Estudio bacteriolgico de las salmonelosis de las aves (S. pullorum, S. gallinarum. S. Enteritidis y S. Typhimurium) en Amrica Latina Dr.

Horacio Ral Terzolo, Med. Vet., Ph.D Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria (INTA), rea de Produccin Animal, Casilla de Correo 276, (7620) Balcarce, Argentina. E Mail: hterzolo@balcarce.inta.gov.ar

Esta revisin est destinada a ser prctica e integral, considerando no slo los aspectos generales de la bacteriologa del gnero Salmonella, sino tambin la relacin de Salmonella pullorum, S. gallinarum, S. Enteritidis y S. Typhimurium con las diferentes enfermedades causadas por estas bacterias. Se espera que esta presentacin pueda ser til como introduccin para comprender la complejidad de estas enfermedades con el fin de dispensar informacin prctica que nos proporcionar herramientas aptas para seleccionar y aplicar de manera efectiva las mejores medidas de control disponibles. Salmonelas zoonticas en Amrica Latina Salmonella es agente causal de enfermedades entricas bacterianas, tanto en los seres humanos como en los animales. Las salmonelas paratficas causan infecciones que son consideradas zoonosis de importancia y por lo tanto este tema debe ser abordado centrndose tanto en la infeccin de los animales como en las cuestiones de salud pblica. En Amrica Latina las infecciones bacterianas de los seres humanos representan alrededor del 57% de las enfermedades transmitidas por los alimentos y cerca del 10% de estas infecciones son causadas por la ingestin de alimentos preparados con ingredientes provenientes de las aves de corral. La prevalencia de las serovariedades de Salmonella en las aves de corral vara segn los distintos pases y de acuerdo con diferentes perodos de tiempo que se consideren. Ciertos serotipos surgen dentro de un pas o regin durante un perodo y luego desaparecen sin ninguna causa aparente o medida de intervencin. Histricamente, tanto en Amrica Latina como tambin en el resto del mundo, S. Typhimurium ha sido la serovariedad ms frecuentemente aislada en los seres 1

humanos y en las aves de corral. Sin embargo, durante la dcada de 1980, S. Enteritidis ha surgido como la serovariedad predominante, sobrepasando ampliamente las tasas de aislamiento de S. Typhimurium. Hoy en da, en Amrica Latina, S. Enteritidis es la serovariedad predominantemente aislada de humanos, animales, alimentos y medio ambiente, lo que representa entre el 25 y el 60% del total de los aislamientos de Salmonella. La salmonela es una bacteria muy difundida en el medio ambiente Hay que sealar la importancia cada vez mayor de la contaminacin por Salmonella de alimentos preparados a partir de vegetales como diversos cultivos, verduras y semillas, entre otros; la contaminacin de la soja y en especial la de la harina de soja a granel que se transporta por barco, es un importante y difcil problema en todo el mundo, ya que este producto es la base de muchos alimentos balanceados destinados a varias especies de animales domsticos y entre ellos las aves de corral. La supervivencia de Salmonella en el medio ambiente es enormemente amplia porque este microorganismo es capaz de crecer entre 7 y 45C, slo se destruye a 65C durante 10 a 15 minutos, resiste un pH muy cido (incluso por debajo del pH4), resiste la salazn hasta un 20% cuando la sal se adiciona como conservante a los alimentos, sobrevive en los alimentos congelados e inclusive sigue siendo viable durante varios aos en el medio ambiente y en ciertos alimentos es capaz de sobrevivir durante muchos aos (por ejemplo aadida en la miel), etc. Las bacterias del gnero Salmonella son un grupo muy verstil y fascinante de microorganismos que estn adaptados para vivir en condiciones ambientales muy diversas y algunos de ellos tambin se adecuan para colonizar diferentes especies animales. En cada nicho ecolgico las salmonelas se desarrollan exponiendo diferentes adaptaciones fenotpicas; por ejemplo, si la bacteria vive en un ro sta desarrollar muchos flagelos para asegurar el movimiento de los microorganismos en un medio lquido, pero si, en cambio, necesitan multiplicarse sobre una tabla de cortar o picar de cocina estas bacterias no tendrn flagelos sino que se organizarn en biopelculas mecnica y desinfeccin. o biofims, siendo as muy resistentes a la limpieza

Formacin de biopelculas La capacidad de las salmonelas para formar complejas comunidades asociadas en las superficies, llamadas biopelculas (biofilms) contribuye a su resistencia y persistencia tanto en el hospedante como en el medio ambiente y es especialmente importante para el procesamiento de los alimentos. Las salmonelas se pueden unir a diferentes tipos de materiales abiticos (como plstico, vidrio, cemento, caucho y acero inoxidable) o superficies biticas (plantas, clulas epiteliales y los clculos biliares), as como a plsticos usados en el laboratorio (poliestireno). Los diferentes componentes estructurales de la Salmonella estn involucrados en la formacin de las biopelculas: fimbrias, curli, protena BapA, flagelos, celulosa, cido colnico, antgeno aninico O, cpsula y cidos grasos. La formacin de biopelculas est fuertemente influenciada por diferentes seales del medio ambiente que interactan a travs de una red de regulacin compleja as como tambin depende de una comunicacin entre las mismas salmonelas, llamada deteccin de qurum (quorum sensing) La formacin de las biopelculas de Salmonella

