensayo, placas de Pfctri, pipetas, prohetas.

matraces, vasos, etc. Al estudiar en dicho laboratorio la presencia de microorganismos en los diferentes medios biolgicos, es evidente que todo el material que se utilice debe estar limpio y sin contaminantes. Como herramienta fundamental, el microbilogo utiliza el cultivo. Una vez aislado el microorganismo ha de identificarse. La identificacin se realiza de acuerdo con principios taxonmicos. Sin embargo, en el laboratorio clnico de microbiologa deben caracterizarse diariamente muchos especmenes y hay que dar los resultados lo antes posible. Por este motivo, las pruebas que se emplean deben ser fciles de realizar, tener un coste bajo y proporcionar los i resultados con rapidez. Ixs mtodos clsicos de especincin se bawn en caractersticas morfol- i gicas y metabcas. En los ltimos aos estn siendo cada vez ms tiles en los laboratorios clnicos de microbiologa las pruebas que utilizan tcnicas de S biologa molecular. Los medios de cultivo que se inoculan con los especmenes que se analizan para aislarlos e identificarlos lienen que ser estriles. El laboratorio de microbiologfa debe disponer de un lugar adecuado para preparar los medios nutritivos j especiales Adems, ha de disponer de sistemas de esterilizacin del material. 5 Los medios deshidratados deben guardarse en lugares frescos y lejos del con- S tacto directo con la luz. Estos medios son muy higroscpicos, por lo que. una vez | que se abren los paquetes que los contienen, hay que tener cuidado con la o humedad y cerrarlos bien. | PAKTK V. Microtoiosia ESTERILIZACIN- Y DESINFECCIN Los concepto de esterilizacin y desinfeccin se refieren slo a los micro organismo. Se dice que un medio es estril cuando la ausencia de microorga nismos (protozoos, hongos, hacterias y virus! e completa. El trmino estril es absoluto. El proceso de esteriizacin l comprende los mecanismos que conducen a la inactivacin total de cualquier tipo de microorganismo, incluida su capacidad de reproduccin. Sin embargo, la esterilizacin no implica la destruccin de los constituyentes celulares, como las enzimas, los productos intermediarios. las toxinas, etc.

Se denomina desinfeccin al proceso de reduccin de los microorganismos de un medio, de los cuales se elimina, fundamentalmente, los patgenos. En contraste con la esterilizacin, la desinfeccin no es un trmino absoluto, sino relativo. Un medio estril est desinfectado, pero un medio desinfectado no tiene por qu ser estril. Mtodos de esterilizacin El c-alor, las radiaciones, los ultrasonidos y la filtracin son los mtodos prin cipales de esterilizacin. ESTERILIZACIN POR CAI -OR El ms sencillo y seguro es el calor, que inactiva enzimas y componentes proteicos esenciales para el funcionamiento celular. La incineracin producida, por ejemplo, por la llama de un mechero de alcohol o de gas es un sistema sencillo de esterilizacin, muy eficaz, que se utiliza fundamentalmente para esterilizar las asas de platino que se emplean para sembrar los cultivos. En la esterilizacin por el calor hay que diferenciar bsicamente dos tipos de calor: el seco y el hmedo. Como mtodo de esterilizacin, el calor seco utiliza una atmsfera de aire caliente, que se consigue con estufas u hornos. Se requieren temperaturas elevadas [ 160-180 C> y exposiciones prolongadas ms de 2 h|, y se suele emplear paro la cristale y ra el instrumental metlico. Por su parte, el calor hmedo emplea agua calentada o vapor de agua a presin. Sin embargo, el agua a 100 C no basta para destruir las esporas de las bacterias, por lo que no se logra la esterilidad absoluta, ftira la este rilizacin con color hmedo se emplean autoclaves, que son sistemas que aprovechan el hecho de que. cuando disminuye la presin sobre el agua, sta alcanza la ebullicin a temperaturas ms elevadas. Generalmente, en los autoclaves se trabaja a una atmsfera, lo que produce vapor de agua u 120 C. El tiempo de actuacin suele ser de 10 a 30 min. La esterilizacin por calor hmedo en autoclave se utiliza principalmente para los aparatos con ajustes de goma y las jeringas que contengan piezas metlicas, y pora esterilizar los medios de cultivo. ESTERILIZACIN POR RADIACIONES V UIJRASOMOOS

La esterilizacin por medio de radiaciones emplea dos tipos de radiacin: las no ionizantes y las ionizantes. Entre las radiaciones no ionizantes, la luz ultravio- | ' 32. 'l'Kniexa micrdiolgu-m btKQ* | lela de longitud de onda comprendida entre 240 y 2 nm es un mtodo importante de -90 esterilizacin. El mecanismo de accin de la luz ultravioleta se basa en la produccin de mutaciones letales. Este tipo de esterilizacin se usa bsicamente para vendas y paquetes quirrgicos. Las radiaciones ionizantes, como los rayos y. producen cambios estructurales de los cidos nucleicos y las protenas. Estas radiaciones son muy eficaces para esterilizar y tambin inactivan los virus. Se aplican para productos farmacuticos Ixis ultrasonidos destruyen las estructuras de k microorganismos, como la membrana plasmtica, y esto conduce a su inactivacin. Se suelen usar para esterilizar los medios lquidos ESTERILIZACIN POR FILTRACIN Finalmente, la filtracin es otro de los agentes fsicos utilizados para esterilizar. En este caso, se eliminan ios microorganismos y no se destmyeo. Hay filtros de varios tipos, con tamaos de poro inferiores a las dimensiones de los microorganismos, que permiten separarlos selectivamente. Los ms utilizados son los de porcelana, las membranas porosas y los de colodin. Debido al pequeo tamao de los poros, deben hacerse pasar a presin a travs del filtro los lquidos que quieren esterilizarse. Hay que tener en cuenta que la filtracin tiene el inconveniente de no retener los virus ms pequeos. Los filtros de membrana se emplean para la produccin comercial de varias soluciones farmacuticas y de inyectables que se estropean con el calor. Asi- mismo, el suero para los medios de cultivo de bacterias y virus a menudo se esteriliza por filtracin, y tambin algunos azcares que son inestables cuando se calientan. Desinfectantes TIPOS

Generalmente, la desinfeccin utiliza sustancias qumicas que afectan el funcionamiento celular por diversos mtodos, por ejemplo destruyendo la pared celular, la membrana plasmtica, los cidos nucleicos o las protenas. Segn el mecanismo de accin, los desinfectantes pueden ser bactcriostticos o bactericidas. Los fcucfcrosrdfcos inhiben la multiplicacin de los microorganismos pero no producen su muerte, mientras que los bactericidas destruyen el microorganismo. Slo estos ltimos son adecuados como desinfectantes El efecto bacte- riosttico o bactericida de un desinfectante depende de diversos factores, que se consideran ms adelante. VARIABLES DE SU EFICACIA A diferencia de los antibiticos, que son muy selectivos para determinadas especies bacterianas los desinfectantes son muy txicos. La eficacia de los des infectantes depende de diversos variables, entre las que cabe consklcrar su concentracin, el tiempo de actuacin, el pH. la temperatura y la presencia de otras sustancias. 32. Tcnicas tm<rip6io/djica fritev-m | Tincin con fucsina Se introduce la extensin en una disolucin acuosa de fucsina entre 1 y 2 min. Tincin de Grum Hay que introducir la extensin en una disolucin acuosa de violeta de gen ciana de 1 a 2 rain. Luego se diferencia con una disolucin de lugol (yodo y yoduro potsico! durante 30 s. Se decolora con alcohol del %% o alcohol-acetona, y se lava con agua. Despus se introduce la extensin en una disolucin acuosa de fucsina diluida entre % y 60 s y se vuelve a lavar con agua. 1/m grmenes gramposUivos se tien de color morado, y los gramnegativo, de rojo. Tincin de Ziehl-NkUen Se introduce la extensin en fucsina fcnicada concentrada durante 10 min. y se calienta tres veces con un mechero, dejndose enfriar entre vez y vez hasta que se desprendan vapores. Luego se decolora con cido clorhdrico concentrado y alcohol del 96* y se lava con agua. Despus se introduce La extensin en una disolucin de a2ul de metilno entre 2 y 5 min, y

se lava otra ver con agua. Los microorganismos acidorresistentes aparecen con una coloracin roja, mientras que el fondo y los microorganismos, que no son acidorresLstentes aparecen de color azul. Tincin de Giemsa Se introduce la extensin en una disolucin de Gicrasa |cosina + azur II glicerina metano!) durante 4 min. RECUENTOS DE BACTERIAS Cuando se realiza un recuento de Ixacterias debe diferenciarse el nmero total, sin considerar si estn vivas o muertas, y el nmero de las vivas, esto es las capaces de crecer y multiplicarse. L masa celular total puede determinarse de forma directa en trminos de peso seco; sin embargo, este mtodo es tedioso y slo suele utilizarse como referencia para calibrar otros. El mtodo ms empleado pora determinar la cantidad iotaI de microorganismos en suspensin es medir la turbidez. Esta puede cuantificarse de forma visual, por comparacin con una serie de tubos calibrados, o por nefelometra o turbidimetrla, utilizando como patrones disoluciones de bacterias que contengan una cantidad conocida de stas. Las tcnicas turbidimtricas son muy tiles para determinar la masa celular en un cultivo en crecimiento y pata evaluar la accin de determinados frmacos sobre las hactenas. Las hacterias totales |vlvas y muertas} pueden cuantificarse con una cmara de recuento bacteriano como la de Rstroff-Hausser, o utilizando un contador eleclrnico de partculas que. adems, proporciona la distribucin de tamaos. Las terrenas vrias se cuentan diluyendo el espcimen con un diluyenle adecuado y sembrndolas en un medio de cultivo slido apropiado. Despus de lo

32- TCMCAT nuctabtoigteM HLIICJJ | mis utilizado es el de Stuart, que contiene tioglicolato, cloruro de calcio y gli- cerofosfato. Medios liquido y slidos Los medios de cultivo pueden ser lquidos o slidos. En los primeros, los microorganismos inoculados se multiplican de forma difusa por todo el medio, sin que se formen colonias aisladas de cada microorganismo. Por su parte, los medios slidos son los mis habituales en los laboratorios clnicos de microbiologa. El agente solidificante ms utilizado es el agar, un polisacrido complejo que se extrae a partir de algas marinos Al calentarlo a 100 C. forma una disolucin que. despus de enfriarse a 32-40 C. do lugar a un gel por el que los solutos pueden difundirse igual que en una disolucin acuosa. El agar es qumicamente inerte y no es atacado por ningn microorganismo de inters clnico. 1.0$ componentes del medio de cultivo se mezclan con el agar liquido y. al enfriarse, quedan incluidos en l. En el mercado se dispone de muchos medios de cultivo deshidrat dos para a reconstituirlos en el laboratorio. Para preparar el medio de cultivo, se peso exactamente la cantidad adecuada del medio deshidratado y se disuelve con agitacin Una vez disuelto, debe esterilizarse en el autoclave. Suele emplearse una temperatura de 121 C durante 15 min. Como las sustancias enriqueccdoras y los suplementos de los medios suelen ser sensi bles al calor, hay que enfriar el medio a 45-55 C en un bao de agua antes de aadir las sustancias enriquecedoras y los suplementos. Luego, se dispensa el medio en los tubos o las placas de Fetri, con una agitacin suave, haciendo la operacin con rapidez. Inmediatamente, se tapan los tubos o las placas, y se dejan stas ligeramente abiertas entre 1 y 2 h para obtener una superficie seca. Despu se almacenan loa medios en plata s esterilizados por vapor, invertidos en una bolsa de plstico o en otro contenedor, en un refrigerador a oscuras entre 1 y 2 semanas.

