BACTERIAS LÁCTICAS: CLASIFICACIÓN Y FISIOLOGÍA

Descripción general y géneros incluídos

Una definición completa de las bacterias lácticas, no existe. Inevitablemente, la
mayoría de las características que se podrían usar para tal definición están sujetas a
limitaciones, esto quiere decir que son seguras sólo bajo condiciones determinadas que se
deberían llamar “normales o standard”, pero se pueden encontrar excepciones a tal
definición. De este modo, es más apropiado describir la bacteria láctica típica (LAB), como
Gram positiva, no esporulada, catalasa negativa, carente de citocromos, de habitat no
aeróbico pero aerotolerante, muy exigente desde el punto de vista nutricional, tolerante al
ácido y de metabolismo estrictamente fermentativo, con ácido láctico como principal
producto final de la fermentación de los azúcares. Una característica clave de LAB que se
debe resaltar es la incapacidad de sintetizar porfirinas (grupo hemo), por esto, estas
bacterias carecen de una verdadera catalasa y de citocromos cuando crecen en los medios
de cultivo en el laboratorio, los que carecen de hematina o compuestos relacionados. Bajo
estas condiciones, que son las normales en la mayoría de los estudios de estas bacterias,
ellas no poseen los mecanismos de una cadena de transporte de electrones y cuentan con
la fermentación, fosforilación a nivel de sustrato, para la generación de energía. En algunas
LAB se puede presentar una actividad catalasa mediada por una “pseudocatalasa” que
carece de un grupo hemo, luego, la ausencia de citocromos puede ser una característica
más segura en el diagnóstico preliminar que el test de la catalasa, que es más usado. Sin
embargo, es importante notar que la situación puede ser totalmente diferente si se añade
hematina (o hemoglobina) a los medios de cultivo. LAB pueden sintetizar una verdadera
catalasa y aún citocromos, en algunos casos resulta en una verdadera respiración con una
cadena de transporte de electrones funcional.
Los géneros que coinciden con la descripción de las LAB típicas en la mayoría de
los aspectos son (como están clasificadas en el Manual de Bergey de 1986): Aerococcus
(A.), Lactobacillus (Lb.), Leuconostoc (Ln.), Pediococcus (P.), y Streptococcus (S.).
Históricamente, se ha considerado al género Bifidobacterium como perteneciente al grupo
de LAB, porque las especies de Bifidobacterium coinciden con la descripción general, sin
embargo, ellas están filogenéticamente más relacionadas al grupo Actinomycetaceae de
bacterias Gram positivas. Además, ellas tienen una vía especial para fermentar los
azúcares, lo que las separa claramente del grupo de LAB. Bifidobacterium tienen mucha
importancia en el tracto gastrointestinal de animales y humanos por su posible acción
probiótica.
Una extensa revisión de los streptococos se estableció en el Manual de Bergey de
1986. Así, el género original, Streptococcus se dividió en tres nuevos géneros:
Enterococcus (E.), Lactococcus (Lc.), y Streptococcus sensu stricto. Los géneros
Lactobacillus, Leuconostoc y Pediococcus se han mantenido sin cambios, pero algunas
LAB en forma de bastón, que inicialmente estaban incluídas en el género Lactobacillus,
forman ahora el género Carnobacterium (C.) y las especies de Pediococcus halophilus se
han promovido a nivel de género, formando el género Tetragenococcus (T.). El género
Weissella incluye especies previamente clasificadas como Lactobacillus o Leuconostoc.
Leuconostoc oenos, los “leuconostoc del vino” tiene su propio género, Oenococcus (O.).
Nuevos géneros, tales como, Alliococcus, Dolosigranulum, Globicatella y Lactosphaera,
se han descripto para ubicar cepas que están relacionadas al grupo de LAB, tanto
fisiológica como filogenéticamente (Axelsson, 1998).