permite que estas bacterias resistan a la accin de diferentes factores de estrs, tales como la desecacin o la aplicacin de desinfectantes (por ejemplo, hipoclorito de sodio, glutaraldehdo, agentes tensioactivos catinicos y triclosn) y tambin contra al accin de ciertos antibiticos (por ejemplo, ciprofloxacina). Los inhibidores de la cpula de la biopelcula tambin se pueden utilizar, como por ejemplo surfactina, glucosa, furanonas halogenadas, 4 (5)-2-aril aminoimidazoles, furocumarinas y salicilatos. Tambin es posible combinar terapias con desinfeccin (por ejemplo, combinaciones de triclosn y sales de amonio cuaternario o furanonas, halogenadas y antibiticos con desinfectantes) y aplicacin de micro-emulsiones como la de aceite de soja en agua. Las furanonas halogenadas son secretadas por diversas algas y plantas y especficamente actan interfiriendo la deteccin de qurum. Tifosis y Paratifosis de las aves en Latinoamrica En las gallinas ponedoras de la mayora de los pases de Amrica Latina se han combinado los problemas de la salmonelosis causados por S. gallinarum (Tifosis Aviar) con los de la S. Enteritidis (Paratifosis). En cambio, en las aves reproductoras la Paratifosis por lo general tiene presentaciones espordicas y los brotes suelen ser rpidamente controlados. En la industria de los pollos de engorde, S. Enteritidis y S. Typhimurium slo se detectan espordicamente, 3

mientras que muchas otras serovariedades pueden ser tambin encontradas en las canales de los pollos, tanto en los mataderos como en los negocios de venta al pblico. Existe mucha informacin disponible en lo referente a brotes alimentarios en seres humanos, varios suelen estar relacionados con el consumo de alimentos de origen aviar. La presencia Tifosis Aviar no asegura que el establecimiento afectado deba estar libre de Paratifosis pues ambas enfermedades pueden coexistir en la misma granja y varias veces han sido encontradas al mismo tiempo. El Esquema de Kauffmann White Las especies y subespecies de Salmonella se clasifican fenotpicamente usando diferentes pruebas de desarrollo bacteriano y de diferenciacin bioqumica, mientras que las serovariedades o serotipos se clasifican de acuerdo con el Esquema de Kauffmann White. En primer lugar se determina el antgeno de tipo "O", lo que se basa en los polisacridos que estn asociados con lipopolisacridos (LPS); los diferentes antgenos "O " se expresan mediante nmeros que se escriben al comienzo de la frmula antignica. Luego se expresan los antgenos H , los que se determinan en base a las protenas flagelares. Dado que las salmonelas pueden presentar variaciones de fase, se distinguen cepas monofsicas (con una sola fase) o cepas bifsicas (con dos fases), adems hay fenotipos inmviles o mviles, pudiendo estos ltimos expresar diferentes tipos de antgenos "H". S. Gallinarum es siempre inmvil pero conserva material gentico que codifica para flagelos y presenta un mun flagelar basal con forma de gancho al microscopio electrnico, cuya protena compleja se llama FliE. Los aislamientos inmviles pueden ser inducidos a virar a la fase mvil mediante cultivos en tubos de Craigie y tambin estos mismos tubos pueden ser utilizados para detectar una cepa que es bifsica aunque sea incapaz de expresar una de las dos fases flagelares. Los antgenos flagelares se expresan combinando letras y nmeros. Las cepas patgenas de S. Typhi, as como algunas cepas de S. Dublin, portan al antgeno "Vi" (Vi de virulencia) que se relaciona con la presencia de una cpsula proteica. Las diferentes variaciones de las cepas pueden afectar los resultados de serotipificacin: S - R (Liso Rugoso), M - N (Mucoide No mucoide), las variaciones de la forma como por ejemplo la llamada "Fase L" que ocurre cuando el LPS se pierde y la Salmonella despus de perder su pared

rgida adquiere una forma redondeada o esferoplasto, Fimbriado - No fimbriado, OH O (Mviles Inmviles), y monofsica - bifsica del citado antgeno flagelar. Especies, subespecies y serovariedades de Salmonella Constantemente se adicionan nuevas serovariedades a la lista. Sin embargo, slo dos especies de salmonelas son realmente reconocidas dentro del gnero: S. enterica (con 2.443 serovariedades) y S. bongori (con 20 seroviedades). S. enterica est compuesta por seis subespecies: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae e indica. Casi todas las especies patgenas de los animales de sangre caliente se incluyen dentro de Salmonella enterica subsp. enterica (incluye 1.454 serovariedades). El resto de las subespecies de Salmonella enterica (989 serovariedades) colonizan a los animales de sangre fra o desarrollan en el medio ambiente como salmonelas de vida libre, a excepcin de algunas serovariedades de S. enterica subsp. arizonae que pueden causar enfermedad (Arizonosis) en los pavos. Grupos de Salmonella de acuerdo con su prevalencia en el hospedante La mayora de los brotes de salmonelosis en los seres humanos y en los animales domsticos son causados por relativamente pocas serovariedades, las que en base a su prevalencia para los hospedantes se pueden dividir en tres grupos. El primer grupo est formado por serovariedades que son especficas para ciertos hospedantes, causando en ellos enfermedades sistmicas limitadas a un nmero de especies filogenticamente relacionadas. Ejemplos de estas serovariedades son S. Gallinarum (que incluye a las biovariedades S. gallinarum y S. pullorum) en las aves de corral, S. Typhi y S. Paratyphi A en los seres humanos, S. Typhi-suis en los porcinos, S. Abortus-ovis en ovinos y S. Abortus-equi en los equinos. Todas estas serovariedades son especficas y estn completamente adaptadas slo para determinadas especies de animales o bien seres humanos, aunque nunca causan una enfermedad gastroentrica en los seres humanos debida a una infeccin cruzada entre especies de salmonelas adaptadas a un determinado animal; por lo tanto no se consideran serovariedades causantes de zoonosis. Como una excepcin en un artculo cientfico se describi un empiema humano causado por la biovariedad S. gallinarum en una persona inmuno-comprometida; sin embargo cabe sealar que los seres humanos saludables e

