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U N I V E R S I D A DA L A SP E R U A N A S

Prcticas de Microbiologa Ambiental


APELLIDOS:


NOMBRES: MESA:

  

ICA - PER

2011

NORMAS DE BIOSEGURIDAD
INTRODUCCIN:
Durante el trabajo diario de microbiologa, se dan situaciones de potenciales riesgos que varan segn el agente infeccioso y los procedimientos utilizados. Las Normas de Bioseguridad pretenden reducir a un nivel aceptable el riesgo inherente a la manipulacin de material peligroso. Requiere: Un trabajo coordinado de grupo, la actitud ante las practicas seguras de cada uno de los integrantes del equipo, determinan su propia seguridad, as como la de sus compaeros y la de la colectividad del Laboratorio. Equipamiento y el diseo del Laboratorio de Microbiologa, es parte fundamental en la proteccin de los empleados en el ejercicio de sus labores.
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Un programa de seguridad gestionado por profesionales bien entrenados, con un alto grado de participacin por parte de los trabajadores, puede llevar no slo a una disminucin del nmero de lesiones y enfermedades, sino tambin a un incremento de la satisfaccin del trabajador y de su productividad. Poner en prctica estas normas significa tomar conciencia que adems de nuestra propia salud consideraremos la de los dems. Estas normas de bioseguridad deben implementarse en forma permanente y universal considerando que todo material biolgico es potencialmente infectivo.

NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA:


La peligrosidad de un agente est directamente relacionada con el tipo de microorganismo y la manipulacin a la que es sometido. Por ello es bsico: 1. Conocer los agentes, sustancias y productos peligrosos que existen en el laboratorio. 2. Conocer la metodologa de trabajo del laboratorio. 3. Conocer el equipamiento del laboratorio. 4. Conocer las medidas a tomar en caso de emergencia. 5. Conocer las leyes relacionadas con la seguridad biolgica. 6. Respetar y hacer cumplir todo lo anterior. Modos de infeccin ms frecuentes: a. Auto inoculacin accidental debida a pinchazos o cortes con agujas, pipetas, bistures u otros elementos punzantes. b. Exposicin de la piel o mucosas a sangre, hemoderivados u otros fluidos biolgicos contaminados especialmente cuando la permeabilidad de las mismas se encuentra alterada por heridas, escoriaciones, eczemas, herpes, conjuntivitis o quemaduras. c. Inhalacin de aerosoles producidos al agitar muestras, al destapar tubos, al expulsar la ltima gota de una pipeta, durante la centrifugacin, especialmente cuando se emplean tubos abiertos o con mayor volumen del aconsejado por el fabricante en una centrfuga de ngulo fijo o cuando sta es frenada abruptamente para ganar tiempo. d. Salpicaduras en los ojos o aspiracin bucal.

MEDIDAS GENERALES:
Las siguientes medidas son de obligado cumplimiento en cualquier rea del laboratorio: 1. Las puertas del laboratorio debern estar cerradas y el acceso al mismo deber estar restringido mientras se lleven a cabo trabajos con materiales biolgicos. La puerta deber portar emblemas que digan: "Prohibido pasar Peligro biolgico". 2. El acceso al laboratorio estar limitado al personal autorizado. No deben entrar en los mismos familiares ni amigos. 3. El laboratorio deber ser mantenido limpio, ordenado y libre de materiales extraos. 4. No se permitir comer, beber, fumar y/o almacenar comidas as como el uso de cualquier otro tem personal (ej. cosmticos, cigarrillos) dentro del rea de trabajo. 5. Usar bata, chaqueta o uniforme dentro del laboratorio. Esta ropa protectora deber ser quitada inmediatamente antes de abandonar el rea de trabajo. 6. Antes de iniciar la tarea diaria asegrese que la piel de sus manos no presente cortes, raspones y otras lastimaduras, en caso que as sea cubrir la herida de manera conveniente antes de colocarse los guantes. 7. Usar guantes de ltex de buena calidad para todo manejo de material biolgico o donde exista aunque sea de manera potencial el riesgo de exposicin a sangre o fluidos corporales. 8. Cambiar los guantes de ltex toda vez que hayan sido contaminados, lavarse las manos y ponerse guantes limpios. 9. No tocar los ojos, nariz o piel con las manos enguantadas. 10. No abandonar el laboratorio o caminar fuera del lugar de trabajo con los guantes puestos. 11. El uso de agujas, jeringas y cualquier otro instrumento similar deber ser restringido a su uso indispensable. Las agujas y otros elementos punzantes debern ser descartados en un recipiente resistente. 12. Todos los procedimientos debern ser realizados de manera tal que sea nula la creacin de aerosoles, gotas, salpicaduras, etc. 13. Bajo ninguna circunstancia se pipetear sustancia alguna con la boca, para ello se usarn pipeteadores automticos. 14. Las superficies del rea de trabajo debern ser descontaminadas cuando se termine la tarea diaria. Usando para tal efecto una solucin de hipoclorito de sodio en concentracin adecuada. 15. El recipiente para decontaminar especmenes deber contar con tapa de seguridad para todo traslado fuera del lugar de trabajo. En ese caso el exterior del recipiente deber ser mantenido libre de toda contaminacin con sangre usando solucin descontaminante. 16. El desecho de los fluidos orgnicos puede efectuarse por las caeras habituales una vez que estos hayan sido convenientemente descontaminados. 17. Una vez usados los guantes de ltex debern ser colocados dentro del recipiente con solucin descontaminante. 18. El transporte de las muestras dentro o entre laboratorios se realizar de tal manera que, en caso de cada, no se produzcan salpicaduras. Lo recomendable es hacerlo en cajas hermticas o neveras transportables. Estas cajas o neveras debern ser rgidas y resistentes a los golpes, contar con materiales absorbentes en su interior y de fcil desinfeccin. Se etiquetarn o identificarn de forma oportuna y no podrn ser utilizadas para otros fines. Bajo ningn concepto se deben transportar las muestras a mano.