Siembra

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FI C H U

3 2 1 F u f m ti li e M R i b iJ r t a s p U c M p a r * V
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c u lt i v o s t > :l c ri k o i

La siembra de los medios slidos incluidos en placas de fctri suele hacerse con un asa de platino, pasada previamente por la llama en la forma que se indica en la figura 32-1. Cuando se trata de hisopos, en lugar de cargar un asa de pa-

32. Tcmcaa mknbolglcat hica} puede ser til para controlar el tratamiento son las endocarditis bacterianas, las osteomielitis bacterianas, los pacientes inmunocomprometidos con infec ciones poco frecuentes y en combinaciones poco habituales de los frmacos Para realizar la prueba se aade un inculo estndar del microorganismo que infecta al paciente, preparado en un medio de Mueller-Hinton complementado con cationes a diluciones seriadas del suero del paciente en el pico y en el valle de concentraciones del antibitico. TYas 24 h de incub acin, el titulo bactericida del suero ser igual a lo dilucin del ltimo pocilio sin crecimiento bacteriano. Sistema automticos Se han comercializado aparatos automticos para las pruebas de sensibili ad. que d proporcionan los resultados en periodos de tiempo ms corlo que los mtodos manuales, debido a que usan sistemas sensibles de deteccin ptica. En general, los sistemas automticos |>ara las pruebas de sensibilidad microbiana se combinan con los sistemas automticos de identificacin. En el apartado siguiente se presentan los ms utilizados. ANALIZADORES AUTOMATICOS PARA MICROBIOLOGA En la microhiologia clnica, la automatizacin est menos desarrollada que en otras reas del laboratorio clnico. Con todo, en el mercado hay varios sistemas automticos para identificar k microorganismos y para las pruebas de sensibilidad microbiana. Los principales sistemas son los de BD Biosciences (Phoe- nix. BACTEC MGIT 960 y BACTEC 460TB| y los de bioMereux (VITAL, Mini API y V1TEK 2|. El Phoenix puede realizar hasta 100 pruebas de identificacin y de sensibili ad d simultneamente. Cada panel de identificacin/susceptibilidad tiene 136 pocilios (hasta 85 para susceptibilidad y 51 para identificar). Utiliza un indicador redox colorimirico para las pruebas de susceptibilidad, y varios indicadores colorimtricos y fluorimetricos para la identificacin. El tiempo promedio de los resultados es de 6 h para los microorganismos grampositlvos, y de entre 6 y 12 h para los gramnegativos. El BACTEC MGIT 960 y el BACTEC 460 TB son analizadores automticos ; pata nuco bacteria* Puia la deteccin del segundo se utiliza la medida de la can I tidad de CO marcado -

radiactivamente, producido por el metabolismo de las j micobactcrias cuando crecen en un medio de cultivo adecuado. El BACTEC MG1T960 utiliza un compuesto fluorescente para detectar el crecimiento de las ' micobactcrias. El VITAL utiliza dos medios de cultivo {aerbico y anaerbicol y la deteccin se realiza por fluorescencia. Los especmenes se leen cada 15 min y se dan los 1 resultados en cuanto son positivos. El mn API utiliza para la identificacin las ! tiras de ptueb&s bioqumicas, automatizando su manipulacin e interpretacin y \ el VITEK 2 emplea unas tarjetas semejantes a las de crdito. Todos los sistemas descritos tienen la posibilidad de establecer una conexin i hidireccional con el sistema informtico de laboratorio. C AP T U L O 33 __ Procesado de especm en m enes icrobiologa

CONSIDERACIONES GENERALES El laboratorio clnico de microbiologa analiza una gran variedad de espec enes. como m sangre, orina, lquido cefalorraqudeo (LCR1. heces, exudados y efusiones de diversas cavidades corporales. La recogida y la manipulacin ade cuadas de los especmenes son fundamentales para diagnosticar las enfermedades infecciosas. Los especmenes deben recogerse en el momento ms apropiado, cuando mayor sea la prolxabilidad de detectar el microorganismo, que para las bacterias es antes de comenzar el tratamiento, y para la mayora de los virus, la fase aguda de la enfermedad. La cantidad de espcimen recogido debe ser la adecuada para poder realizar de forma completa los estudios que se soliciten. Los especmenes han de recogerse del lugar de la infeccin, evitando la contaminacin de los lugares adyacentes. Todos los especmenes, excepto las

heces, deben recogerse en un contenedor estril e identificarse de forma adecuad para que a no haya confusiones en el laboratorio. Una vez obtenidos, hay que enviar los especmenes al laboratorio lo ms | rpidamente posible. Si no puede evitarse la tardanza, la orina, las heces, los % esputos y los especmenes para delectar laCMamidia trachomarix o los virus * deben refrigerarse para Impedir que crezca la flora normal. La sangre, el LCR y otros lquidos tienen que mantenerse a temperatura ambiente. El transporte de sj los especmenes para los estudios microbiolgicos debe realizarse de forma muy cuidadosa, para evitar los contagios. \ ESPECMENES DE SANGRE. HEMOCULTIVOS s El hemoeultivo es la tcnica empleada para detectar bacterias en sangre. En condiciones normales, la sangre es estril y cualquier bacteria que penetre en | la circulacin sangunea se elimina inmediatamente. La bactcricmia suele ser o intermitente, excepto en la endocarditis, la fiebre tifoidea, la brucelosis y las PA KIT Microbiologa infecciones incontroladas; por ello es muy importante en que momento se recoge el espcimen. El mejor momento para recoger la sangre para los hemo cultivos es cuando comienza a subir lo temperatura. Deben tomarse varios espe cmenes espaciados en el tiempo. Su nmero depender de la naturolezo de la bactcricmia: transitoria, intermitente o continua. Principales microorganismos que infectan la sangre Las bacterias principales que pueden encontrarse en los cultivos sangu eos son: n Eitreptococcus, Pscudotnonas, Brucella. Proleus, Neiamo, Satmonella, Echerichia, Haemaphilus y Lep! aspira. Asimismo, los cultivos sanguneos son muy tiles para diagnosticar las infecciones diseminadas por hongos como la Candida, el Qyptococcus neoformans y el Histoplasma capsulatum. Los principales parsitos sanguneos son los Pastnodium, los faishmania.los Vypanoscma y el ToxopSasma. Tipos de cultivos sanguneos

Hay varios tipos de cultivos para sangre, coda uno con sus ventajas c inconvenientes. Se usan medios lquidos enriquecidos y pueden utilizarse los digeridos de casena, de semilla de soja, caldo-tripticasa y caldo de extracto de cere- brocorazn. Estos medios permiten que crezcan microorganismos aerobios, anaerobios y dq>endientesde CO. Generalmente, los medios ; comerciales lquidos se envasan al vacio con CO y contienen el anticoagulante polianetol sulfo- nuto PSS| al 0,025%. Este anticoagulante es un antagonista de la accin bacte ricida del suero. Los frascos tienen una capacidad de 50 a 100 mi de medio de cultivo. La sangre obtenida en condiciones estriles se diluye un 10% en dicho medio. Los cultivos se incuban a 35 "C y se observa diariamente, al menos durante 7 das, la aparicin de turbidez, hemlisis, gases o colonias definidas. De los cultivos positivos deben hacerse extensiones y teirlas con Cram y subcultivos. ftjra realizar stos se desinfecta el tapn de goma de los frascos de cultivo y se pincha con una jeringa estril. Se extraeu 0,25 mi de medio y se siembra directamente en agar-triptena-soja chocolate. Hay que tener cuidado al introducir la aguja en el tapn de goma y sujetar bien el mbolo, por si hubiera presin de gas por productos de fermentacin. Los .subcultivos deben incubarse, preferente mente, en atmsfera de CO y en condiciones anaetbicas. Si se sospechase la presencia de Brucella, habr de utilizarse el medio bifsico de Castaeda o caldo de soja-tripticasa, e incubar durante 21 das o ms Siembra cuantitativa directa Cuando la concentracin bacteriana en sangre es superior a 100 bacte riav'ml, resulta til la siembra directa de una cantidad determinada de sangre heparinizada. La siembra se realiza en sbana, en placas de agar sanguneo y agar achocolatado. A las 18 h. aparecen colonias que pueden utilizarse para estudiar sensibilidades, Este mtodo es til para H in/Juenxac, N. meningiltdis y 5.pncumoHiac. Con l, crecen menos contaminantes y, cuando lo hacen, interfieren menos en las bacterias productoras de la infeccin. Con este mtodo no ."?.'<. fior.exxSn uprcrmcnu en micnoMoIqgia hav enriquecimiento, por lo que no es til pora microorganismos de crecimiento difcil, y tampoco vale para brucelosis y bacleriemias de pequeo inoculo, como la endocarditis. Sistemas automticos

Hay sistemas automticos comerciales para el seguimiento continuo de los hemocultivos. Las principales ventajas de estos sistemas son que se elimina la necesidad de los subcultivox ciegos y se acorta el perodo normal de incubacin de 7 a 5 das. En el captulo 31 se han presentado los sistemas automticos para la identificacin. ESPECMENES DE ORINA. URINOCULTIVOS El sistema urinario est dividido en dos partes: la superior, que comprende los rones y los urteres, y la inferior, que comprende la uretra y la vejiga urinaria. En condiciones normales, el sistema urinario no contiene microorganismos. Las infecciones agudas o crnicas del aparato urinario pueden afectar a los rioncs, los urteres, la vejiga o la uretra. En algunos casos, estas infecciones producen hipertensin, una lesin renal y uremia, mientras que. en otros, pueden pasar inadvertidas durante algn tiempo. La mayora de las infecciones del aparato urinario se producen a travs de la uretra, y en muy pocas ocasiones a travs de la sangre. Las Infecciones del aparato urinario son ms frecuentes en las mujeres que en los hombres. Recogida de especmenes En el captulo 5 se han sealado las condiciones para recoger k especme de orina para nes los urinocultivos. Piira poder obtener unos buenos resultados, es muy importante transportar y almacenar adecuadamente los especmenes de orina para los urinocultivos. Pueden mantenerse en un refrigerador hasta 24 h antes de realizar el cultivo. Microorganismos productores de infecciones urinarias Lo principales microorganismos hallados en la orina infectada son E. coii, oros miembros de las enterobacterias. Proleus, la Psvudomonas (eruginoso y estafilococos. La mayora de las infecciones urinarias son producidas por E. cot, que pertenecen a un nmero limitado de serotipos. Los anlisis micro- biolgicos de la orina deben ser tanto cuantitativos Como cualitativos. Un recuento de 10s bacterias/mi de orina representa un nivel significativo, que indica una infeccin del sistema urinario Un recuento menor de 10' bacterios/mi se : considera contaminacin, mientras que los recuentos comprendidos entre 10* y 10 bacterias/mi requieren un nuevo espcimen para confirmar o desechar la infeccin.

