LABORATORIO No.

1 ESTUDIO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO

INTRODUCCIN Desde los inicios de la microscopia, los investigadores vienen desarrollando mtodos cada vez ms sensibles, eficaces y con mejor resolucin. Al principio ellos debieron enfrentarse a los problemas de aberraciones pticas, imgenes borrosas y pobre desarrollo de lentes, los cuales se mantuvieron hasta mediado del siglo XIX que aparecieron los lentes objetivos que reducan la aberracin cromtica con una apertura numrica entre 0.65 y 1.25. Estos avances se iniciaron con los reportes sobre los mtodos de iluminacin que propuso el profesor August Klher, en 1893, y que sentaron las bases de la microfotografa moderna. En las ltimas dcadas se ha incrementado la aplicacin de la microscopa ptica en los laboratorios de investigacin de una amplia variedad de disciplinas como la biologa celular y molecular, microbiologa, inmunologa y virologa. El rpido desarrollo de diferentes mtodos como los de fluorescencia, contraste de fases, confocal y de campo oscuro entre otros, que sumados a los avances en la digitalizacin y anlisis de imgenes, han permitido a los microscopistas obtener resultados rpidos, cuantificables y confiables de una gran variedad de especimenes biolgicos. Al margen de estos avances, las bases del funcionamiento de los distintos tipos de microscopios pticos siguen siendo los mismos que se presentan en esta prctica y con los cuales el estudiante deber familiarizarse. BREVE HISTORIA DEL MICROSCOPIO Tres eminentes holandeses, Antn Van Leeuwenhoek, Hans y Zaccharias Janssen, fabricantes de lentes, contribuyeron al desarrollo de la microscopa. El museo de Middleburg, en Holanda, conserva uno de los primeros microscopios conocidos, probablemente fabricado por uno de los hermanos Janssen. Estos aparatos, eran extremadamente simples, por lo que solo permitan el examen de cuerpos opacos. A fines del siglo XVII el italiano Camping construy un microscopio que hizo posible la observacin de preparaciones transparentes. Las imgenes obtenidas por estos microscopios eran muy deficientes. En Inglaterra el cientfico Robert Hooke, trat de construir lentes ms eficaces, pero sus resultados no fueron satisfactorios; sin embargo, sus observaciones contribuyeron al establecimiento de la microscopa como ciencia. Mientras, en el siglo XVII Jonh Marshall y otros fabricantes de microscopios, perfeccionaron mucho el diseo mecnico, pero no la calidad de los lentes. Pero fue, durante el siglo XIX, que se realizaron grandes progresos en los sistemas pticos y en la microscopa en general; an as, fue imposible evitar la dispersin de la luz en sus colores componentes en la fabricacin de microscopios. Este fenmeno conocido como aberracin cromtica, produca una imagen borrosa y coloreada. Las primeras lentes adecuadamente corregidas para microscopios, denominadas acromticas, hicieron su aparicin alrededor de 1830; pero la aberracin esfrica, tambin produca una imagen desenfocada. En 1886, Ernot Abbe y Caol Zeiss en Alemania fabricaron unas lentes apocromticas que corrigieron ambas aberraciones. A finales del siglo XIX, los microscopios comenzaron a adquirir la forma que tienen actualmente, con los aportes de Khler. Desde el ao 1900, los microscopios se han modificado poco en sus principios fundamentales, pero mucho en sus

detalles. Estos perfeccionamientos incluyen, la incorporacin de varios objetivos, cada uno de aumento diferente y roscados a un tambor giratorio o revolver. En 1935, Frizt Zenique invent la tcnica del contraste de fase que hace posible la observacin de especimenes antes invisibles. El microscopio electrnico, desarrollado en vsperas de la segunda guerra mundial, ha sido de gran utilidad para el estudio de molculas qumicas, virus y organelas celulares. Existe un tipo de microscopio electrnico, llamado de barrido, que ha adquirido una extraordinaria utilidad, ya que ofrece representaciones tridimensionales muy reales de las clulas y las estructuras celulares.