19. Lavar las manos con jabn (lquido o slido suspendido) y agua inmediatamente despus que el trabajo haya sido terminado. Si los guantes de ltex estn deteriorados, lavar las manos con agua y jabn despus de quitarlos. 20. Informe inmediatamente a su superior de cualquier accidente ocasionado con elementos del laboratorio.

NIVELES DE BIOSEGURIDAD:
Basados en el grado de peligro que representen los agentes microbianos, los laboratorios se dividen en 4 niveles de bioseguridad, y las prcticas obligatorias de proteccin aumentan con cada nivel. y Nivel de Bioseguridad 1: Los agentes del nivel de Bioseguridad 1 no representan una amenaza para la salud humana; esto quiere decir que aparentemente no causan enfermedad en adultos saludables. Algunos de estos organismos pueden causar enfermedad en personas inmunocomprometidas. Dentro de los agentes se incluyen Bacillussubtilis, Naegleriagruberi, virus de hepatitis canina infecciosa, y especies de E.colino patognicas. y Nivel de Bioseguridad 2: Los agentes estn asociados con enfermedades humanas. Estos laboratorios trabajan con cualquier derivado de sangre humana y con microorganismos tales como el virus del sarampin, muchas especies de Salmonella, especies patognicas de Toxoplasma, Clostridiumbotulinum, virus hepatitis B y otros patgenos. no causan infecciones mortales y no son transmitidos por el aire Nivel de Bioseguridad 3: Este tipo de laboratorio se utiliza cuando el trabajo se realiza con agentes nativos o exticos que tienen potencial de ser transmitidos por va respiratoria (aerosol) y que pueden causar infecciones serias y potencialmente letales. Loa agentes estudiados incluyen Mycobacterium tuberculosis (tuberculosis), virus de encefalitis de St. Louis, Francisellatularensis(tularemia) y Coxiellaburnetii.

Nivel de Bioseguridad 4:

Se trabaja con agentes peligrosos y exticos que poseen un alto riesgo de infeccin y riesgosos para la vida, y agentes infecciosos de transmisin por va area. Tambin se estudian en estos laboratorios agentes relacionados con riesgo de transmisin desconocido. Estos agentes suponen un alto riesgo de enfermedad mortal, pueden ser transmitidas por va aerosol (respiratoria) y no tienen vacuna o terapia disponible. Todos estos agentes son virus, algunos ejemplos son el virus Marburg, el virus Ebola , y virus que causan fiebre hemorrgica Congo-Crimea y fiebre Lassa.

NORMAS GENERALES DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA:


1. Es imprescindible el uso de bata de laboratorio. 2. Al iniciar y finalizar las prcticas, el estudiante se lavar las manos con agua y jabn. 3. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada prctica es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes ms habituales para esto son la leja y el alcohol (etanol 96). 4. Los cultivos microbianos deben manejarse siempre alrededor de la llama. Se deben evitar los desplazamientos innecesarios por el laboratorio, ya que pueden crear corrientes que originen contaminaciones o producir accidentes. 5. Durante las prcticas est prohibido comer, beber y fumar. Cuando se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos, etc. 6. Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la realizacin de la prctica deben estar apartados del lugar de trabajo. 7. Para deshacerse del material contaminado se utilizarn los recipientes adecuados, que sern esterilizados posteriormente. Nunca se debe tirar nada contaminadopor los lavaderos o a la basura comn.

8. Bajo ningn concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio. 9. No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre pipeteadores manuales. 10. En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos, etc.) se comunicar inmediatamente al instructor.

MATERIALES Y EQUIPOS BSICOS DE USO FRECUENTE EN MICROBIOLOGA:


1. MATERIAL DE VIDRIO:

2. OTROS MATERIALES:

3. EQUIPOS E INSTRUMENTOS:

Microscopio

Autoclave

Horno

Incubadora

Bao Mara

Refrigerador

Balanza

Centrfuga

Potencimetro Contador de colonias

OBSERVACIN DE BACTERIAS
PREPARADOS EN FRESCO: Permiten observar los organismos suspendidos en un lquido en condiciones de vida normal, sin sufrir alteraciones ocasionadas por algunos colorantes; pudiendo apreciar la movilidad, los cambios citolgicos durante el proceso de divisin celular y en la formacin de esporas. Se emplean las siguientes tcnicas: 1. Tcnica de montaje hmedo: Las preparaciones hmedas se efectan colocando una gota del cultivo en medio lquido sobre una lmina portaobjeto y cubrindolo con una laminilla, haciendo una ligera presin par repartir el material en capa fina y uniforme evitando la formacin de burbujas.

Si el cultivo est en medio slido o es muy rico en grmenes, se coloca sobre la lmina portaobjeto una gota de solucin salina y en ella se emulsiona la muestra en estudio y se cubre con una laminilla.. Para evitar la evaporacin y el efecto de las corrientes de aire, se sellan los bordes de la laminilla del preparado con vaselina, cera u otra sustancia semejante.

Fig. 2.1. Montaje hmedo entre portaobjetos y cubreobjetos 2. Tcnica de la gota pendiente: Persigue el mismo propsito que el montaje hmedo, con la ventaja que hay menor distorsin por el peso de la lmina cubreobjeto. Se utiliza lmina portaobjeto con excavacin central. La tcnica consiste en colocar en el centro de una lmina cubreobjeto una gota de la suspensin en estudio. El borde de la excavacin de la lmina portaobjeto se cubre con una delgada capa de vaselina y luego se invierte sobre la laminilla presionando suavemente, guiando la gota de suspensin hacia el centro de la concavidad; luego se procede a colocar en posicin normal la lmina portaobjeto para el examen microscpico.