inmuno-competentes son totalmente refractarios a padecer una enfermedad causada por S. gallinarum. El segundo grupo consta de dos serovariedades que estn restringidas a dos hospedantes (S. Dublin en las especies de bovinos y S. Cholerae-suis en especies de porcinos), sin embargo, estas serovariedades son potencialmente capaces de infectar a otras especies animales y seres humanos. El tercer grupo consiste en las ms difundidas serovariedades de Salmonella enterica subsp. enterica, tales como S. Enteritidis y S. Typhimurium que usualmente causan gastroenteritis en una amplia gama de especies hospedantes que no tienen relacin entre s. Originalmente estas dos serovariedades eran especies de Salmonella especficamente adaptadas para infectar a los roedores pero han evolucionado desarrollando tambin la capacidad de infectar a muchas otras especies animales, entre ellas al ser humano. Susceptibilidad de los hospedantes para S. Enteritidis y S. Typhimurium En cuanto a la susceptibilidad de S. Enteritidis y S. Typhimurium para diferentes especies animales, podemos afirmar que los roedores y los seres humanos son los ms susceptibles seguidos por los rumiantes y los equinos que tienen una sensibilidad intermedia y es interesante observar las aves, especies de carnvoros mamferos y porcinos son los animales menos susceptibles. El hecho de que las aves de corral y las aves en general sean una de las especies menos susceptibles para adquirir una enfermedad clnicamente detectable hace que estas especies de animales sean una las ms relevantes como portadores inaparentes de salmonelas paratifoideas; como a menudo las infecciones por estas dos serovariedades pasan desapercibidas en las aves, ambas serovariedades tienen ms posibilidades de infectar a los seres humanos a travs del consumo de alimentos contaminados o subproductos alimenticios procesados. Adems, el aumento mundial del consumo de productos avcolas significa muchas ms oportunidades para que estas difundidas serovariedades puedan infectar a los seres humanos. Inmunidad maternal y desarrollo de la enfermedad Pollitos jvenes, de menos de 2 o 3 das de edad, son muy vulnerables a contraer una enfermedad paratifoidea declarada debido a la septicemia que les causa a esa edad la Salmonella; 6

de acuerdo con la inmunidad materna que ha adquirido en forma pasiva de su lote de aves reproductoras de origen, la progenie de pollitos puede o no ser propensa a sufrir diferentes tasas de mortalidad. Hoy en da, como la mayora de los lotes de aves reproductoras han sido inmunizados con vacunas inactivadas contra S. Enteritidis, ya sea sola o combinada con S. Typhimurium, casi todos los lotes de pollitos tienen algn grado de proteccin provista por los anticuerpos maternales que, de este modo, ocultan los sntomas haciendo que la enfermedad se torne clnicamente inaparente. Cuando durante la dcada de 1980, en la Argentina, apareci por primera vez la S. Enteritidis perteneciente al fagotipo PT4 o al estrechamente relacionado fagotipo PT34, en un lote de pollitos de engorde que nunca antes haba tenido previo contacto con esta Salmonella, los signos de la enfermedad y la mortalidad fueron muy evidentes. Estos sntomas consistieron en un crecimiento desigual de los pollos con aparicin de algunas aves enanas, la reabsorcin incompleta e induracin del saco vitelino y tasas de mortalidad variable, que pudieron afectar hasta un 10% de las aves de la primera camada de pollitos que haban nacido de esos lotes de aves reproductoras. Estas aves no haban sido vacunadas ni haban tenido contacto previo con la enfermedad. Fue interesante observar cmo, a medida que la inmunidad maternal fue paulatinamente aumentando en el lote reproductor pesado de origen de esas aves, los sucesivos lotes de pollitos que eclosionaron de esa progenie fueron disminuyendo gradualmente las tasas de mortalidad hasta que, dos semanas despus, tanto la mortandad como los sntomas y lesiones desaparecieron completamente. Salmonella Enteritidis y S. Gallinarum estn clonalmente relacionadas El anlisis comparativo entre el genoma de S. Enteritidis y el de S. Gallinarum indic que ambas serovariedades estn muy correlacionadas entre s y probablemente comparten genes que podran haber sido adquiridos a partir de una de bacteria primitiva que fue un ancestro comn. La estrecha relacin entre la serovariedad S. Gallinarum adaptada a las aves de corral y S. Enteritidis significa que esta ltima posee algunos de los factores de virulencia que hicieron que la serovariedad Gallinarum sea exitosa como patgeno para las aves de corral. Ambas salmonelas pertenecen al serogrupo D1, lo que indica que la estructura de los LPS de ambas es muy similar. Las dos serovariedades son parte del mismo linaje clonal, tienen los mismos mecanismos de multiplicacin intracelular y ambas poseen la fimbria SEF14, que est fuertemente involucrada 7