1.3 CLASES DE MICROSCOPIOS: Existen dos tipos de microscopios: simples y compuestos Microscopios simples : Consta de un solo sistema de lente Microscopios compuestos: Constan de dos (2) sistemas de lentes: el objetivo y el ocular. El microscopio compuesto es un instrumento que aumenta considerablemente la imagen de los objetivos que en l se observan. Entre las variedades de ste microscopio encontramos el electrnico y el fotnico u ptico. Este ltimo tipo de microscopio est formado por una parte mecnica y una parte ptica. (Figura No.1.1) Parte Mecnica: a. Pie o Base: Generalmente en forma de herradura o rectangular, es el apoyo de las dems piezas del microscopio. El pie debe ser slido y pesado para asegurar su estabilidad. b. Columna o Brazo: Este elemento relaciona el tubo del microscopio con el pie; sostiene la platina y el condensador y de ella se agarrar el microscopio cuando se traslada durante los trabajos. En algunos microscopios la columna es mvil

1.1 OBJETIVOS: 1.1.1 OBJETIVO GENERAL: Valorar la importancia del microscopio como instrumento bsico para el estudio e investigacin en las Ciencias Biolgicas. 1.1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS: Identificar las diferentes partes que constituyen el microscopio y reconocer las funciones de cada una de ellas Adquirir habilidad en el uso y manejo correcto del microscopio, siguiendo las indicaciones de las guas de laboratorio. 1.2 MATERIALES Microscopios Porta-objetos y cubre-objetos Papel limpia lentes Goteros Hilos de lana y algodn Flores con polen

Figura No.1.1 Microscopio ptico

Para observar imgenes de las diferentes partes del microscopio haz clic aqu

c. Tubo del Ocular: Est colocado en la parte superior del microscopio, donde estn acoplados los oculares, que pueden tener movimiento vertical, con ayuda de una cremallera sobre la columna. En algunos microscopios el tubo del ocular es inclinado y se mantiene fijo, en este caso se mueve la platina. d. Revlver o Disco Giratorio: Est debajo del tubo ocular donde estn acoplados los objetivos, presenta movimiento giratorio para facilitar el cambio de un objetivo a otro. e. Platina: Es una placa que puede ser cuadrada, circular o rectangular, con un orificio central que permite el paso de la luz a travs de ella. Su funcin es sostener las placas con los preparados biolgicos que se van observar f. Carro: es un dispositivo ubicado sobre la platina, cuya funcin es sujetar y mover la placa que se va a estudiar. Posee dos tornillos que permiten movimientos horizontales (hacia adelante, hacia atrs, hacia la derecha y hacia la izquierda) del portaobjeto. Cuando la platina carece del anterior dispositivo, lleva dos soportes para fijar las placas llamadas ganchos o uas. g. Mecanismos de Movimiento: Est integrado por el tornillo macromtrico y el micromtrico Tornillo Macromtrico: Acerca o aleja rpidamente el objetivo del preparado a observar; su funcin es lograr un enfoque ms o menos claro o aproximado del objeto. Tornillo Micromtrico: Acerca o aleja el objetivo del preparado, pero lentamente, casi imperceptiblemente, permite desplazamientos muy finos de la platina o del tubo del ocular. Durante la observacin y enfoque este tornillo debe estarse moviendo permanentemente; su funcin es darle nitidez al enfoque.

Parte ptica: Esta integrada por los objetivos, oculares y el aparato de iluminacin (espejo, diafragma, condensador y filtros). Estos elementos son los que permiten la iluminacin, ampliacin y la visin aumentada del objetivo. a. Objetivo: Es la pieza ms importante del microscopio. Ellos se acoplan mediante roscas estndar al revlver y pueden ser cambiados de posicin con slo rotarlos. Reciben el nombre de objetivos porque son los lentes que estn ms cerca del objeto. La mayora de los microscopios tienen tres o cuatro objetivos. Las lentes de los objetivos son de aumentos diversos, los ms usados son: Objetivos de pequeos aumentos 3.5x; 4x, 5x, 6x, 8x y 10x; objetivos de grandes aumentos 40x, 45x, 50x y objetivos de inmersin 90x, 95x y 100x. Las lentes de inmersin se emplean con aceite de inmersin para conectar la lente frontal (lente inferior del objetivo) al porta-objeto. Entre el objetivo y el objeto se produce una prdida de luz por reflexin que se corrige adicionando al preparado unas gotas de aceite de cedro (aceite de inmersin) cuyo ndice de refraccin 1.515, es prximo al cristal. Este aceite tambin reduce o suprime por completo la refraccin de los rayos de luz provenientes de la fuente luminosa.