La presencia de leucocitos en la orina (piura! se ha considerado un signo de infeccin urinaria; sin embargo, se ha comprobado que. a menudo, las bac- teriurias significativas no producen piuria o sta es intermitente. pAKTK V, Mtcrobtokicta Cultivo bacteriano I.a siembra de La orina se realiza con un asa de platino calibrada, con la que se toman 0,001 mi, Se inocula la orina homogeneizada sin centrifugar en agar CLED |cistina, lactosa y dficit de electrlitos! y agar sanguneo, o un medio general. Se incubu a37 eC de 24 a 48 h y se cuentan las colonias. Se multiplica el nmero obtenido por 1.000 y se da el resultado en bacterias por mililitro de orina. El crecimiento de tres o ms especies en una orina recogida adecuadamente indica contaminacin. Mtodos de cribado Un gran porcentaje de las orinns que se envan al laboratorio para su cultivo no proporcionan un crecimiento bacteriano o las recuentos estn por debajo de los valores con significacin clnica, por lo que se emplean sistemas de cribado para proporcionar r sultados rpidos, e eliminar los especmenes negativo y simplificar el trabajo, Se utilizan tres grupos de mtodos de cribado:
1. 2. 3.

Mtodos microscpicos. Mtodos qumicos. Mtodos de microcultivo.

Los mtodos microscpicos consisten en centrifugar la orina y realizar una extensin del sedimento que se te con Gram. la presencia de ms de dos bacterios por campo de gran aumento seala bacteriuria en ms del 9fi % de los casos. Los mtodos qumicos v basan en la deteccin de enzimas bacterianas, txis dos mtod os qumicos ms utilizados son el de los nitritos y el del cloruro de Irieniltetrazolio |TTC). La prueba de nitritos se basa en que los microorganismos mis frecuentes que producen infecciones de las vas urinarias reducen el nitrato presente en la orina a nitrito. Esta prueba es positiva, principalmente, con los grmenes gramnegativos. Las tiras para los anlisis

sistemticos de orina incluyen esta prueba. Un resultado negativo de la prueba de nitritos no excluye la infeccin de las vas urinarias o la pielonefritis. por lo que en tal caso deben realizarse otras pruebas. La prueba de TTC es ms sensible que la de nitritos: se basa en que las enzimas bacterianas reducen el cloruro de trifeniltelrazoHo soluble e incoloro a un forniazn rojo insoluble. Los mtodos de microcultivos utilizan medios slidos obtenidos en dispositivos especiales, como tiras de plstico. Para usarlas se extraen de) estuche y se introducen en la orina. Se deja escurrir la orina en exceso y se eliminan los ltimos restos de lquido, aplicando el borde inferior del soporte sobre un papel de filtro. Se coloca de nuevo la tira en el estuche y se cierra. Se incuba de 18 a 24 h en una estufa a 37 C. El nmero de grmenes se obtiene comparando la tira con un patrn que generalmente se sum inistra con las tiras. Adems, estas tiras proporcionan una orientacin sobre el tipo de grmenes. En el caso de microorganismos que degraden lactosa, aparecern colonias amarillas y un cam del bio medio de cultivo de azul a amarillo. Los microorganismos que no degraden lactosa dejarn el medio de cultivo de color azul y las colonias setn incolo| pAim V. MtcrctxoSogta ] ESPUTOS Los microorganismos comensales que estn en los esputos son los mismos que los de las vas respiratorias nhns Asociados con neumonas se hallan S. aureus. S. pneumontiic y Ktebsictki pneumona*. En los trastornos crnicos se encuentran H. influtnzae y PastrurcHa. Recoger adecuadamente los esputos es muy importante, ya que debe obtenerse el esputo, y no saliva. Se recogen en un recipiente de plstico desechable estril. Despus se realiza una extensin, se tie con Grom y se observa al microscopio. En loe procesos inflamatorios se encuentra un gran nmero de leucocitos polimorfonucleares neutr filos. Algunos laboratorios utilizan la proporcin poli- morfonuclcares/clulas epiteliales para analizar la conveniencia del cultivo de especmenes de esputos A veces, reconocer un solo tipo de microorganismo en la tincin de Gram puede ayudar a tomar una primera decisin sobre la eleccin del antibitico. Tambin se tie con Ziehl-Neelscn para bacilos tuberculoso*. Los cultivos se realizan directamente en agar sanguneo, de forma aerobia y anaerobia, y con CCV Se incuba durante 18 h a 37 C. ft>ra las micobactenas se realiza un cultivo en un medio de Lovrenstein-Jensen.

SECRECIONES GENITALES Los principales patgenos del uocto genital asociados oon las enfermedades de transmisin sexual son el Trrpontma paliidum, N. gonorrhoeae, lacmophilus ducreyi, C. tr achomatis. Ureapiosma urealyiiaim.el virus de la inmunodeficiencia humana y el herpes genital. Los especmenes que se envan para cultivo son, en la mujer, las secreciones vaginales y los especmenes endocervicales y, en el hombre. los exudados uretrales, las secreciones prostticas y los aspirados lenticulares. iV. gonarrhocac y C. trachomatis son las bacterias principales que se asocian a las enfermedades de transmisin sexual. Bn el hombre, las extensiones de exu dados uretrales teidos con Gram son sensibles y especficas para diagnosticar la gonorrea Cuando las extensiones sean negativas, habr que realizar cultivos. En las mujeres, las extensiones de exudados vaginales teido con Gram no son lo bastante sensibles ni especficas, y debern realizarse cultivos. El material recogido se siembra directamente en agar de Thayer-Martin y se coloca en un ambiente enriquecido en COj. ESPECMENES NASOFARNGEOS Los cultivos nosoaringeos se utilizan, fundamentalmente, para detectar los portadores de N. meningitidis y 5 pyogenes.los nasales para neumococos y Hat-- mophtlus.y los farngeos para estreptococos {J-hemolticos de) grupo A. Los especmenes farngeos se obtienen con un hisopo que se introduce por la boca, deprimiendo la lengua mie ntras se pasa vigorosamente por la faringe. Los especmenes nasales se obtienen introduciendo el hisopo por la nariz. Si el espcimen se procesa inmediatamente, no es necesario un medio de transporte; en caso contrario, se usan los medios de transporte adecuados, Con el hisopo se preparan extensiones que se tien con la tcnica de Gram. Luego se siembra en agar-triptena soja con un 5% de sangre de carnero, y se incuba a 35 C en una atmsfera con un 10% de CO. :

34. 7W>1h'4U tac.vrJdjKai y b&tery\toglQ cilniVa > CiUlMJ Xe funplKOOH lp* y & op-fffvji S. (>>$ > * Ifl'ut Al i^iUtfM :j'vi;>:i 8) BACILOS CRAMPOSITIVOS Un bacilos grampositivos son aerobios estrictos o anaerobios lacultotivos, poseen forma alargada y pueden o no formar esporas. Con la excepcin del Raci flus anlhracis, se mueven mediante flagelos laterales. Los gneros ms comunes son Bacillus, Listeria. Corynebaelcrium y Lactobacillus. Baclus De las numerosas especies de Bacillus, dos tienen significacin mdica: B anlhracisy B. cereus. El primero es muy patgeno y hay que tener mucho cuidado cuando se manipule material que puede contener esta especie. B. cereta puede producir otitis, neumona, septicemia y endocarditis. Asimismo, las espe cics de Bacillus pueden producir gastroenteritis. Crecen bien en agar sanguneo. Las especies significativas de Bacillus pueden diferenciarse segn varias propiedades bioqumicas y otras caractersticas. Listeria Las especies de Listeria no forman esporas y no se ramifican 1.a nica espe- ci patgena es L. monocytoger.es.Las especies se cultivan en agar sanguneo y son p-heraolticos. En el agar sanguneo producen colonias pequeas de color azul grisceo, rodeadas por una zona estrecha de 0-hemlisis. u S. entumo* 1 lMwaw HUI RA M I tHu<-nu ptr* ulcolii car lo piiniripiWs <om ponente del grupo J< coco patopoiilrn.

| Coryncbacterium S 1.a principal especie patgena de cate gnero es el C. diphtcriae, que produce difteria (una enfermedad del sistema respiratorio supcriorl. Se caracteriza por la formacin de una seudomembrana fibrinosa, normalmente sobre la mucosa respiratoria, y por una lesin tisular en el miocardio y el tejido nervioso como consecuencia de una exotoxirw. Actualmente, se vacuna contra esta bacterio a todos los nios. por lo que es * difcil observarla. Al microscopio con tincin de azul de metileno de I.efler, / se observa formando colonias que se apelotonan entre si. La prueba de onti- cuerpos contra la difteria se utiliza sobre todo para determinar la respuesta 5 del paciente a la protena toxoide. Se emplea para los casos de reiteracin de o infecciones.

PARTS V. MKNTMOFFA Laclobaclus La mayora de las bacterias de este gnero, que no forman poras, fermentan la glucosa a cido lctico (de aqu su nombre]. La aplicacin ms corriente de los Laclobaclus es industrial, concretamente la produccin de lcteos. Este gnero contiene tambin varias bacterias que forman parte de la flora natural de la vagina de la mujer. Debido a que forman cido lctico a partir de glucosa, estas bacterias crean un ambiente cido que inhibe el crecimiento de muchas especies bacterianas patgenas, por lo que su eliminacin puede dar lugar a infecciones urogenitales. BACTERIAS GRAMNEGATIYAS Las bacterias gramnegativas no se tien con el colorante de Gram. a causa de que su pared celular tiene un alto contenido de lpidos y pocos peptidoglu- canos. La capacidad patognica de estas bacterias se debe a determinados componentes de sus paredes celulares, principalmente la capa de lipopoli- sacridos. Neisseria El gnero Ntisuria est formado por cocos aerobios que se encuentran en pares, no forman esporas y colonizan las membranas mucosas del ser humano. Estos microorganismos inmviles requieren un ambiente hmedo y temperaturas templadas para crecer de modo ptimo. Las especies de Neissaia crecen bien en agar acl>ocolatado. que contiene antibiticos que inhiben el crecimiento de ras bacterias y hongos. Una forma importante para identificar las especies de este gnero es la prueba de la oxidasa, a la que dan positivo. Desde el punto de vista clnico, los dos miembros ms significativos del gnero son .V. gororrh<xae y iV. meningitidis. J Y. gonorrhoeae produce gonorrea, que se transmite por contacto sexual de las membranas mucosas. Pueden portarlo hombres y mujeres durante aos sin producir signos o sntomas. N. meningitidis causa meningitis, esto es, la inflamacin de las membranas que recubren el sistema nervioso central. Las diferentes cepas de N. meningitidis se clasifican por sus polisacridos capsulares.