Clasificacion a nivel de género

La base general para la clasificación de LAB en diferentes géneros se ha
mantenido casi sin cambios desde el trabajo de Orla-Jensen (1919). Sin embargo, con la
descripción de nuevos géneros y especies, se ha incrementado la dificultad para usar
estos tests clásicos para una segura identificación de los géneros. Todavía estos
caracteres fenotípicos se usan mucho como punto de partida para tests más sofisticados.
Si bien se considera que la morfología es una característica cuestionable en la taxonomía
(Woesse, 1987), aún se la usa en la descripción corriente de los géneros de LAB. Así,
LAB se pueden dividir en bastones (Lactobacillus y Carnobacterium) y cocos (todos los
otros géneros). Una excepción es el nuevo género Weissella que incluye tanto cocos
como bastones. Además, la división celular en dos direcciones perpendiculares de un solo
plano (previamente se describía incorrectamente como “división en dos planos”, Simpson,
1995), llevando a la formación de tetradas, se usa como una característica clave en la
diferenciación de los cocos. Los géneros formadores de tetradas son Aerococcus,
Pediococcus y Tetragenococcus.
Una característica importante usada en la diferenciación de los géneros de LAB es
el modo de fermentación de la glucosa bajo condiciones standard, esto es,
concentraciones no limitantes de glucosa y de factores de crecimiento (aminoácidos,
vitaminas y precursores de ácidos nucleicos) y disponibilidad limitada de oxígeno. Bajo
estas condiciones, LAB se pueden dividir en dos grupos: homofermentadores, que
convierten la glucosa casi cuantitativamente ácido láctico y los heterofermentatdores, que
fermentan glucosa a ácido láctico, etanol, ácido acético y CO 2. En la práctica, un test para
detectar la producción de gas a partir de glucosa permitirá distinguir entre los grupos
(Sharpe, 1979). Leuconostoc, Oenococcus, Weissella y un subgrupo de Lactobacillus son
heterofermentadores, todas las otras LAB son homofermentadores.
El crecimiento a ciertas temperaturas es muy usado para distinguir algunos de los
cocos. Los enterococos clásicos crecen ya sea a 10°C como a 45°C, lactococos y
vagococos crecen a 10°C pero no a 45°C. Streptococos generalmente no crecen a 10°C,
mientras que el crecimiento a 45°C depende de la especie. Se puede usar también la
tolerancia a la sal (6.5% de NaCl) para distinguir entre enterococos,
enterococos/vagococos y streptococos, si bien se pueden encontrar reacciones variables
entre los streptococos (Mundt, 1986). La tolerancia extrema a la sal (18% de NaCl) está
limitada al género Tetragenococcus. Una característica muy usada es también la
tolerancia a las condiciones ácidas o alcalinas. Aerococcus, Carnobacterium,
Enterococcus, Tetragenococcus y Vagococcus se caracterizan por crecer a un pH
relativamente alto, si bien no todos pueden crecer al test de pH 9,6. La formación de
diferentes formas isoméricas del ácido láctico durante la fermentación de la glucosa se
puede usar para distinguir entre leuconostoc y la mayoría de los lactobacilos
heterofermentadores, ya que los primeros producen solo ácido láctico D y los últimos por
una racemasa, ácido láctico D-L, pero las cepas de Weissella pueden causar confusión en
este aspecto (Axelsson, 1998).
Un resumen de las diferencias entre los géneros de LAB con los tests fenotípicos
clásicos se muestra en la siguiente tabla.

Tabla 18. Características diferenciales de las Bacterias Lácticasa

Bastones Cocci
Carácter
Carnob. Lactob. Aeroc. Enteroc. Vagoc. Oenoc. Pedioc. Strept. Tetragenoc. Weissella b

Formac.tetradas - - + - - - + - + -
CO2 de glucosac -e +/- - - - + - - - +
Desarrollo a 10°C + +/- + + + + +/- - + +
Desarrollo a 45°C - +/- - + - - +/- +/- - -
Desarrollo a 6,5%
ClNa NDf +/- + + - +/- +/- - + +/-
Desarrollo a 18%
 ClNa - - - - - - - - + -
Desarrollo a pH
4,4 ND +/- - + +/- +/- + - - +/-
Desarrollo a pH
9,6 - - + + - - - - + -
Acido lácticod L D,L,DLg L L L D L,DLg L L D,DLg

Fuente: Axelsson, 1998

Referencias
a) +, positivo; -,negativo; +/- la respuesta varía entre especies; ND, no determinado
b) las cepas de Weissella pueden tener forma de bastón
c) test para homo o heterofermentación de glucosa; negativo y positivo denota homo o
heterofermentación, respectivamente
d) configuración del ácido láctico producido a partir de glucosa
e) se pueden producir pequeñas cantidades de CO2, dependiendo del medio
f) se ha informado sobre ausencia de crecimiento en 8% de ClNa
g) la producción de ácido láctico D-, L- o DL- varía entre especies

El género Carnobacterium no se puede distinguir de Lactobacillus con estos tests,

como Vagococcus de Lactococcus. Vagococcus y Carnobacterium tienen una
composición única de ácidos grasos, característica que separa a estos géneros del resto
de LAB. En general, Carnobacterium se puede distinguir de lactobacilos por su capacidad
de crecer a pH 9,0 y su incapacidad de crecer en medio con acetato, selectivo para
lactobacilos. Se puede confundir a Pediococcus con Aerococcus, dado que la morfología
es similar. Sin embargo, Pediococcus son más ácido tolerantes que Aerococcus y crecen
bien anaeróbicamente, contrariamente a los Aerococcus que tienen una naturaleza más
microaerofílica (Evans, 1986). Las especies de Weissella se pueden confundir fácilmente
con Leuconostoc o con lactobacilos heterofermentadores. Oenococcus caen dentro del
grupo Leuconostoc con los tests clásicos pero se pueden distinguir fácilmente por su
tolerancia extrema al ácido y al etanol (Dicks et al., 1995).
Se debe resaltar que algunas características fenotípicas se superponen entre
especies y que puede haber excepciones a las reglas generales presentadas en la Tabla
18. Por ejemplo, el género Enterococcus, como se describe corrientemente, contiene
muchas especies que no responden a los tests clásicos (Devriese et al., 1993). La
clasificación de LAB está dependiendo de métodos más sofisticados, dentro de los cuales
la secuenciación de RNAr es la más segura a nivel de género. Se están usando
secuencias conocidas de RNAr para realizar pruebas específicas a nivel de género
(Collins et al., 1993; Nissen et al., 1994).
Clasificación a nivel de especie
Es imposible describir la clasificación de todas las especies de LAB en forma breve.
Sólo el género Lactobacillus comprende más de 50 especies reconocidas (Collins et al.,
1991). Por esto se hará una descripción resumida, mencionando algunas de las especies
más interesantes desde el punto de vista de tecnología de los alimentos.
Como ya se indicó una clasificación confiable de LAB se basa en métodos de
biología molecular, si bien algunos conceptos de Orla-Jensen todavía se aplican. Esto es
más certero si se aplica a nivel de género que de especie. En algunos casos sólo un
análisis a nivel de ácido nucleico resolverá el problema de clasificación. Todavía la
caracterización clásica fenotípica y bioquímica es importante para una clasificación
preliminar, así como también para aprender las propiedades de la cepa. Algunas de las
características listadas en la Tabla 18 son también muy usadas en la clasificación a nivel
de especie, por ejemplo, la tolerancia a la sal y al pH, crecimiento a ciertas temperaturas y
configuración del ácido láctico producido. Otras características usadas en la
caracterización clásica fenotípica y bioquímica de las cepas son la clase de carbohidratos
fermentados, hidrólisis de arginina, formación de acetoína (test de Vogues-Proskauer),
tolerancia a la bilis, tipo de hemólisis, producción de polisacáridos extracelulares,
requerimientos de factores de crecimiento, presencia de ciertas enzimas (por ejemplo, ß-
galactosidasa y ß-glucuronidasa), características de crecimiento en la leche, y tipo
serológico. Una caracterización posterior incluye más estudios moleculares y
quimiotaxonómicos, incluyendo el tipo de diamino ácido en el peptidoglucano, presencia y
tipo de ácido teicoico, presencia y tipo de menaquinonas, relación citocina + guanina
(C+G) del DNA, composición de ácidos grasos y movilidad electroforética de lactato
deshidrogenasa (LDH) (Axelsson, 1998).

Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus y Vagococcus

Históricamente, la tipificación serológica con la agrupación de Lancefield
(Lancefield, 1933) ha sido muy importante en la clasificación de streptococos. El método
se considera ahora menos importante en la clasificación pero aún se usa mucho en la
identificación rápida de los principales patógenos (Sharpe, 1979; Hardie, 1986a; Schleifer,
1987). Sin embargo, existe indudablemente alguna correlación entre la presencia del
antígeno del grupo D y los enterococos (previamente llamados streptococos del grupo D,
o streptococos fecales). De forma similar, el antígeno del grupo N se correlaciona con los
lactococos (previamente streptococos del grupo N o streptococos lácticos), pero se debe
notar que los vagococos también poseen el antígeno del grupo N (Collins et al., 1989).
A pesar de la formación de nuevos géneros, el género Streptococcus senso
stricto en aún muy grande y la clasificación es dificultosa. El género se divide
groseramente en tres grupos: piógenos, orales y otros streptococos (Hardie y Whiley,
1995). Algunos cocos anaerobios, previamente incluídos en el género como el grupo
streptococos anaerobios (Hardie, 1986a), se ha demostrado que no están relacionados
con todos los otros streptococos y se han excluído (Schleifer, 1987). El grupo piógeno
contiene muchas cepas famosas de patógenos, por ejemplo, S. pyogenes y S. agalactiae.
Otro patógeno, S. pneumoniae, fue inicialmente incluído en este grupo, pero se ha
transferido al grupo oral, el que contiene las especies principalmente asociadas con la
cavidad oral del hombre y los animales.
La única especie de streptococos que está asociada con la tecnología de
alimentos es S. thermophilus, que se usa en la manufactura de yogurt (en co-cultivo con
Lb. delbrüeckii subsp. bulgaricus). S. thermophilus fue incluído en el grupo “otros
streptococos” por Schleifer y Kilpper-Bälz (1987) y Hardie (1986b), pero está ahora en el
grupo oral (Hardie y Whiley, 1995). La resistencia al calor, la capacidad de crecer a 52°C
y el mas bien limitado número de carbohidratos atacados, permite distinguir a S.
thermophilus de otros streptococos (Hardie, 1986b).
El género Lactococcus: está íntimamente asociado con los productos lácteos,
pero de las cinco especies comúnmente reconocidas, sólo una, Lc. lactis se usa
realmente en tecnología láctea. Se pueden distinguir tres subespecies: Lc. lactis subsp.
lactis, Lc. lactis subsp. cremoris, y Lc. lactis subsp. hordniae. Solo las dos primeras tienen
importancia en la elaboración de productos lácteos. Lc. lactis subsp. lactis incluye
especies anteriormente llamadas S. lactis subsp. lactis, S. lactis subsp. diacetilactis, y
también Lactobacillus xylosus. Esto último ilustra el hecho que la morfología algunas
veces no es definitiva en la clasificación de las bacterias lácticas ya que hacer la distinción
entre cocos y bastones no es siempre fácil. Lc. lactis subsp. cremoris incluye especies
anteriormente designadas como S. cremoris o S. lactis subsp. cremoris. Lc. lactis subsp.
cremoris se distingue de Lc. lactis subsp. lactis por la incapacidad de crecer a 40°C, de
crecer en 4% de Na Cl, de hidrolizar arginina y de fermentar ribosa. Características
bioquímicas comunes (por ejemplo, utilización de azúcares) se pueden usar para
distinguir entre las especies de lactococos, pero también están disponibles métodos
genéticos (Axelsson, 1998).
 El género Enterococcus: se considera que no es de importancia en la industria de
los alimentos. Algunas especies, en particular E. faecalis (previamente S. faecalis), puede
ser patógeno oportunista y por esto se lo considera indeseable en los alimentos. Sin
embargo, preparaciones de E. faecium (previamente S. faecium) y E. faecalis han sido
usadas como probióticos y como inoculantes de ensilados. Su capacidad como probiótico
no ha llamado la atención hasta ahora debido a que el habitat natural de muchos
enterococos es el intestino del hombre y de los animales. Se han encontrado especies de
enterococos en algunos tipos locales de quesos en el sur de Europa. Es difícil, casi
imposible, asignar definitivamente el género a una cepa sólo con los tests mostrados en la
Tabla 18. Pruebas adicionales muy usadas, para las cuales la mayoría de los enterococos
son positivos, son el test de Vogues-Proskauer y la fermentación de ribosa (Devriese et
al., 1993). Solo con test fenotípicos se puede identificar cepas a nivel de especie y
demostrar sin ambigüedades que son enterococos. Las especies se diferencian
principalmente por su capacidad de fermentar carbohidratos, hidrólisis de arginina e
hipurato y la presencia y/o tipo de menaquinonas (Schleifer y Kilpper-Bälz, 1987).

