Virologia Tema 12345

MICROBIOLOGIA VETERINARIA II
Caractersticas generales, estructura y taxonoma viral

TEMATICA Generalidades Estructura viral Taxonoma viral Glosario Generalidades Los virus son mucho ms pequeos que las clulas procariontes o eucariontes En general, a diferencia de las clulas, los virus tienen una estructura simple y esttica No tienen un sistema metablico propio. Dependen de la maquinaria de la clula hospedera para su replicacin (parsitos intracelulares estrictos) Tienen genomas de ADN o ARN , pero carecen de ribosomas y otros factores necesarios para la traduccin de protenas. As pues, dependen de la clula hospedera para la produccin de protenas virales. Sus genomas codifican informacin mnima para asegurar lo siguiente: 1) replicacin del genoma y empaquetamiento 2) produccin de protenas virales 3) subvertir funciones celulares para permitir la produccin de viriones. Algunos virus (bacterifagos) infectan clulas procariontes, mientras que otros infectan clulas eucariontes. Algunos virus destruyen las clulas, produciendo enfermedad; otros persisten en estado latente o persistente en la clula infectada; y otros pueden causar transformacin maligna de las clulas a las que infecta. Estructura viral Los virus se componen, al menos, de un genoma de cido nucleico ADN o ARN y una cubierta de protenas. Muchos virus tienen adems una membrana externa llamada envoltura. La cubierta proteica o cpside de un virin (virus completamente ensamblado o partcula viral) est compuesta de mltiples copias de uno o ms tipos de protenas. Estas protenas se ensamblan, formando unidades estructurales llamadas capsmeros. Al cido nucleico ms la cubierta o cpside de una partcula viral es frecuentemente llamada nucleocpside
MSc. Germn Gaitn Mendoza
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Los virus ms simples son aquellos que carecen de envoltura y tienen ADN o ARN de cadena sencilla (Fig. 1.1).
Los virus envueltos contienen una membrana externa que rodea a la nucleocpside (Fig.1.2). La envoltura viral se deriva de membranas de la clula hospedera (nuclear, de aparato de Golgi, de retculo endoplsmico o membrana plasmtica). Tal como estas membranas, la envoltura viral se compone de una bicapa lipdica con protenas insertadas en ella, protenas que son codificadaspor el virus. Algunos virus, como los bacterifagos, tienen colas proteicas complejas que se requieren para el anclaje y/o la penetracin del ADN viral en la clula hospedera susceptible.
Figura 1-1. Virin no envuelto con cpside icosahdrica. El cido nucleico est en el interior de la cpside.
Figura 1-2. Virin envuelto con cpside helicoidal. El cido nucleico se localiza en el interior del virin como indica la lnea punteada en forma de espiral. Las lneas en la superficie exterior de la envoltura representan espculas glicoproticas. Genoma viral
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El genoma viral est compuesto por ADN o ARN. Un virus no contienen ADN y ARN simultneamente. El ADN puede ser de una sola cadena (ss por sus siglas en ingls) (parvovirus y circovirus), de doble cadena (ds por sus siglas en ingls) (polyomavirus, adenovirus, herpesvirus), o parcialmente de doble cadena (hepadnavirus). El genoma de ADN puede tener sus extremos covalentemente ligados el uno al otro (circular = polyomavirus, circovirus) o no estar unido por sus extremos (lineal = adenovirus, herpesvirus, parvovirus). El genoma de los virus de viruela (poxvirus) es ssADN cuyos extremos estn covalentemente unidos uno al otro. Todos los genomas virales de ARN son lineales. La mayora de estos son cadena sencilla y unos pocos son de cadena doble (reovirus, bornavirus). La mayora de los virus de ARN tienes sus genomas en una sola pieza (monopartita) mientras que otros lo tienen dividido en 10 segmentos (reovirus), 7 u 8 segmentos (ortomyxovirus), tres segmentos (bunyavirus) y dos segmentos (arenavirus). En cuanto a ssARNs, hay dos posibilidades importantes de secuencia: Si el ssARN funciona como mensajero para la traduccin de protenas (tiene la misma orientacin que el mARN), se le llama sentido positivo. En contraste, si el ARN viral es antisense (o complementario) a ese mARN y entonces no puede ser traducido directamente - se dice que es sentido negativo. En algunos virus (Arenavirus y Bunyavirus) se transcriben porciones del genoma de ARN, generando ARNs mensajeros que son entonces traducidos. La copia de estos mARNs (complementaria, supuestamente ARNs sentido negativo) puede ser tambin traducida. Este arreglo es nico entre los virus, y se dice que es ambos sentidos (ambisense). Los genes contenidos dentro del genoma pueden codificar desde unos pocos productos gnicos diferentes (Polyomavirus, 6 - 7 genes, 5000 nucletidos de longitud) hasta ms de 70 - 100 productos gnicos diferentes (Herpesviridae, 60 a 120 genes, 120,000- 220,000 pares de bases de nucletidos de longitud). En general, los genomas de los virus ARN son ms pequeos, con un tamao mximo de 30,000 nucletidos como se ve en los Coronavirus. Una hiptesis para esto es que las polimerasas ARN virales tienden a cometer ms errores que las polimerasas ADN. As, la fidelidad de la replicacin puede limitar el tamao. En contraste, los genomas de virus de ADN pueden alcanzar un tamao de hasta 300,000 nucletidos, como se ve en algunas especies de Herpesvirus. La cpside La funcin de la cpside es proteger el genoma viral durante su transferencia de clula a clula. La cpside puede estar hecha de mltiples copias de una sola protena o de una asociacin de varias protenas diferentes. Las cpsides hechas de mltiples copias de una sola protena representan un buen ejemplo de economa, ya que un solo gene puede codificar los productos necesarios para cubrir con la cpside el genoma completo. La cpside de un virus puede tener diferentes formas geomtricas que son caractersticas de varias familias virales. Estas incluyen: 1. Icosadrico desnudo (picornavirus, polyomavirus) o envuelto (herpesvirus). Esta figura geomtrica tiene varias caras triangulares y esquinas; el nmero de caras y esquinas puede variar de acuerdo al nmero y tipo de asociacin entre las protenas estructurales (unidades). 2. Estructura helicoidal, desnudo (virus del mosaico del tabaco) o envuelto (virus de la rabia). 3. Complejos, que tienen una mezcla de arreglos (por ejemplo, bacterifagos, virus de viruela).
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Los virus varan en tamao, desde los circovirus con 17 - 22 nm de dimetro, hasta los virus de viruela o poxvirus que alcanzan los 300 nm. Estos virus tienen forma de ladrillo u ovoide y son suficientemente grandes como para ser vistos con microscopio ptico, no como los otros virus para cuya visualizacin es necesario el uso de microscopio electrnico. Se han utilizado varias tcnicas para la visualizacin de los virus. La cristalografa de rayos X es un medio para determinar su estructura fsica, as como las dimensiones de las protenas individuales y componentes virales. La informacin obtenida por esta tcnica se usa luego para "construir" (un modelo) de la estructura total de la partcula viral. La microscopa electrnica se usa para generar informacin en torno a la forma general de los virus, y se usa tambin con fines diagnsticos a travs de la deteccin de partculas virales en especmenes o muestras clnicas. Cinco formas estructurales bsicas De acuerdo a su morfologa bsica, y tal como se mencion anteriormente, hay cinco estructuras virales bsicas diferentes. Estas formas, con ejemplos, se enlistan a continuacin: 1. icosadrico desnudo - adenovirus y picornavirus.
2. helicoidal desnudo - virus del mosaico del tabaco; no se conocen virus de humanos o de animales que tengan esta estructura. 3. 4. 5. Envolturas virales La envoltura viral, caracterstica de algunas familias virales, se deriva de membranas de la clula hospedera por protrusin de yemas, lo cual ocurre durante la liberacin de viriones de la clula (infectada). Esta membrana es frecuentemente una porcin de la membrana plasmtica, sin embargo puede ser parte del aparato de Golgi, del retculo endoplsmico o de la membrana nuclear, dependiendo del tipo de virus y del compartimiento celular donde la replicacin se lleva a cabo. Independientemente de su origen, la membrana se compone de una bicapa lipdica - de origen celular con protenas asociadas. Estas protenas asociadas con la bicapa lipdica son principalmente de origen viral (codificadas por el virus) y son en su mayora glicoprotenas. El nmero de protenas virales en la envoltura puede variar desde una hasta ms de diez, dependiendo del virus. Las glicoprotenas de la envoltura viral llevan a cabo varias funciones, incluyendo el anclaje inicial del virin a la clula blanco, penetracin, fusin y diseminacin de una clula a otra, entre otros. El anclaje del virin a la superficie celular requiere que la envoltura est intacta y las glicoprotenas tengan su conformacin nativa. Los frmacos antivirales estn dirigidos contra las protenas de la envoltura y pueden disminuir la habilidad del virus para anclarse e iniciar la infeccin, disminuyendo as la infectividad. El proceso de protrusin de yemas, y la consecuente adquisicin de la envoltura por los viriones recin formados, puede o puede no resultar en la muerte de la clula hospedera. Si son liberados muchos viriones simultneamente, la integridad de la membrana celular puede estar suficientemente comprometida como para conducir a la muerte celular. De manera alternativa, la liberacin de los viriones puede ser lenta, resultando en una excrecin crnica e infecciones persistentes. De hecho, a diferencia de la liberacin de virus no envueltos, que se lleva a cabo principalmente a travs de la lisis y muerte celular; el egreso de virus envueltos frecuentemente es compatible con la supervivencia de la clula. Por tanto, el fenmeno de protrusin de yemas provee de un medio de liberacin viral sin conducir a la muerte celular. Protenas Virales hay dos tipos bsicos de protenas codificadas por los virus: estructurales y no estructurales. icosadrico envuelto - togavirus y flavivirus. helicoidal envuelto - rhabdovirus y paramyxovirus. complejos - bacterifagos y virus de viruela.
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Las protenas estructurales son aquellas que son parte de la estructura fsica del virin (cpside, envoltura) , mientras que las protenas no estructurales se producen dentro de la clula infectada y juegan diferentes papeles en los pasos de replicacin viral. El nmero de protenas codificadas por los genomas virales vara enormemente, desde tan pocas como dos protenas, hasta cientos de ellas. Tpicamente las protenas estructurales son aquellas que componen la cpside y que empaquetan el cido nucleico del genoma viral. En algunos virus envueltos hay una capa proteica entre la cpside y la envoltura (el tegumento). Las protenas que forman el tegumento tambin son protenas estructurales. Las protenas de la estructura externa de la cpside o envoltura son ligandos, que interactan con receptores en la superficie de la clula blanco. Algunas de estas protenas (glicoprotenas) se procesan en el lumen del retculo endoplsmico rugoso, donde se aaden oligosacridos a la cadena polipeptdica. Estas protenas son enviadas al aparato de Golgi, a las vesculas secretoras, y finalmente se fusionan con la membrana plasmtica hacindose presentes sobre la superficie de la clula infectada. Esto es especialmente importante para los virus envueltos. Las glicoprotenas de la envoltura juegan papeles en la mediacin de la interaccin entre los viriones y las clulas (anclaje, penetracin, fusin, diseminacin de una clula a otra) y son los blancos principales de los anticuerpos neutralizantes. Las protenas no estructurales son principalmente, pero no exclusivamente, enzimas como aquellas asociadas con el proceso de transcripcin del genoma, replicacin y procesamiento de protenas. Un ejemplo de protenas no estructurales es la trancriptasa reversa de los retrovirus, que hace copias de ADN a partir de un molde de ARN. Este paso es una caracterstica importante de los retrovirus cuyo ARN necesita ser convertido a ADN para ser incorporado al cromosoma del hospedero. Algunos virus codifican varias protenas no estructurales que juegan diversos papeles accesorios en la regulacin de la expresin gentica celular y viral, regulacin de diferentes pasos del ciclo viral, neutralizacin de la defensa del hospedero, transformacin celular, etctera. Otros componentes virales Lpidos Los lpidos de los virus se derivan de las membranas celulares de la clula hospedera. stos son en su mayora fosfolpidos (50 - 60%) y el resto es colesterol. Como consecuencia de que se derivan de la clula hospedera, su composicin lipdica vara. La bicapa lipdica de la membrana de la clula hospedera que rodea al virin de los virus envueltos, tambin posee protenas virales y glicoprotenas, como las espculas caractersticas de algunos virus envueltos. La composicin lipdica global de los virus envueltos representa aproximadamente el 25 - 30% de su peso seco. El resto se divide entre la porcin del cido nucleico y la porcin proteica. Carbohidratos Los carbohidratos virales estn presentes tpicamente como los residuos de oligosacridos de las glicoprotenas, glicolpidos y mucopolisacridos. La composicin de los carbohidratos corresponde a aquella de la clula hospedera. Sin embargo las glicoprotenas frecuentemente tienen un enlace N- u Oglucosdico. Los carbohidratos virales se encuentran principalmente en la envoltura. Algunos de los virus ms grandes y complejos contienen glicoprotenas internas o protenas glicosiladas en la cpside. Taxonoma viral Los virus constituyen un grupo numeroso y heterogneo. Se clasifican en categoras taxonmicas jerrquicas basadas en muchas caractersticas. La clasificacin es dinmica ya que continuamente se van descubriendo nuevos virus y se acumula nueva informacin sobre virus ya conocidos. La clasificacin y nomenclatura usadas en este documento esta actualizada hasta el momento de ser
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escrito. Los cambios ms recientes aparecen en informes del Comit Internacional de Taxonoma Viral (ICTV por sus siglas en ingls) , sptima edicin (Disponible en amazon.com). El esquema bsico de clasificacin jerrquica es: Orden - Familia - Subfamilia Gnero - Especie - Cepa / Tipo. Ciertas caractersticas virales, referidas ms adelante, definen cada una de estas categoras taxonmicas. Las rdenes tienen el sufijo -virales, las familias tienen el sufijo -viridae, mientras que los gneros contienen el sufijo -virus. Una especie viral est constituida por un linaje replicante que ocupa un nicho ecolgico, por ejemplo una enfermedad en particular. Los virus se clasifican en familias con base en muchas caractersticas. Una caracterstica bsica es el tipo de cido nucleico (ADN o ARN) y la morfologa, esto es, el tamao y forma del virin as como la presencia o ausencia de una envoltura. Tambin se usan el rango de hospederos y las propiedades inmunolgicas del virus (serotipos). Tambin se usan en la clasificacin las propiedades fsicas y fisicoqumicas como masa molecular, densidad de flotacin, inactivacin trmica, estabilidad al pH y sensibilidad a varios solventes. Algunos aspectos importantes de la taxonoma actual de los virus son si su material gentico es ADNA o ARN, si es de cadena sencilla o doble, la organizacin de su genoma y la presencia de ciertos genes. Todo lo anterior se utiliza para ubicar a los virus en rdenes o familias particulares. Por ejemplo, el orden Mononegavirales estcompuesto por aquellos virus que poseen genoma de cadena sencilla de ARN con orientacin negativa. Finalmente, la clasificacin se basa en las macromolculas producidas (protenas estructurales y enzimas), propiedades antignicas y propiedades biolgicas (por ejemplo, acumulacin de viriones en las clulas, infectividad, hemoaglutinacin). Las Familias virales se enlistan en la tabla de contenidos bajo varias categoras de sus cidos nucleicos. Las familias se presentan en el libro usando el mismo orden en el que aparecen en esta lista. Partculas atpicas asociadas con infecciones Virus defectuosos Los virus defectuosos son aquellos cuyo genoma carece de un gen o genes especficos, debido a mutacin o delecin. Como resultado de lo anterior, los virus defectuosos no son capaces de llevar a cabo un ciclo de vida productivo en las clulas. Sin embargo, si la clula infectada con el virus defectuoso est co-infectada con un "virus ayudante" el producto del gen que carece el virus defectuoso es complementado por el virus ayudante, y el virus defectuoso puede replicarse. Es interesante que, para algunos virus, durante la infeccin se produce una mayor cantidad de viriones defectuosos que de viriones infecciosos (tanto como 100:1). La produccin de partculas defectuosas es caracterstica de algunas especies virales y se cree que modera la severidad de la infeccin/enfermedad in vivo. Los virusoides, que son ejemplo de virus defectuosos, se discutirn ms adelante en esta seccin. Pseudoviriones Los pseudoviriones pueden ser producidos durante la replicacin viral cuando el genoma del hospedero se fragmenta. Como resultado de este proceso algunos fragmentos del ADN del hospedero se incorporan en la cpside en lugar del ADN viral. Entonces, los pseudoviriones poseen la cpside viral a la cual los anticuerpos pueden unirse y facilitar el anclaje y penetracin en la clula hospedera, pero no pueden replicarse una vez que logran el acceso a la clula, debido a que no tienen ninguno de los genes virales esenciales para el proceso de replicacin. Priones
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Aunque no son virales, los priones son partculas proteicas infecciosas asociadas con encefalopatas espongiformes transmisibles (TSE por sus siglas en ingls) de humanos y de animales. TSE incluye la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob en humanos, "scrapie" en ovejas y encefalopata espongiforme bovina. En el anlisis a la necropsia, el cerebro presenta grandes vacuolas en las regiones de la corteza y del cerebelo, por lo que la enfermedad causada por priones se llaman "encefalopatas espongiformes". Una examinacin ms detallada del tejido cerebral revela la acumulacin de fibrillas y placas amiloideas asociadas con protenas de priones. Estas enfermedades se caracterizan por la prdida del control motor, demencia, parlisis, desgaste y eventualmente la muerte. Los detalles de la patogenia son en su mayora desconocidos. Viroides Los viroides son cidos nucleicos de bajo peso molecular, desnudos, extremadamente resistentes al calor, a la radiacin ultravioleta y la radiacin ionizante. Estas partculas se componen exclusivamente de una pieza de ARN circular de cadena sencilla, con algunas regiones de cadena doble. Los viroides causan en su mayora enfermedades de plantas, como la enfermedad del tubrculo ahusado de la papa. Virusoides Los virusoides (tambin llamados ARN satlites) son similares a los viroides en el sentido de que son cidos nucleicos desnudos, de bajo peso molecular, extremadamente resistentes al calor y a las radiaciones ultravioletas y ionizantes. Sin embargo, dependen de un virus ayudante para la replicacin. Los virusoides se replican en el citoplasma de la clula a travs de una polimerasa ARN dependiente de ARN. Nueva familia viral Mimiviridae Mimiviridae es una familia viral que contiene un miembro, Mimivirus. El nombre de Mimivirus se deriva de "microbio imitador". Fue descubierto en 1992 dentro de un protozoario y, a la fecha, es el virus conocido de mayor tamao, alrededor de 400 nm de dimetro. La cpside es de forma icosahdrica, el virin carece de envoltura y su genoma es de ADN circular de cadena doble (dsADN), de 1.2 Mb de longitud y con1,260 genes. La secuencia del genoma de Mimivirus fue publicada en el ao 2004. Glosario Bacterifago: Un virus que infecta clulas procariontes y tiene muchos de los atributos de los virus de plantas y animales. Requiere una bacteria viva para llevar a cabo su ciclo reproductivo. Protrusin de yemas: A travs de este proceso los virus envueltos adquieren su envoltura. Es precedido por la insercin de glicoprotenas virus-especficas en la membrana celular del hospedero. Este proceso ocurre ms frecuentemente en la membrana plasmtica y confiere infectividad. Mucopolisacrido: Una clase de polisacrido (glucoaminoglicanos) como heparina, cido hialurnico y sulfato de condroitina, que absorben agua para formar un material espeso mucoide, gelatinoso. Oligosacrido: Una azcar que contiene un nmero pequeo y conocido de unidades de monosacridos.
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Cultivo y caracterizacin de virus