en la colonizacin de los tejidos reproductivos. Por lo tanto, la adquisicin de la fimbria SEF14 es de vital importancia para que S. Enteritidis logre una exitosa colonizacin de los huevos. Mtodos de diagnstico En el mercado se encuentran varios medios de cultivo muy eficientes y diversas tcnicas para aislar Salmonella spp. de las aves de corral, alimentos o muestras ambientales. Se han descripto distintas tcnicas de aislamiento, tales como caldos de enriquecimiento no selectivo y selectivo y diferentes agares para seleccionar e identificar las colonias mediante la presentacin de una tpica apariencia de Salmonella. Los caldos de enriquecimiento no selectivo incluyen el agua peptonada y el caldo lactosado. Los caldos de enriquecimiento selectivo ms comunes son Salmocyst , Tetrationato, VassiliadisRappaport y SelenitoCistina. Los agares Xilosa-LisinaDesoxicolato, SalmonellaShigella, HektoenEntrico o Rambach son adecuados para la deteccin y el aislamiento de la mayora de las colonias de salmonelas paratficas. Dado que las colonias de S. Gallinarum son menores que las de las otras serovariedades de Salmonella enterica, producen dbil SH2 y, por lo general, pueden ser aisladas en cultivo puro y abundante de los rganos internos de las aves enfermas, el uso del agar MacConkey para el aislamiento primario de las aves de corral que sufren brotes de Tifosis Aviar es una muy opcin muy conveniente. Para caracterizar fenotpicamente a los aislamientos se utilizan conjuntos de medios de cultivo y pruebas bioqumicas. Para una rpida deteccin de Salmonella spp. en alimentos o ingredientes alimentarios se encuentra comercialmente disponible una prueba de ELISA. Ahora tambin se cuenta en el mercado con pruebas moleculares especialmente diseadas para la rpida identificacin de algunas de las serovariedades patgenas ms comunes de Salmonella enterica. Estos mtodos moleculares tienen la ventaja de superar los inconvenientes que causan las anteriormente citadas variaciones de las cepas de salmonelas que pueden afectar los resultados de la serotipificacin clsica. Mtodos de muestreo Las muestras ms apropiadas para aislar Salmonella de los brotes con casos de septicemia, ya sea debidos a la Tifosis Aviar o a la Paratifosis de las aves de corral, son: el hgado, la vescula biliar con su contenido y el bazo. Todas las especies de Salmonella son capaces de sobrevivir e 8

inclusive multiplicarse en bilis pura y a veces el desarrollan biopelculas adherentes en las mismas paredes de la vescula biliar. Los contenidos de ciego son siempre adecuados para aislar salmonelas paratficas, aunque no siempre constituyen una buena muestra para aislar S. Gallinarum porque en los brotes agudos las aves enfermas con frecuencia mueren antes de que el intestino pueda ser colonizado. La mdula sea del hueso tarso-metatarso es la mejor opcin cuando el ave ya se encuentra muerta de Tifosis Aviar. Los hisopos cloacales de las aves adultas no siempre son la mejor muestra porque en la mayora de las aves la excrecin suele ser intermitente. Por el contrario, la toma de muestras de meconio pulsando el vientre de los pollos de 1 da de edad, es el mejor tipo de muestreo para adoptar. A veces es muy difcil aislar Salmonella enterica de los rganos o heces de los reproductores infectados, en cuyo caso es mejor cultivar las muestras de la descendencia de pollitos en lugar de la de sus padres. Cuando se lleva a cabo la autopsia de pollitos muy jvenes, adems del meconio, el saco vitelino y el hgado son muestras excelentes. Los cultivos de muestras ambientales de las granjas, criaderos y mataderos, as como las de diferentes implementos para la cra o el trabajo con las aves, son importantes para conocer el nivel de contaminacin y poder tomar as medidas preventivas, pero hay que tener en cuenta que existen otras serovariedades de Salmonella ambientales que no estn involucradas en las enfermedades de las aves y que tambin pueden ser aisladas. Desventajas de la prueba de aglutinacin con sangre entera Durante muchos aos la prueba de aglutinacin rpida con sangre total y antgeno de S. pullorum fue utilizada en las granjas como una prueba de prctica para erradicar a la Tifosis Aviar mediante la eliminacin de las aves reactoras positivas. Hoy en da, debido a la difusin de la serovariedad patgena S. Enteritidis en la industria avcola, la mayora de las aves reproductoras se inmunizan con bacterinas inactivadas basadas en S. Enteritidis y, puesto que S. Enteritidis y S. Gallinarum son serovariedades que comparten antgenos comunes, estas aves desarrollan anticuerpos que reaccionan contra ambas. A veces, cuando las aves de la granja estn infectadas con S. Enteritidis y los animales estn libres de S. Gallinarum, algunas de las aves pueden ser errticamente positivas a la prueba de sangre total con antgeno de S. pullorum. Adems cabe sealar que algunos brotes de Tifosis Aviar pueden ser causados por una cepa de S. gallinarum que pudiera tener diferencias antignicas con las cepas de S. pullorum estndares o 9