Pediococcus
Se pueden describir como las únicas bacterias lácticas acidófilas,
homofermentadoras, que se dividen alternativamente en dos direcciones perpendiculares
para formar tetradas (Simpson y Taguchi, 1995). Los pediococos son importantes en la
tecnología de alimentos, tanto por sus aspectos positivos como negativos. P. damnosus
es el principal organismo que causa deterioro en la elaboración de cerveza porque
produce diacetilo y acetoína, confiriendo gusto a manteca al producto. P. acidilactici y P.
pentosaceus se usan como cultivos iniciadores para elaborar embutidos y para inocular
encurtidos. Pediococcus también pueden ser importantes constituyentes del complejo
conocido como bacterias lácticas no iniciadoras, el que está involucrado en la maduración
de quesos. Las principales características para distinguir entre especies son la capacidad
de fermentar azúcares, de hidrolizar arginina, de crecer a diferentes niveles de pH (7,0 y
4,5) y la configuración del ácido láctico producido. Es difícil separar especies de P.
pentosaceus y P. acidilactici en base a estas propiedades pero se puede distinguir las
especies con estudios de homología DNA-DNA. Estas dos especies tienen en común la
capacidad de producir una pseudocatalasa que no posee el grupo hemo (Axelsson,
1998).
 Leuconostoc y Weissella
Se ha definido que el género Leuconostoc está formado por bacterias lácticas
cocoides, heterofermentadoras, que producen sólo ácido láctico D- a partir de glucosa y
no producen amonio a partir de arginina. De esta manera, Leuconostoc se ha separado
de otras bacterias lácticas en forma de cocos por su metabolismo heterofermentativo y de
los lactobacilos heterofermentadores por su morfología y por otros aspectos claves. Sin
embargo, es fácil confundir a Leuconostoc con algunos lactobacilos heterofermentadores
en forma de coco-bacilos. Weissella incluye tanto bacterias en forma de cocos como de
bastones.
Leuconostoc puede formar importantes cantidades de diacetilo a partir de citrato en
la leche y con este propósito algunas especies, principalmente Ln. mesenteroides subsp.
cremoris, se ha usado en la industria láctea con este propósito. Leuconostoc es también
importante en la fermentación espontánea de vegetales, como sauerkraut, donde ellos
generalmente inician la fermentación láctica. Muchas especies de Weissella parecen
estar asociadas con la carne, donde ellas pueden proliferar a bajas temperaturas.
Especies y subespecies de Leuconostoc y Weissella se distinguen por propiedades
tales como modelos de fermentación de carbohidratos, formación de dextrano (a partir de
sacarosa), hidrólisis de esculina, factores de crecimiento, crecimiento a diferentes pH y
temperaturas y desasimilación de citrato y/o malato, pero la clasificación es dificultosa. La
desasimilación de malatato requiere atención, ya que esta vía metabólica lleva a la
formación de ácido L-láctico (Axelsson, 1998).

Lactobacillus
El género Lactobacillus es el más grande de los géneros incluídos en LAB. Es un
grupo muy heterogéneo, incluyendo especies con una gran variedad de propiedades
fenotípicas, bioquímicas y fisiológicas. La heterogeneidad se refleja en el rango del
porcentaje C+G del DNA de las especies incluídas en el género. Este rango es de 32-53%
y es el doble del usualmente aceptado para un solo género (Schleifer y Stackebrandt,
1983). La heterogeneidad y el gran número de especies se debe a la definición del
género, que en esencia es: bacterias lácticas de forma de bastón. Tal definición es
comparable a una distribución por medio de la cual todas las LAB en forma de cocos se
incluyen dentro de un solo género. Sin embargo, entre los cocos, inicialmente se han
reconocido aspectos fenotípicos, lo que permite una diferenciación en diversos géneros
posibles. Aún cuando la situación era más difícil para las LAB en forma de bastón, Orla –
Jensen (1919) trató de dividir este grupo de un modo similar a lo que se hizo para los
cocos. Así, se crearon sub-géneros de Lactobacillus: Thermobacterium, Streptobacterium,
y Betabacterium. Esta división es aún válida en un grado considerable, si bien las
designaciones se han abandonado y se han hecho algunas modificaciones a las
definiciones del subgrupo (Kandler y Weiss, 1986; Hammes y Vogel, 1995). La Tabla 19
muestra un resumen de las características usadas para distinguir entre los tres grupos y
algunas de las especies bien conocidas incluídas en cada grupo. La base fisiológica para
la división es (en general) la presencia o ausencia de las enzimas clave del metabolismo
homo y heterofermentativo de los azúcares, fructosa 1,6-difosfato aldolasa y
fosfocetolasa, respectivamente (Kandler, 1983, 1984; Kandler y Weiss, 1986).