Existen varios mtodos rpidos que se de Neisseria. Estos mtodos y serolgi- cas, pruebas de utilizacin moleculares y fluorescentes. Entero bacterias

_Jutilizan para identificar las especies comprenden pruebas enzimticas de hidratos de carbono y anlisis

La familia de las enterobacteras incluye varios miembros, que van desde los patgenos entricos hasta patgenos oportunista extraintestinalcs. Son aerobios y anaerobios facultativos, no forman esporas y no se mueven. Las entcrobacterias representan un grupo heterogneo que tiene en comn estas propiedades.

34.ncniiYM bof.tfriolfcat y baet/rieleglo dta

-

Fermentan glucosa, normalmente con produccin de gas. Crecen bien en agar McConkcy. Dan positivo a la reaccin de la cattlau. Dan negativo a lo reaccin de la oxidase. Reducen el nitrato a nitrito.

Los principales gneros que producen infecciones en el ser humano son: Escherichia. Klebsiea. Proteus. Enterc-bacter. Salmonella. Shigella. Serratia, Citro- bacicr y Providencia. Escherichia coli es la bacteria que se encuentra con mayor frecuencia en el laboratorio clnico. Adems de ser La primera causa de infecciones del aparato urinario, produce otras en muchas otras partes del cuerpo. Entre las principales enfermedades producidas por las cepas patgenas de E coli estn las neumonas, las meningitis y la diarrea. La especie de mayor importancia clnica del genero Klebsiclla es A', pneumo- niae.que produce neumona e infecciones del aparato urinario en los pacientes cateterizados. Proteus produce infecciones del aparato urinario e infecciones nosocomiales {hospitalarias). Es muy mvil y no forma colonias regulares, sino de tipo pululante cuando se cultiva en un medio no inhibidor. Los especies de Enterobacter poseen una gran movilidad y producen infecciones urinarias y de otras partes del cucrpo. como el sistema respiratorio. Salmonella e$ causa de intoxicaciones alimntanos, que dan lugar o infe cciones intestinales con diarrea, vmitos, escalofros y cefalea. Las dos especies principales que producen salmonelosis son S. iyphimurium y S. enteritidis. Mientras que la mayora de las SalmoneUas las portan los animales, la 5.thypi slo lo porta el ser humano. Este parsito intracelular produce fiebre tifoidea que se caracteriza por fiebre, diarrea e infeccin de los rganos infectados. Shigelki causa diarrea, que se acompaa de fiebre, y tambin es un patgeno invasor que puede recuperarse de las heces sanguinolentas de un hospedador infectado. Por su parte, Serratia marccsccns produce infecciones del aparato urinario. heridas infectadas y neumona, Los Ctrohacffr tienen poca importancia clnica. Finalmente, aunque son raras, las especies de Providencia producen infecciones hospitalarias del aparato urinario.

Identificar y diferenciar las cnterobacterias puede ser tedioso y requerir tiempo. Para simplificar el trabajo, hay varios diagramas de flujo para distinguir las principales (fig 34-2). Sin embargo, debido a la variabilidad de las cepos, la interpretacin de muchas reacciones bioqumicas no es fcil; esto es. no hay una reaccin clara positiva o negativa. Se emplean sistemas comerciales de identificacin, como api20E y aparatos automticos Asimismo existen pruebas de aglutinacin para detectar anticuerpos contra estos microorganismos. Bacilos pleomrflcos En este grupo se incluyen los gneros Haemophilus, Bordetella, Brucella. fasteurelia y Legionella.

PAKTT V. AlriobiniV^f

O v a Cl-objclt" l o tn'iC<f"t KtEnifro&KC* a ' 1 , G'u'.u ProtKJt

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Pkhm .14-2 ixttrunui de rtuy> pan ktotlfcar roMrotoctera HAtUOfUILUS Las cspccics de Haemophilus son cocobacilos gramnegativos anaerobios facultativos, que colonizan normalmente las vas respiratorias superiores del ser humano. Generalmente, estos microorganismos dan positivo a las reacciones de la oxidasa y la catalasa. fermentan los hidratos de carbono y reducen los nitratos a nitritos. Todas las especies de Haemophilus necesitan para crecer entre un 5 y un 10% de CO,. Estas especies se clasifican por sus propiedades capsulares en seis grupos serolgicos diferentes (af)- Las especies que poseen una cpsula de tipo b tienen significacin clnica debido a su virulencia. Las principales cspccics de Haemophilus con nteres clnico son H. m/lueiuae, H. haemolyticus, H. ducreyi y H parainP.uemae

La infeccin por H. infueiaae es frecuente en los niftos, donde produce una infeccin respiratoria secundaria que normalmente afecta a los que ya tienen gripe. Esta especie puede tener dos cepas, segn tengan o no una cpsula de polisacrido patgena. Aunque ambas cepas se encuentran como flora normal en la nariz y la faringe, pueden producir una enfermedad grave en los pacientes inmunodeprimidos o con problemas respiratorios. Las cepas que carecen de cpsula normalmente producen infecciones localizadas (otitis y sinusitis|. mientras que las de tipo b. que tienen cpsula, dan lugar a infecciones graves, principalmente en los nius menores de 5 artos sin vacunar. Estas infecciones son, entre otras, meningitis, epiglotilis, bronquitis y neumonas. Hay varios mtodos rpidos jxara identificar y/o lipar las especies de Hair- mophilwf. Estos mtodos emplean pruebas enzimticas con sustratos rromog nicos. pruebas de aglutinacin, equipos comerciales para la tipificacin serol- gica y pruebas moleculares. II BCRDTtUA Las especies de Bordetella son cocobacilos gramnegativos pequeos, aerobios estrictos. La especie ms importante es f periussis.que produce la tos ferina. Esta bacteria, muy contagioso, penetra por inhalacin en el aparato respiratorio, donde destruye las clulas epiteliales ciliadas de la trquea y los bronquios.

34. Tcnicosbaclenaigicas y bccteriofogfo ctlnu o BfiVCLLA Las cspccics de Brucella son cocobacilos gramnegativos aerobios estrictos que producen brucelusis. Las cuatro especies que infectan al ser humano se nombran segn el animal en el que estn normalmente: B ubortus |vaca), B. suis |ccrdo|. B mellitensis icabra) y B. canis |perro). Bntcella pueden entrar en el organismo a travs de la piel, el aparato respiratorio o el tubo digestivo. Una vez aqu, este microorganismo intracelulor puede entrar en la sangre o los conductos linfticos, donde se multiplica dentro de los fagocitos. Las especies de Brucella producen enfermedades febriles septicmicas e infecciones localizadas del hueso o diversos rganos. La brucelosis se asocia con la exposicin ocupacional o no profesional a los animles. Presenta un tiempo de incubacin variable, un comienzo brusco y no tiene sntomas especifico. La confirmacin de la brucelosis por el laboratorio. ms que en aislar el microorganismo suele hadarse en pruebas serolgicas. Habitualmente se emplean pruebas de aglutinacin, que detectan anticuerpos en el suero. FUANCOtUA La especie de Francisclla de mayor importancia clnica es la F. lularensis, que produce tularemia. Esta enfernedad es muy infecciosa y la transmiten los roedores y los animales domsticos la identificacin por el laboratorio puede realizarse usando un medio de agar sanguneo con cistena. PASTURCLLA Las cspccics de Psteurelki son cocobacilos anaerobios gramnegativos inmviles que no son parsitos intracelulares. P. multoeida es la especie que infecta con mayor frecuencia al ser humano. Para identificarla, este microorganismo se puede cultivar en agar achocolatado, donde produce un olor desagradable.
LSGKJHCLLA

Las especies de Legionella se encuentran muy dispersas por la naturaleza, especialmente en ambientes acuosos. Los reservnos de estos microorganismos son los aparatos de aire acondicionado, las torres de refrigeracin y otros sistemas de agua, lagos de agua dulce, manantiales de aguas trmicas y depsitos de agua de bebida. Sus especies son aerobias, no forman esporas, se mueven, son bacilos gramnegativos y bioqumicamente inactivas. El cultivo es la forma definitiva para identificar especies de Legionella. Los medios inoculados deben incubarse durante 5 das en una atmsfera hmeda que contenga entre un2 y un 5% de COj. Para su identificacin puede utilizarse nmunofluorescencia directa con sensibilidad y especificidad bajas, radioinmunoanlisis para L pneumophila con una sensibilidad y especificidad altas, enzimolnmunoanli.-us de sensihili&id y especificidad elevadas, aglutinacin con Uitex con poca sensibilidad y sondas de ADN- La deteccin de anticuerpos presenta una sensibilidad y una especificidad elevadas. P.*IM V: A<>aobk)fngta Con relacin a los procedimientos diagnsticos de las enfermedades por espiroquetas, hay que sealar que una herramienta importante es observar directamente el material potcncialmcnte infectado, utilizando microscopa de campo oscuro o mtodos de fluorescencia directa con anticuerpos. Borreliosis (enfermedad de LymeJ La enfermedad de Lyme |borrcliosisl se transmite por la picadura de un artrpodo infectado por la espiroqueta B burgdorferi. Se presenta con diversos sntomas, que pueden confundirse con procesos inmunitarios e inflamatorios. La inflamacin alrededor de la picadura produce una lesin cutnea, que es la primera manifestacin de la enfermedad. Posteriormente, se producen sntomas neurlgicos, cardiacos o artrticos Hay mtodos de enzimoinmunoanlisis para diagnosticar la enfermedad de Lyme. Sin embargo, existe una gran variabilidad, debido a la diversidad de los antigenos utilizados. Los especmenes equvocos o positivos por enzimoinmunoanlisis deben confirmarse mediante la transferencia Western ilunbicn pueden aplicarse mtodos de biologa molecular, con amplificacin por la PCR.