Fig.2.2. Montaje hmedo en gota pendiente

PREPARADOS FIJADOS Y COLOREADOS: El examen en fresco de los microorganismos permite conocer algunas de sus caractersticas (morfologa, tamao, movimiento, etc). Sin embargo los microorganismos vivos son casi incoloros y no se pueden visualizar fcilmente al microscopio ptico normal cuando se encuentran suspendidos en agua, de ah que se utilicen colorantes para incrementar su contraste con el entorno que los rodea y de esta forma hacerlos visibles. Las coloraciones bacterianas se realizan para estudiar la morfologa, agrupaciones y estructuras como cpsulas, esporas, flagelos, etc., que ayudan a la identificacin de una especie o grupo en particular. Las bacterias tienen afinidad por los colorantes derivados de la anilina o especialmente por aquellos de carcter bsico. Estos colorantes llevan en su parte cromfora carga electro-positiva, la que tendra una fuerte afinidad por los grupos electro-negativos que normalmente presentan las bacterias en su protoplasma, entre los cuales se encuentran los cidos nucleicos y sus derivados. Para una buena tincin, hay que tener en cuenta la naturaleza de la bacteria, edad del cultivo o muestra, el carcter cido o bsico del medio y preferentemente una buena aplicacin de la tcnica.

Para obtener los preparados fijados y coloreados se deben realizar los siguientes pasos: 1. Extensin: Consiste en extender en un portobjeto limpio y exento de grasa una gota de la suspensin bacteriana. Para ello se hace uso del asa bacteriolgica. 2. Fijacin: Consiste en pasar el preparado suavemente por la flama de un mechero hasta que seque. La finalidad es adherir la muestra a observar en la lmina portaobjeto y as evitar que se desprenda en los lavados posteriores. Tambin se puede efectuar la fijacin con alcohol etlico, alcohol metlico, mezcla de alcohol-ter, etc. 3. Coloracin: Es el proceso de aplicar uno o ms colorantes de acuerdo a la tcnica empleada: Las coloraciones son simples, diferenciales y especiales. 4. Lavado y secado: Para eliminar el exceso de colorante se lava el preparado ante un chorro de agua y luego se seca suavemente ante la llama de un mechero, el empleo de papel de filtro o al medio ambiente. 5. Observacin: Se ubica los preparados primero con el objetivo de menor aumento y luego se examinan con el objetivo de mayor e/o inmersin. Colorante Es aquella sustancia o compuesto orgnico que tiene los grupos CROMFOROS que le comunica al cuerpo la propiedad de color y AUXCROMO que le confiere la propiedad de disociacin electroltica que le permite fijarse al objeto. Tipos de colorantes a) Por su origen: Colorantes naturales: Son colorantes extrados de organismos animales y plantas. Ejemplo: carmn, hematoxilina, ndigo, orcena. Colorantes artificiales: Preparados a partir de la destilacin fraccionada de la hulla. b) Por su reaccin tintoreal: Bsicos: Son colorantes nucleares, muestran afinidad por las porciones cidas de la clula. Ejemplo: cristal violeta o violeta de genciana, azul de metileno, fucsina bsica, etc. cidos: Son colorantes citoplasmticos, presentan fuerte afinidad por las porciones bsicas de la clula. Ejemplo: cido pcrico, eosina, fucsina cida, safranina, etc. Neutros: Asocian un colorante cido y un bsico y poseen las propiedades de ambos, y a veces propiedades nuevas. Ejemplo: eosinato de azul de metileno,etc. Mordiente Es una sustancia que con los colorantes reacciona formando compuestos insolubles incrementando la fijacin del colorante a las bacterias, ejemplo: fenol, yodo, sulfato de anilina, cido tnico, fierro, cobre, etc. Tambin se puede usar un agente fsico, por ejemplo el calor. Coloracin Tipos de coloracin Coloracin simple Coloracin diferencial Coloracin especial COLORACIN SIMPLE Es aquella en donde se utiliza un solo colorante, en este caso las clulas se tien en forma uniforme. Este procedimiento es usado cuando se quiere revelar rpidamente presencia de

microorganismos en diversas muestras y permite examinar la morfologa, algunas estructuras y agrupacin de las bacterias. Objetivo: Observar las caractersticas morfolgicas, agrupaciones y tamao de las bacterias.

DISEO EXPERIMENTAL Materiales y Microscopio compuesto de campo claro y Lminas portaobjeto y Cultivos de 24 horas en medio lquido y medio slido de: E. coli, Psudomonasspp., Staphylococcusspp., Bacillussubtilis. y Colorantes en solucin: azul de metileno, cristal violeta, safranina, fucsina bsica. y Mechero y asa bacteriolgica y Solucin salina estril y aceite de inmersin. Procedimiento y Prepare una extensin a partir de un cultivo bacteriano y fijelo. y Cubra el preparado con gotas del colorante y dejar actuar, dependiendo del colorante, durante 30 , 1 a 3 minutos. y Lave con agua corriente y secar y Examine el preparado coloreado con el objetivo de inmersin utilizando una gota de aceite de inmersin. Anote sus resultados. Resultados y observaciones.

COLORACIONES DIFERENCIALES: Las coloraciones diferenciales son aquellas que se emplean dos o ms colorantes. Estas tcnicas ponen de manifiesto diferencias entre las clulas bacterianas, o entre partes de una misma clula, debido a las diferentes reacciones qumicas que se originan con los constituyentes qumicos de la estructura externa e interna de la clul bacteriana. Entre los procedimientos ms usados est la coloracin de Gram y Ziehl-Neelsen.