Temtica 3 Mtodos de propagacin viral Concentracin y purificacin de virus Infectividad y almacenamiento Visualizacin de virus Cuantificacin directa de virus Cuantificacin indirecta de virus Mtodos miscelneos usados para caracterizacin Glosario Se han desarrollado mtodos para el almacenamiento, visualizacin, cuantificacin (directa e indirecta) y propagacin de virus. Tambin hay mtodos para el diagnstico de laboratorio de enfermedades virales, muchos de los cuales son mtodos serolgicos, basados en la deteccin de la respuesta del hospedero a la infeccin. A lo largo del tiempo, fue posible observar que el contagio de ciertas enfermedades era capaz de pasar a travs de filtros que las bacterias no podan pasar. Los filtrados obtenidos no eran capaces de crecer en medios de cultivos para bacterias, y eventualmente se demostr experimentalmente que eran infectivos y que contenan virus. A excepcin de los virus de viruela, los virus no pueden ser observados con microscopio ptico. Eventualmente los virus fueron observados con microscopio electrnico. Algunos de los mtodos importantes usados en los estudios bsicos de virus se describen a continuacin. Tal como se mencion en el captulo anterior, los virus animales presentan una considerable diversidad en sus caractersticas fsicas. La caracterstica que ms refleja las propiedades del virin es la presencia o ausencia de la envoltura viral. Los virus no envueltos son, en general, sensibles a la radiacin ultravioleta, relativamente termoestables y susceptibles al dao por los cristales de hielo. Debido principalmente a la presencia de la envoltura de membrana, los virus envueltos se inactivan con solventes lipdicos (como cloroformo y ter) y detergentes (como el desoxicolato), son sensibles a la radiacin gama y ultravioleta, relativamente termolbiles y el dao que les produce la formacin de cristales de hielo es ms extenso que el que se produce en los virus no envueltos o desnudos.

Mtodos de propagacin viral Para aislar, caracterizar e identificar virus, as como para producir vacunas virales, se necesita una cantidad considerable de partculas virales. Esto se logra a travs de diferentes mtodos de propagacin, los cuales se enlistan a continuacin:
Hospederos animales
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En el pasado, la propagacin de virus en organismos hospederos susceptibles no infectados era la nica manera de obtener grandes cantidades de virus. Actualmente el uso de animales experimentales como hospederos para propagacin viral est limitado por razones ticas. La propagacin viral en animales es ms til para aquellos virus que no crecen fcilmente en cultivos celulares. Por ejemplo: cepas vacunales del virus de la enteritis hemorrgica de pavo pueden ser propagadas tanto en aves vivas como en cultivos celulares. Sin embargo los productos propagados en bazo (de aves vivas) parecen ser ms usados que los propagados en cultivo. Para fines diagnsticos la inoculacin de animales es un medio para detectar virus en muestras clnicas, como el virus de la rabia en ratones lactantes.
Huevos embrionados
Antes del desarrollo de las tcnicas de cultivo de clulas y de tejidos, el uso de huevo embrionado para propagacin viral fue una de las primeras alternativas al uso de organismos animales hospederos. El huevo embrionado es an el mtodo preferido para la propagacin de virus de influenza tipo A y para muchos otros virus aviares. El huevo embrionado tambin es til en la diferenciacin de algunos virus que producen lesiones similares, como los virus de la viruela de la vaca y los virus de la pseudo viruela de la vaca. Aunque el virus de la enfermedad de la lengua azul (BTV) es un virus de mamferos, se replica bien en huevo embrionado, por lo que este sistema se usa para propagacin viral con fines diagnsticos y de investigacin. Cuando se usa huevo embrionado, uno debe considerar la posible presencia de anticuerpos maternos (IgY) en el saco vitelino del huevo. Por lo tanto, frecuentemente es preferible obtener huevo embrionado de parvadas libres de patgenos especficos (SPF). El dar pases en embrin de pollos es til en la atenuacin de ciertos virus para vacunas de virus vivo modificado.
Cultivo de clulas/tejidos
El cultivo de tejidos se refiere al crecimiento y mantenimiento de clulas de tejidos vivos in vitro. Hay bsicamente dos tipos: cultivo de explantes y cultivo de clulas. Los explantes son pequeos fragmentos de tejidos del hospedero que se mantienen en cultivo, mientras que el cultivo de clulas se obtienen mediante de la disgregacin de diferentes tejidos del hospedero en clulas individuales. La mayora de los sistemas usados en virologa son en realidad cultivos celulares y no cultivos de tejidos, aunque ambos trminos se usan de manera indistinta. Los cultivos celulares se subdividen a su vez en cultivos primarios, cultivos semi-continuos y cultivos continuos.
Cultivo de explantes
Estos son cultivos de pequeos fragmentos de tejidos especficos, tomados directamente del hospedero animal. Los cultivos de explantes son tiles para el aislamiento viral y se requieren para el aislamiento de algunos coronavirus. La demostracin de latencia de algunos alfa herpesvirus humanos y animales puede requerir explantes de ganglio nervioso sensitivo (por ejemplo, trigmino).
Cultivos celulares primarios
Estos se derivan de tejidos frescos que han sido digeridos enzimticamente con tripsina u otras proteasas, para liberar clulas individuales. Como resultado, con frecuencia los cultivos primarios estn compuestos de muchos tipos celulares
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diferentes. En condiciones in vitro las clulas de los cultivos primarios raramente pueden dividirse, o se dividen a una velocidad muy baja. Es por esto que tienen un tiempo de vida limitado, conocido como lmite de Hayflick. A pesar del tiempo de vida limitado de los cultivos primarios, son ideales para el aislamiento de algunos virus. Los cultivos primarios raramente sobreviven ms all del vigsimo pase in vitro.
Cultivos semi-continuos
Son tambin conocidos como lneas celulares diploides, debido a que contienen el cromosoma diploide normal caracterstico de la especie de la que ellos se derivan. Los cultivos semi-continuos son cultivos primarios que tienen algunas clulas que pueden ser cuidadas para sobrevivir ms all del lmite de Hayflick. Los cultivos semicontinuos tienden a morir entre el 30 y el 50 pase in vitro. A pesar de esta limitante, los cultivos semi-continuos son tiles en la propagacin de una gran variedad de virus. Los cultivos semi-continuos son por lo general de fibroblastos.
Cultivos celulares continuos
Se les conoce tambin como lneas celulares heterodiploides, debido a que poseen un nmero anormal de cromosomas. Estos cultivos se derivan de tejidos normales o neoplsicos y se caracterizan por su habilidad para ser propagados in vitro indefinidamente. De manera general, las lneas celulares continuas no son tan sensibles como las otras para propagacin viral. Sin embargo, facilitan la propagacin a gran escala de algunos virus para vacunas e investigacin. Muchas lneas continuas estn disponibles de proveedores como la Coleccin Americana de Cultivos Tipo (ATCC por sus siglas en ingls). La mayora de los laboratorios de virologa almacenan en congelacin alcuotas iniciales de sus cultivos continuos, debido a que las lneas celulares que estn continuamente en cultivo pueden sufrir cambios en sus caractersticas celulares. Las causas de estos cambios pueden ser infeccin por Micoplasma spp., o virus contaminantes (por ejemplo, circovirus porcino y virus de la diarrea viral bovina).
Concentracin y purificacin de virus