Sfilis La sfilis es una enfermedad, normalmente de transmisin sexual, producida por la infeccin con 1>eponema palfdum. La infeccin es generalizada desde el comienzo y la enfermedad se caracteriza por periodos de latencia, a menudo de hasta 20 ao9. Estas caractersticas, junto con el hecho de que el T. palidwn no puede aislarse en cultivos, hacen que las pruebas scrolgicas ocupen una posicin central en el diagnstico de la sfilis. Hay pruebas serolgicas no treponmicas que detectan la presencia de anti uerpos contra el c material lipoproteico de las clulas daadas y 1a cardiolipina de los treponemas, y por tanto no son especficas del gneTo T>rponcma Estos pruebas son el VDRLvenercal disease research laboratory} y otras parecidas. Thmbin existen pruebas serolgicas treponmicas que detectan la presencia de anticuerpos contra antgenos treponcmicos y que se emplean para confirmar una prueba de deteccin sistemtica no treponmica positiva, Una de estas pruebas es el FTA ABS /fluorescent rreponc/nal antibody absorbed!, que es una prueba de inmunofluorescencia indirecta. Se han comercializado pruebas de enzimoinmunoon llsis que emplean antigenos treponcmicos especficos 'Ihm- bin se dispone de pruebas moleculares de transferencia Western y de reaccin en cadena de la polimerasa. Leptospirosls La leptospinj.MS es una enfermedad infecciosa que afecta tanto al hombre com a los o animales. Es producida por espiroquetas del gnero Uptospira. La infeccin puede ir desde un estodo subclinico hasta la gravedad, y moslrar sntomas como fiebre, cefalea, mialgia. meningitis y dolores abdominales. Pueden surgir complicaciones, com una insuficiencia o hepatorrenal y alteraciones del sistema nervioso central, El diagnstico de la leptospirosis puede realizarse observando al microscopio cultivos sanguneos, de orina o de liquido ccfalorra4S6 34. Temeos bacttrioigicA y fai-fdrnx'cgtto clnica quideo. Las prueba serolgicas pueden efectuarse a partir del sptimo da tras la aparicin de los signos clnicos. M1COPLASMA Y UREAPLASMA

Son los bacterias mis pequeas de vida libre. Debido a que carecen de pared celular adquieren diversas formas, no se tien con Gram y son resistentes a los antibiticos de |J-lactamasa. Son aerobios o anaerobios facultativos y tienen requisitos de crecimiento exigentes. Los medios para aislarlos precisan la suple- mentacin con cidos nucleicos y/o precursores de los cidos grasos. Micoplasmas urogenitales Hay dos especies que son patgenas para el ser humano: Urexiplasma ure- afytkum y Mycoplasma hominis. La primera produce uretritis en los varones, y en las embarazadas puede dar lugar a una corioamnionitis y a la rotura prematura de membranas. Tambin se la ha asociado a trastornos de la reproduccin. Por su parte, M. hominis produce vaginitis, endometriti* y salpingitis inespecficas. Ambos microorganismos pueden producir infecciones neonatales, como meningitis, infecciones respiratorias y septicemia. La colonizacin se produce durante el nacimiento. Dado que los micoplasmas genitales pueden ser comensales o patgenos, el diagnstico de la infeccin requiere la identificacin y la cuantiftcacin. Se dispone de equipos de reactivos para el cultivo, la identificacin y la titulacin diferencial de 11. ureafylicum y M. hominis. La identificacin se basa en las propiedades metablicas especificas de cada especie. Para la primera es la hidrlisis de urea, y para la segunda, la de arginina. En ambos casos, se produce la alcalinizacin del medio, con un cambio de color de un indicador. Las lecturas se realizan a las 24-48 h. Mycop/asma pneuntoniae Es uno de los principales agentes etiolgicos de la neumona en la edad escolar. La presencia de anticuerpos IgM permite diagnosticar una infeccin aguda directamente a partir de un espcimen de suero. La presencia o un aumento significativo del titulo de lgG entre do especmenes recogidos con un intervalo de unas 2 semanas, confirma la infeccin reciente Los anticuerpos suelen determinarse por enzimoinmunonnlisis. MICOBACTERIAS Son microorganismos en forma de bacilos, delgados, que no se mueven. La micobacterias son aerobios estrictos y no forman esporas. El complejo Myco- baclerium tuberculosis est

formado por Ai.tuberculosis. Al bwis y M. africanum. Son los agentes etiulgicos de la tuberculosis humono Las micobacterias atu- berculosas se dividen en cuatro grupos, segn la pigmentacin de las colonias y In velocidad de crecimiento en un medio slido. La identificacin de las micobacterias se basa en la deteccin de bacilos aci- dorresistentes en extensiones teidas de especmenes clnico, el crecimiento del \pakt* v. ahcrtt^ microorganismo en el medio de cultivo adixuado -como el de l-wen.stein-Jen- sen-, y pruebas bienjumicas oomo las de la niacina y la catalasa, las sondas <le ADN. la cromatografa Liquida y los sistemas automticos. La observacin directa de las extensiones de micobactcrias es importante por varias razones. Aunque la extensin no es tan sensible como las tcnicas de cultivo y se requieren aproximadamente 10* badlos/m! de esputo para que sea positivas, observar la extensin n proporciona un diagnstico de presuncin fcil y rpido. La observacin al microscopio tambin puede utilizarse para seguir a los pacientes en tratamiento. Adems, es muy importante detectar la presencia de una infeccin por micobactcrias lo ms rpidamente posible, ya que los pacientes que lu presenten son focos de diseminacin de la tuberculosis. Las micobactcrias son capuces de formar complejos estables con determinados colorantes de arilmctano |colorantes con anillos metnkos aromticos), como la fuscina o la auiamina 0. Una vez foimados estos complejos, son muy resistentes a la decoloracin con alcoholes cidos o cidos minerales fuertes, por lo que se llaman acidorrcsistciitcs. Aunque se <iesco<ioce el mecaniuno exacto responsable de lu resistencia al cido de las micobactcrias. se ha atribuido a la presencia de cidos miclicos en la pared celular externa. CHLAMYDIA. RICKVITSIA, COXIELLA Y EIIRLICH1A Estos gneros incluyen parsitos intracelulares estrictos. Crecen bien en el saco vitellno de huevos de gallina embrionarios. C. rrocfroMitifis es la causa ms frecuente de enfermedad de transmisin sexual. Su peligrosidad se debe a las posibles complicaciones asociadas a la infeccin: cndomclritls. salplngitls, embarazo ectpico y esterilidad en los adultos y conjuntivitis y neumonas en los recin nacidos, C. psillaci, que se halla con menor frecuencia en el ser humano y se transmite principalmente por los pjaros, puede producir neumona. Y C. pneumoniae produce enfermedades respiratorias agudas y crnicas, y se ha relacionado con enfermedades cardiovasculure.v

Actualmente, el cultivo celular es el mtodo de referencia para diagnosticar las infecciones por Chkimydicu. Las lincas celulares ms utilizadas son las clulas de mono McCoy o Buffalo. Las monocapas celulares crecen en cubreobjetos de vidrio u otro soporte adecuado. Tras la incubacin entre y 72 h, se fijan las monocapas y se tien con anticuerpos monoclonales conjugados con fluores- cena. Tambin puede emplearse una prueba de inmunofluorescencia directa, y se dispone de enzimoininurioanlisis que detectan los li|x>polisucridos de Chlamydia, tcnicas de hibridacin de cidos nucleicos y tcnicas de amplificacin de estos cidos Las richeiisias son microorganismos muy pequeos, de tamao parecido al de k virus, pero que se semejan a las bacterias grumnegativax. Son incapaces de replicarse de forma independiente y. por lo tonto, existen como parsitos intracelulares. Tienen un ciclo de transmisin entre artrpodos {pulgas, garrapatas y caroa) y hospedadores vetlelirados pequeos animales salvajes). 1 ser humano se infecta accidentalmente, -as rickcttsias l producen <ks tipos de enfermedades: el tifus y las fiebres exantemticas. No se recomienda el aislamiento en las infecciones por rickettsios, a causa de su elevada infcctividad. Las pruebas serolgicas, como la fijacin del comH. 7Vcff*uj bor&'rJgjiB y vjitvyJu^fcJ i'lifrtfu plemento y la microaglutinacin, y las serolgicas, como los F.LISA y las RIA, son limitados en trminos de sensibilidad, especificidad y disponibilidad. La prueba serolgica ms empleada es la inmunofluorescencia de lesiones cutneas, clulas endoteliales circulantes y biopsias. La Coxiilla bumetii produce la fiebre Q. que transmiten al ser humano animales infectados. El diagnstico de laboratorio de la fiebie Q suele hacerse demostrando la presencia de anticuerpos frente a C. bunietii.

C AP T U L O 35 Tcnicas virolgicas y virologa clnica

CONCEPTOS GENERALES Los virus son la causa ms frecuente de Las enfermedades infecciosas humanas. La gravedad de sus acciono va desde el resfriado comn hasta el SIDA. Son partculas compuestas, por lo general, por un cido nucleico y protenas, que no pueden duplicarse por s solas y necesitan para hacerlo una clula a la que infectan. Como cido nucleico contienen ADN o ARN, pero nunca ambos a la vez. El cido nucleico del virus est rodeado por una cubierta proteica ms o menos compleja, denominada cpside. Los virus se unen a las clulas hospedadoras inyectndoles su cido nucleico, que es la parte infecciosa de la partcula. Superiormente, y en un momento determinado que depende de cada virus, el cido nucleico de ste se apodera de la maquinaria de biosnteris de lo clula hospedadoro, forrando la sntesis de los componentes del virus Una vez formados stos, se constituyen las nuevas partculas del virus y se lisa la clula, saliendo al exterior los virus ya formados. MTODOS DE ANLISIS DE LOS VIRUS Existen diversas tcnicas para analizar los virus. Pueden agruparse asi: Mtodos de observacin directa mediante microscopa eleclrnica. Cultivos. Deteccin de antgenos vricos. Deteccin del cido nucleico del virus. Deteccin de anticuerpos contra el virus.

Mtodos de observacin directa mediante microscopa electrnica La observacin directa de las partculas de virus mediante microscopa electrnica utilizando una tincin negativa con cido fosfotngstico o uno fijaS. rnvu vinMgieos y virvyiu cIKIZ' INFECCIONES VRICAS DE LAS VAS RESPIRATORIAS Un gran nmero de virus din lugar a infecciones de las vas respiratorias. Ix principales patgenos respiratorio son el virus de la gripe, el virus respiratorio sincitial y los odenovirus, Ln gripe se diagnostica durante los dos o tres primeros das de la enfermedad, cuando es mxima la expansin vrico. Ln prueba diagnstica ms sensible es el cultivo, y los especmenes ms adecuados son las secreciones nasofarngeas, los esputos y los hisopos farngeos. Para hacer un diagnstico rpido es til la inmunofluorescencia directa de antgenos vricos cu secreciones nasofarngeas. La deteccin de antgenos vricos en estas secreciones nasofarngeas puede realizarse mediante enzimoinmunoaivlisis comerciales. El virus respiratorio sinario! produce infecciones importantes de las vas respiratorias inferiores, sobre todo en los nios pequeos Puede detectarse mediante inmunofluorescencia directa o enzimoinmunoanlisis de los anlgeniu en las secreciones respiratorias, En cuanto a los adenovirus. presentan gran nmero de scrotipos. La mayo ra de los casos de infecciones respiratorias causadas por estos virus se diagnostican de acuerdo con los sntomas clnicos. En determinados laboratorios pueden utilizarse los c ultivos de los virus. Las pruebas scrolgicas se basan en demostrar anticuerpos frente a antgenos especficos de grupo. En raras ocasiones se requiere el serolipo especfico, para cuya obtencin se emplean pruebas de fijacin del complemento. MONONUCLEOSIS INFECCIOSA 1.a mononucleosis infecciosa es una enfermedad linfoproliferativa producida por el virus de Epstcin-Ban- |VEB). Es un viras con ADN de doble cadena de la familia de los herpesvirus. que tambin produce el linfoma de Burkitt. el carcinoma nasofarngeo y la neumonitis intersticial linfoctica. El VEB se propaga a travs de la saliva contaminada e infecta a los linfocitos B. Los antgenos vricos que aparecen sobre la superficie de los linfocitos B afectados inducen la