Coloracin de Gram Fue descrita por primera vez por el mdico Dans Christian Gram en 1884 y aplicada posteriormente por Friendlander a la bacteriologa. La tincin de Gram es una tincin diferencial que nos permite clasificar las bacterias en Gram(+) o Gram(-) segn las caractersticas de su pared celular. Adems permitir observar la morfologa de los microorganismos. Los Gram positivos son los que retienen el complejo cristal violeta-yodo, observndose de color azul. Los Gram negativos no retienen el complejo y lo pierden por la accin de un decolorante, tomando la coloracin del segundo colorante. El colorante contraste ms utilizado es la safranina o la fucsina por lo que se observan de color rojo, recomendndose que las personas daltnicas utilicen el pardo de Bismarck. Es importante recordar que la tincin de Gram nicamente da resultados vlidos cuando se aplica a cultivos jvenes de 24 horas o menos. Objetivo: Ejecutar la coloracin Gram correctamente y hacer estudios morfolgicos reconociendo la diferenciacin de las bacterias en dos grupos.

DISEO EXPERIMENTAL: Materiales y Microscopio compuesto de campo claro. y Lminas portaobjeto y Cultivos de 24 horas en medio lquido y medio slido de: E. coli, Pseudomonasspp., Staphylococcusspp., B. subtilis. y Batera de coloracin de Gram: solucin de cristal violeta, safranina, lugol y alcohol acetona. y Mechero y asas bacteriolgicas y Solucin salina estril y aceite de inmersin. Procedimiento y Prepare una extensin del cultivo en estudio y fijelo al calor. y Cubra el preparado con cristal violeta por 1 minuto. y Lave con agua corriente. y Cubra el preparado con lugol durante 1 minuto. Lave nuevamente con agua. y Decolore con alcohol-acetona durante aproximadamente 20 segundos. Lavelo con agua corriente. y Cubra la extensin con safranina (u otro colorante contraste) durante 30 . y Lave, seque y observe con el objetivo de inmersin. Las bacterias Gram positivas aparecern coloreadas de violeta oscuro y las gramnegativos de rojo.

Resultados y observaciones Cultivo bacteriano Escherichia coli Pseudomonas spp. Staphylococcus spp. Bacillus subtilis ____________________________________________________________________________ Morfologa Gram

COLORACIONES ESPECIALES: Las coloraciones especiales permiten visualizar diferentes estructuras bacterianas, como por ejemplo flagelos, esporas, cpsula, nucleoide o un determinado grupo microbiano. Coloracin de esporas Las esporas bacterianas son formas de resistencia a las altas temperaturas, la radiacin, la desecacin, desinfeccin qumica,etc. Cuya formacin se observa en los gneros: Bacillus, Clostridium, Sporosarcina. Al microscopio, las esporas sin teir se observan como grnulos brillantes. Objetivo: Demostrar mediante sta tcnica la presencia de esporas, su forma, dimetro y posicin. DISEO EXPERIMENTAL: Mtodo de Wirtz-Conklin Materiales y Microscopio de campo claro y Lminas portaobjeto y Cultivos en agar nutritivo inclinado de 48 horas de: B. subtilis, B. thurigiensis o de B. cereus. y Solucin acuosa de verde de malaquita al 5%. y Solucin acuosa de safranina al 0,5% (puede usarse fucsina diluda). y Mechero y asas bacteriolgicas. y Solucin salina fisiolgica y aceite de inmersin Procedimiento y Prepare una extensin de la bacteria y fijela al calor. y Cubra la extensin con verde de malaquita y caliente hasta la emisin de vapores, durante unos 5 minutos. y Lave con agua destilada y Aada la solucin de safranina y deje actuar durante un minuto. y Lave con agua corriente, seque y observe con lente de inmersin. Las esporas se observan de color verde y las clulas bacterianas de color rojo. Resultados y observaciones

Coloracin de Vag

Las bacterias cuyo dimetro es menor al del poder de resolucin del microscopio de campo claro no pueden ser visualizadas con las tcnicas comunes de coloracin por lo que requieren de tcnicas especiales que aumenten su grosor a fin de ser observadas, de ah la utilidad de la coloracin de Vag. Las bacterias que requieren de sta coloracin estn comprendidas dentro de los gneros: Borrelia, Spirillum, Leptospira y Treponema. Objetivo: Observar las diferentes morfologas de las bacterias espiraladas. DISEO EXPERIMENTAL Materiales y Microscopio ptico de campo claro. y Lminas portaobjeto y Muestra de sarro dentario y Batera de coloracin Vag: solucin de mercurio cromo, solucin de cristal violeta y Mondadientes y aceite de inmersin. Procedimiento y Prepare una extensin de sarro dentario utilizando mondadientes y deje secar al ambiente. y Cubra la extensin con mercurio cromo y djelo actuar durante 3-5 minutos. y Lave con agua corriente. y Agregue cristal violeta y deje actuar durante 3 5minutos. y Lave con agua corriente, seque y observe con objetivo de inmersin. Las bacterias espiraladas se observan en forma ntida de color violeta oscuro. Resultados y observaciones

Cuestionario 1. Mencione las ventajas que ofrece un preparado en fresco .. 2. Mencione 4 especies bacterianas Gram positivas y 4Gramnegativas GRAMPOSITIVAS: a) b) c) d) GRAMNEGATIVAS: a) b) c) d)

..

