UNIVERSIDAD NACIONAL SAN ANTONIO ABAD

DEL CUSCO

Curso: Actividades
Docente: Zulma Virginia Lara Diaz del Olmo
Alumno: Michael Ángel Concha López
 Determinación por fluorescencia HPLC de nitritos en agua mediante
derivación precolumna con 4-metil-7-aminocumarina

Objetivos

Detectar la presencia de nitritos en agua mediante la derivación obteniendo un intermediario

diazonio. Esto haciendo uso de la cumarina para el procedimiento debido a su alta
reactividad. Posteriormente a una hidrólisis, determinar de manera precisa la presencia de
estos componentes mediante el uso de un espectrofotómetro UV-Vis.

Introducción

La determinación de nitritos es importante debido a su uso como aditivos en diversos

productos alimenticios y también por su presencia en el agua. En el agua se consideran como
trazas de los contaminantes primarios denominados “Nitratos”.
Existe la posibilidad de obtener nitritos a partir del Óxido de dinitrógeno y que la reacción de
los nitritos con las aminas secundarias dé lugar a la formación de nitrosaminas, algunas de las
cuales se sabe que son altamente cancerígenos y mutagénicas.
Los métodos oficiales se basan en la espectroscopia de especies azoicas resultantes de la
reacción de aminas primarias con una sal de aminas primarias con una sal de diazonio, esta
última producida por la reacción de iones de nitrito con un compuesto adecuado. La
modificación de Bratton Marshall de la técnica pionera de Griess es un ejemplo bien
conocido que permite la detección de 10 gg. L-1 de nitritos, un umbral que hoy se considera
demasiado alto.
Se ha conseguido una importante mejora del límite de detección de nitritos de la
quimioluminiscencia directa del óxido nítrico en el ozono. Los métodos cromatográficos
también se ven favorecidos en gran medida debido a la especificidad mejorada que resulta de
la etapa de separación. Independientemente del proceso cromatográfico utilizado, los mejores
rangos de detección electroquímica o UV se sitúan entre 1 y 100 gg.L -1.
Debido a las ventajas de los procedimientos cromatográficos citados, hemos desarrollado una
nueva y sencilla forma de realizar la HPLC fluorimétrico; cuyo objetivo era alcanzar límites
de detección de nitritos similares a los típicos de la detección por quimioluminiscencia.
Debido al interés de nuestro equipo en el desarrollo de sondas fluorescentes cumarínicas para
la detección por HPLC, seleccionamos un derivado que reacciona fácilmente con NO2 en
agua, para obtener un compuesto de alto rendimiento cuántico de fluorescencia La 4-metil-7-
aminocumarina (cumarina 120) se seleccionó como el reactivo de derivación de precolumna
más apropiado para este propósito. Esta guía describe la optimización del procedimiento de
derivatización de precolumna propuesto y la evaluación del rendimiento analítico y la
fiabilidad del método propuesto de HPLC-fluorescencia.
Métodos y materiales

Reactivos:
Todos los disolventes eran de grado HPLC.
● Destilar el agua tres veces antes de su uso.
● Nitrito de sodio y ácido sulfúrico; se adquirieron en Merck y eran de grado analítico.
● 4-metil-7-aminocumarina (cumarina 120 ®); eran de Kodak Products.
● El H2SO4 acuoso (0,5 mol.L -1) se prepara pesando una cantidad adecuada de
H2SO4 puro y añadiendo sobre agua tres veces destilada.
● Las soluciones acuosas de trabajo de nitritos (2,10 -8 a 10 -6 mol.L-1; 0,96 a 46
ktg.L-1) deben diluirse adecuadamente de una solución madre acuosa.
● Las soluciones metanólicas de cumarina 120 ® (2,10 -4 mol.L -1) se deben proteger
de la luz a + 4 °C durante una semana.

Aparatos:
● Las mediciones espectroscópicas directas se realizan con un espectrómetro de
absorbancia Shimadzu modelo UV 2100 y un luminómetro Perkin Elmer LS 50
equipado con una célula de cuarzo de 10 mm para los espectros de fluorescencia.
● Las rendijas de emisión y excitación se deben fijar a 5 nm.
● La LC se debe realizar con una bomba de metanálisis Shimadzu LC 9A equipada con
un inyector de bucle Rheodyne ® modelo 7125 20 p.1 inyector de bucle.
● La fase móvil (hexano-isopropanol, 95:5 v/v) se fija en 1,8 ml.min -1.
● La columna analítica debe ser una Spheri-5 cyano (5 I.tm) de 100 x 4,6 mm de
Brownlee Laboratories.
● La detección se realiza con un detector fluorimétrico Shimadzu RF 551 de excitación
y emisión a 325 y 380 nm, respectivamente.
● Todos los cromatogramas deben ser registrados con un integrador Shimadzu LC5A.

Procedimiento de Derivatización Precolumna

● La solución de cumarina 120 ® (50 ktL) se introduce en un tubo de vidrio con tapón
(5 mL) y se mezcla a fondo con H2SO4 (0,5 mol.L-1; 950 pL).
● La solución de nitrito (estándar para la curva de calibración o la muestra de agua a
determinar; 500 IxL) y la mezcla se mantuvo a temperatura ambiente durante 20
minutos.
● Los tubos sellados se calientan a 100 °C durante 70 minutos, se enfrían a temperatura
ambiente, y los productos fluorescentes se extraen con acetato de etilo (2 - 2 ml).
● La capa orgánica se transfiere cuidadosamente a un vial apropiado, se reduce a
volumen bajo una suave corriente de nitrógeno (Air Liquide, Francia), y el residuo se
disuelve en etanol(400 ~tl).
● El análisis de cromatografía líquida se realizó con alícuotas (20 ~tl) de esta solución.
● Los procedimientos se deben hacer por triplicado y promediar los resultados
obtenidos.
 Bibliografía

Zhou, J., Prognon, P., Delfín, C., & Hamón, M. (1993, Diciembre). HPLC

fluorescence determination of nitrites in water using precolumn derivatization with 4-

methyl-7-aminocoumarin. Chromatographia, 36, 57-60.

https://doi.org/10.1007/BF02263837