Tabla 19 Distribución del género Lactobacillus

Grupo I Grupo II Grupo III

Homofermentadores Heterofermentadores
Heterofermentadores
Característica obligados facultativos obligados

Fermentación de pentosas - + +
CO2 a partir de glucosa - - +
CO2 a partir de gluconato - +a +a
FDP aldolasa presente + + -
Fosfocetolasa presente - +b +
Lb. acidophilus Lb. casei Lb. brevis
Lb. delbrüeckii Lb. curvatus Lb.
buchneri
Lb.helveticus Lb. plantarum Lb.
fermentum
Lb. salivarius Lb. sakei Lb. reuteri

a) Cuando fermetan
b) Inducible por pentosas
Adaptado de Sharpe (1981) y Kandler y Weiss (1986)

En la descripción más reciente del género (Hammes y Vogel, 1995), se ha

mantenido la división fisiológica en tres grupos (designados A, B o C, pero a cada especie
se le ha asignado un sufijo (a, b o c) para reflejar la posición en ciertos clusters
filogenéticos. Por ejemplo, Lb. acidophilus se colocó en el grupo Aa y Lb. salivarius en el
grupo Ab porque estas especies pertenecen a diferentes clusters filogenéticos. Se resalta
que el cluster c contiene aquellos lactobacilos heterofermentadores que ahora deben ser
designados Weissella, por ejemplo, Lb. confusus y Lb. viridiscens.
 Los caminos clásicos para distinguir entre las especies de lactobacilos han sido
modelos de fermentación de carbohidratos, configuración del ácido láctico formado,
hidrólisis de arginina, requisitos para el crecimiento y crecimiento a diferentes
temperaturas (Sharpe, 1979, 1981). Estas características son aún muy usadas, pero una
clasificación más apropiada también requiere análisis del peptidoglucano, movilidad
electroforética del LDH, mol % G+C del DNA y aún estudios de homología DNA-DNA
(Kandler, 1984; Kandler y Weiss, 1986). Se dispone actualmente de pruebas de
oligonucleótidos específicas de especie (derivadas de secuencias de RNAr) para un
número creciente de lactobacilos (Pot et al., 1994a), posiblemente proveyendo simples
rutas en los esquemas clásicos.
Lactobacillus están ampliamente distribuidos en la naturaleza y muchas especies
han encontrado aplicaciones en la industria de los alimentos. En general, ellos son los
más tolerantes al ácido dentro del grupo de LAB (Kashket, 1987) y llevan a cabo muchas
fermentaciones lácticas espontáneas como ensilados y fermentaciones de vegetales
(Daeschel et al., 1987). Lactobacilos están también asociados con la cavidad oral, el
tracto gastrointestinal y la vagina de la mujer y de los animales (Sharpe, 1981; Kandler y
Weiss, 1986). Algunas especies, por ejemplo, Lb. brevis, Lb. casei y Lb. plantarum, se
pueden encontrar en muchos hábitats. Otros son más especializados y se encuentran
solo en ciertos nichos, por ejemplo, el organismo de la levadura Lb. sanfranciscensis y Lb.
delbrüeckii subsp. bulgaricus (inicialmente Lb. bulgaricus) asociado al yogurt (Axelsson,
1998).

Metabolismo de las bacterias lácticas

La característica esencial del metabolismo de LAB es la eficiente fermentación de los
carbohidratos acoplada a la fosforilación a nivel de sustrato. El ATP generado se usa
luego en propósitos biosintéticos. LAB como grupo presentan una gran capacidad para
degradar diferentes carbohidratos y compuestos relacionados. Generalmente, el producto
final predominante es el ácido láctico (> 50% de la fuente carbonada). Está claro, sin
embargo, que LAB se adaptan a diversas condiciones y cambian su metabolismo en
consecuencia. Esto puede llevar a la formación de diversos productos finales (Axelsson,
1998).
 Principales vías de fermentación