3. Mencione 4 bacterias mviles, indicando el nmero de flagelos que presenta a) b) c) d) 4. Esquematice la micrografa electrnica que muestra las partes de una endospora bacteriana

5. Porque la cpsula bacteriana no se colorea con colorantes habituales?

MEDIOS DE CULTIVO
INTRODUCCIN La gran meta que tiene un microorganismo es crecer y dividirse; para ello necesita duplicar el material que posee. Las clulas utilizan elementos qumicos que provienen del medio ambiente para transformarlos en los constituyentes caractersticos que componen dicha clula. Estos compuestos qumicos se llaman nutrientes y el proceso por el cual una clula transforma estos nutrientes en sus componentes celulares se denomina anabolismo o biosntesis. La biosntesis es un proceso que requiere energa. Esta energa se obtiene del medio ambiente. Las clulas pueden utilizar tres tipos distintos de fuentes de energa: luz, compuestos orgnicos o compuestos inorgnicos. Aunque algunos organismos obtienen su energa de la luz, la mayor parte lo hacen a travs de compuestos qumicos. Cuando estos compuestos qumicos se rompen originando compuestos ms simples se libera energa y a este proceso se le denomina catabolismo. El resultado colectivo de las reacciones anablicas y catablicas es el metabolismo. Cuando los microorganismos se separan de su hbitat (donde adquieren los nutrientes) y se cultivan en laboratorios o industrias se deben usar medios de cultivo que contengan los elementos qumicos necesarios para su crecimiento. MEDIOS DE CULTIVO Medio de cultivo es el substrato lquido o slido ptimo para el mantenimiento y crecimiento de microorganismos en el laboratorio. El medio variar dependiendo del tipo de microorganismo.

Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son: 1. Peptonas. Son protenas hidrolizadas, se obtienen por digestin qumica o enzimtica de protenas animales o vegetales. 2. Azcares. Son una fuente de carbono para los microorganismos. Los ms empleados son la glucosa, la lactosa y la sacarosa. 3. Extractos. Son preparados de ciertos rganos o tejidos animales o vegetales obtenidos con agua y calor. Ej.: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. 4. Agar. Se utiliza como agente solidificante. Es un polisacrido que se obtiene de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo. 5. Fluidos corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguneo son aadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos microorganismos patgenos. 6. Sistemas amortiguadores. Son sales que se aaden al medio para mantener el pH dentro del rango ptimo del crecimiento bacteriano. Ej.: fosfatos bisdicos o bipotsicos. 7. Indicadores de pH. Son indicadores cido-base que se aaden para detectar cambios de pH en el medio. 8. Agentes reductores. Sustancias que se aaden al medio para crear las condiciones que permitan el desarrollo de los grmenes microaerfilos o anaerobios. Ej.: cistena y tioglicolato. 9. Agentes selectivos. Sustancias como el cristal violeta, las sales biliares etc. que a determinadas concentraciones en el medio actan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos. Para que un medio responda con xito en el cultivo de los microorganismos, debe cumplirse con las siguientes condiciones: 1. Contener las sustancias nutritivas necesarias para el crecimiento microbiano 2. La humedad (aw), el pH y la presin osmtica deben ser ptimos. 3. Debe estar esterilizado y preservado de cualquier contaminacin. Los medios de cultivo sirven para: 1. Aislamiento de microorganismos 2. Identificacin 3. Conservacin 4. Clasificacin 5. Obtencin de toxinas 6. Obtencin de masa celular en la preparacin de vacunas y otros fines. 7. Estudios complementarios, como los de sensibilidad de las bacterias a los antimicrobianos. Un cultivo que contiene solamente una clase de microorganismo se conoce como cultivo puro o axnico. Un cultivo que contiene ms de una clase de microorganismo se conoce como cultivo mixto. TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO 1. Por su origen a) Naturales: Son de origen animal o vegetal cuya composicin qumica estructural no se conoce con exactitud, por ejemplo: leche, peptonas, extracto de carne, rebanada de papa.

b) Sintticos: Son aquellos que se conoce la identidad y la cantidad de cada compuesto qumico, es decir es un medio qumicamente definido., ejm. Un medio con azcares, aminocidos, vitaminas, etc. c) Semisintticos: Son medios sintticos a los que se les agrega extractos orgnicos complejos como extracto de levadura, extracto de carne, etc. 2. Por su consistencia a) Lquidos. Se denominan caldos y se preparan en tubos o erlenmeyers. Ejm. Agua peptonada, caldo nutritivo, caldo tetrationato, etc. b) Slidos. Son aquellos que contienen un agente solidificante entre sus componentes, normalmente agar en la proporcin de 1 a 2%. Tambin se emplea la gelatina, silica gel, etc. Se preparan en placas de Petri o en tubos en slant (tubos con la superficie del medio inclinada). Ejm. Agar nutritivo, agar Sabouraud, agar Mac Conkey. c) Semislidos. Son los medios lquidos a los que se agrega 0,2 a 0,5% de agar u otra sustancia gelificante para darles una consistencia blanda. Se utilizan para estudios de movilidad de los microorganismos y como nutrientes para cepario. 3. Por su composicin o funcin a) Medios comunes o bsicos. Son los que contienen los requerimientos nutritivos mnimos necesarios que permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos. Ejm. Caldo nutritivo, agar nutritivo. b) Medios enriquecidos o mejorados. Son aquellos medios bsicos que han sido suplementados con sustancias de mayor valor nutritivo, como sangre, suero sanguneo, lquido asctico, yema de huevo, etc. Ejm. Agar sangre, Agar chocolate, Agar jugo de tomate. b) Medios de enriquecimiento. Son medios lquidos que favorecen el crecimiento de un determinado grupo de microorganismos, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto. Ejm. Caldo selenito, caldo tetrationato, agua peptonada alcalina, etc. c) Medios selectivos. Permiten el crecimiento de un tipo de microorganismo determinado, inhibiendo el desarrollo de los dems. Ejm. Agar Mac Conkey, Agar manitol salado, Agar telurito, etc. d) Medios diferenciales. Son aquellos en los que se pone de relieve alguna propiedad que un determinado tipo de microorganismos posee. Estos medios se utilizan para apreciar cambios bioqumicos especficos de un germen frente a determinado substrato, como produccin de H2S, formacin de gas, cambios en el pH. Ejm. Agar TSI, Agar Urea, Agar gelatina. e) Medios de transporte y mantenimiento. Se utilizan en la recogida, transporte y conservacin de muestras microbiolgicas. Esencialmente, son medios no nutrientes, semislidos muy reductores, que inhiben las reacciones enzimticas autodestructivas dentro de las clulas y evitan los efectos letales de la oxidacin. Ejm. Medio Stuart, Medio Cary Blair, etc. TCNICAS DE SIEMBRA En trminos microbiolgicos se entiende por SIEMBRA al proceso mediante el cual se lleva una porcin de una poblacin de microorganismos (inculo) a un medio de cultivo adecuado, para que en condiciones ptimas de tensin de oxgeno, temperatura y tiempo de incubacin puedan multiplicarse in Vitro. Esta operacin se realiza teniendo en cuenta las siguientes precauciones: 1. Realizarlas en habitaciones cerradas, evitando corrientes de aire, para lo cual se recomienda el uso de una cmara de flujo laminar. 2. Identificar convenientemente los tubos y placas a sembrar. 3. Ejecutar la siembra cerca de la llama de un mechero para evitar la contaminacin. 4. Esterilizar el asa de platino antes y despus de la siembra. 5. Flamear la boca de los tubos antes y despus de realizada la siembra.