Figura No. 1.2 Especificaciones de los objetivos.

b. Ocular: Estn colocados en la parte superior del tubo ocular. Est formado por dos sistemas de lentes dispuestos de un cilindro. Su finalidad es aumentar la imagen dada por el objetivo y eventualmente corregir algunos defectos de la misma. Reciben dicho nombre porque son las lentes que se encuentran ms cerca del ojo. Hay oculares de 3.5x; 5x; 6,3x; 10x; 12.5x; 15x; 20x y 25x. El aumento de la imagen de un objeto observado a travs de un microscopio, se calcula multiplicando el nmero de aumento del objetivo con el cual se est trabajando por el nmero de aumento del ocular que se est utilizando. c. Aparato de iluminacin: Est conformado por la fuente de luz, el diafragma, el condensador y los filtros. d. Fuente de luz: Puede ser natural o artificial, cuando es natural (solar) o procede de un foco luminoso situado fuera del microscopio, un espejo recoge la luz del medio y la refleja a travs del objeto y del sistema de lentes. La luz artificial la constituye generalmente un bombillo ubicado en el microscopio y conectado a un circuito elctrico de bajo voltaje. e. Diafragma: Est ubicado entre la fuente de luz y el condensador, inmediatamente debajo de la platina, su funcin es regular la intensidad de luz que atraviesa el objeto. El diafragma tiene una palanquita que al moverla hacia delante o hacia atrs agranda o achica el orificio central, dejando pasar mayor o menor cantidad de luz respectivamente. f. Condensador: Es un elemento cnico que posee un sistema de dos lentes convergentes que recogen o concretan los rayos luminosos para enviarlos al objetivo por el agujero de la platina. Existe un tornillo manual que permite guardar la altura del condensador. Esta graduacin es importante cuando se trabaja con objetivos de gran aumento (40x, 100x), ya que en la medida que se trabaja con stos objetivos el condensador debe subirse. Lo contrario

sucede cuando se trabaja con objetivos de menor aumento (4x, 10x). g. Filtros: Entre la fuente de luz y el condensador de algunos microscopios existe un portafiltros en el cual se puede colocar filtros a voluntad del observador. Los filtros son elementos de cuarzo o de vidrio, pueden ser de color azul, amarillo o verde. Ellos interceptan el haz de rayos luminosos antes de entrar al condensador, esto se hace con el objeto de seleccionar un tipo de luz determinada para una experiencia dada.
Para observar imgenes de filtros haz clic aqu.

1.4 LA LUZ: La luz es una forma de energa transportada continuamente por el espacio a velocidades muy elevadas (330.000 Km/s en el vaco). La luz est formada por pequeos corpsculos que salen de un foco luminoso en forma de ondas. El brillo de la luz es proporcional a la altura o amplitud de la onda y su color depende de la longitud de sta. La luz blanca est constituida por una gama de colores del espectro visible, stos colores son: rojo, anaranjado, amarillo, verde, azul y violeta. Cada color corresponde a una longitud de onda determinada, por consiguiente, la luz blanca se compone de muchos rayos de luz, todos vibrando con diferentes longitudes de onda. (Figuras 1.3 y 1.4).

Figura No.1.3. Naturaleza Ondulatoria de la Luz

La luz de una sola longitud de onda se llama monocromtica. Si bien se utilizan casi solo microscopios de luz blanca, la mayora de las lentes modernas estn diseadas para el uso de luz monocromtica verde.

Los detalles solo se observan si la preparacin es lo suficientemente delgada para que sea transparente con la luz que recibe. Para realizar preparaciones microscpicas los porta y cubre-objetos deben limpiarse antes de usarse. Un buen mtodo es guardarlos en alcohol y antes de utilizarlos secarlos con un pao limpio y libre de grasa. Los cubre-objetos deben limpiarse con mucho cuidado porque son frgiles. Las preparaciones microscpicas pueden ser acuosas o en seco. Las preparaciones acuosas son las ms simples y fciles usadas para examinar cualquier objeto fluido, como agua de estanque o sangre. Se deposita una gotita del lquido que se desea observar en el centro del porta-objeto, se coloca el cubreobjeto sobre el porta, forme con las dos lminas un ngulo de 45 grados y luego deje caer suavemente la laminilla cubre-objeto sobre el preparado, evitando la formacin de burbujas. Figura No.1.5. El lquido no debe rebosar los bordes del cubre-objeto, en caso de que suceda seque cuidadosamente el lquido sobrante usando papel absorbente o papel toalla. La preparacin queda as lista para la observacin. Estas preparaciones son de corta duracin porque se secan rpidamente; para hacerlas ms duraderas debe cerrarse hermticamente los bordes del cubre objeto; la duracin de sta preparacin no es indefinida. Los bordes se pueden cerrar con vaselina o esmalte. Un cierre ms hermtico se consigue cerrando con blsamo de Canad (Euparal). Las preparaciones en seco como lo ndica su nombre, se hacen para observar objetos secos, tales como alas de insectos. Aqu se utiliza goma arbiga, la cual se extiende sobre el porta, luego se deposita el objeto sobre la superficie y se deja endurecer la