1. Fermentación de las hexosas

LAB pueden fermentar las hexosas por dos vías principales (Figuras 4.A y 4.B)
homofermentación láctica (vía Embden-Meyerhof) y heterofermentación láctica (vía 6-
fosfogluconato-fosfocetolasa).
El transporte y fosforilación de la glucosa puede ocurrir de la siguiente manera:
transporte del azúcar libre y fosforilación por una glucoquinasa dependiente del ATP.
Algunas especies usan el sistema fosfoenolpiruvato:azúcar fosfotransferasa (PTS), donde
el fosfoenolpiruvato es el donador del grupo fosfato de alta energía. En ambos casos, se
requiere un enlace fosfato de alta energía para la activación del azúcar.
La glucólisis (vía Embden-Meyerhof), usada por todas LAB, excepto por
Leuconostoc, lactobacilos del grupo III y Weissella, se caracteriza por la formación de
fructosa-1,6-difosfato, la que es escindida por una FDP aldolasa en dihidroxiacetona
fosfato (DHAP) y gliceraldehído 3-fosfato (GAP). GAP (y DHAP vía GAP) es luego
convertido a piruvato en una secuencia metabólica que incluye fosforilación a nivel de
sustrato en dos sitios. Bajo condiciones normales, esto es, exceso de azúcar y limitada
disponibilidad de oxígeno, piruvato es reducido a ácido láctico por una lactato
deshidrogenasa dependiente de NAD+ (nLDH), de esta manera reoxidando el NADH
formado durante las primeras etapas de la glucólisis. Se obtiene así un balance redox, el
ácido láctico es prácticamente el único producto final y el proceso metabólico se
denomina homofermentación láctica.
La otra vía principal de fermentación ha tenido muchas designaciones, como la vía
de la pentosa fosfato, la vía pentosa fosfocetolasa, el shunt de la hexosa monofosfato, y
como la llamaron Kandler y Weiss (1986) en el Manual de Bergey, la vía 6-fosfogluconato.
Lars Axelsson se refiere a ella como la vía 6-fosfogluconato/fosfocetolasa, reconociendo
un paso clave en la secuencia metabólica (la división de fosfocetolasa), y al mismo tiempo
distinguiéndola de la vía de Bifidum, la que también involucra fosfocetolasa pero no tiene
6-fosfogluconato como intermediario. La vía 6-fosfogluconato/fosfocetolasa se caracteriza
por los pasos iniciales de deshidrogenación con la formación de 6-fosfogluconato, seguida
de decarboxilación. La pentosa 5-fosfato remanente es escindida por fosfocetolasa en
GAP y acetil fosfato. GAP se metaboliza de igual modo que en la vía glucolítica,
resultando en la formación de ácido láctico. Cuando no está disponible un aceptor de
electrones, acetil fosfato se reduce a etanol vía acetil CoA y acetaldehído. Ya que este
metabolismo conduce a cantidades significativas de otros productos finales (CO2, etanol)
además de ácido láctico, se conoce como heterofermentación láctica.
La terminología referente a estas vías y a las bacterias que las usan, se presta a
confusiones, por ello es necesario aclarar algunos aspectos. En general, el término LAB
homofermentadoras se refiere a aquellas que usan la vía glucolítica para la fermentación
de la glucosa, mientras que LAB heterofermentadoras son aquellas que usan la vía 6-
PG/PK. Sin embargo, se debe remarcar que la glucólisis puede conducir a una hetero-
fermentación láctica (esto es, cantidades significativas de otros productos finales además
del ácido láctico) bajo ciertas condiciones y que algunas LAB, vistas como
homofermentadoras, usan la vía 6-PG/PK cuando metabolizan ciertos sustratos.
En teoría, la homofermentación láctica de la glucosa resulta en 2 moles de ácido
láctico y en una ganancia neta de 2 moles de ATP por mol de glucosa consumida. La
hetero fermentación láctica de la glucosa a través de la vía 6-PG/PK resulta en un mol de
ácido láctico, un mol de CO2, un mol de etanol y un mol de ATP/glucosa. En la práctica,
estos valores teóricos se obtienen raramente. Es común obtener un factor de conversión
de 0,9 desde azúcar a productos finales carbonados y probablemente refleja una
incorporación de carbono del azúcar en la biomasa, si bien la mayoría de los factores de
crecimiento (aminoácidos, nucleótidos y vitaminas) se suministran en exceso en el rico
medio que se usa frecuentemente. Estos medios complejos también pueden contribuir a
otros balances de fermentación y a la formación de otros productos finales, en particular
ácido acético, porque compuestos como ácidos orgánicos, aminoácidos y residuos de
azúcares pueden alterar la fermentación (Kandler, 1983). La presencia de oxígeno puede
tener también un efecto significativo en el metabolismo.
Otras hexosas distintas de la glucosa, como manosa, galactosa y fructosa, son
fermentadas por muchas LAB. Los azúcares entran en las principales vías al nivel de
glucosa 6-fosfato o fructosa 6-fosfato después de isomerización y/o fosforilación. Una
excepción importante en LAB es el metabolismo de la galactosa, ya que usa un sistema
PTS para la captación de este azúcar, por ejemplo, Lc. lactis, E. faecalis, y Lb. casei. En
estas especies, la galactosa 6-fosfato formada por el sistema PTS se metaboliza a través
de la vía tagatosa 6-fosfato (Bissett y Anderson, 1974) (Figura 5.A).
La vía de la tagatosa coincide con la glucólisis al nivel de GAP. Muchas cepas en
esta categoría también tienen la capacidad de transportar galactosa con una permeasa y
convertirla a glucosa 6-fosfato a través de la vía de Leloir (Figura 5.B) (Thomas et al.,
1980). Esta vía es también usada por LAB que fermentan galactosa y transportan
galactosa con una permeasa ya que carecen de galactosa PTS (Kandler, 1983; Konings
et al., 1989; Fox et al., 1990).