6. Poner en prctica las normas de bioseguridad. CLASES DE SIEMBRA 1. Por transplante: Se realiza con la finalidad de hacer perdurar el microorganismo transfiriendo peridicamente de un cultivo a un medio de cultivo, o bien para realizar la identificacin bioqumica. Por lo general se realiza de tubo a tubo, en medios lquidos o slidos, y pueden ser:  De slido a slido  De slido a lquido  De lquido a lquido  De lquido a slido. 2. Por aislamiento: Se realiza con la finalidad de separar especies microbianas para obtener un cultivo puro a partir de una muestra problema (orina, heces, agua, alimentos, secreciones, etc.). Una vez aislado el cultivo puro se identifica las especies valindose de sus propias caractersticas. Estas siembras pueden realizarse por: agotamiento en superficie y por diluciones sucesivas. a) Por agotamiento en superficie: Consiste en diseminar los microorganismos en la superficie del medio de cultivo contenido en placas de Petri. Puede hacerse:  Aislamiento por estra con asa de Kolle.  Aislamiento por estras con aguja de Kolle  Aislamiento por extensin con esptula de Drigalsky. b)Por diluciones sucesivas: Consiste en hacer diluciones sucesivas de una muestra y luego colocar 1 mL de cada dilucin en placas Petri. A continuacin se vierte el medio licuado y mantenido a 45C (siembra por incorporacin o vertido en placa), rotando luego las placas a fin de homogeneizar la muestra con el medio. OBJETIVOS: Reconocer la importancia, clasificacin y el empleo de los medios de cultivo. Ejecutar diversas tcnicas de siembra para aislar y transferir bacterias. DISEO EXPERIMENTAL Materiales y Cultivos de bacterias en medios lquidos y slidos. y Tubos con caldo nutritivo, Agar nutritivo y Agar semislido y Placas con Agar nutritivo, Agar Mac Conkey, Agar manitol hipertnico y Agar sangre. Procedimiento a) Siembra por inoculacin o agitacin. Se realiza en tubos con medios lquidos. Con el asa de siembra estril tome una cantidad suficiente de inculo e introduzca en el medio y agite.

b) Siembra por estras Se realiza en tubos con Agar inclinado, introduciendo esta vez el asa con el inculo hasta el fondo de la parte inclinada y deslice suavemente en zigzag en la superficie del medio sin perforarlo hasta el extremo superior del mismo.

c) Siembra por puntura o picadura Se realiza en tubos con Agar semislido. Con el asa de siembra estril en forma de aguja, tome una cantidad suficiente de inculo e introdzcalo en forma vertical en el centro del medio.

d) Siembra por estra agotamiento Se realiza en placas con medios slidos y tiene por finalidad obtener colonias aisladas de microorganismos a partir de una mezcla a fin de obtener un cultivo puro. Con el asa bacteriolgica que contiene el inculo siembre una lnea en zigzag sobre un cuarto de la superficie del medio sin daarlo; esterilice el asa de siembra y sin tomar nuevo inculo trazar otra lnea en zigzag en perpendicular a la anterior de tal modo que crucen a la anterior. Repetir esta operacin dos veces ms.

e) Siembra por agotamiento con esptula de Drigalsky Se realiza en placas con medios slidos. Tome cuatro placas con medio slido y numrelas secuencialmente, luego en la primera colocar con una asa o pipeta Pasteur una gota de la muestra, seguidamente extenderla sobre toda la superficie del medio con el empleo de una asa de vidrio o Drigalsky; sin esterilizarla deslice sobre toda la superficie sin estropear el medio en la placa siguiente y as sucesivamente hasta sembrar todas las placas numeradas. f) Siembra por diluciones sucesivas  Por incorporacin o placa vertida Realice diluciones decimales de la muestra y con una pipeta coloque 1 mL de cada dilucin en cada una de las respectivas placas de Petri y luego agregue 20 mL a cada una de ellas de medio de cultivo licuado y mantenido a 45C. Rotar las placas para homogenizar la muestra y dejar solidificar.