Una vez que un virus ha sido propagado adecuadamente, necesita ser recuperado de las clulas hospederas y los restos de stas, y luego ser purificado. Esto se logra por varios procesos que involucran centrifugacin diferencial (a diferentes velocidades), dilisis, precipitacin, cromatografa y gradientes de densidad. El paso inicial de este proceso es la centrifugacin diferencial; se usa una velocidad baja (~2,000 x g) para quitar restos celulares y a para concentrar se usa a continuacin, en el caso de volmenes pequeos, una velocidad alta de centrifugacin (40K a 80K x g) y en el caso de volmenes mayores, se usa dilisis y precipitacin o precipitacin con metanol fro (-70C) o con polietilenglicol. La purificacin se lleva a cabo mediante cromatografa o centrifugacin usando gradientes de densidad. Los virus envueltos pueden ser purificados aprovechando su velocidad de sedimentacin en gradientes de sacarosa. Los virus desnudos pueden ser purificados por centrifugacin a travs de gradientes de cloruro de cesio.
Infectividad y almacenamiento
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Infectividad
La infectividad es la habilidad de la partcula viral para infectar una clula hospedera. La temperatura en el exterior de la clula hospedera afecta fcilmente la capacidad del virus para conservar su infectividad, particularmente en el caso de los virus envueltos. Debido a que los virus no tienen actividad metablica propia, la infectividad es el mejor medio para evaluar la integridad de la partcula viral despus de que se ha expuesto a cierta temperatura. Las siguientes son consideraciones importantes al respecto: A 60C, la infectividad del virus disminuir rpidamente, en segundos. A 37C, la infectividad disminuir dramticamente, en minutos. A 20C, la infectividad disminuir, en cuestin de horas. La infectividad en las temperaturas antes mencionadas influyen en la transmisin del virus por contacto directo (a 37C) y por fomites (a 20C). A 4C, la infectividad en tejidos se pierde en cuestin de das. Los clnicos deben tener esto en cuenta al considerar los especmenes clnicos. Con frecuencia se usan temperaturas abajo del punto de congelacin para almacenamientos por periodos largos. Lo importante a considerar es mantener al mnimo la formacin de cristales de hielo. Debe mantenerse en mente el hecho de que los virus presentan gran diversidad en su resistencia y labilidad Algunos son capaces de sobrevivir por horas, das, o incluso meses bajo condiciones ambientales, mientras que otros se inactivan en pocos minutos bajo las mismas condiciones. Los tres mtodos principales para almacenar virus son: Congelacin a -70C, con o sin criopreservante. Para almacenamiento por largos periodos: congelamiento en nitrgeno lquido (196C). Liofilizacin con almacenamiento en congelacin o a temperatura ambiente.
Visualizacin de los virus

Los dos mtodos principales usados para visualizar la estructura / morfologa de los virus son: la microscopa electrnica y la microscopa de fuerza atmica. Otros tipos de microscopa se usan para observar cambios inducidos por la replicacin viral en las clulas infectadas. Sin un medio para visualizar los virus es difcil obtener informacin acerca de la estructura o las interacciones clula-virus. Ms an, el visualizar las partculas virales le permite a uno estimar directamente el nmero de partculas (virales) presentes en una suspensin. Hay otros mtodos que le permiten a uno estimar el nmero de virus indirectamente. En cualquier caso, la cuantificacin directa o indirecta es siempre un estimado. Este estimado numrico es importante al preparar vacunas, al determinar el nmero mnimo de viriones necesarios para producir una enfermedad y en procedimientos virales de investigacin.
Microscopa ptica
Si bien la microscopa ptica no es til para la examinacin directa de los virus (con excepcin de los virus de la viruela), es til para observar los efectos de la infeccin
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viral en la clula hospedera. El dao celular o la destruccin causada por el virus es conocida como efecto citoptico (CPE por sus siglas en ingls). Los efectos citopticos que pueden observarse incluyen: 1. Clulas redondeadas y agregados en forma de racimo de uvas, como se observa con adenovirus; 2. Clulas redondeadas, encogidas, lisadas, dejando gran cantidad de restos celulares, como se observa con los enterovirus 3. Clulas agrandadas y redondeadas en reas focales, como con herpesvirus 4. Fusin de clulas que se convierten en clulas multinucleadas (sinsicios) como en el caso de paramyxovirus. Adems es posible observar cuerpos de inclusin, caractersticos de algunos virus.
Microscopa de fluorescencia
La microscopa de fluorescencia puede ser usada para visualizar clulas o tejidos infectados por virus, usando anticuerpos antgeno-especficos marcados con fluorocromos. El anticuerpo se une especficamente a los antgenos virales presentes dentro de las clulas o tejidos y los marca con la molcula fluorescente (generalmente fluorescena). La marca fluorescente se observa posteriormente con un microscopio de luz ultravioleta que excita a la molcula del fluorocromo, lo que uno observa como una zona coloreada sobre un fondo relativamente oscuro. De manera alternativa, la visualizacin puede llevarse a cabo de forma indirecta usando anticuerpos sin marca (como los de sueros convalecientes) seguidos de la aplicacin de anticuerpos marcados con fluorescena que se unen al primer anticuerpo. Los ensayos basados en el uso de anticuerpos fluorescentes son usados comnmente en el diagnstico viral y la investigacin.
Microscopa electrnica
La microscopa electrnica involucra la aceleracin de electrones a un estado de alta energa y el enfoque magntico de los mismos hacia la muestra. Los electrones de alta energa tienen longitudes de onda muy cortas, proporcionando as una mejor resolucin de estructuras muy pequeas. La microscopa electrnica tiene suficiente poder de resolucin para observar polmeros grandes como ADN y ARN, as como protenas grandes. Para facilitar la visualizacin, las muestras pueden ser cubiertas con metales pesados como osmio, antes de la examinacin con el microscopio electrnico. Los electrones impactan el metal pesado y posteriormente son visualizados en una pantalla fluorescente. La microscopa electrnica proporciona imgenes tridimensionales de viriones y de su localizacin (nuclear o citoplasmtica) dentro de la clula hospedera en un momento dado durante la infeccin. La observacin de viriones en clulas vivas no es posible, debido a que las muestras tienen que ser tratadas con metales pesados.
Microscopa de fuerza atmica

La microscopa de fuerza atmica trabaja a travs de la medicin de una propiedad local (tal como altura, absorcin ptica, magnetismo, etc.) de una sonda puesta muy cerca de la muestra. Esto hace posible tomar mediciones en un rea muy pequea de la muestra. Los electrones son capaces de "atravesar por tnel" entre los tomos, provocando una fuerza pequea pero cuantificable. El resultado de estas mediciones es un mapa detallado del contorno o la superficie de la estructura.
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La ventaja de la microscopa de fuerza atmica es que la preparacin de la muestra es mnima y pueden usarse especmenes vivos. Este mtodo ha sido til para obtener imgenes detalladas de estructuras de cpsides y de interacciones virusclula.
Microscopa inmunoelectrnica
Esta tcnica permite la visualizacin de complejos antgeno / anticuerpo que son especficos para un virus en particular. En este mtodo se obtienen cortes ultra finos (de la muestra) y se incuban con un anticuerpo especfico para el virus. Despus de un paso de lavado, el corte se incuba con Protena A conjugada con partculas de oro (de unrango de 5 a 20 nm). Este conjugado se une a la porcin Fc del anticuerpo y se detecta por microscopa electrnica.
Enumeracin directa de virus

Estimar el nmero de virus tiene una cantidad importante de usos, incluyendo produccin de vacunas e investigacin. La microscopa electrnica se usa para cuantificar las partculas virales en una solucin libre de clulas. Se examina un volumen conocido de la muestra y se cuenta el nmero de viriones. Este nmero se usa para calcular el nmero de virus. Una limitante es que las cpsides vacas, es decir, partculas no infectantes, tambin son contadas. En investigacin, se compara el nmero de partculas infectantes y el nmero total, y se establece una relacin de partculas totales / partculas infecciosas para un virus dado.
Enumeracin indirecta de virus

Los mtodos indirectos de cuantificacin viral son aquellos que usan factores asociados con la infectividad (actividad biolgica). Los tres mtodos principales usados para determinar indirectamente concentraciones virales son: ensayos de hemoaglutinacin, ensayos de formacin de placas y el mtodo de la dilucin limitante.
Hemoaglutinacin
Este ensayo se basa en la propiedad que tienen muchos virus envueltos para aglutinar glbulos rojos (RBCs) o (GR). El ensayo se lleva a cabo en una microplaca, aadiendo glbulos rojos a diluciones de la muestra que contiene virus, y observando posteriormente la hemoaglutinacin. Son necesarias muchas partculas virales para cubrir los glbulos rojos y producir hemoaglutinacin. Por ejemplo: se necesitan aproximadamente 104 viriones de influenza por unidad hemoaglutinante (1 unidad de HA). Una unidad de HA se define como la mxima dilucin de la muestra viral que causa hemoaglutinacin completa. La hemoaglutinacin es til en la concentracin y purificacin de algunos virus, y como prueba presuntiva rpida para la presencia de este tipo de virus en fluidos de cultivos celulares infectados y de embriones de pollo. Es especialmente til para probar actividad viral en cultivos celulares infectados con virus hemoaglutinantes que producen un efecto citoptico (CPE) mnimo o no detectable. Tambin pueden ser examinados directamente especmenes clnicos como heces, para buscar actividad hemoaglutinante de partculas virales. Otros ensayos del mismo tipo, en los que se prueba una actividad enzimtica de un virus en particular (como aquellos que producen transcriptasa reversa), pueden ser llevados a cabo de manera similar.
Ensayo de formacin de placas
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Este ensayo involucra la inoculacin de clulas hospederas susceptibles con un virus, y usar su actividad biolgica para estimar el nmero de viriones presentes. En este procedimiento se usan diluciones decimales seriadas del virus para inocular monocapas de clulas hospederas. Despus de un periodo de incubacin en el que se permite la adsorcin del virus a la superficie de las clulas hospederas, la monocapa es cubierta por una capa de un gel compuesto por medio de cultivo para clulas hospederas y agarosa. La presencia del agar evita la diseminacin a gran escala del virus en el cultivo celular, pero permite la diseminacin localizada de clula a clula. Con los virus citopticos la destruccin de las clulas lleva a la formacin de zonas desocupadas llamadas placas, que pueden ser vistas entre las 24 y 72 horas de incubacin. Un clculo que involucra el nmero de placas observadas, el factor de dilucin de la muestra y el volumen de muestra diluida utilizada, da como resultado las unidades formadoras de placa (PFU) por mililitro de muestra.
El mtodo de dilucin limitante
Este ensayo basado en titulacin mide un efecto in vitro sobre las clulas, como el CPE, cuando stas se expone a varias diluciones de la solucin que contiene el virus. Si es posible, se usa una concentracin conocida de un virus de referencia como control positivo. Dependiendo del virus, se hacen diluciones seriadas dobles o diluciones seriadas decimales del material viral y se ponen en contacto con las clulas. El ttulo infectivo (el recproco de la dilucin ms alta que provoca el 50% de CPE en el cultivo infectado) se expresa como TCID50/ml (dosis infectiva 50 cultivo celular). Este ensayo puede usarse con clulas en cultivo, embriones de pollo o incluso con animales de laboratorio.
Mtodos miscelneos usados para caracterizacin