2. Fermentación de disacáridos
 Dependiendo del modo de transporte, los disacáridos entran a la célula como
azúcares libres o azúcar-fosfato. En el primer caso, los disacáridos libres son escindidos
por hidrolasas específicas a monosacáridos, los que luego entran en las principales vías
ya descriptas. En el último caso, cuando los sistemas azúcar-PTS están involucrados,
fosfohidrolasas específicas escinden el disacárido fosfato en un monosacárido libre y un
monosacárido-fosfato.
Hasta aquí, el metabolismo del disacárido mejor estudiado en LAB es la
fermentación de la lactosa. La mayoría de las cepas de Lc. lactis, al menos las usadas
como fermentos iniciadores, contienen un sistema lactosa PTS (Lawrence y Thomas,
1979; Thompson, 1979). Se ha caracterizado bien un sistema lactosa PTS en Lb.casei
(Chassy y Alpert, 1989). En estas cepas, la lactosa entra al citoplasma como lactosa
fosfato, luego es escindida por fosfo ß-D-galactosidasa (P-ß-gal) para dar glucosa y
galactosa 6-fosfato. La glucosa es fosforilada por glucoquinasa y metabolizada a través
de la vía glucolítica, mientras que la galactosa 6-fosfato es metabolizada a través de la vía
de la tagatosa 6-fosfato. El sistema enzimático de lactosa PTS y de ß-D-gal son
generalmente inducidos y reprimidos por glucosa (Kandler, 1983).
El metabolismo de lactosa en Lc. lactis y Lb. casei es el sistema mejor estudiado
de fermentación de azúcares presente en LAB.
Algunas LAB termófilas, por ejemplo S. thermophilus, Lb. delbrüeckii subsp.
bulgaricus, Lb. delbrüeckii subsp. lactis, y Lb. acidophilus solo metabolizan la glucosa
después del transporte de lactosa y escición por ß-D-gal, mientras que la galactosa se
excreta al medio (Hickey et al., 1986; Hutkins y Morris, 1987). En S. thermophilus esto se
debe a una baja actividad galactoquinasa (Thomas y Crow, 1984; Hickley et al., 1986) y a
una característica de la proteína transportadora de lactosa (Poolman, 1993).
 La fermentación de maltosa entre LAB se ha estudiado más extensivamente en
lactococos. Parece haber un sistema de permeasa para el transporte. Un hecho
interesante del metabolismo de maltosa en Lc. lactis es que la maltosa es escindida por
una maltosa fosforilasa en glucosa y ß-glucosa-1-fosfato. Solo la glucosa se usa en la
glucólisis, mientras que ß-glucosa-1-fosfato probablemente es un precursor para la
síntesis de la pared celular (Sjöberg y Hahn-Hägerdahl, 1989).
 La fermentación de la sacarosa mediado por un sistema permeasa es iniciado por la
escisión del azúcar por hidrolasa para dar glucosa y fructosa, los que entran en las
principales vías. En algunos lactococos, la sacarosa es transportada por sacarosa PTS y
una sacarosa 6-fosfato específica escinde la sacarosa 6-fosfato a glucosa 6-fosfato y
fructosa (Thompson y Chassy, 1981). El sistema sacarosa PTS y la sacarosa 6-fosfato
hidrolasa son inducidas por la presencia de sacarosa el medio (Thompson y Chassy,
1981). La sacarosa puede también actuar como un donador de monosacáridos para la
formación de exopolisacáridos en ciertas LAB. En la producción de dextrano por Ln.
mesenteroides, la sacarosa es escindida por una enzima asociada a la pared celular, la
dextransacarasa. La mitad de glucosa se usa para la síntesis de dextrano y la fructosa es
fermentada de la manera usual (Cerning, 1990).
 La fermentación de otros monosacáridos, tales como celobiosa, melibiosa y trehalosa,
no ha sido estudiada con gran profundidad. La capacidad de fermentar estos azúcares
difiere entre las diferentes especies de LAB. Probablemente, el metabolismo es mediado
por sistemas de transporte e hidrolasas específicos, resultando en los respectivos
monosacáridos (o monosacárido-fosfato), los que ingresan en las vías comunes
(Axelsson, 1998).

3. Fermentación de las pentosas y compuestos relacionados

Las pentosas son fácilmente fermentadas por muchas LAB. En general, se usan
permeasas específicas para transportar los azúcares dentro de la célula. Ya dentro, las
pentosas son fosforiladas y convertidas a ribulosa 5-fosfato o xilulosa 5-fosfato por
epimerasas o isomerasas (Kandler, 1983). Estos compuestos luego se pueden
metabolizar a través de la vía 6-PG/PK. Esto pudiera implicar que solo LAB
heterofermentadoras pueden usar las pentosas, pero este no es el caso. En efecto,
despreciando algunas cepas y especies diferentes, todos los géneros de LAB son pentosa
positivos, con la única excepción de los lactobacilos del grupo I. LAB homofermentadoras
que utilizan las pentosas lo hacen por la misma vía que las heterofermentadoras. La
fosfocetolasa de estas especies es generalmente inducida por las pentosas (Kandler,
1983). La heterofermentación láctica de las pentosas conduce a la formación de
diferentes productos finales, si se compara con la fermentación de la glucosa. No se
forma CO2 y ya que no se requieren etapas de deshidrogenación para lograr el
intermediario xilulosa 5-fosfato, la reducción de acetil fosfato a etanol es redundante. En
lugar de esto, el acetil fosfato es usado por la enzima acetato quinasa en el paso de
fosforilación a nivel de sustrato para producir acetato y ATP. La fermentación de las
pentosas lleva a la producción de cantidades equimolares de ácidos láctico y acético.
Algunas LAB son capaces de llevar a cabo la fermentación del gluconato. Similar a
las pentosas, el gluconato es fermentado por la vía 6-PG/PK, dando lugar a una
heterofermentación láctica por especies vistas como homofermentadoras. El metabolismo
se ha estudiado en E. faecalis, pero una vía similar puede también existir en Lb. casei
(London, 1990). En E. faecalis el gluconato es transportado por un sistema PTS gluconato
inducible y el 6-fosfogluconato resultante entra a la vía 6-PG/PK (London, 1990). Muchos
lactobacilos del grupo II y III también fermentan gluconato (Kandler y Weiss, 1986),
probablemente en una secuencia metabólica similar a la de E. faecalis, si bien el
transporte puede ser mediado por una permeasa en muchos casos. Ya que antes de la
reacción de la fosfocetolasa no es necesario un paso de deshidrogenación, algo de acetil
fosfato puede ser reducido a etanol a efectos de mantener el balance redox.
Unas pocas especies de LAB, como Lb. casei, pueden crecer a expensas de
pentitoles. Estos son translocados a través de la membrana por un sistema PTS pentitol
específico. Pentitol fosfatos resultantes son oxidados a pentosa fosfatos por
deshidrogenasas y luego metabolizados a través de la vía 6-PG/PK (London, 1990).
Similar a la fermentación del gluconato, algo de etanol se produce a partir del acetil
fosfato a causa de reoxidar el NADH formado durante la deshidrogenación inicial
(Axelsson, 1998).