 En superficie

Se realiza en medios slidos, ejecutndose las diluciones de forma similar al anterior y coloque en este caso 0,1 mL de cada dilucin la cual es extendida en toda la superficie del medio mediante una esptula de vidrio o Drigalsky. Resultados y observaciones

CARACTERSTICAS DE LOS CULTIVOS MICROBIANOS


INTRODUCCIN Las especies microbianas se pueden identificar basndose en las caractersticas de crecimiento y en la actividad que desarrollan los microorganismos en los distintos medios de cultivo y condiciones ambientales en que se incuban. La interpretacin de los cultivos primarios se realiza luego de 24 a 48 horas de incubacin, requiere una considerable destreza. Para determinar las caractersticas de desarrollo de un cultivo puro es costumbre observar los siguientes aspectos del cultivo: Caractersticas de los cultivos en medios lquidos a) Cantidad de crecimiento: Escaso, moderado o abundante b) Distribucin de crecimiento: Uniformemente distribuido (turbidez), limitado a la superficie como: pelcula, anillo o membrana; acumulado en el fondo: sedimento granuloso o viscoso. c) Olor: ptrido, de frutas o aromtico, o imperceptible. d) Cromognesis: pueden ser coloreados o no coloreados.

Caractersticas de los cultivos en medio slido inclinado a) Cantidad: escaso, moderado o abundante b) Forma de crecimiento: Filiforme, difuso, perlado, rizoide, arborescente, equinulado, etc. c) Consistenciadel cultivo: viscosa, fibrosa, butirisa, quebradiza, etc. d) Cromognesis: con produccin o no de pigmentos.

Caractersticas de los cultivos en medio semislido a) Desarrollo a lo largo de la lnea de inoculacin: filiforme, perlado, papilar, vellosa, arborescente, etc. b) Movilidad: (+) si se observa invasin del medio de cultivo a partir de la lnea de inoculacin. (-) slo desarrolla en la lnea de inoculacin.

Caractersticas de los cultivos en medios slidos en placa Cuando se siembra en stos medios podr visualizarse en la superficie masas microbianas separadas entre si, denominadas COLONIAS. Cada colonia es el resultado de la multiplicacin de una clula bacteriana. La evaluacin de las caractersticas macroscpicas de las colonias se lleva a cabo sosteniendo la placa con una mano y observando el desarrollo microbiano en la superficie de las placas de agar. Durante el examen las placas se deben inclinar en distintas direcciones con iluminacin brillante directa, de modo que la luz sea reflejada desde diversos ngulos. Algunos microbilogos utilizan una lupa o un microscopio estereoscpico para ayudarse en la deteccin de colonias minsculas. Las placas de agar sangre se deben examinar tambin al trasluz, empleando iluminacin brillante, a fin de detectar reacciones hemolticas en el agar. A continuacin se enumera las caractersticas comnmente observadas en las colonias, tiles para una identificacin bacteriana preliminar: a) Tamao: dimetro en mm. b) Forma: puntiforme, circular, filamentosa, amiboide, rizoide, fusiforme. c) Borde: entero, ondulado, lobulado, aserrado, filamentoso, rizado. d) Elevacin: plana, elevada, convexa, umbilicada, etc. e) Superficie: lisa (colonia S), rugosa (colonia R) f) Consistencia: butirosa, viscosa, membranosa, quebradiza, etc. g) Densidad: opaca, translcida, transparente. h) Color: blanco, amarillo, naranja, verde. i) Olor: ftido, zumo de uvas, chocolate quemado.

Objetivo Adiestrar en el reconocimiento de las caractersticas de desarrollo de los microorganismos en los diferentes medios de cultivo.

DISEO EXPERIMENTAL Materiales y Tubos con caldo nutritivo, agar nutritivo y agar semislido sembrados con cepas microbianas. y Placas con agar nutritivo, agar Mac Conkey y agar manitol hipertnico Lupas y estereoscopios. Procedimiento 1. Examine los cultivos en medio lquido teniendo cuidado de no agitarlos y aprecie las caractersticas desarrolladas: a) Cantidad de crecimiento, b) Distribucin del crecimiento , c) olor, d) Color. 2. Examine los cultivos en medio slido inclinado y aprecie las caractersticas desarrolladas: a) Cantidad, b) Forma de crecimiento, c) Consistencia del cultivo, d) Cromognesis. 3. Examine los cultivos en medios semislidos y aprecie las caractersticas desarrolladas: a) Desarrollo a lo largo de la lnea de inoculacin, b) Movilidad. 4. Examine los cultivos en medios slidos en placa y aprecie las caractersticas de las colonias desarrolladas: a) Tamao, b) Forma, c) Borde, d) Elevacin, e) Superficie, f) Consistencia, g) Densidad, h) Cromognesis, i) Olor. 5. Examine los cultivos en agar sangre e identifique los patrones hemolticos de las colonias de las bacterias sembradas. 6. Examine los cultivos en agar Mac Conkey observe las colonias de las bacterias seleccionadas y diferencie las fermentadoras de las lactosa de los no fermentadoras. 7. Examine los cultivos en agar manitol hipertnico observe las colonias de las bacterias seleccionadas y diferencie las fermentadoras del manitol de las no fermentadoras.

Resultados y/o observaciones 1. Descripcin de los cultivos en caldo nutritivo ____________________________________________________________________________ ESPECIE BACTERIANA Cantidad Olor Turbidez Pelcula Sedimento ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________

2. Descripcin de los cultivos en agar nutritivo inclinado ____________________________________________________________________________ ESPECIE BACTERIANA Cantidad Forma Crecim. Consistencia Color ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________

3. Descripcin de los cultivos en agar semislido ____________________________________________________________________________ ESPECIE BACTERIANA Desarrollo Movilidad ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ 4. Descripcinde las colonias en agar nutritivo en placa ____________________________________________________________________________ ESPECIE BACTERIANA Tamao Forma Borde Elevacin Consistencia Color ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________

5. Descripcin de las colonias en agar Mac Conkey ____________________________________________________________________________ ESPECIE BACTERIANA Crecimiento Fermentacin de Lactosa Color ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ 6. Descripcin de las colonias en agar manitol hipertnico ____________________________________________________________________________ ESPECIE BACTERIANA Crecimiento Fermentacin del manitol Color ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ Cuestionario 1. De donde se obtiene el agar y cul es su punto de fusin y solidificacin?