variables que se usan en la formulacin del antgeno de esta prueba; en este caso slo unas pocas aves infectadas pueden ser detectadas como reactoras positivas. Tambin se ha de tener en cuenta que existen algunas cepas que comparten antgenos comunes con otras enterobacterias distintas de Salmonella spp, tal como por ejemplo algunas cepas de Escherichia coli (antes llamadas "Salmonella coli"); estas cepas pueden causar una tasa relativamente alta de falsas aves reactoras positivas, inclusive si la explotacin est libre de Tifosis Aviar. Cabe entonces indicar que esta prueba slo tiene valor poblacional y no individual y sus resultados deben interpretarse con mucha cautela ya que el diagnstico final debe ser bacteriolgico y basado en el aislamiento de la Salmonella spp. causante de la enfermedad. Relacin entre virulencia de la Salmonella, la cra de pollos y las condiciones ambientales El tipo y la gravedad de las diversas infecciones por Salmonella varan enormemente y estn influenciados por muchos factores tales como: la serovariedad de la Salmonella, la virulencia de la cepa, la dosis infecciosa, la edad y el estado inmunolgico de las aves, el manejo del lote y la aplicacin de medidas de bioseguridad y tambin tiene que tenerse en cuenta la regin geogrfica en donde se encuentra la granja y las condiciones climticas. El acervo gentico de las aves es tambin importante, aunque en menor grado. Es primordial tener en cuenta los factores de virulencia de la serovariedad y tambin los atributos de virulencia que porta y expresa la cepa infecciosa actuante. Entre ellos tenemos que tener en cuenta: la pared celular con su LPS, la membrana celular con sus protenas, la enterotoxina termolbil (LT), la citotoxina y los flagelos, fimbrias o pilis as como tambin el ADN que lleva determinantes de virulencia, ya sea en el cromosoma o en los plsmidos. Mutaciones e intercambio gentico de Salmonella Debido a que el tiempo de generacin de Salmonella slo dura alrededor de 22 minutos, la duplicacin de estas bacterias es muy rpida. Esta duplicacin rpida del ADN bacteriano da posibilidades para que la bacteria pueda adquirir en forma relativamente rpida cambios genticos, ya sea por mutaciones o intercambio gentico. Este intercambio de los genes puede tener lugar mediante la transformacin o sea la transferencia del ADN libre; por transduccin o sea la transferencia por medio de bacterifagos especficos de Salmonella; o por conjugacin en 10 1

la cual el material gentico del cromosoma o plsmidos puede ser transferido mediante un pili sexual del bacilo donante al receptor. Fagotipificacin Durante dcadas la fagotipificacin ha sido til como mtodo fenotpico y definitivo para la caracterizacin epidemiolgica de S. Typhimurium. La fagotipificacin tambin es importante para efectuar estudios epidemiolgicos de cepas de Salmonella Enteritidis procedentes de diferentes regiones; as, por ejemplo, se encontr que en Europa predomina los fagotipos (PT) PT1, PT4 y PT6, en los EE.UU. el PT8, en Espaa el PT14b y en Argentina el PT4 y sus variantes el PT34 (de cepas muy virulentas) y el PT7 (de cepas de baja virulencia). El sistema es recomendado por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), Centro Colaborador para el fagotipado de Salmonella, sin embargo, es bastante complejo y hay suficientes desafos para la normalizacin de la interpretacin de los resultados de lisis, para asegurar de que a la misma cepa se asigna al mismo fagotipo por los diferentes laboratorios. En el futuro los mtodos de caracterizacin molecular sustituirn a los mtodos de caracterizacin fenotpica, aunque a pesar de ello, la fagotipificacin se mantendr vigente durante algn tiempo ms como una herramienta til para la vigilancia de Salmonella. Plsmidos de virulencia de Salmonella Las serovariedades de salmonelas patgenas contienen plsmidos de replicacin autnoma, siendo slo algunos de ellos transferibles por conjugacin. Algunos estn involucrados en virulencia o portan genes de resistencia a los antibiticos, mientras que otros son enigmticos y sin funcin reconocida. Algunos plsmidos han sido secuenciados, como por ejemplo el plsmido de virulencia de 60kb perteneciente a S. Enteritidis. Los plsmidos de virulencia varan entre los 50 y 100kb y estn presentes en muchas cepas de diferentes serovariedades de Salmonella. Los plsmidos de virulencia tienen una regin comn de ADN de ~ 8kb que codifica para todos los genes spv (spv = plsmido de virulencia de Salmonella) y estn presentes en las cepas patgenas de S. Enteritidis, S. Gallinarum (biovares S. gallinarum y S. pullorum), S. Typhimurium, S. Cholareasuis, S. Derby, S. Dublin y S. Paratyphi B. Otras subespecies de Salmonella como S. arizonae tienen los genes spv incluidos en el cromosoma. El plsmido spv es 11 1

necesario para la expresin in vivo de un fenotipo de virulencia completa. Las cepas que se han curado del plsmido spv pierden su capacidad de sobrevivir y persistir en el hospedante. Por medio de experimentos de desafo con S. gallinarum en pollos de 2 semanas de edad se ha demostrado la relacin entre la mortalidad y la presencia, ausencia o la reintroduccin del plsmido de virulencia. Treinta genes del plsmido spv de S. Typhimurium regulan las respuestas a las condiciones del medio interno y de estrs que pudieran encontrarse dentro del hospedante, incluyendo crecimiento en anaerobiosis y en carencia de nitrgeno y fosfato asequible, shock cido y osmtico y estrs oxidativo. Una respuesta bien caracterizada a la presin ambiental es la induccin de la respuesta de cido tolerancia; as una previa exposicin a un pH bajo (4.4-5.8) durante un corto perodo de tiempo desencadena una respuesta bacteriana que aumenta la resistencia a condiciones que son an ms cidas (pH 3.3 a 3). Salmonelas multiresistentes a los antibiticos El uso de antibiticos en medicina humana y veterinaria y su empleo para la proteccin de las cosechas proporciona una presin de seleccin que resulta en la propagacin preferencial de las bacterias que son resistentes. Debido al intercambio gentico antes mencionado, algunos de los determinantes moleculares pueden ser seleccionados y reproducidos en las bacterias, ya sea en la misma especie bacteriana o en otras especies del gnero, siempre que estn genticamente relacionados, por ejemplo, entre Salmonella con otras Enterobacteriaceae. Se han expresado opiniones divergentes sobre el uso a gran escala de los antibiticos en la industria avcola. Se estim que al prohibir el uso extensivo de los antibiticos en los pollos se podra reducir la propagacin de las bacterias resistentes a los antibiticos, pero esta accin debe ir acompaada de otras medidas, porque sino se puede dar lugar a un aumento en la incidencia de salmonelas resistentes a los antibiticos en los pollos debido a la necesidad de incrementar los tratamientos. Sin embargo en algunos pases con buenas medidas de bioseguridad en las granjas, como por ejemplo en Dinamarca, la prohibicin del uso de los antibiticos como promotores del crecimiento en pollos fue encontrada beneficiosa pues no produjo ningn aumento en la excrecin de Salmonella. El mencionado plsmido de virulencia spv codifica para los genes asociados a la resistencia a los antibiticos en S. Typhimurium, S. Dublin y S. Choleraesuis. Este plsmido ha 12 1