Hay algunos mtodos en virologa que son tiles en la identificacin y clasificacin de virus desconocidos. Algunas de esas tcnicas sern mencionadas brevemente aqu, pero si se usan en el diagnstico de laboratorio de un virus en particular, se explicarn con detalle posteriormente.
Sensibilidad a solventes lipdicos
La sensibilidad de los virus a solventes lipdicos como cloroformo y ter es til en la taxonoma de ciertos virus. Cualquier virus que posea envoltura es susceptible a solventes lipdicos. Todos los virus envueltos de animales, excepto algunos virus de la viruela, son sensibles al ter.
Identificacin del tipo de cido nucleico

Esto se lleva a cabo examinando la sntesis de cido nucleico en la clula, en presencia mde inhibidores de la sntesis de ADN, como la 5-bromo-2-desoxiuridina (BRU). Si se inhibe la sntesis viral como consecuencia disminuir la multiplicacin viral. En el caso de que el crecimiento viral no sea inhibido se presume que al virus contiene ARN.
Anlisis con enzimas de restriccin
Las enzimas de restriccin (RE) son endonucleasas que cortan el ADN de doble cadena en sitios de reconocimiento especficos que son secuencias palindrmicas que van desde cuatro hasta ocho pares de bases de longitud. El anlisis con enzimas de restriccin es particularmente til en la clasificacin de
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"subserotipos" virales, en la diferenciacin de virus vivos modificados vacunales de virus virulentos y en el rastreo epidemiolgico de brotes de enfermedades. Metodolgicamente esta tcnica consiste en tratar el ADN viral con una o varias enzimas de restriccin y luego separar los fragmentos resultantes por medio de electroforesis en geles de poliacrilamida. Los virus de ARN pueden ser analizados de una manera similar haciendo primero el ADN complementario (ADNc) al ARN viral usando la enzima transcriptasa reversa, y luego amplificando este ADNc por el mtodo de PCR.
Hemoadsorcin
Virus envueltos como los ortomixovirus y paramixovirus adquieren su envoltura externa por protrusin de yemas a travs de la membrana celular. Antes de la protrusin, se incorporan a la membrana celular protenas codificadas por el virus (hemoaglutininas). Esas clulas (aquellas a las se incorporaron hemoaglutininas a su membrana) adsorben eritrocitos a su superficie, lo que trae como consecuencia la formacin de focos de hemoadsorcin que pueden ser detectados microscpicamente.
Mtodos inmunolgicos
Los animales infectados con virus responden produciendo anticuerpos especficos. La deteccin y cuantificacin de estos anticuerpos, que reflejan el estado de la enfermedad, son tiles en la planeacin de programas de salud para el hato y estudios epidemiolgicos de los brotes de enfermedades. Si bien la deteccin de anticuerpos es til en el diagnstico de enfermedades tambin, con frecuencia es un proceso tardado que requiere la comparacin de los niveles de anticuerpos en sueros de la fase aguda de la enfermedad y de la convalecencia, sueros que se colectan con 10 a 14 das de diferencia unos de otros. Una estrategia ms rpida es usar anticuerpos especficos anti-virus para detectar antgenos virales directamente en especmenes clnicos. Estos anticuerpos generalmente se obtienen por hiperinmunizacin de conejos o cabras con un virus especfico. De manera alternativa pueden usarse anticuerpos monoclonales, si hay disponibles. Los anticuerpos monoclonales (mAbs) se preparan en ratones primero exponiendo al ratn al antgeno viral, que sensibiliza a las clulas B del bazo. Estas clulas se colectan y se fusionan qumicamente con una lnea celular de plasmocitoma de ratn que secreta IgG. Posteriormente estas clulas hbridas son clonadas y los hibridomas resultantes, que son derivados de una sola clula, se analizan para buscar secrecin de la IgG antiviral especfica. Las clulas del hibridoma seleccionado son inyectadas de regreso por va intraperitoneal al ratn, donde las clulas se multiplican rpidamente y causan la acumulacin de un fluido asctico que contiene una alta concentracin de anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales son especialmente tiles en la tipificacin y subtipificacin de virus. Cuando son acoplados a fluorocromos, los mAbs son muy usados para la deteccin de virus en tejidos. Tambin son usados para la identificacin de virus en muchos estuches diagnsticos comerciales de ELISAs.
Glosario MSc. Germn Gaitn Mendoza Pgina 15
Virus citopticos: Son aquellos que alteran la apariencia microscpica de clulas en cultivo. Estos cambios pueden incluir redondeo de las clulas, fusin celular, desprendimiento celular, produccin de cuerpos de inclusin. Gradientes de densidad: Procedimiento para separar clulas o macromolculas como protenas y cidos nucleicos, generalmente usando centrifugacin a travs de un gradiente de densidad. Este ltimo consiste en una solucin en la que hay un rango de densidades del soluto (generalmente sacarosa o cloruro de cesio), menos concentrado en la superficie y ms concentrado en el fondo. Como resultado de la centrifugacin las clulas o macromolculas se desplazan a travs del gradiente y forman una banda que se ubica donde su gravedad especfica es igual a la densidad del medio. Palndromos: Secuencias que se leen igual en ambas direcciones. La mayora de los sitios de reconocimiento de las endonucleasas de restriccin son palndromos, por ejemplo la secuencia de reconocimiento de EcoR1 (E.coli) es: 5' GAATTC 3', 3' CTTAAG 5'
Interacciones virus-clula y patognesis viral

Indice
Interaccin entre Virus y Clulas Hospederas Patognesis de las Infecciones Virales Glosario Para el entendimiento de la interaccin entre el virus y la clula hospedera es necesario tener conocimiento de la replicacin y la gentica viral. La interaccin a nivel celular y la progresin de una infeccin viral particular determinan la patognesis de la enfermedad y sus manifestaciones clnicas.

Interaccin entre virus y clulas hospederas

La interaccin entre los virus y sus clulas hospederas est ntimamente ligada al ciclo de replicacin viral. Ms an: la interaccin del virus con los componentes y las estructuras celulares durante el proceso de replicacin influye en cmo el virus causa la enfermedad. En total hay cuatro posibles efectos primarios de la infeccin viral a una clula hospedera. La mayora de las infecciones no cusan patologa celular o alteracin morfolgica aparente, sin embargo la replicacin puede causar citopatologa (redondeamiento celular, desprendimiento, formacin de sinsicios, etc.), transformacin maligna o lisis (muerte).
Muerte celular
La muerte celular durante la replicacin viral puede ser causada por diversos factores. El factor ms probable es la inhibicin de la sntesis celular basal de biomolculas tales como protenas. Durante el ciclo de replicacin, el virus induce a la maquinaria celular a fabricar principalmente productos virales, ms que aquellos que la clula fabricara normalmente. Como resultado de esto, la clula sintetiza predominantemente productos virales, y los productos celulares necesarios para la supervivencia de la clula no estn presentes, o lo estn pero en cantidades demasiado bajas como para mantener su viablildad. Adems de la carencia de productos celulares esenciales, este evento resulta en la acumulacin excesiva de productos virales (ARN, ADN, protenas), que pueden ser txicos para las clulas. En
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la fase de liberacin del ciclo de replicacin de algunos virus se estimula la apoptosis de la clula hospedera. En otras instancias la inhibicin de la sntesis de macromolculas celulares causa daos a las membranas de los lisosomas, y por consecuencia la liberacin de enzimas hidrolticas, provocando la muerte celular.
Efectos celulares
Los efectos citopticos (CPE por sus siglas en ingls) son todos aquellos cambios morfolgicos en las clulas provocados por la infeccin viral. Las clulas infectadas algunas veces tienen alterada su membrana celular. Como resultado de esto, la membrana de la clula infectada es capaz de fusionarse con su clula vecina. Se piensa que esta alteracin es el resultado de la insercin, durante el ciclo de replicacin, de protenas virales. El resultado de la fusin es la generacin de una clula multinucleada o sinsicios. La formacin de sinsicios es una caracterstica de numerosos virus envueltos, como los herpesvirus y paramyxovirus. La membrana celular alterada tambin est alterada en lo que se refiere a su permeabilidad, permitiendo la entrada de varios iones, toxinas, antibiticos, etc. Estas clulas multinucleadas son grandes, por lo que algunas veces son llamadas "clulas multinucleadas gigantes". Otro aspecto del efecto citoptico es la alteracin del citoesqueleto, que da lugar al aspecto "redondeado" de las clulas infectadas. En estos casos la clula va a sufrir lisis o va a formar sinsicios. La presencia de CPE en especmenes clnicos puede indicar infeccin viral, y el CPE es usado como base para el ensayo de formacin de placas usado para cuantificacin viral . La infeccin de clulas por algunos virus (por ejemplo virus de viruela y rabia) se caracteriza por la formacin de cuerpos de inclusin en el citoplasma. Los cuerpos de inclusin son reas discretas que contienen protenas o partculas virales. Frecuentemente tiene una apariencia y localizacin caractersticas en la clula infectada, dependiendo del tipo de virus.
Transformacin maligna
En este proceso la infeccin viral da como resultado clulas hospederas que se caracterizan por tener alteraciones en su morfologa, en su control de crecimiento, en sus propiedades celulares y/o bioqumicas. La transformacin maligna y la neoplasia resultante puede ocurrir cuando el genoma viral (o una porcin de ste) se incorpora en el genoma del hospedero, o cuando los productos virales son, por s mismos, oncognicos. Los virus que causan transformacin maligna se conocen como virus tumorales. Se ha demostrado que virus de diferentes familias poseen la habilidad de transformar clulas hospederas. Los virus tumorales no tienen propiedades comunes (forma, tamao, composicin qumica) ms que provocar el desarrollo de malignidad en las clulas que infectan. La transformacin maligna frecuentemente se caracteriza por alterar la morfologa celular. Esto incluye la prdida de su forma caracterstica, y la adopcin de la apariencia redondeada y refrctil descrita para el CPE. Esto es el resultado de la disgregacin de filamentos de actina y la disminucin de la adhesin de la superficie. El crecimiento celular alterado, la caracterstica distintiva de la transformacin maligna, se muestra en clulas infectadas que han perdido la inhibicin por contacto de su crecimiento o movimiento, que tienen disminuidos sus requerimientos de factores de crecimiento de suero, y/o ya no responden a las seales de ciclo celular asociadas con
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crecimiento y maduracin celular (inmortalidad). Algunas de las alteraciones en las propiedades celulares que exhiben las clulas con transformacin maligna incluyen la induccin continua de la sntesis de ADN, cambios cromosomales, aparicin de antgenos de superficie nuevos embrionarios, e incremento de aglutinacin por lectinas. Las caractersticas bioqumicas que frecuentemente se ven alteradas en clulas con transformacin maligna incluyen la reduccin de los niveles de AMP cclico. El AMP cclico es una seal qumica asociada con el ciclo celular y al mantener los niveles reducidos, la clula se divide continuamente. Tambin est involucrado en el incremento de la secrecin del activador plasmingeno (formacin de cogulo), fermentacin para la produccin de cido lctico (conocido como efecto Warburg), prdida de fibronectina, y cambios en los azcares de las glicoprotenas y los glicolpidos.
Oncognesis
Aunque ha sido difcil comprobar la causa-efecto, varios virus de ADN y de ARN se han asociado con transformacin neoplsica. Los virus implicados en la oncognesis o llevan consigo una copia del gen asociado con el crecimiento y la proliferacin celular, o alteran la expresin de la copia del gen que tiene la clula hospedera. Los genes afectados incluyen aquellos que estimulan y aquellos que inhiben el crecimiento celular. Los genes virales que transforman a las clulas infectadas se conocen como oncogenes (genes v-onc), los cules estimulan el crecimiento y la proliferacin descontrolada de la clula. El descubrimiento de los oncogenes llev a descubrir que todas las clulas poseen genes anlogos, llamados proto-oncogenes (genes c-onc), que normalmente estn quiescentes en las clulas y se activan en algn momento del desarrollo. Los proto-oncogenes incluyen productos celulares como factores de crecimiento, factores de transcripcin y receptores de factores de crecimiento. Los virus de ADN asociados con la oncognesis incluyen virus de la enfermedad de Marek (Herpesviridae) y los papillomavirus bovinos, equinos, y orales caninos (Papillomaviridae). Estos virus son tpicamente de cidos nucleicos epismicos circulares (independientes de los cromosomas del hospedero, ms que integrados). Los oncogenes (v-onc) codifican para protenas asociadas con el ciclo de replicacin viral. Los virus ARN asociados con oncognesis incluyen miembros de la familia Retroviridae (por ejemplo virus de leucosis aviar y de leucemia felina). Estos virus integran sus genomas (o una copia de sus genomas) en el cromosoma del hospedero: se conocen como provirus o ADN proviral. La integracin viral es mediada por los extremos terminales del genoma, conocidos como LTRs (repeticiones terminales largas, por sus siglas en ingls). Los LTRs contienen regiones promotoras/ potenciadoras, adems de las secuencias involucradas en la integracin del provirus en el genoma del hospedero. Los Retrovirus pueden causar oncognesis porque codifican oncogenes por s mismos o por alterar la expresin de los oncogenes celulares o proto-oncogenes a travs de la insercin de sus genomas en el cromosoma del hospedero, en un sitio cercano a estos genes.
Sin cambios morfolgicos o funcionales MSc. Germn Gaitn Mendoza Pgina 18
En algunos casos, la infeccin con produccin viral puede ocurrir sin que puedan detectarse cambios en la clula hospedera. Esto se conoce como infeccin endosimbitica. Probablemente depende de las necesidades de replicacin del virus. Es muy probable que el virus requiera que los procesos celulares estn activos para que la replicacin viral se lleve a cabo, y por lo tanto no altera las caractersticas de la clula.
Patognesis de las infecciones virales