2. Que porcentaje se usa de gelatina para solidificar los medios de cultivo? Cules son las desventajas frente al agar?

6. Mencione 4 enterobacterias lactosa (+) y 4 enterobacterias lactosa (-) Lactosa + Lactosa

a) b) c) d)

a) b) c) d)

FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO


INTRODUCCIN Actualmente, las nicas formas de vida existentes en determinados ambientes extremos son exclusivamente procariticas. Desafiando a nuestras ideas preconcebidas de lo que es la vida "normal", encontramos extraordinarios seres vivos unicelulares viviendo a pH muy cidos o muy alcalinos, o reproducindose a temperaturas de ms de 100C y a grandes presiones. Hasta ahora hemos venido considerando el crecimiento de las bacterias en funcin de su fondo gentico, en relacin con los nutrientes, y en unas hipotticas condiciones ideales (ptimas). Sin embargo, el trabajo experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales, es decir, una serie de agentes fsicos y qumicos que 1. modifican la velocidad de crecimiento, provocando cambios que, a determinados valores de dichos factores pueden llegar a ocasionar la muerte de microorganismos; 2. condicionan la distribuicin de los microorganismos en sus ecosistemas y hbitats naturales; 3. permiten a los humanos controlar el crecimiento microbiano, a travs de la mutagnesis, la esterilizacin y desinfeccin y la quimioterapia. No todos los microorganismos toleran del mismo modo un determinado factor ambiental. As, unas determinadas condiciones pueden ser nocivas para una especie bacteriana, y en cambio ser neutras o beneficiosas para otra. Temperatura La temperatura es uno de los factores ambientales ms importantes que influyen en el crecimiento y en la supervivencia de los microorganismos, afectndolos en cualquiera de los dos sentidos. La temperatura mnima influye en funcin de: a) un descenso de la fluidez de la membrana de modo que se detienen los procesos de transporte de nutrientes y el gradiente de protones, b) un aumento de la viscosidad del citoplasma, c) un debilitamiento de los enlaces hidrfobos de las protenas (debido a cambios fsicos en la estructura del agua de solvatacin) que provoca la inactivacin de enzimas alostricos y de actividad funcional de los ribosomas. En muchos casos los polisomas no se ensamblan. Por encima de la temperatura mnima la tasa de crecimiento va aumentando proporcionalmente hasta alcanzar la temperatura ptima, debido a que las reacciones metablicas

catalizadas por enzimas se van aproximando a su ptimo. En dicha temperatura ptima las enzimas y reacciones se dan a su mxima tasa posible. A partir de la temperatura ptima, si seguimos subiendo la temperatura se produce un descenso acusado de la tasa de crecimiento hasta alcanzar la temperatura mxima. Dicha temperatura refleja: a) desnaturalizacin e inactivacin de protenas enzimticas esenciales, b) colapsamiento de la membrana citoplasmtica, c) lisis trmica de la bacteria.

pH Los microorganismos pueden crecer en una variada gama de pH que va desde pH = 2 para los acidfilos hasta pH = 11 para alcalfilos. En general los microorganismos que toleran pH cidos no toleran pH alcalinos y viceversa. Independientemente del pH que pueda soportar un microorganismo, es importante conocer cul es el pH ptimo para el crecimiento. De la misma surge claramente que en general los hongos tienen un pH ptimo cercano a 5 mientras que para bacterias se da alrededor de pH = 7. Durante el crecimiento los microorganismos modifican el pH del medio de cultivo, normalmente hacindolo disminuir; por tal motivo es frecuente incluir en el medio substancias que acten como tampon (buffer) a fin de evitar que el pH se aleje del ptimo. Cambios por fuera del rango permisible tiene como consecuencia variaciones en las constantes de ionizacin de los componentes celulares que inhiben o destruyen el desarrollo del microorganismo.

Presin osmtica La membrana plasmtica, selectivamente permeable, separa a los microorganismos de su ambiente, por ello, stos pueden verse afectados por cambios en la concentracin osmtica del medio. Es decir, cualquier cambio drstico en la concentracin de solutos presentes en la fase acuosa

de una preparacin, puede ocasionar la lisis o la deshidratacin de los microorganismos. El soluto utilizado dentro de la clula para el ajuste de la actividad de agua (aw) citoplasmtica no debe inhibir los procesos bioqumicos dentro de ella. Gases Los gases que afectan el desarrollo microbiano son el oxgeno y el CO2. La necesidad de la presencia de estos gases dependern de las caractersticas fisiolgicas de los microorganismos; su presencia, ausencia y/o concentracin favorecern o inhibirn su crecimiento. En los microorganismos aerobios la obtencin de energa est ligada a la presencia de oxgeno. En efecto, ste es aceptor final de los electrones provenientes de la cadena de citocromos donde se genera abundante ATP (adenosina trifosfato). Las molculas de ATP aportarn luego la energa necesaria para las reacciones de sntesis con las que el organismo se "fabricar" a s mismo, y la requerida para el mantenimiento celular. Objetivo Demostrar la accin de los factores ambientales sobre el crecimiento de los microorganismos: temperatura, pH, presin osmtica y necesidad de gases. DISEO EXPERIMENTAL A.EFECTO DE LA TEMPERATURA Material