adquirido un sistema de Toxina Antitoxina que garantiza su supervivencia. Tanto la toxina como la antitoxina son codificadas por el plsmido y las dos protenas se unen para formar un dmero regulador que es inofensivo para la clula bacteriana. La antitoxina es lbil, pero se repone continuamente por el gen codificado por el plsmido. Si una bacteria pierde el plsmido durante la duplicacin bacteriana, la bacteria an tendr inalterado el complejo de Toxina Antitoxina y como la antitoxina se deteriora continuamente y no puede ser repuesta, la toxina se libera y acumula y finalmente la clula carente del plsmido morir. El problema de la resistencia mediada por plsmidos en aves de corral se limita principalmente a algunas cepas multirresistentes de S. Typhimurium que surgieron en la dcada de 1960, estas cepas son resistentes a la ampicilina, estreptomicina, sulfonamidas, tetraciclinas y furazolidona. Por otro lado, S. Enteritidis, a pesar de tener el plsmido spv, rara vez exhibe resistencia gentica adquirida a los antibiticos; sus plsmidos slo confieren un fenotipo de resistencia limitada. Durante 1995-2001 se llev a cabo un estudio que incluy 258 cepas de S. gallinarum y se demostr una resistencia aumentada de algunos antibiticos que haban sido cada vez ms utilizados y en cambio se detect una disminucin de la resistencia de otros que haban sido completamente retirados del uso en las granjas o bien administrados de forma muy espordica. Islas de patogenicidad y virulencia Las Salmonelas han desarrollado estrategias para colonizar diversos nichos anatmicos de los pollos. Las islas de patogenicidad son entidades grandes y distintivas localizadas dentro del cromosoma bacteriano. Albergan a uno o ms genes de virulencia. Pueden ser genticamente estables o con mayor frecuencia inestables, debido a la movilidad de los recursos genticos del ADN por repeticiones directas, integrasas, transposasas y genes procedentes de bacterifagos. Muchas de estas islas contienen un % C + G (porcentaje de guanina ms citosina) que es mayor o menor que el del genoma del ncleo. Estos genes tienen puntos de anclaje mediante tRNA que han adquirido de fagos lisognicos. La Isla de Patogenicidad de Salmonella 1 (SP-1) contiene un ADN estable que se requiere para la invasin de las clulas no-fagocticas permitiendo que la salmonelas invadan los tejidos del intestino despus de una infeccin oral. Adems, la SP-1 induce la apoptosis de los macrfagos, y escinde a dos citoquinas pro-inflamatorias o interleuquinas (IL) IL1 y IL18. 13 1

Ambos eventos permiten que las salmonelas interiorizadas por los macrfagos infectados escapen al espacio intercelular del medio interno del hospedante y all atraigan a nuevos fagocitos; as se forma un foco inflamatorio donde aumenta la replicacin de las salmonelas en el espacio intercelular y estos bacilos libres son ingeridos por los fagocitos recin llegados. Slo a travs de la apoptosis Salmonella es capaz de producir nuevos focos inflamatorios. Otra funcin importante de la SP-1 es la adquisicin por Salmonella de hierro combinado del medio interno del pollo, lo que permite la multiplicacin extracelular de las bacterias dentro de los espacios intercelulares de los tejidos de pollo. SP-2 es necesaria para la proteccin de las salmonelas contenidas dentro las clulas del ave en una vacuola pues impide la accin de la oxidasa y el xido ntrico, poderosos agentes oxidantes que son liberados por una sintetaza producida por el fagocito. Tambin codifica para la translocacin de protenas efectoras intracelulares de la salmonela a travs de la formacin de agregados tubulares en los endosomas de la clula de ave. Otra de las funciones de la SP-2 es codificar para la respiracin anaerbica mediante la enzima tetrationato-reductasa. SP-3 codifica para la supervivencia intracelular y la replicacin de Salmonella en el medio ambiente pobre en nutrientes de las vacuolas usando las limitadas concentraciones de purinas, pirimidinas, ciertos aminocidos y Mg2+. Los genes de SP-4 codifican para sistema de secrecin de tipo I involucrado en la produccin de toxinas bacterianas y en la supervivencia dentro de los macrfagos. SP-5, tambin llamada " Isla Salmonella Genmica del Centrisoma 7 ", codifica para protenas efectoras de las SP-1 y SP-2. SP-6 codifica para fimbrias que contribuyen a la virulencia de S. enterica. SP-7 tambin se llama "Isla de Patogenicidad Mayor" contiene elementos genticos que codifican para virulencia como los pilis que contribuyen a la invasin de las clulas epiteliales y la cpsula de polisacridos del antgeno Vi de S. Typhi, S. Dublin y S. Paratyphi C. Ms investigacin es necesaria para conocer las funciones de las otras islas, aunque se describen algunas: SP-8 codifica para bacteriocinas de S. Typhi, SP-9 para una citotoxina de S. Typhimurium y SP-10 para las fimbrias de adherencia Sef de S. Enteritidis y de S. Typhi. Finalmente, "La isla Genmica de Salmonella 1" codifica para la resistencia a los antibiticos.