Figura No.1.4. Espectro de Luz Visible 1.5 LENTES: Las lentes son el componente ms importante del microscopio; se fabrican de vidrio u otros materiales transparentes. Pueden ser convexas o cncavas en ambas superficies, planas en una cara o tener cualquier combinacin de stas dos formas en su superficie. Las lentes son de dos tipos: positivas y negativas. Lentes Positivas: Hacen converger los rayos de luz, es decir, los concentra para formar una imagen real. Lentes Negativas: Hacen divergir los rayos de luz, sin formar ninguna imagen real. 1.6 PREPARACIONES MICROSCPICAS: Debemos tener en cuenta que a travs del microscopio solamente se pueden observar objetos que dejan pasar rayos de luz, por esta razn el preparado debe ser lo ms delgado y transparente posible, pues un preparado grueso solo nos permite observar una mancha negra.

goma. Una vez endurecida la goma se pone un poco de blsamo de Canad sobre el objeto y se coloca el cubreobjeto.

que se emplea el reactivo incoloro de Schiff par teir el DNA en tonos rojizos purpreos. (Figura 1.6)

Figura No.1.5. Preparaciones Acuosas 1.7 COLORANTES : Los colorantes son sales compuestas por un cido y una base. Se clasifican en cidos, bsicos y neutros, segn la parte de los mismos que imparta el color. En los colorantes cidos el grupo cromforo, el que imparte el color, es el componente cido, el componente bsico es incoloro. Lo contrario sucede con los colorantes bsicos. Los colorantes neutros tienen coloreado el componente cido y el bsico. La mayora de los colorantes son sintticos, aunque se emplean todava algunos naturales. La hematoxilina y el carmn son los colorantes naturales ms importantes para la tincin de tejidos. El carmn es producido por la conchinilla (Coccus cacti). La hematoxilina se extrae de la madera de un rbol de Mxico, el palo Campeche. Otro colorante es la orcena que se extrae de lquenes. Existen tres tcnicas de tincin de uso general: la coloracin seca o de tejidos muertos, la coloracin vital o de tejidos vivos y la histoqumica, en la cual se utilizan las reacciones de los colores para hacer visible los elementos estructurales de las clulas y de los tejidos. Una reaccin histoqumica muy conocida es la de Feulgen, en la

Figura No.1.6. Colorantes.

Haz clic aqu.

1.8 MANEJO DEL MICROSCOPIO: Antes de iniciar una observacin microscpica se debe iluminar completamente el campo visual, para lo cual se procede de la siguiente manera: 1. Gire el revlver hasta que el objetivo de menor aumento quede en posicin de trabajo, o sea que quede alineado con los oculares. Usted sentir un golpecito (como un clic) cuando el objetivo llegue a su posicin de uso. 2. Lleve el condensador a su posicin ms alta. 3. Accione el tornillo macromtrico hasta que el objetivo de menor aumento descienda lo mximo posible o hasta que la mesa ascienda lo mximo posible, segn sea el modelo del microscopio. Esta operacin se hace llegar hasta un punto de parada (tope). 4. Mire a travs del ocular o gire el espejo hacia la fuente de luz hasta obtener un mximo de iluminacin. Si el campo visual no queda uniformemente iluminado, baje lentamente el condensador hasta obtener una iluminacin uniforme. Si su microscopio es elctrico siga los pasos 1, 2 y 3. Enchufe el cable del transformador a la fuente de energa.

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Conecte el cable del microscopio al transformador y luego accione el botn de ste para que encienda la bombilla. Mire por el ocular. 5. Una vez lograda una correcta iluminacin coloque el preparado sobre la platina. Mirando de lado, asegrese que el objeto a observar est centrado justo debajo del objetivo de menor aumento. 6. Mirando a travs del ocular mueva suavemente el tornillo macromtrico, si el objeto est bien centrado aparecer su imagen en el campo visual. Dle nitidez al enfoque accionando el tornillo micromtrico. Mueva el carro en diferentes direcciones para seleccionar el mejor campo posible. Puede controlar la intensidad de la luz, mediante el diafragma o el regulador de la intensidad de la luz de la bombilla. Para hacer un enfoque con mayor aumento debe seguir las indicaciones anteriores. Una vez obtenido el enfoque correcto con menor aumento, mueva el revolver y coloque en posicin de trabajo el objetivo de mayor aumento. Si su microscopio est bien calibrado debe aparecer enfocada la imagen del objeto. Este enfoque se refina accionando el tornillo micromtrico. Cuando el microscopio es monocular debe acostumbrarse a mantener tambin abierto el ojo que no utilice en la observacin microscpica, esto le evita cansancio.