produccin de linfocitos T mononucleares anmalos caractersticos. Los perixlusde incubacin van de 4 a 6 semanas y. aunque al final la enfermedad suele resol verse. los sntomas pueden durar |*r(od<xs largos. El VEB puede cultivarse en lineas celulares linfoblastoides Sin embargo. $ esto no es prctico, ya que lleva mucho tiempo y. adems, no diferencia entre 1 infecciones primarias y reactivadas, El diagnstico de la infeccin por el VEB en el laboratorio generalmente se hace identificando linfocitos atpicos m sangre i perifr ica, junto con una prueba de anticuerpos heterfilos Ipruebns de Paul Bunnell|. La deteccin de estos onticuerpos es muy especifica, pero muy poco -r sensible. Asimismo, se dispone de mtodos de inmunofluorescencia indirecta J para detectar anticuerpos contra el antigeno de la cpsidc del virus. Y los mto- | dos de enzimoinmunoanlisis detectan anticuerpos de las clases IgG e IgM con- ' tra el antgeno de la cpsidc. Tambin pueden determinarse anticuerpos contra 2 el antgeno nuclear del virus. Rccientemenle. se ha hecho posible delectar el ADN del VEB mediante la | reaccin en cadena de la polimerasa iPCR|. Esta tcnica puede ser til para diag o noslicar la Infeccin tempranamente. Puede detectarse en suero, liquido refalo- i ir/i. VC Microbiologa rraquldeo o biopsias tisulares de enfermos con una linfoadenopata inducida por una mononudeoais infecciosa, enfermedades linfoproliferativas tras trasplantes, un linfoma de Burkitt y un carcinoma nasofarngeo. El cido nucleico del VEB tambin puede detectarse mediante hibridacin in situ (ISH|. en la que se emplea una sonda para los ARN codificados por el virus. INFECCIONES POR CITOMEGALOVIRUS El citomegalovirus jCMV| es un virus de la familia de los berpesvirus. Produce infecciones que pueden mantenerse latentes y reactivarse despus. La seroprevalencia de los anticuerpos contra el CMV varia desde el 40 al 100% de los adultos sanos, dependiendo de la situacin socioeconmica. La infeccin por CMV es la infeccin intrauterina ms frecuente, que afecta a cerca del l % de los recin nacidos La infeccin primaria por CMV en la madre es frecuentemente virmica y posa al feto a travs de la placenta.

El diagnstico definitivo paro confirmar la infeccin por CMV se obtiene mediante un cultivo. Aislar el CMV del liquido amnitico, la sangre de cordn o los tejidos fetolcs y la sangre del neonato proporciona el diagnstico de la infeccin congnita. Los anticuerpos de tipo IgM contra el CMV que se detectan cuando el feto est en el (itero o en el momento del parto indican tambin una infeccin congnita. El mtodo diagnstico ms adecuado es la determinacin mediante enzi moinmunoanlLsis de los anticuerpos de tipo IgG, que indican un estado inmune y exposicin, y los anticuerpos de tipo IgM. que sealan una infeccin aguda. Rra la deteccin sistemtica en donantes de sangre puede emplearse un mtodo de aglutinacin que detecta anticuerpos totales. Las tcnicas de transferencia puntual dol biol pueden detectar el genoma del CMV en la orina. Asimismo, la microscopa electrnica puede detectar CMV en orina o especmenes bucales de recin nacidos infectados de forma congnita. Hay mtodos de deteccin del ADN mediante la PCR y mtodos de hibridacin in situ. Tambin puede emplearse la inmunofluorescencia directa en biopsias de tejidos. RUBOLA La rubola la causa un virus con ARN de la familia togavlrus. Es una enfer edad muy m contagiosa que se propaga a travs de las secreciones respiratorias. El paso a la cavidad amnitica a travs de la placenta durante el primer trimestre produce en el feto muchas malformaciones. Sin embargo, en la actualidad, la rubola congnita es rara debido a la eficacia de la vacunacin y la deteccin sistemtica prenatal. El cultivo requiere mucho tiempo y no suele realizarse. Se emplean enzlmoinmunoanlisis para detectar anticuerpos de los tipos IgG o IgM. stos sealan una infeccin reciente, mientras que aqullos indican el estado inmune. MENINGITIS Y ENCEFALITIS VRICAS Los principales virus que producen meningitis son los e nterovirus. mientras que el que produce ms a menudo encefalitis es el virus del herpes simple 35. TVmiMj viroAfelCO) y iroiyjla rtotica,

iVHS). La tcnica ms adecuada para identificar cnterovirus en el liquido cefa lorraqudeo LCR) es la transcripcin inversa acoplada a la PCR lRT-PCR|. Tambin se utilizan las tcnicas de ADN para detectar el herpes simple en el LCR. GASTROENTERITIS VIRICAS Los rotavirus son virus con ARN que tienen una cpside de dos capas, lo cual da al virus el aspecto de una rueda. Son responsables de al menos el 50% de los casos de diarreas acuosas en los nios pequeos TVadicionalmente. el diagnstico de las gastroenteritis vricas se ha hecho segn las caractersticas morfolgicas, mediante microscopa electrnica ( E) en M especmenes de heces. Sin embargo, la ME no est al alcance de la mayora de los laboratorios, La deteccin rpida de antgenos de rotavirus en especmenes de hcces puede hacerse fcilmente y con gran exactitud mediante pruehas de aglutinacin con tex o l inmunoanlisis. HEPATITIS VRICAS Hay un gran nmero de virus que producen afectacin heptica. Sin embargo, la mayor parte de las enfermedades hepticas vricas son producidas por seis virus diferentes, llamados A. B, C. D, E y G. todos ellos hepatotrpkos y productores de alteraciones liticas en los hepatocitos. Los virus de la hepatitis A (VHA| y hepatitis E |VHE| se transmiten de forma fecal-oral. El virus de la hepatitis B |VHB] se transmite fcilmente a travs de la sangre y se ha adquirido, clsicamente, mediante transfusiones y pinchazos con agu>as contaminadas. Sin embargo, son rutas importantes la infeccin vertical durante el embarazo, la transmisin mediante contactos sexuales y lquidos biolgicos infectados, como la saliva. Los seis virus de la hepatitis no se replican en las lneas celulares estndar, y la deteccin de antgenos vricos y de anticuerpos especficos de los tipos IgM e IgG seala la fase de la infeccin. Hepatitis A La hepatitis A es causada por un pequeo virus de la clase pienrnavirus. que son virus con ARN El virus est muy extendido por todo el mundo y produce infecciones tanto epidmicas

como espordicas, sobre todo en reas con poca higiene y condiciones socioeconmicas bajas El periodo de incubacin del Vil A es de 7 a 42 das, y los pacientes son infecciosos entre 7 y 10 das antes de que aparezcan los sntomas, y durante unos pocos das despus. En la figura 35-1 se presenta la evolucin cronolgica de la infeccin por el VHA. El diagnstico scrolgico de la infeccin aguda por el VHA depende de la demostracin de anticuerpos anti-VHA de tipo IgM. Generalmente, aparecen unas 4 semanas despus de la infeccin y pueden mantenerse hasta 4 meses tras el comienzo de los sntomas clnicos. La presencia de anticuerpos IgG o totales (IgM e IgG| indica una infeccin pasada y una inmunidad asociada. La prueba total detecta ambos tipos de anticuerpos. IgM e IgG. y no diferencia enlre ellos. l\ir eso, cuando se sonfieche una infeccin aguda deber realizarse una prueba de IgM. | PAKTK V. Microbiologa

lnl*cn FKIIKA 35-1 Etvtacia cronolgica E B infcvoo por<1 VMAde B hcpoliln A |VIIAV Hepatitis B La hepalitis B es producida por un virus con ADN de doble cadena, miem bro de la familia hcpadcna. El virus est formado por un ncleo fcorej central que contiene el ADN. rodeado por una cpside proteica. El VHB se halla repartido por todo el mundo, y esta enfermedad es una de las causas principales del carcinoma heptico. El periodo de incubacin del VHB est comprendido entre 30 y 180 das. Alrededor del 60% de las infeccio nes son asintomticas.

pero una pequea proporcin son muy graves, y producen mucho dao al hgado c insuficiencia heptica. El diagnstico y seguimiento de laboratorio de las infecciones agudas y cr nicas del VHB utiliza uno o varios de los siguientes marcadores scrolgicos: ant- geno de superficie de la hepatitis B |HB,Ag|, antgeno e (HBeAg). anticuerpo contra el antgeno core (anti HB,), anticuerpo contra el antgeno e |anti-HBe| y anticuerpo contra el antgeno de superficie |anti-HB,)- La inmunidad de la vacuna para el VHB puede tambin valorarse midiendo la concentracin de anti-HB,. Las combinaciones de varios de estos marcadores son especialmente tiles para diferenciar la hepatitis aguda, la hepatitis crnica y el estado de portador crnico. Su pa trn de reactividad refleja la evolucin de la infeccin. En la figura 35-2 se presenta la temporalidad de la aparicin de los antgenos y los anticuerpos durante la infeccin por el VHB. El HBAg se detecta entre las 2 semanas y los 2 meses anteriores a la aparicin de los sntomas clnicos y unos 2 semanas despus de la infeccin Su presencia varia hasta 2 o 3 meses Entre un 5 y un 10 % de los pacientes tienen concentraciones persistentes de HB,Ag transcurridos 6 meses (portador crnico y hepatitis crnica!. I PAKIt. V. Microbidogla Hepatitis C La hepatitis C es producida por un pequeo virus con ARN". Est distribuida por todo el mundo, con ms de 100 millones de portadores, l-o mayora de los casos son asintomticos. pero cuando se producen los sntomas es frecuente la hepatitis crnica. La transmisin tiene lugar mediante la exposicin a la sangre o a los productos sanguneos La determinacin de los anticuerpos contra el virus de la hepatitis C VHC} es la prueba principal para diagnosticar esta enfermedad. Sin embargo, el tiempo de seroconversin va de 3 a 6 meses en la infeccin adquirida mediante transfusin y de seis a nueve en los casos que no estn relacionados con las transfusiones. Los enzimoinmunoanlisis para el VHC detectan anticuerpos |anti-VHC| para cualquiera de las cuatro protenas del mismo |5-1-1, cl(X>-3, c33c y c22-3). Estas protenas se sintetizan mediante tcnicas recombinantes y se fusionan con la superxkio dismutasa |SOD) como portadora. El RIBA ^reoombinatt immu- noWo assaysf es una tcnica de inmunotransferencia que se emplea para detectar anticuerpos contra protenas del VHC.