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Los diferentes estados de portador de Salmonella de las aves de corral Despus de la infeccin por Salmonella las aves pueden permanecer como portadoras durante un perodo variable de tiempo o inclusive de por vida. La S. enterica puede permanecer viable dentro de los macrfagos u otras clulas del Sistema Retculo Endotelial. Debido al contenido de lisozima de algunos tejidos del ave, la pared celular de S. enterica puede ser total o parcialmente removida dando as lugar a la formacin de un protoplasto (remocin total) o de un esferoplasto (remocin parcial) que es la llamada "Forma L". Las bacterias en este estado generalmente no se detectan por el sistema inmune porque no provocan ninguna respuesta; esto se debe a que la membrana bacteriana tiene una composicin muy similar a la de la clula del ave. Adems no se pueden aislar por mtodos bacteriolgicos estndar dado que stos carecen de la proteccin osmtica que se necesita antes de inducir a una reversin de "Forma L" (de Fase L a Fase Vegetativa con recuperacin de la pared celular). Se describen tres tipos de portadores: Activo: las salmonelas se multiplican in vivo y un gran nmero de bacterias se excretan y contaminan considerablemente el medio ambiente; Pasiva: las salmonelas se ingieren, pero las bacterias no son capaces de multiplicarse o bien debido al estado inmunitario del husped o bien porque el ave es refractaria a la infeccin para esa serovariedad o cepa en particular, en ese caso slo el mismo clon de bacterias que se ingiere es el que se excreta; y Latente: el ave no excreta ninguna salmonela ya que las bacterias intracelulares permanecen ocultas; en ese estado los cultivos bacterianos que se utilizan habitualmente para detectar al bacilo vegetativo de Salmonella son todos negativos, situacin que contina inalterada hasta que el animal sea capaz de excretar las bacterias, lo que generalmente ocurre despus de que cualquier otro factor de estrs reactiva la enfermedad. Los Portadores latentes pueden entonces convertirse en Portadores Activos mediante la accin de diferentes factores de estrs, tales como: transporte, hacinamiento, introduccin de nuevas aves en la granja, cambios bruscos de temperatura, diferentes alteraciones climticas, restriccin alimenticia, muda forzada, actividad reproductiva muy intensa, produccin de huevos y experimentalmente el estrs puede ser desencadenado mediante la inyeccin de corticosteroides.

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Transmisin vertical S. gallinarum, S. pullorum, S. Enteritidis y S. Typhimurium son las salmonelas ms importantes que se transmiten a travs de los huevos. Cuando la infeccin alcanza a una granja de aves reproductoras, se puede generar un grave problema sanitario por esta enfermedad pues las salmonelas se propagan en forma vertical desde los padres hacia su progenie de pollitos. Adems, una vez que la Salmonella patgena se introduce en una granja es muy difcil de eliminar la infeccin y un solo lote de aves reproductoras infectadas puede contaminar en la planta de incubacin a todos los dems pollitos procedentes de otros lotes que hasta el momento no se haban infectado. Por eso cuando la contaminacin llega a las aves reproductoras resulta muy alto el costo econmico para la eliminacin de la enfermedad. Debido a estas razones se hacen ingentes esfuerzos para criar aves reproductoras libres salmonelas patgenas. Por otra parte, cuando las explotaciones comerciales de gallinas ponedoras estn infectadas con salmonelas paratficas la infeccin suele ser clnicamente inaparente y las salmonelas suelen ser inadvertidamente transmitidas a travs de los huevos para consumo humano. Tambin S. gallinarum puede estar presente en algunas granjas y en este caso la enfermedad se vuelve clnicamente evidente y muy a menudo causa mortalidad y grandes prdidas econmicas. Contaminacin de los huevos por diferentes serovariedades de Salmonella enterica Algunas serovariedades de S. enterica subsp. enterica pueden causar enfermedades gastrointestinales en los seres humanos a travs de alimentos preparados con huevos contaminados que se consumen poco cocidos o crudos. En los EE.UU. S. Enteritidis fue descrita como la serovariedad ms frecuentemente aislada (90%) a partir de huevos para consumo domstico, mientras que en las explotaciones de gallinas ponedoras de la UE es la serovariedad ms comnmente aislada del medio ambiente (52%). Adems de S. Enteritidis, otras serovariedades han sido descriptas como causantes de salmonelosis humana debida al consumo de huevos contaminados: S. Typhimurium, S. Infantis, S. Hadar, S. Newport, S. Stanley, S. Derby, S. Agona, S. Kentucky y S. Virchow, entre algunos otros. Las biovariedades adaptadas a las aves como S. pullorum y S. gallinarum producen un alto porcentaje de huevos internamente contaminados (alrededor del 6,5%) durante el perodo de madurez sexual de las aves. Por el contrario S. Enteritidis es menos exitosa, variando el porcentaje de huevos internamente 16 1