juntas. Mantenga las lentes limpias. No toque las lentes con los dedos, ya que el sudor las daa. Nunca limpie las lentes con otra cosa que no sea papel especial para lentes. 4. No permita que lquidos, especialmente cidos o alcoholes, se pongan en contacto con su microscopio. 5. Use siempre cubre-objetos cuando observe en agua u otros lquidos 6. Localice siempre el objeto con el objetivo de menor aumento 7. Los sedimentos de grasa, el aceite de inmersin y los residuos de stos productos deben eliminarse inmediatamente con un poco de disolvente como ter o xilol. Nunca se debe emplear alcohol, ya que disuelve el cemento utilizado en la fabricacin de los lentes. La limpieza final es ms efectiva usando un poco de agua destilada. 8. Cuando no se est usando el microscopio, debe mantenerse siempre cubierto con una funda. 9. Al finalizar sus actividades de laboratorio, tenga en cuenta lo siguiente: 9.1 Antes de apagar la fuente de luz, llevar el dispositivo que regula la intensidad luminosa hasta O (cero). 9.2 Dejar el microscopio con el objetivo de menor aumento en la posicin de enfoque y la platina en su mxima posicin superior. 9.3 Desenchufar el microscopio y colocarle la funda protectora.

1.9 RECOMENDACIONES QUE DEBEN OBSERVARSE PARA EL BUEN USO Y CUIDADO DEL MICROSCOPIO: 1. El microscopio es un instrumento costoso y de precisin, con muchas partes delicadas, por lo tanto, debemos darle el mejor cuido posible. 2. Si su Microscopio presenta algn defecto, consulte con su profesor. No trate de arreglarlo Usted. 3. Las lentes del microscopio cuestan casi tanto como todas las dems partes

2.0 EJERCICIO DE APLICACIN: Con las siguientes prcticas se ejercitar inicialmente al estudiante en el uso y manejo del microscopio. 1. Fibra de lana o algodn: Coloca varias fibras de lana o algodn de diferentes colores sobre un portaobjetos, coloque el cubre-objetos, enfoque con menor y mayor aumento. Esquematice sus observaciones.

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2. Granos de polen: Coloque granos de polen del estigma de una flor en un porta-objetos, con ayuda de un gotero ponga una gota de agua, ubique el cubre-objetos y observe con menor y mayor aumento. Haga un esquema de lo observado.

3.0 CUESTIONARIO: 1. Coloque los nombres a las diferentes partes del microscopio numeradas en la Fig. No. 1.6 e investigue las funciones de cada una de ellas. 2. Qu otros tipos de microscopios se utilizan en la investigacin biolgica? 3. Qu son objetivos secos? 4. Qu son objetivos de inmersin? 5. Para qu se utiliza el aceite de cedro, cuando usamos el objetivo de inmersin? Cuando se utiliza un microscopio de espejo: 6. Qu importancia tiene utilizar la parte cncava del espejo? 7. Qu importancia tiene utilizar la parte plana del espejo? 8. Investigue sobre el funcionamiento de los diferentes microscopios electrnicos y establezca diferencias entre ellos. 9. Describa las principales tcnicas de preparacin de muestras empleadas en microscopa ptica. 10. Qu son los colores complementarios y que utilidad tendran en microscopa ptica.

3.1 ENLACES http://tq.educ.ar/tq03027/tipos.htm

Como usar el microscopio, tipos, generalidades http://www.itg.uiuc.edu/technology/at las/: Pgina con atlas de imgenes
obtenidas en diferentes tipos de microscopios. Retornar a tabla de contenido

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FIGURA 1.6 EL MICROSCOPIO PTICO

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GALERIA DE IMGENES
1. LAS PARTES DEL MICROSCOPIO 1.1 OCULARES 1.5 CONDENSADOR

1.2 OBJETIVOS Y REVOLVER

1.6 TORNILLOS

1.3 PLATINA Y CARRO

1.7 BRAZO

1.4 DIAFRAGMA

1.8 LA IMAGEN

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2. FILTROS 2.1 FILTROS POLARIZADORES

3. TINCIN DE MUESTRAS

2.2 FILTROS MONOCROMATICOS

2.3 UBICACIN DE LOS FILTROS

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2.4 COLORES COMPLEMENTARIOS

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