La PCR para el ARN del VHC utiliza cebadores para una regin 5' no codiicante muy f conservada del genoma del virus. Cuando esta prueba es positiva, el paciente tiene una infeccin activa con el VHC. Esta prueba se recomienda para Jos pacientes que sean positivos para onti-VHC. La medida cuantitativa del ARN del VHC (carga vfrical es til para seguir la respuesta al tratamiento en los pacientes que estn infectados con este virus. Hepatitis O La hepatitis D (delta) tiene por causa un virus que contiene un ARN circular. Requiere HB\g para poder replicarse y. como consecuencia, una coinfeccin con el VHB. El modo de transmisin es parenteral y en las reas endmicas est asociado con epidemias de gran mortalidad. Con relacin al diagnstico, al producirse en coinfeccin con el citado virus, slo debe considerarse en casos de hepatitis B. El diagnstico serolgico de la hepatits D i depende del hallazgo del antgeno y/o la presencia de anticuerpos contra el virus de lo hepatitis O {anti-VHD|. En los pacientes con coinfcccioncs agudas, el antgeno de la hepatitis D (HDAg) aparece poco despus del HB>Ag y desaparece con la convalecencia. Las infecciones agudas estn asociadas con el anticuerpo IgM anti VHD, y los casos crnicos normalmente slo dan el anticuerpo IgG. Ambas anticuerpos pueden finalmente desaparecer despus de la convalecencia. El antgeno y los anticuerpos se determinan mediante radioinmunoanlisis o enzimoinmunoanlisis. Hepatitis E El VHE es un virus con ARN esfrico sin envoltura. Este agente infeccioso est restringido a kxs pases desarrollados y tiene una distribucin mundial. Para el diagnstico se utiliza la determinacin de anticuerpos contra el VHE, mediante radioinmunoanlisis o enzimoinmunoanlisis. Tambin puede detectarse el cido nucleico mediante la PCR. C AP T U L O 36 Tcnicas m icolgicas y m icologa clnica

CONCEPTOS GENERALES Los hongos son vegetales talofitas que carecen de raices y hojas, y pueden prcscnlarsc en forma de levaduras o como micelios ramificados. Todos los hongos tiene una pared celular que los hace grampositivov Muchas especies de hongos son de enorm utilidad para el e hombre, ya que se usan para producir sustancias de fermentacin, como la cerveza y el yogur, y antibiticos: sin embargo, algunas especies son patgenas. Los pacientes inmunodeprimiclos son especialmente ."nstblcs a las infecciones por hongos La mayora de los hongos patgenos para el hombre son saprofitos, esto es. se alimentan de materias orgnicas en descomposicin. La infeccin se produce cuando llegan a los pulmones o a los senos paranasales las esporas transportadas por el aire, o cuando las hifas o las esporas se inoculan casualmente en la piel o la crnea. Los hongos patgenos pueden clasificarse en tres grupos, segn su presentacin clnica:
1. 2. 3.

Hongos que producen micosis superficiales e infecciones epidrmicas. Hongos que causan micosis profundas. Hongos contamname*.

IDENTIFICACIN DF. LOS HONGOS El diagnstico ie las infecciones producidos por hongos se basa funda mentalmente en la observacin directa y en los cultivos de los especmenes afectados. Es posible tambin realizar pruebas serolgicas para estudiar las enfermedades producidas por hongos. La identificacin de las cspccics de stos se basa en las caractersticas macroscpicas y microscpicas de sus colonias. Las principales caractersticas macroscpicas que se analizan son la velocidad de crecimiento, la textura, la topografa de la colonia y el color. Para

36. Ttaca rnrotjjuat y mii!otnliJ /ura . fioriuM-l PU* de Hr-tn cfje cunliene un (>0U COCI NVDK. DI: Satxiu ruuiJ ilcodf te iiiwiiUn lo* hoago& un portaobjetos limpio. Se tapa con un cubre, teniendo en cuenta que el montaje ha de ser delgado, y para ello se puede aplicar una presin suave. Se observa con poco aumento y luz reducida, y se pasa a un gran aumento para buscar las posi les clulas encapsuladas. Las b cpsulas mucoides aparecen como una aureola clara que rodea a la clula de la levadura, que est entre la pared celular y la masa negra circundante de partculas de tinta. CULTIVOS El estudio mlcolgico requiere pocos medios de cultivo, de los cuales el ms empleado es el glucosado de Sabouraud. Los cultivos se realizan por el mtodo del portaobjetos: en un portaobjetos estril se coloca un poco de medio de Sabouraud. se inocula el hongo y se cubre el medio con un cubreobjetos. El conjunto se introduce en una placa de Fetri. que se mantiene hmeda con un papel de filtro empapado en glicerol al 50 fc. colocado en el fondo de la placa |fig- 36-11. El crecimiento del hongo puede observarse con el microscopio directamente en la misma placa. Algunos bongos se pegan al cubreobjetos y. para observarlos, ste se separa y se introduce en una disolucin de lactofcnol y se coloca sobre otro porta Con esta operacin, es posible observar los hongos teidos. Los cultivos tambin pueden efectuarse en agar de Sabouraud en una placa de Fetri. PRUEBAS BIOQUIMICAS Las pruebas bioqumicas son fundamentales para identificur las levaduras y. a veces, son tiles para identificar los hongos. La caracterizacin bioqumica puede realizarse mediante estudios de fermentacin o patrones de asimilacin Se emplean mtodos comerciales, como api20C. VUek y MicroScan,

PRUEBAS SEROLGICAS En muchas circunstancias se utilizan pruebas serolgicas para diagnosticar y seguir las enfermedades producidas por los bongos. Se han descrito prueban de este tipo para detectar antgenos o anticuerpos. Se emplean para aspergilosis, blastonoosbh candidiasis. coccidiumicosis, criptococosis. bistoplasmosis y esporotricosis- Existen para estas pruebas reactivos comerciales pero, debido a que no se realizan con mucha frecuencia, cada laboratorio debe valorar su demanda en funcin de los costes y la caducidad de los reactivos LEVADURAS De las muchas levaduros de la naturaleza, seis gneros {Candida, Cryptococ- cus. Torulopsis, Vickosporon. Malassezia y Rhodotorula) son responsables de la

^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ 36. Tcrrcas /mi-oMgx-as y niiVoluyfei clfriM ] MICOSIS SUBCUTNEAS Las micosis subcutneos son producidas por diversos hongos, la mayora de los cuales son microbios del suelo que penetran en el hospedador mediante una implantacin traumtica. La infeccin que resulta afecta, principalmente, al tejido subcutneo, normalmente sin diseminacin. Hay seis categoras princi- pale. de enfermedades fngicas dentro de las micosis subcutneas: cromoblas- tomicosis esporotricosis rinosj>oridosis. lobomicosis, faeohifomicosis y rnice- toma El diagnstico se realiza mediante la observacin directa de las lesiones y el cultivo. MICOSIS GENERALIZADAS Las principales micosis generalizadas son la blastomicosis, la histoplasmo- sis y la coccidiomicosis. Blastomicosis La blastomicosis es uno enfermedad granulo matosa crnica causada por el hongo dimrfico B/asrom>ves dcrmalitidu. Normalmente se produce una infeccin pulmonar, pero puede generalizarse y dispersarse a la piel y otros rganos. El principal medio diagnstico es la observacin directa de preparaciones hmedas de especmenes tratados con KOH al 10%. La prueba de fijacin del complemento es la prueba serolgica ms utilizada para diagnosticar la blastomicosis. Sin embargo, menos del -10% de los pacientes tienen pruebas positivas cuando est presente la enfermedad activa. En los pacientes con histcplosmosis o coccidiomicosis se producen frecuentes reacciones cruzadas. En general, la nmunodifusin mide IgG. Un resultado positivo puede sugerir una enfermedad activa o reciente. La prueba es positiva en ms o menos el 80% de los casos. Raramente, se producen reacciones cruzadas con la histoplasmosis. Asimismo, una prueba negativa no excluye la blastomicosis.

Histoplasiuosls La histoplasmosis es obra deliistopkama capsuhlum, que normalmente da lugar a una infeccin respiratoria aguda que, en general, es autolimitada o sub- clnica. i-os sntomas son fiehre. catarro y malestar. Cuando progresa y se generaliza .se afectan el hgado. Jos ganglios linfticos y el bazo. El diagnstico se realiza observando directamente extensiones de especme como la capa nes superior de sangre perifrica centrifugada, aspirados de mdula sea y material de biopsia. Se tien con Giemsa y se observan dentro de los macrfagos pequeos levaduras como gemaciones. El cultivo de H. capaulatum es lento. El color de las colonias va desde el blanco al marrn El diagnstico mediante la deteccin de antgenos necesita una confirmacin poi cultivo o histopatologa, ya que en ocasiones se obtienen falsos {XKjitlvos. Pueden determinarse anticuerpos mediante pruebas de fijacin del complemento c inmunodifusin. I PAMTt V. AllCroblO>,)tf Coccidiomkosis Las coccidiomicosis tiene por causa el Coccidioides immilis. En general, son enfermedades respiratorias agudas benignas y autolimitadas. Sin embargo, pue den croniicarse y evolucionar hacia una infeccin fatal que afecte a ln pie), los ganglios linfticos, e) bazo, e) hgado, los huesos, los rones, las meninges o el cerebro. El diagnstico de la coccidiomicosis se realiza mediante observacin directa o con cultivos de esputo, orina y pus en busca de C. immiris. Deben extremarse tas precauciones cuando se manipulen los especmenes que pueden contener el microorganismo, para evitar contagios en el personal del laboratorio. Hay pruebas serolgicas de fijacin del complemento, de inmunodifusin y de ELISA para detectar anticuerpos contra el hongo. En cualquier caso, una serologia negativa no excluye la posibilidad de una infeccin actual. AGENTES M1CTICOS OPORTUNISTAS Aspergllosis

Los AspergiUus, especialmente el A. fumgalas, dan lugar a las aspergllosis, que producen infecciones primarias y secundarias. Entre ellas: reacciones alrgicas pulmonares: una colonizacin en cavidades preformadas taspergilomns}: la infeccin superficinl de la piel, los senos paranusales y el canal externo del odo: la infeccin nccrosante invaora de los pulmones y la enfermedad diseminada fatal. El aislamiento repetido de Aspergitlus en el esputo, o ln demostracin de las hias en el esputo o en el lquido de lavado broncoalveolar sugieren una infeccin. Las pruebas serolgicas de deteccin de anticuerpos son tiles para diag nosticar la aspergilosis, en especial en los (vicenles que dan cultivos negativos, y diferenciar entre varias formas clnicas de la enfermedad. Se utilizan la fijacin del complemento y la inmunodifusin. Los valores son ttulos menores de 1:8, por fijacin del complemento. Ios ttulos superiores tienden a ser una indicacin de la enfermedad y de su gravedad. En cambio, una prueba negativa no excluye la infeccin, especialmente en los pacientes inmunodeprimidns. fin general, la inmunodifusin mide IgG, y un resultado positivo puede sugerir una infeccin activa o reciente. Infeccin por Ptieumocyslis canti P. carinii es un bongo oportunista que produce neumona en los pacientes inmunodeprimidos. Las personas con riesgo de infeccin por P cari'iii son los prematuros, los pacientes con SIDA y los tratados con frmacos inmunosupre sores, como los corticoides. Este hongo es el agente infeccioso oportunista ms comn en los vicenles con SIDA, de los que el 8i)% sufre su infeccin. El diagnstico se realiza en el esputo inducido en el liquido de Uivudo broncoalveolar. Se tie con blanco calciflor o con anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia. Thmbin pueden utilizarse tcnicas de biologa molecular, mediante amplificacin del ADN por la reaccin en cadena de la polimernsa. C AP T U L O 37