contaminados entre el 0,1% y el 0,6%. Adems de la diseminacin sistmica, otros serotipos de Salmonella enterica tambin pueden acceder al huevo a travs del oviducto mediante una infeccin ascendente desde la cloaca hacia la vagina. El grado de invasin de las distintas serovariedades de Salmonella en el epitelio vaginal depende del tipo de LPS y puede clasificarse segn el siguiente rango de frecuencia de aislamientos: el antgeno O9 (S. gallinarum, S. enteritidis) es mayor (>) que el antgeno O4 (S. Typhimurium, S. Heilderberg), O4 > O7 (S. Infantis, S, Montevideo) y O7 > O8 (S. Hadar). Factores de virulencia asociados con la colonizacin de huevo El proceso de colonizacin del tracto reproductivo es complejo y depende de muchos factores, incluyendo fimbrias Sef y fimbrias manosa dependientes de Tipo 1, flagelos, LPS, estructura de la pared celular y tolerancia al estrs. S. Enteritidis es la serovariedad paratfica mejor adaptada para colonizar y persistir en el tracto reproductivo de la gallina. Se demostr que pasajes repetitivos in vivo de una cepa de S. Enteritidis a travs de los tejidos reproductivos de la gallina aumenta su capacidad de inducir la contaminacin interna del huevo, mientras que los pasajes seriados in vivo a travs del hgado o del bazo no afectan la capacidad de la cepa para causar contaminacin interna de los huevos. Contaminacin de los huevos despus de la oviposicin S. Enteritidis puede contaminar la cscara del huevo y es capaz de migrar a travs de la cscara y de las membranas asociadas contaminando as el contenido del huevo. Esto ocurre con mayor frecuencia si la cscara del huevo est daada aunque tambin puede suceder en huevos intactos y recientemente puestos que hayan sido expuestos a contaminacin fecal de salmonelas. La contaminacin fecal puede ocurrir en el momento de la oviposicin cuando el vulo pasa a travs de la cloaca en una gallina infectada o si el huevo se mantiene, por ejemplo, en un maple o una cubeta de huevos, que hubiera sido anteriormente utilizado y se hubiera contaminado con heces. La presencia de estircol de pollo y otros componentes orgnicos hmedos sobre la cscara del huevo facilitan la supervivencia y el crecimiento de las salmonelas pues proporcionan nutrientes y proteccin fsica. Las bacterias pueden penetrar fcilmente en una cscara de huevo que est agrietada. Sin embargo, el huevo intacto posee tres barreras fsicas que tienen por objeto 17 1

evitar la penetracin de bacterias: la cutcula sobre las aberturas de los poros, la cscara del huevo y las membranas cristalinas de la cscara o frfaras. La cscara del huevo, adems de ser una barrera fsica, tambin acta como barrera qumica mediante la lisozima, ovotransferina, avidina y ovocalixina-36, esta ltima provoca un aumento de la permeabilidad con efecto bactericida y pertenece a un grupo de protenas de adherencia especfica para los LPS bacterianos. Debido esta proteccin tan completa, la cscara de huevo intacta slo es susceptible de ser penetrada inmediatamente despus de la puesta. Durante los primeros minutos despus de la oviposicin la cutcula es inmadura y algunos de los poros pueden estar abiertos. En este momento hay una diferencia trmica entre la temperatura del huevo recin puesto y el medio ambiente; esta diferencia genera una presin negativa que succiona a la Salmonella hacia el interior del huevo. Contaminacin de los huevos antes de la oviposicin Las otras posibles rutas de entrada de las salmonelas dentro del huevo consisten en la contaminacin directa de la yema, la albmina, las membranas de la cscara o el mismo huevo con su cscara antes de la oviposicin. Cuando las infecciones son producidas por cepas de salmonelas invasoras, los macrfagos infectados migran hacia los rganos internos del ave y particularmente hacia los tejidos reproductivos: ovario, infundbulo, magnum, istmo y glndula de la cscara. La investigacin disponible hasta la fecha sugiere que la contaminacin del contenido de los huevos por S. Enteritidis es principalmente una consecuencia de la infeccin de los tejidos reproductivos. La bacteria est casi siempre presente en cultivo puro en el contenido de los huevos y los diferentes estudios han demostrado que no existe una asociacin entre la presencia de S. Enteritidis sobre las cscaras del huevo y su presencia dentro del contenido del huevo. Por otra parte, S. Enteritidis puede aislarse de los tejidos reproductivos de las gallinas naturalmente infectadas, inclusive en ausencia de colonizacin intestinal. S. Enteritidis se localiza principalmente en la regin del oviducto en donde se secreta la albmina y suele persistir all de por vida sin daar a la gallina. Con menos frecuencia S. Enteritidis tambin puede infectar a los ovarios a travs del torrente sanguneo. S. Enteritidis generalmente no produce las lesiones tpicas del ovario que se encuentran en las aves enfermas de Tifosis Aviar, pero excepcionalmente algunas gallinas de un plantel pueden tener vulos deformados. Los pequeos folculos inmaduros blancos son mucho ms susceptibles a la invasin de S. Enteritidis que los ms 18 1

maduros, que son de color amarillo, tanto sean estos pequeos como grandes; la penetracin de los folculos inmaduros puede llevar a la contaminacin de los huevos despus de la maduracin, lo que significa que unas pocas gallinas de un lote pueden tener una infeccin transovrica de los huevos que persiste durante todo el ciclo reproductivo completo. Despus de realizar infecciones experimentales por va intravenosa se encontr que S. Enteritidis es capaz de colonizar a los ovarios y a los folculos preovulatorios a un nivel que es significativamente mucho ms alto que el de otras cinco serovariedades distintas y no relacionadas. S. Typhimurium tambin puede ser capaz de colonizar los ovarios, pero en mucho menor medida que S. Enteritidis. De hecho, S. Enteritidis coloniza muchos ms ovarios y rganos internos y los tejidos de estas aves albergan muchas ms clulas de S. Enteritidis que de S. Typhimurium por gramo del rgano.

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