La patognesis se define como la generacin y desarrollo de una enfermedad. Las infecciones virales pueden ser agudas, crnicas, latentes o persistentes. El primer paso en el proceso de una enfermedad es la exposicin.
Exposicin y transmisin
La exposicin pude ocurrir por contacto directo con un animal infectado, por contacto indirecto con secreciones / excreciones de un animal infectado, o por vectores mecnicos o biolgicos. La transmisin del virus desde la madre a la descendencia (transplacentaria, perinatal o por el calostro) se conoce como transmisin vertical. La transmisin va cualquier otro mecanismo que no sea de la madre a la descendencia es transmisin horizontal. Puede ocurrir activacin de un virus latente no replicante dentro de un individuo, sin que el agente infeccioso se adquiera de una fuente externa.
Va de entrada
Los virus penetran al hospedero a travs del tracto respiratorio (aerosoles), el tracto digestivo (contaminacin oral-fecal), el tracto genitourinario (reproduccin, inseminacin artificial), la conjuntiva (aerosoles), y a travs de aberturas en la piel (abrasiones, agujas, picaduras de insectos, etc.). Si despus de la entrada del virus prosigue o no la infeccin, depende de la habilidad del virus para enfrentarse e iniciar infeccin en clulas susceptibles. La susceptibilidad de las clulas a un virus dado depende principalmente de sus receptores de superficie, que permiten el anclaje y la posterior penetracin del virus.
Infecciones localizadas y diseminadas
Siguiendo la infeccin, el virus se replica en el sitio o cerca del sitio de entrada (replicacin primaria). Algunos virus permanecen confinados a este sitio inicial de replicacin, produciendo infecciones localizadas. Un ejemplo de esto es el resfriado comn y las infecciones similares de animales domsticos causadas por rhinovirus. Otros virus causan infecciones diseminadas (sistmicas) por su difusin a rganos adicionales va torrente sanguneo, linftico o quiescente a travs de los nervios. La propagacin inicial del virus a otros rganos por el torrente sanguneo se conoce como viremia primaria. La viremia puede darse ya sea por presencia de virus libres en el plasma o por virus asociados con clulas sanguneas. Despus de la multiplicacin viral en esos rganos puede darse una viremia secundaria con propagacin a (otros) rganos blanco. Un buen ejemplo de virus que causan infecciones sistmicas es el teschnovirus porcino 1 (gnero Teschnovirus). El virus se transmite de forma fecal-oral. Se replica inicialmente en las clulas de las amgdalas, migra a los intestinos y a los ndulos linfticos mesentricos. De estos ndulos linfticos, el virus entra al sistema nervioso central. Una vez en el sistema nervioso central se observan los
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signos neurolgicos de ataxia, temblores, prdida de coordinacin, entumecimiento de los miembros, convulsiones, parlisis y coma. La preferencia de un virus particular por un tejido o tipo celular especfico se conoce como tropismo.
Mecanismos de infecciones virales
La replicacin viral ocurre en los rganos blanco causando dao celular. El nmero de clulas infectadas y/o la extensin del dao pueden tener como consecuencia la disfuncin del rgano o tejido y la manifestacin clnica de la enfermedad. El intervalo entre la infeccin inicial y la aparicin de signos clnicos es el periodo de incubacin. Los periodos de incubacin son cortos en enfermedades en las que el virus crece rpidamente en el sitio de entrada (por ejemplo influenza) y son ms largos si las infecciones son generalizadas (por ejemplo moquillo canino). Algunos virus infectan animales pero no producen manifestacin de signos de la enfermedad. Estas infecciones se conocen como subclnicas (asintomticas o inaparentes). Hay numerosos factores que pueden influir en el resultado de las infecciones virales. Estos incluyen: inmunidad preexistente, gentica del animal, edad del animal y factores relacionados a estrs como estado nutricional, condiciones ambientales etc. Los mecanismos por los que los virus causan enfermedad son complejos. La enfermedad puede ser resultado de efectos directos de los virus en las clulas hospederas, como muerte celular, efecto citoptico y transformacin maligna. De manera alternativa, la enfermedad puede ser resultado de efectos indirectos causados por la respuesta inmunolgica y fisiolgica del hospedero. Un ejemplo de respuesta fisiolgica indirecta es la infeccin por rotavirus, que causa diarrea en animales jvenes y humanos. La diarrea puede ser causada por los eritrocitos infectados por el rotavirus, que estn estimulados a producir citocinas, excitando las neuronas entricas e induciendo la secrecin de exceso de fluidos y electrolitos en el intestino grueso. Un ejemplo de patognesis de la enfermedad mediada por la respuesta inmunolgica ocurre en la enfermedad de Borna en caballos. El virus se distribuye desde el sistema nervioso central a los nervios perifricos a travs de los axones. El hospedero responde a la presencia de neuronas infectadas por el virus induciendo una respuesta inmune mediada por clulas. Los macrfagos, neutrfilos y linfocitos T citotxicos especficos son activados para destruir a las neuronas infectadas por el bornavirus. El resultado es una inflamacin crnica del SNC que corresponde a los signos neurolgicos asociados con la enfermedad. Dos trminos muy importantes usados para hablar de enfermedades microbianas son patogenicidad y virulencia. Patogenicidad es la habilidad del virus u otro agente microbiano o parasitario para causar enfermedad. Virulencia es el grado de patogenicidad. Un virus avirulento es aquel que no tiene la capacidad para causar enfermedad. Un virus atenuado es aquel cuya capacidad para causar enfermedad ha sido debilitada, frecuentemente por mltiples pases en cultivo celular, huevos embrionados o animales.
Eliminacin (diseminacin) viral
La eliminacin viral es el mecanismo de excrecin de la progenie viral para su diseminacin hacia una nueva poblacin de hospederos. Los virus tpicamente son eliminados va aperturas en el cuerpo o superficies. En infecciones localizadas, el
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virus es tpicamente excretado va el portal de entrada. En infecciones diseminadas el virus puede ser excretado por diferentes rutas. No todos los virus son excretados de sus hospederos. Estos incluyen virus que se replican en sitios como el sistema nervioso, como en la encefalitis viral, y hospederos finales.
Evasin de las defensas del hospedero
En un esfuerzo por detener la infeccin, el hospedero inicia una respuesta inflamatoria. Los componentes principales de esta respuesta incluyen interfern, linfocitos T citotxicos, linfocitos B productores de anticuerpos, diversas molculas efectoras y complemento. Estos componentes trabajan en conjunto y se potencian unos a otros en un intento de liberar al hospedero de la infeccin viral. En este esfuerzo por liberarse del virus infectante, la respuesta inflamatoria causa muchos de los signos clnicos y lesiones asociados con las infecciones virales. Los interferones ( y ) son producidos por las clulas infectadas por el virus. Actan para detener replicacin viral adicional en la clula infectada y en las clulas vecinas. Los interferones tambin fomentan la expresin de antgenos en la clula infectada, hacindolas ms fciles de reconocer para las clulas T citotxicas. Algunos virus como los adenovirus producen ARNs que bloquean la fosforilacin de un factor inicial, reduciendo as la habilidad del interfern para bloquear la replicacin viral. Las clulas T citotxicas destruyen a las clulas infectadas mediante la liberacin de perforinas, que crean poros en las clulas infectadas por virus. Posteriormente son liberadas granzimas dentro de la clula infectada, las que degradan a los componentes celulares. Finalmente, las clulas T citotxicas estimulan la apoptosis de la clula hospedera. Algunos virus reducen la expresin, en la superficie de la clula hospedera, de los antgenos de superficie del CMH (complejo mayor de histocompatibilidad) clase I (por ejemplo citomegalovirus, herpesvirus bovino tipo I y adenovirus). Como las clulas T citotxicas no pueden detectar antgenos virales que no estn formando complejos con los antgenos del CMH clase I, las clulas infectadas con estos virus no pueden ser destruidas de esta manera, permitiendo la "supervivencia" del virus dentro de la clula hospedera. Sin embargo, clulas con insuficientes o ningn antgeno de CMH clase I en sus superficies son reconocidas por las clulas asesinas naturales, que destruyen a la clula de manera similar a la descrita para las clulas T citotxicas. Los linfocitos B productores de anticuerpos secretan anticuerpos especficos para neutralizar los viriones infectantes cuando son liberados por las clulas. Los complejos antgeno-anticuerpo a su vez pueden activar el sistema del complemento. El complemento ayuda a estimular la inflamacin, la neutralizacin efectiva de virus, y la destruccin de clulas infectadas por virus. Las diferentes molculas efectoras (citocinas) que son producidas por las clulas del sistema inmune, desempean muchos papeles, incluyendo la induccin de fiebre y la atraccin de otras clulas inflamatorias (por ejemplo neutrfilos y macrfagos) al sitio daado.
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Algunos virus poseen receptores para una variedad de citocinas (por ejemplo, el virus de la viruela bovina tiene receptores para la interleucina 1, que estimula la produccin de fiebre). Cuando las clulas inmunes liberan la citocina, sta se une al virus, reduciendo entonces la cantidad de citocinas disponibles para modular la respuesta inmune. Esto aumenta la "supervivencia" del virus dentro del hospedero. Un mecanismo alternativo para evadir la respuesta inmune es tener muchos tipos antignicos (serotipos). Una respuesta inmune hacia un serotipo no garantiza proteccin ontra otro serotipo del mismo virus. Por ejemplo, hay ms de 100 serotipos de rhinovirus y 24 serotipos de virus de lengua azul.
Infecciones virales persistentes
Algunos virus tienen la habilidad para abrogar la respuesta inflamatoria y causar infecciones persistentes. Esto lo realizan de diferentes maneras, incluyendo la destruccin de linfocitos T, causando inmunosupresin, evadiendo el reconocimiento inmunolgico, alterando la expresin antignica, y por inhibicin de la produccin de interfern. Clnicamente hay tres tipos importantes de infecciones persistentes:
Infecciones con portadores crnicos

stos son organismos que continuamente producen y excretan grandes cantidades de virus, por largos periodos de tiempo. Como resultado de esto, ellos estn transmitiendo continuamente el virus a otros organismos. Algunos portadores crnicos son asintomticos o exhiben la enfermedad con signos muy leves. Ejemplos de esto son las infecciones por virus de la artritis equina, virus de la panleucopenia felina y virus del polioma aviar.
Infecciones latentes
Un tipo especial de infeccin persistente es aquella en la que el virus permanece en el hospedero en un estado "no-productivo". Los herpesvirus son notorios causando infecciones latentes. El genoma viral se mantiene en las neuronas en forma de crculo cerrado, y se reactiva peridicamente (frecuentemente durante condiciones de estrs) resultando en infeccin productiva y excrecin viral. Tambin ocurren infecciones latentes con retrovirus, en los que el ADN proviral se incorpora en el genoma de la clula hospedera. Puede resultar transformacin celular y malignidad si el transcrito integrado altera la organizacin normal de los procesos de control celular.
Infecciones virales lentas