Tcnicas parasitolgicas y parasitologa clnica

CONCEPTOS GENERALES Desde un enfoque biolgico, un parsito es un organismo que vive dentro de otro y se aprovecha de todos sus sistemas vitales. El parsito puede ser desde un protozoo unicelular simple hasta un organismo complejo como un helminto. Estos organismos pueden tener ciclos vitales muy sencillos, en los que se forma una relacin ntima con un solo hospedador, o tener ciclos vitales complejos, en los que participan formas de vida libre y uno o varios hospedadores intermediarios. En medicina se aplica el nombre de vparasitologa al estudio de los protozoos, helmintos y artrpodos que causan enfermedades al hombre. Segn el lugar donde se localicen los parsitos, pueden considerarse los intestinales, los sanguneos, los de algunos rganos y tejidos y los cutneos PARSITOS INTESTINALES Los principales parsitos Intestinales son los protozoos y los helmintos (nematodos. cestodos y tremtodos). c Protozoos intestinales t Entre los protozoos intestinales estn las amebasEntamoeba histofytica/, los I flagelados /Giardia lambliaf, los ciliados (Balantidiunt culi), los coccidios y los microsporidios. La E. hiilolytica produce disenteria amebiana, que es una ? infeccin del intestino grueso. La infeccin se adquiere ingiriendo quistes en R alimentos o agua contaminados, sobre to en do zonas con una higiene deficiente. - El grado de enfermedad va desde un estado asintomtico a una disenteria aguda, con heces frecuentes que contienen sangre y moco, y dolor abdominal de tipo clico.

G. lamblia produce giardiasis. En forma de quistes puede encontrarse en o grandes cantidades en las heces de las personas totalmente asintomaticas. En algunas petona. la forma flagelada (Irofoznitr) se engancha a la mucosa del intestino delgado uiusiin diarrea clicos y prdida de peso, Se adquiere al beber agua contaminada o al nadar en agua dulce contaminada. Helmintos intrstiiiiilcs Los principales nemotoda patgenos intestinales son Enterobius wrmiatlaris, Ascaris hmhricokts. TVichuris trichiuria y Stiotiptoides sfmelaris. A. lumbrkoides infecta el intestino, particularmente el de los nios. I.i infeccin se adquiere al ingerir huevos que estn en el suelo contaminado con hcccs o al ingerir carne contaminada sin cocinar, ln cuanto a H vfrmkulans, es una lombriz de 1 cm de longitud que infecta el intestino grueso, sobre todo en los nios pequeos. I.os principales ees lodos |>atgertos intestinales son Taenia sagwata y /! sohum. Se trata de gusanos planos con una cabe/a (esclex) y un conjunto de segmentos, cuya longitud puede variar entre unos pocos centmetros y varios metros, segn las cspccics Lo infeccin se adquiere al ingerir carnc sin cocinar que contenga los quistes de la larva El escole* emerge del quiste y se engancha a lo pated del intestino. Los principales tronatodos intestinales son Clouorehis sinensis y Fsola heptico. Especmenes para estudiar los parsitos intestinales Como la mayora de los [wrsitos intestinales salen del organismo jx>r las heces, los principles mtodos do rutina del laboratorio microbiolgico inclu yen la observacin dimcui de las lieces en busca de aqullos. El vertido cclico de la mayor parte de los parsitos en las heces requiere observar, al menos, tres especmenes recogidos en dias alternos. Algunos parsitos requieren que se concentren las hcccs antes de realizar el examen. Para concentrarlas hay que mezclar de 2 a 5 g |2 a 5 mi) del espcimen de hcccs con de 10 a 12 mi de formol al 10%. Se filtra una alcuota de lo suspensin con dos capas de gasa, hasta obtener 3 mi en un tubo de centrifuga de 15 mi. Despus se aode 10 mi de una solucin salina al tubo y se centrifugo durante 2 min a 2.000 rpm. Se decanta el sobrenadante y se resuspende el sedimento en 9 mi de formol al 10%. A continuacin se aade 3 mi de acetato

de etilo. Se tapa el tubo con un tapn de goma o corcho y se agita durante 30 s. Luego se quita con cuidado el tapn manteniendo el tubo alejado. Se eliminan las capas superiores y se conserva el sedimento, donde estn los parsitos. El sedimento se utiliza para realizar la preparacin. Observucin de Ins heces Rara realizar la prueha, hay que colocar una gota del espcimen de hcccs sus peivdido en una solucin salina fisiolgica o de las heces concentradas en el centro de un portaobjetos limpio. Se aade una o dos gotas de una disolucin de yodo de Lugol, se mezcla la disolucin de yodo y el espcimen con el borde de un cubreobjetos y se observa con el microscopio. La determinacin del tamao de los parsitos es importante para identificarlos correctamente. Para ello se utilizan algunas peiona.- la fot na flagelada (trofozoitol se engancha a la mucosa del intestino delgado causan diarrea clicos y prdida de peso, Se adquiere al beber agua contaminada o al nadar en agua dulce contaminada. Helmintos intestinales Los principales nemotoda patgenos intestinales son Enterabais vrrrmcularis, Ascaris lumbricoides. TVichuris trichiuria y St>ongyhides zimolaris. A. lumbricoide* infeca el intestino, particularmente el de los nios. I.t infeccin se adquiere al ingerir huevos que estn en el suelo contaminado con heces o al ingerir carne contaminada sin cocinar, ln cuanto a E vermicutar, es una lombriz de 1 Cm de longitud que infecta el inteslino grueso, sobre todo en los nios pi\|iie<*v Los principales ceslmiox |>atgerios intestinales son Taenia saginata y /! Mihum. Se trata de gusanos planos con unn cabeza |escolexl y un conjunto de segmentos, cuya longitud puede variar entre unos pocos centmetros y varios metros, segn las cspccics Lo infeccin se adquiere al ingerir carnc sin cocinar que contenga los quistes de la larva El escole* emerge del quiste y se engancha a la pared del intestino. Los principales tronalodos intestinales son Clonorehis sinensis y Fasciola heptico. Especmenes para estudiar los parsitos intestinales

Como la mayora de los [wrsitos intestinales salen del organismo jx>r las heces, los principles mtodos do rutina del laboratorio microbiolgico inclu yen la observacin dirncUi de las lieccs en busca de aqullos. El vertido cclico de la mayor parte de los parsitos en las heces requiere observar, al menos, tres especmenes recogidos en das alternos. Algunos parsitos requieren que se concentren las heces antes de realizar el examen. Para concentrarlas hay que mezclar de 2 a 5 g |2 a 5 mi) del espcimen de heces con de 10 a 12 mi de formol al 10%. Se filtra una alcuota de la suspensin con dos capas de gasa, hasta obtener 3 mi en un tubo de centrifuga de 15 mi. Despus se aade 10 mi de una solucin salina al tubo y se centrifuga durante 2 min a 2.000 rpm. Se decanta el sobrenadante y se resuspende el sedimento en 9 mi de formol al 109. A continuacin se aade 3 mi de acetato de etilo. Se tapa el tubo con un tapn de goma o corcho y se agita durante 30 s. Luego se quita con cuidado el tapn manteniendo el tubo alejado. Se eliminan las capas superiores y se conserva el sedimento, donde estn los parsitos. El sedimento se utiliza para realizar la preparacin. Observacin de las heces Para realizar la prueha, hay que colocar una gota del espcimen de heces sus- peivdido en una solucin salina fisiolgica o de las heces concentradas en el centro de un portaobjetos limpio. Se aade una o dos gotas de una disolucin de yodo de Lugol, se mezcla la disolucin de yodo y el espcimen con el borde de un cubreobjetos y se observa con el microscopio. La determinacin del tamao de los parsitos es importante para identificarlos correctamente. Para ello se utilizan ! P.*Jtm V. Micrcibiciagij siente y el T. gambiente se propagan mediante la mosca tsets y producen la enfermedad de! sueo. Y en Amrica central y del sur, una especie diferente, el T. cnai.se propaga por una chinche que chupa la sangre y da lugar a la enfermedad de Chagas. La toxoplasmosis la produce el T. gondii, cuyo hospedador primario es el gato. La infeccin humana se adquiere por la ingestin de quistes presentes en carne poco cocinada o con heces de gato. La infeccin durante el embarazo es ms grave, ya que produce deformaciones en el feto.

Hay varias especies patgenas de Lshmania, todas las cuales tienen reservnos animales y se transmiten por mosquitos flebtomos. Cousan dos tipos de enfermedad: una cutnea o mucocutnca y otra visceral. La forma visceral |kala-azar| es una enfermedad generalizada. Extensiones gruesas Los parsitos sanguneos se buscan e identifican en extensiones gruesas de sangre, que se realizan de forma anloga a las delgadas, pero presionando menos con el portuobjetos. Las extensiones se dejan secar sin calentar, hasta que no brillen Una vez secas, se sumergen en agua destilada hasta que se elimine la hemoglobina. Luego, se cubren con colorante de Giemsa de 30 a 60 min. se lavan con aguo para eliminar el exceso de colorante y se dejan secar. Las extensiones sanguneas gruesas y finas pueden utilizarse no slo para la deteccin sistemtica en pacientes con riesgo de parsitos sanguneos, sino tambin para determinar la especie y el nivel de parasltemia en los casos positivo. Pruebas serolgicas Existen pruebas serolgicas que dctcctan anticuerpos para diagnosticar los parsitos sanguneos. PARSITOS DE OTROS LUGARES CORPORALES Parsitos hepticos El parsito heptico ms comn es el cestodo ftjjc/oia heptico, que produce la fasciolasis. Los principales sntomas de la infeccin aguda correspondiente son dolor abdominal, hepatomegalia, fiebre, nuseas y vmitos. Los sin tomas de la infeccin crnica son la obstruccin y la inflamacin biliares. Las pruebas de anticuerpos son tiles en los estadios precoces de la infeccin, cuando los ovoquistes no estn en las heces o en los especmenes biliares. Adems. estas pruebas pueden emplearse para seguir la infeccin tras el trata miento. Las pruebas de anticuerpos pueden realizarse por inmunoclcctroforesis o por pruebas de fijacin del complemento. Parsitos vaginales El protozoo flagelado Trichornonas wginatis causa lo tricomoniasis. una enfermedad comn de transmisin sexual. Afecta hasta un 20% de las mujeres jvenes con actividad sexual, a las que produce vaginiti.v En los varones da