Fermentación de azúcares y categorías metabólicas de LAB

A partir de las descripciones de los perfiles de fermentación de azúcares de LAB ya
descriptas, es posible dividir el grupo de LAB en tres categorías metabólicas. El género
Lactobacillus contiene especies que se pueden ubicar en las tres categorías y este es el
punto de partida para la división del género en tres grupos (Kandler y Weiss, 1986).
 La primera categoría incluye lactobacilos del grupo I y algunas especies
individuales de otros géneros que son homofermentadores obligados, significando que los
azúcares pueden ser fermentados únicamente por glucólisis.
 La segunda categoría incluye Leuconostoc, lactobacilos del grupo III y Weissella
que son heterofermentadores obligados, significando que solo la vía 6-PG/PK está
disponible para la fermentación de los azúcares. La diferencia aparente a nivel enzimático
entre estas dos categorías está en la presencia o ausencia de las enzimas claves de la
glucólisis y de la vía 6-PG/PK, FDP aldolasa y fosfocetolasa, respectivamente. Las
especies homofermentadoras obligadas poseen una FDP aldolasa constitutiva y carecen
de fosfocetolasa, mientras que lo contrario ocurre para las especies heterofermentadoras
obligadas (Kandler, 1983; Kandler y Weiss, 1986). Esto conduce a la diferencia en la
formación de los productos finales a partir de glucosa, pero también a la incapacidad de
las especies homofermentadoras obligadas de atacar las pentosas (ni el gluconato).
 La tercera categoría incluye las restantes LAB (lactobacilos del grupo II y la
mayoría de las especies de enterococos, lactococos, pediococos, streptococos,
tetragenococos y vagococos). Este grupo se parece a los homofermentadores obligados
en que ellos poseen una FDP aldolasa constitutiva, por los que usan la glucólisis para la
fermentación de las hexosas. Como ya se mencionó, las pentosas (y probablemente el
gluconato y pentitoles cuando son fermentados) inducen la síntesis de fosfocetolasa,
resultando en una heterofermentación láctica. Así, estas LAB son homofermentadoras con
respecto a las hexosas y heterofermentadoras con respecto a las pentosas y otros
sustratos, y deben ser llamadas heterofermentadoras facultativas (Kandler, 1983; Kandler
y Weiss, 1986).
Recientes estudios han mostrado que algunos lactobacilos considerados
homofermentadores obligados u heterofermentadores obligados en realidad poseen la
enzima clave que se creía ausente (Saeier at al., 1996b; Biddle y Warner, 1993). La
fosfocetolasa en estas cepas se está caracterizando genética y bioquímicamente. Por lo
tanto, los límites entre las categorías metabólicas pueden no ser tan absolutos como
inicialmente se pensó y la mayoría de las LAB pueden ser, en realidad,
heterofermentadoras facultativas (Axelsson, 1998).

Configuración del ácido láctico

Durante la fermentación de los azúcares diferentes especies de LAB producen, ya
sea exclusivamente ácido láctico L(+) o exclusivamente ácido láctico D(-),
aproximadamente cantidades iguales de ambos o predominantemente una forma, pero
cantidades medibles de la otra (Garvie, 1980; Kandler y Weiss, 1986; Schleifer, 1986).
Esto depende de la presencia de lactato deshidrogenasas dependientes de NAD+ (nLDH)
y sus respectivas actividades. Esto es, si ambos ácidos lácticos, D(-) y L(+) se forman,
está generalmente presente una D-nLDH y una L-nLDH. Sólo unas pocas especies, por
ejemplo, Lb. curvatus y Lb. sakei producen una enzima, llamada racemasa, que convierte
el ácido láctico L(+) en ácido láctico D(-) (Garvie, 1980). En este caso, el ácido láctico L(+)
producido inicialmente, induce la recemasa, resultando en una mezcla de ácidos lácticos
D(-) y L(+). La razón o la posible ventaja de producir una mezcla de ambos ácidos no está
clara. La inactivación de L-nLDH por métodos genéticos en una cepa de Lb. plantarum no
cambió la velocidad de crecimiento en cultivos en el laboratorio o la concentración de
ácido láctico en cualquier etapa del cultivo. La ausencia de L(+) fue simplemente
reemplazada por un incremento en la producción de ácido láctico D(-), indicando que la
reducción de piruvato a lactato no es una etapa limitante en la glucólisis. Generalmente, el
ácido láctico L(+) es el principal producto formado en las primeras etapas de la curva de
crecimiento y ácido láctico D(-) al final de la fase estacionaria (Garvie, 1980). Se piensa
que la concentración interna de piruvato y el pH tienen influencia en la actividad de las
enzimas LDH y así la relación de los isómeros en las distintas etapas del crecimiento
(Axelsson, 1998).