Se refiere a aquellas infecciones virales en las que hay un largo periodo entre la infeccin inicial y el inicio de la enfermedad. En estos casos el crecimiento viral no es lento, sino que la incubacin y progresin de la enfermedad es extensa. Un ejemplo es la enfermedad subaguda de la panencefalitis esclerotica, que se desarrolla varios aos despus de la infeccin con el paramyxovirus de las paperas. La "encefalitis del perro viejo" debida al recrudecimiento del moquillo parece ser una condicin anloga.
Glosario
Antgeno: Una sustancia, generalmente ajena al cuerpo pero ocasionalmente producida dentro del cuerpo, que el sistema inmune reconoce como extraa o "no
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propia". Cuando es reconocida de esta manera, se producen anticuerpos especficos que reaccionan con ella. Apoptosis: Una forma de muerte celular programada caracterizada por la fragmentacin del ADN nuclear. Citocinas: Grupo diverso de protenas pequeas (< 30 kilodaltones), solubles, producidas por leucocitos, que median una variedad de funciones inmunes. Linfocitos T citotxicos: Clulas que reconocen antgenos extraos anclados en molculas del CMH tipo I. Son eficaces destruyendo clulas slo si stas contienen antgenos extraos. Endosimbiosis: Forma de simbiosis en la que un organismo vive dentro de otro. Granzimas: Grupo de proteasas de serina que penetran a la clula blanco mediante canales transmembranales creados por perforinas, donde interactan con varias vas intracelulares que disparan la apoptosis y la degradacin del ADN. Interferones: Grupo formado por tres diferentes protenas designadas como alfa, beta y gama. Todas ellas tienen una accin no especfica contra los virus , pero los interferones alfa y beta son los ms potentes. Interleucinas: Grupo de citocinas secretadas por clulas efectoras del sistema inmune que provocan respuesta en otras clulas del sistema inmune. Lectinas: Glicoprotenas vegetales que se unen especficamente a ciertos azcares, parte de lo cual ocurre en la superficie de las clulas. Macrfagos: El principal fagocito de tejidos, rganos y aquellas membranas serosas como la pleura y el peritoneo. Antgenos del CMH clase I (complejo mayor de histocompatibilidad): Grupo de genes que codifican para las protenas de autorreconocimiento o antgenos importantes de la incompatibilidad. Estos antgenos se presentan en la superficie de todas las clulas del cuerpo y sirven para identificarlas como pertenecientes al organismo, y no como extraas. Algunos antgenos de CMH se presentan en la superficie de clulas del sistema inmune. La regin del CMH humano se conoce como la regin HLA (antgeno leucocitario humano por sus siglas en ingls) y se localiza en el cromosoma 6. Clulas asesinas naturales (clulas NK): Linfocitos citotxicos que componen aproximadamente el 5 a 15% de los linfocitos circulantes, carecen de los marcadores fenotpicos de las clulas T y B. Tienen la capacidad de destruir ciertas clulas tumorales y clulas infectadas por virus que carecen de marcadores del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) en la superficie celular, y su mecanismo para destruir a las clulas es similar al de las clulas T citotxicas. Neutrfilos: Clulas fagocticas de vida corta que poseen grnulos que contienen varios compuestos bactericidas; son los ms numerosos de los linfocitos circulantes constituyendo aproximadamente el 60 a 70% en humanos. Microscpicamente tienen una forma irregular y ncleo multilobulado; tambin se conocen como leucocitos polimorfonucleares. Perforinas: protenas formadoras de poros que requieren de la presencia de calcio para polimerizar y formar canales transmembranales en la clula plasmtica de la clula blanco.
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Defensas del hospedero contra los virus
Tal como los virus son capaces de causar enfermedad gracias a su habilidad de infectar clulas e iniciar el proceso de replicacin mediada por el hospedero, el hospedero y las clulas de ste poseen algunos mecanismos para prevenir, minimizar, o contener las infecciones virales. En este captulo se discuten estas defensas, desde las respuestas innatas y las barreras protectoras, hasta las respuestas inmunes especficas. El resultado de la interaccin entre el hospedero y el virus se refleja en el carcter de la enfermedad.
Defensas del hospedero

Barreras fsicas / qumicas Las barreras fsicas / qumicas son parte del sistema inmune innato, aquel que posee cada hospedero al nacer. Estas barreras previenen o limitan la infeccin. Cualquier factor que comprometa la integridad de alguna de estas barreras proporciona un acceso del virus a las clulas del hospedero. Por el contrario, algunos virus son capaces de atravesar estas barreras fcilmente, gracias a su ciclo de replicacin. Piel. La piel es una barrera eficaz para la mayora de las infecciones, incluyendo aquellas causadas por virus. Esto es debido a que la piel est compuesta en parte de clulas muertas queratinizadas, que no pueden dar sustento a la replicacin viral. Para traspasar esta barrera, los virus necesitan penetrar ms profundamente en el epitelio, a travs de cortaduras, quemaduras, o picaduras de insectos. Membranas mucosas. Estas actan como barreras fsicas, previniendo el acceso directo a las clulas hospederas. Adicionalmente, el moco interfiere con el anclaje del virus a la clula hospedera porque contiene receptores virales en s mismo. Por ejemplo, los paramyxovirus se unen a los receptores de cido silicoasociados con las clulas hospederas. La presencia de glicoprotenas-cido silico en el moco interfiere con el anclaje a esos sitios. Epitelios ciliados. La accin combinada de los cilios con el moco del epitelio facilita el desplazamiento fsico de los virus atrapados hacia afuera del cuerpo, disminuyendo as la infectividad viral. El tamao del inculo, tamao de la gota, corrientes de aire, humedad y temperatura son factores asociados con la penetracin de esta barrera. pH cido. El pH cido del tracto gastrointestinal (pH 2) fcilmente desnaturaliza las protenas asociadas con muchos virus. Sin embargo, los virus entricos pueden ya sea resistir este pH o usar la exposicin a este pH para facilitar su descapsidacin y volverse entonces infectantes en el intestino. Lgrimas. Estas proveen lavado constante para minimizar la cantidad de partculas virales disponibles para infectar las clulas de la conjuntiva. Carencia de receptores. Esto involucra el rango de hospederos o la presencia de receptores en tejidos especficos. Si el receptor necesario para el anclaje no est presente, entonces la infeccin no puede ocurrir.
Respuestas inmunes no especficas
Las respuestas inmunes no especficas ocurren con cualquier infeccin viral. Estas respuestas sirven principalmente para limitar la diseminacin viral desde el sitio de
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infeccin, impedir la replicacin viral y colaborar con la respuesta inmune especfica para un ataque dirigido al virus infectante. Fiebre. Esta inhibe la replicacin viral a travs de la estimulacin de otras respuestas inmunes y de la disminucin de la replicacin viral. Adicionalmente, el incremento de la temperatura puede mediar la inactivacin directa de las partculas virales. La importancia de la fiebre sola durante la infeccin viral no es clara. Inflamacin. Esta se refiere a la respuesta inmune local no especfica caracterizada por enrojecimiento, inflamacin, calor y dolor. Neutrfilos y macrfagos son atrados a la zona por citocinas. Este proceso ayuda a limitar la infeccin. La produccin constante de citocinas y el reclutamiento de clulas inmunes contina hasta que el antgeno es neutralizado eficazmente. Despus sigue la reparacin del tejido. En algunos casos, la respuesta inflamatoria se vuelve crnica, dando origen a una inmunopatologa inducida por el virus. Interferones (IFN). Son un grupo de glicoprotenas especficas del hospedero inducidas por el virus, que inhiben la replicacin viral por induccin de la degradacin del ARN viral y bloqueando la traduccin de protenas virales. Adicionalmente los interferones confieren resistencia a las infecciones virales en las clulas vecinas. Hay tres tipos de interferones producidos por el cuerpo: alfa, beta y gama. Los interferones alfa y beta son llamados interfern tipo 1 y estn involucrados en la respuesta inmune innata. El interfern gama (IFN-gama) est involucrado en la respuesta inmune especfica y ser considerado posteriormente. Los interferones alfa y beta trabajan por interferencia especfica con la traduccin viral, y tienen poco efecto sobre la traduccin celular. Este fenmeno se conoce como inhibicin selectiva. Los ARNm virales son reconocidos por secuencias de nucletidos especficas del virus, que no se encuentran en las clulas del hospedero. Adicionalmente, el IFN estimula el incremento en la produccin de complejos mayores de histocompatibilidad (CMH) de clase I y de clase II en la superficie de las clulas hospederas. Esto ayuda para el reconocimiento de los antgenos virales, y el disparo de la respuesta inmune especfica en las clulas blanco infectadas por el virus. Interfern alfa (IFN alfa). Estable a pH.2; produccin inducida por productos de la replicacin viral (los virus ARN estimulan su produccin en mayor medida que los virus ADN) y ARNds. Tambin llamados IFN leucocitario. Interfern beta (IFN beta). Estable a pH.2; produccin inducida por productos de la replicacin viral (los virus ARN estimulan su produccin en mayor medidque los virus ADN) y ARNds. Tambin llamado IFN fibroblstico. Clulas asesinas naturales (NK). Las clulas NK son clulas sanguneas blancas de linaje linfopoytico. Son llamadas tambin la tercera poblacin de linfocito (T, B y NK), clulas nulas o linfocitos grandes granulares. Algunos virus, como parte de su ciclo de replicacin, provocan la disminucin de CMH clase I hecho por la clula hospedera. Las clulas NK reconocen a aquellas clulas que carecen o que expresan menos el CMH clase I, y las destruyen por apoptosis. De esta manera ellas reconocen y destruyen a las clulas infectadas por virus. Las clulas NK destruyen clulas infectadas por virus de la misma manera que las clulas T citotxicas
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descritas posteriormente. Las clulas NK tambin son importantes en el reconocimiento y destruccin de clulas tumorales. Fagocitosis. Es la accin de macrfagos y neutrfilos para englobar y destruirpartculas virales. Los macrfagos se activan (se hayan ms dispuestos para englobar y destruir) en respuesta a interfern gamma y otras citocinas. Cascada del Complemento. La mayora de los virus son incapaces de fijar complemento por la va alternativa. Sin embargo, como la va clsica emplea anticuerpos especficos en el primer paso de la cascada, este mecanismo puede lisar virus o clulas infectadas fcilmente.
Respuestas inmunes especficas
Las respuestas inmunes especficas son respuestas a una infeccin diseadas para cada patgeno. Estas respuestas toman de varios das a varias semanas para desarrollarse. Entonces, el cuerpo depende de la accin de la respuesta inmune noespecfica para ayudarse a localizar la infeccin hasta que se genera la respuesta inmune especfica. Las respuestas inmunes especficas son humorales (produccin de anticuerpos) o mediadas por clulas. En algunas instancias la infeccin viral provoca inmunopatologas caractersticas o inducen inmunosupresin.
Respuesta inmune humoral

La respuesta inmune humoral involucra la produccin de anticuerpos contra antgenos virales especficos. Estos anticuerpos son producidos por clulas plasmticas, que se derivan de linfocitos B. La estimulacin de la produccin de anticuerpos es el mecanismo primario involucrado en la recuperacin de infecciones virales, en particular de infecciones virales citolticas acompaadas de viremia, y de infecciones virales de superficies epiteliales. Los anticuerpos producidos pueden ser, respecto al virus, neutralizantes o no neutralizantes, dependiendo de su interaccin con los viriones y sus efectos sobre el ciclo de replicacin. En la mayora de las instancias, la produccin de anticuerpos es el resultado de infecciones virales. Esto es inmunidad activa. De manera alternativa, a un individuo puede administrrsele anticuerpos preformados de un individuo recuperado. Este es un ejemplo de inmunidad pasiva. Estos anticuerpos preformados pueden ser administrados a individuos que pudieron haberse expuesto a un virus en particular, como el virus de la rabia. Anticuerpos neutralizantes. Estos son los anticuerpos que inhiben la habilidad del virus para invadir a las clulas y replicarse. Interfieren con el anclaje viral, su penetracin y/o su descapsidacin. Adems son capaces de daar la envoltura viral con la ayuda del complemento (va clsica). Los anticuerpos neutralizantes son ms eficaces en el momento de la infeccin o durante la viremia. Anticuerpos no-neutralizantes. Estos son anticuerpos que no tienen actividad neutralizante directa, pero pueden colaborar a controlar la infeccin por otros medios, como mejorar la degradacin viral. Adicionalmente funcionan como opsoninas para incrementar la fagocitosis de los viriones. Los anticuerpos antivirales unidos a las protenas virales en la superficie de las clulas infectadas
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pueden tambin disparar la cascada del complemento y conducir a la destruccin celular mediada por complemento.
Respuesta inmune mediada por clulas

La inmunidad mediada por clulas (CMI por sus siglas en ingls) involucra la accin de los linfocitos T citotxicos, la citotoxicidad dependiente de anticuerpos mediada por clulas (ADCC), la accin de las clulas asesinas naturales y los macrfagos activados. La CMI es el mecanismo de defensa ms importante en las infecciones no citolticas en las que la membrana de la clula infectada es alterada por el virus. Linfocitos T citotxicos. Estos son clulas T especficas que reconocen a los antgenos virales asociados con las molculas del CMH clase I en la superficie de la mayora de las clulas. Estos linfocitos T tienen un antgeno de superficie llamado CD8. La interaccin entre la clula infectada y la clula T citotxica provoca la liberacin de perforinas por parte de la clula T citotxica, lo que crea poros en la membrana de la clula infectada. La clula T citotxica tambin libera granzimas, (nota de la traductora: un grupo de proteasas de serina). La accin combinada de las perforinas y granzimas provocan la lisis celular. De manera adicional, las clulas T citotxicas activan las protenas Fas, que estimulan la apoptosis en la clula infectada por el virus. Citotoxicidad dependiente de anticuerpos mediada por clulas. La ADCC se refiere a una respuesta inmune en la que las clulas infectadas por el virus, cubiertas por anticuerpos son usadas como blanco para ser atacadas por clulas inmunes como macrfagos y clulas asesinas naturales. Linfocitos T ayudadores o cooperadores. Estos linfocitos T tienen un antgeno de superficie llamado CD4. Son capaces de reconocer antgenos proteicos asociados con antgenos del CMH clase II, que se encuentran slo en unos pocos tipos celulares como macrfagos, linfocitos B y clulas dendrticas. Linfocitos T ayudadores o cooperadores conciertan la respuesta inmune contra el antgeno ya sea por secrecin de citocinas que estimulan la produccin de anticuerpos por linfocitos B especficos, o por estimulacin de la produccin de clulas especficas para una respuesta inmune celular.
Efectos inmunolgicos de la infeccin viral

Estos son el resultado de las interacciones entre el sistema inmune del hospedero y la replicacin viral.
Inmunopatologa inducida por virus

La inmunopatologa inducida por virus es el dao al tejido, resultante de la respuesta inmune a un virus. Esta inmunopatologa puede ser el resultado de diversas interacciones inmunolgicas, tales como complejos antgeno-anticuerpo y dao tisular debido a clulas T citotxicas, anticuerpos o complemento. El tipo y localizacin de la inmunopatologa puede ser caracterstico de una infeccin viral en particular. Algunos ejemplos de inmunopatologas inducidas por virus son: Uveitis anterior. Los complejos antgeno-anticuerpo se depositan en el ojo, estimulan la inflamacin local, y provocan uveitis anterior. Adicionalmente, los complejos inmunes que quedan en la circulacin se depositan en el rin,
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provocando la inmunopatologa de nefritis glomerular. Esto se observa frecuentemente durante el periodo de recuperacin de las hepatitis infecciosas caninas. Coriomeningitis linfoctica. Infeccin de ratones causada por un arenavirus. Tiene como consecuencia dao en el SNC, resultado de la destruccin de las clulas infectadas por los linfocitos T citotxicos. La encefalitis del perro viejo (virus del moquillo canino, un paramixovirus) es similar ya que la inmunopatologa es tambin el resultado de una respuesta inmune celular a la infeccin viral persistente. Hepatitis de la marmota y hepatitis B del pato. Se piensa que la mayor parte del dao heptico asociado a estas infecciones es causado por la accin continua de los linfocitos T CD8+ al destruir hepatocitos infectados, ms que por la accin del virus por s mismo.
Inmunosupresin inducida por el virus
Como resultado de su replicacin, algunos virus suprimen la respuesta del sistema inmune del hospedero, y al hacerlo son capaces de establecer la infeccin. La inmunosupresin causada por virus ocurre en infecciones citolticas y no citolticas. Frecuentemente se observa como consecuencia de las infecciones virales que involucran infeccin de los linfocitos, tal como sucede con el virus humano de inmunodeficiencia adquirida (VHI) y el virus felino de inmunodeficiencia.
Evasin del sistema inmune
Algunos virus, por su mtodo de replicacin, son capaces de evadir la accin del sistema inmune del hospedero. Hay varias maneras en que esto puede llevarse a cabo durante la replicacin viral. Algunos ejemplos incluyen infeccin de sitios inmunolgicamente privilegiados, variabilidad antignica de los viriones, inhibicin del INF-, disminucin de la expresin del CMH clase I, inhibicin del procesamiento de pptidos, y expresin de estructuras homlogas al sistema inmune. Los sitios inmunolgicamente privilegiados son aquellas partes del cuerpo que no tienen contacto directo con la circulacin y por esto son normalmente segregados del sistema inmune. Estos sitios incluyen el cerebro, los testculos y la prstata, la retina ocular y los abazones del hmster. La produccin por virus de estructuras anlogas al sistema inmune incluye: Cytomegalovirus producen glicoprotenas que son anlogas a los receptores de IgG-Fc. El virus del fibroma de Shope produce un anlogo al receptor de TNF (factor de necrosis tumoral por sus siglas en ingls). Virus Epstein-Barr produce un anlogo de la interleucina (IL)-10. El fenmeno de latencia (herpesvirus, retrovirus) es otro mecanismo para evadir al sistema inmune. Los adenovirus producen segmentos cortos de ARN que bloquean la activacin de los interferones.
Prevencin de las enfermedades virales, vacunas y frmacos antivirales Prevencin de la infeccin
La nica forma certera de prevenir la infeccin viral es previniendo la exposicin. Esto se realiza en la prctica permitiendo la mezcla solamente de animales sin evidencia de exposicin previa. Esta restriccin al contacto se refiere con frecuencia
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a los "hatos cerrados". Para mantener efectivamente este estado de cerrado, todos los animales de reemplazo y de exhibicin deben ser aislados del resto de animales por al menos 2 3 semanas. Durante este tiempo, los animales son monitoreados con el fin de observar signos clnicos y realizando pruebas serolgicas (o virolgicas) para poner en evidencia la exposicin. El prevenir la exposicin mediante la restriccin al contacto es bastante eficaz en reas en donde un virus en particular es relativamente desconocido, pero es poco prctico en reas en donde estos virus son endmicos. En tales casos, los esfuerzos estn dirigidos desde prevenir la "infeccin" hasta prevenir la enfermedad.
Control de la infeccin y la enfermedad
Para controlar las infecciones virales y la enfermedad, son fundamentales las buenas prcticas de manejo. Los factores de estrs juegan un papel importante en la predisposicin del animal a la infeccin y la diseminacin de la enfermedad. Son particularmente importantes la asociacin del estrs con la mala nutricin, la sobrepoblacin y el alojamiento con ventilacin inapropiada. Las prcticas de manejo deben incluir medidas preventivas para proteger al feto y al recin nacido. Algunos virus que producen una infeccin moderada o inaparente en animales adultos, pueden ser causa de abortos o afecciones serias en neonatos (por ejemplo el parvovirus porcino). Por lo tanto, los esfuerzos deben encaminarse a restringir el contacto de animales preados y recin nacidos con otros animales. Igualmente es importante asegurar que el recin nacido reciba calostro, el cual contiene anticuerpos que confieren proteccin durante las primeras semanas de vida. Otro aspecto de buen manejo, es la necesidad de minimizar el contacto entre diferentes especies de animales, ya que algunos virus producen infecciones inaparentes en una especie pero enfermedad severa en otras. Un ejemplo es el virus de la pseudorrabia, el cual produce infeccin subclnica en cerdos viejos pero comnmente es fatal en lechones, ovejas, perros y gatos. Es esencial la limpieza y desinfeccin, el empleo de overoles limpios y lava-patas para prevenir la diseminacin de los virus por los fomites. Estos aspectos de manejo deben practicarse todo el tiempo, esencialmente durante los brotes de la enfermedad. Cuando se presenta un brote, todos los animales deben ser puestos en cuarentena (aislados y observados) y si est indicado tratarlos sintomticamente. Por ejemplo: Recibir el apoyo teraputico necesario, como lquidos de reemplazo en casos de diarrea severa. La solucin acuosa de clorato de sodio es eficaz para desinfectar. Puede ser aconsejable el tratamiento con antibiticos para prevenir infecciones bacterianas secundarias.
Vacunas
En algunas instancias, la prevencin de la enfermedad puede lograrse mediante la vacunacin. Mientras que la vacunacin no necesariamente previene la infeccin, la "preparacin" previa del sistema inmune del husped permite una rpida respuesta y desalojo del virus antes de que se presente la enfermedad o una enfermedad
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ligera de corta duracin. En efecto, la vacunacin es la forma ms eficaz y barata dentro de las medidas de prevencin de enfermedades en la salud animal. Existen dos tipos principales de vacunas que son utilizadas corrientemente en la prctica veterinaria, aquellas que se hacen con virus muerto (inactivado) y aquellas preparadas con virus vivo modificado. Las vacunas con virus muerto consisten de virus, generalmente cultivados en cultivos de tejidos o en huevos embrionados, que han sido qumicamente inactivados, con frecuencia con formalina o beta-propiolactona. Frecuentemente, estas vacunas contienen adyuvantes que las hacen ms inmunognicas. Las vacunas con virus muerto por lo general requieren ms de una dosis para inducir la inmunidad y la dosis peridica de refuerzo para el mantenimiento adecuado de inmunidad. Las vacunas inactivadas inducen a menudo una inmunidad menos protectora y de menor duracin que la inducida por vacunas a virus vivo modificado. Las ventajas de las vacunas con virus muerto son: No se revierten a virulentas y son seguras al aplicarlas en animales preados e inmunosuprimidos. Las vacunas a virus vivo modificado poseen virus que han sido hechos menos virulentos por distintos mtodos. Esto se efecta por el cultivo seriado del virus en cultivos de clulas, en huevos embrionados o animales de laboratorio. Los virus tambin pueden ser atenuados al suprimir genes especficos responsables de la virulencia. Esta manipulacin gentica se empleo en la preparacin de la vacuna pseudorrabica disponible comercialmente. Las vacunas atenuadas generalmente confieren una inmunidad de por vida, puesto que la replicacin del virus vacunal imita la infeccin natural. Una vacuna viva atenuada suficientemente no debera causar la enfermedad en animales sanos vacunados; sin embargo, puede producir la enfermedad en animales inmunocomprometidos y en fetos. Algunas vacunas a virus vivo modificado pueden administrarse por va oral, nasal o genital (prepucial o vaginal), en donde estas estimulan una respuesta local de anticuerpos de secrecin (IgA). La principal desventaja de las vacunas vivas modificadas es que algunas producen una enfermedad leve, infecciones letales del feto y la posibilidad de que el virus atenuado pueda recuperar su virulencia. El virus de las vacunas a virus vivo puede transmitirse por contacto entre los animales. Varias nuevas vas se estn explorando en un esfuerzo por hacer vacunas ms seguras y ms eficaces. A continuacin, algunas de estas vas: La vacuna de subunidad es un tipo de vacuna inactivada que contiene las porciones del virus necesarias para inducir la inmunidad (protenas, fragmentos). Los pptidos sintticos son producidos por sntesis qumica de pequeas porciones de protenas virales (pptidos) y se emplean como vacunas de subunidades refinadas. Las vacunas recombinantes son de tres clases: Protenas recombinantes: El gen para el antgeno viral blanco es clonado y el cDNA introducido en una bacteria o levadura por medio de un plasmido, en donde cualquiera de los dos producen grandes cantidades de antgeno. Este antgeno se emplea como vacuna. Vectores virales: El gen o genes de varios virus (generalmente virus de la viruela, herpesvirus o
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A denovirus) son eliminados y reemplazados con un gen (o genes) que codifica el antgeno (o antgenos) deseado; estos ltimos son introducidos en el animal y seexpresan como clulas infectadas. Los virus que llevan los genes del antgeno deseado son llamado vector. Vacunas de gen eliminado: El virus virulento se hace menos virulento mediante la eliminacin del gen o el reemplazo de regiones clave de genes con otro material gentico. Algunas vacunas recombinantes estn siendo usadas, incluyendo la de la protena de la hepatitis B humana expresada en levaduras; la protena del virus de la rabia expresada en virus vacunal; las protenas F y HA del virus del moquillo canino insertado en el genoma del virus de Viruela del canario. Vacunas anti-idiotipo: los anticuerpos anti-idiotipo se elaboran en un proceso de dos pasos. Primero se introduce el antgeno a un organismo que posee una respuesta inmune. Estos anticuerpos se emplean para inmunizar un segundo individuo, al cual se produce una respuesta inmune. Algunos de estos anticuerpos tienen caractersticas antignicas del antgeno original y son llamados anticuerpos antiidiotipo. Estas vacunas anti-idiotipo solo han sido empleadas experimentalmente. Vacunas de ADN: en este acercamiento, el gene(s) viral(es) del antgeno de la protena es introducido en el sujeto va un plasmido, estimulando la produccin de un anticuerpo viral especfico, protector. Hasta el momento este tipo de vacuna se ha utilizado sobre todo de manera experimental. En un esfuerzo por encontrar una vacuna eficaz para prevenir una pandemia potencial de gripe, se est investigando la posibilidad de usar vacunas de ADN. Su eficacia en los seres humanos para generar una inmunorrespuesta apropiada tiene todava que ser establecida. Sin embargo, una vacuna de ADN ha sido aceptada en los EE.UU. para la prevencin de la infeccin del virus del Nilo Occidental en caballos. Vacunas con marcador: Estas vacunas nicas carecen de un pptido caracterstico o poseen un pptido nuevo que no est presente en la cepa tipo del virus de campo. De esta forma el pptido faltante o nuevo sirve como marcador para la cepa vacunal de un virus en particular. Estos permiten las pruebas diagnosticas para diferenciar entre animales vacunados y portadores o infectados. Las pruebas diagnosticas serolgicas detectan anticuerpos para la cepa viral de campo pero no para la vacuna del virus alterado. Los mtodos empleados para crear una vacuna con marcador son la eliminacin del gen (eliminacin de un pptido) o la creacin de una vacuna subunidad (pptido nuevo). Las vacunas con marcador estn disponibles comercialmente e incluyen la pseudorrabia (vacuna de eliminacin) y el herpes virus-1 bovino (vacuna de eliminacin), y otras vacunas estn siendo desarrolladas actualmente para otras enfermedades.
Vacunacin en el huevo
Esta forma de vacunacin es practicada para prevenir la enfermedad de Marek. Los huevos embrionados son inoculados con un dispositivo automtico a los 18 das de incubacin. El proceso, el cual es seguro y efectivo, se emplea para vacunar contra la bronquitis infecciosa y la enfermedad infecciosa de la bolsa.
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Generalmente, vacunas eficaces estn disponibles para aquellos virus que tienen uno o pocos tipos antignicos estable y que pueden obtenerse en cantidad suficiente para la preparacin de la vacuna. Interesantemente, es a causa de esta inestabilidad antignica que la composicin de la vacuna contra la influenza humana tiene que ser cambiada regularmente (anualmente), de acuerdo con la cepa actual circulante entre la poblacin.
Inmunizacin pasiva
La inmunizacin pasiva se refiere a la transferencia de inmunoglobulinas a individuos no inmunes. Las inmunoglobulinas presentes en sueros inmunes contienen anticuerpos neutralizantes que previenen la unin de virus especficos a las clulas susceptibles. La inmunidad pasiva natural incluye la recepcin de anticuerpos maternos por va placentaria (IgG), calostro (IgG) o el amnios de la yema del huevo (Igy). La recepcin de niveles inadecuados de anticuerpos maternos puede producir unas altas tasas de morbilidad y mortalidad en muchas de las enfermedades virales en animales jvenes. En la prctica clnica, las inmunoglobulinas son generalmente suministradas antes de la exposicin o durante el perodo de incubacin para modificar la infeccin. Los antisueros (producidos en animales donadores), protegen por un perodo corto de tiempo y tienen un uso muy limitado en la prevencin de enfermedades virales. Los antisueros han sido empleados para prevenir el moquillo canino, la panleucopenia felina y la infeccin con el virus del Este del Nilo en equinos. En algunos rebaos de equinos y bovinos, el almacenamiento de calostro con su posterior administracin a neonatos se emplea para incrementar su inmunidad.
Inmunidad del rebao

Este fenmeno ocurre cuando una proporcin suficientemente grande del hato ha sido inmunizada y por lo tanto es inmune a un virus en particular. Un individuo que pueda eventualmente carecer de inmunidad al mismo virus est protegido, ya que el resto del rebao es incapaz de trasmitir el virus. Para que sea eficaz, la vacuna en cuestin debe prevenir la enfermedad causada por el virus y su transmisin. Un efecto similar se observa con la enfermedad natural, si la mayora de la poblacin se ha recuperado de una enfermedad y posee una inmunidad prologada, entonces algunos de los individuos no infectados pueden ser protegidos por la inmunidad del rebao mientras que no existan animales reservorios en el rebao.
Frmacos antivirales
Los frmacos antivirales han tenido un uso muy limitado en veterinaria. Parece ser que algunos de estos frmacos son eficaces contra virus animales que estn estrechamente relacionados con los virus humanos, contra los cuales han mostrado cierta eficacia. Estos frmacos pueden ser separados en dos grandes categoras con base en su mecanismo de accin. Estos son los anlogos de nuclseosidos y los anlogos no nuclesidos discutidos ms abajo. En 2006, el CDC (Centre for Disease Control, EUA) inform que una cepa humana de influenza tipo A ha desarrollado resistencia a dos frmacos antivirales usados comnmente, rimantidina y amantadina. La cepa gripal H3N2, predominante en la poca de gripas, tratada anteriormente con estos
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frmacos antivirales, ha desarrollado resistencia. Esta informacin apoya la necesidad para el desarrollo de frmacos antivirales adicionales y para la posibilidad del uso de mezclas de frmacos antivirales para el tratamiento de la influenza.
Inhibidores de nuclesidos
Muchos de los frmacos antivirales disponibles comercialmente son anlogos de nuclesidos, los cuales afectan el cido nucleico de las polimerasas virales. Los ms comunes de estos son: acicloguanosina (acyclovir), dihidroxipropoxi-metilcuanina (ganciclovir), adenina-arabinosida (vidarabine) y azidotimidina (zidoyudine). Los frmacos antivirales no son ampliamente utilizados en medicina veterinaria. El aciclovir es eficaz contra el virus herpes y se ha empleado para tratar infecciones por herpesvirus ocular en gatos. Este frmaco tambin se ha empleado para tratar profilcticamente a pjaros psitacinos caros que han sido expuestos al herpesvirus psitacino.
Inhibidores no nuclesidos
Los interferones y los frmacos antivirales se emplean en el tratamiento especfico de enfermedades virales. Tienen importancia en la terapia viral ya que aparecen en forma temprana en la infeccin y juegan un papel mayor en la recuperacin. Actan inhibiendo la sntesis de protena viral. El tratamiento de animales con interferones exgenos no se practica ampliamente debido a la poca disponibilidad de interferones de especies hospederas. Mientras que los interferones no necesariamente son especficos de una especie hospedera, su accin depende de su capacidad de ligarse a receptores especficos en la superficie celular. El interfern- humano, comercialmente disponible como ADN recombinante, tiene alguna actividad cruzada entre especies y ha sido empleada para tratar oralmente a gatos infectados con el virus de la leucemia felina. Adems de los interferones, otros frmacos que inhiben la traduccin de mARN viral, son el fomiversin y la metisazona. El fomiversin (Vitranene) es un ADN antisense que bloquea la replicacin del citomegalovirus. La metizasona (Nmetilsatin- -tiosemicarbazona) es especficado para el mARN del virus de la viruela. La amantadina (Symmetrel) y la rimantidina (Flumadina) interfieren con la penetracin y/o descubrimiento de muchos virus envueltos, pero es eficaz solo contra las infecciones de influenza A en humanos. Estos antivirales no se emplean comnmente en los EUA. El saquinavir (Invitasa), indinavir (Crixivan), ritonavir (Norvir) y nelfinavir (Viracept) son inhibidores de proteasas virales. Actan unindose al sitio activo de la proteasa, impidiendo a la enzima el fragmentar otras protenas. Estos frmacos se emplean a menudo en los ccteles para tratar la infeccin con el VIH en humanos. El zanamivir (Relenza) y oseltamivir (Tamiflu) inhiben la liberacin del virus de la clula hospedera. Son especficos para la neuraminidasa del virus de la influenza, previene la liberacin y por lo tanto limita la diseminacin del virus.
Glosario MSc. Germn Gaitn Mendoza Pgina 33
Adyuvantes: Substancias o formulas qumicas empleadas para aumentar la respuesta inmune en respuesta a vacunas inactivadas. Estas actan reteniendo el inmungeno en el sitio de la inyeccin, como en un efecto de depsito y as retardar su liberacin; la estimulacin antignica es prolongada por consiguiente aumentada. Algunos adyuvantes pueden estimular igualmente a los macrfagos, linfocitos y otras clulas involucradas en la respuesta inmune. Las sales metlicas, tales como el aluminio, emulsiones aceitosas (adyuvantes de Freund) y vesculas lipdicas sintticas (liposomas), son algunos de los adyuvantes empleados. Neuraminidasa: Es una glicoprotena que se presenta como una punta sobre el exterior de la envoltura del virus de la influenza. La neuraminidasa separa en sus componentes a un inhibidor de la protena de hemaglutinina del virus de la influenza.
Procedimientos diagnsticos en las infecciones virales

Procedimientos diagnsticos
Los procedimientos bsicos para el diagnstico de laboratorio de virus, son el aislamiento del virus, la demostracin del virus o algn producto viral en las muestras clnicas (mtodo directo), y la deteccin y medicin de los anticuerpos especficos contra un virus (mtodo indirecto). Cada procedimiento tiene sus mritos, pero la demostracin directa del virus y/o de los productos virales es el mtodo ms eficaz y til en el diagnstico de rutina.
Procedimientos de demostracin
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Los mtodos directos incluyen la visualizacin de los viriones al microscopio electrnico, detectando el genoma viral empleando sondas de referencia de ADN y detectando antgenos virales por inmunofluorescencia. Este ltimo mtodo ha sido el ms til en el diagnstico por laboratorio.
Mtodos de serologa general

Durante los estados tardos de la enfermedad, la prueba del suero de los animales infectados, en busca de anticuerpos para virus especficos puede ser el nico medio de diagnstico. Esto puede lograrse mediante varias pruebas serolgicas. Las pruebas serolgicas ms comnmente empleadas en los laboratorios de diagnstico veterinario para el diagnstico de infecciones virales son: prueba de seroneutralizacin(SN); prueba de inhibicin de la hemoaglutinacin (IH); prueba de la inmunodifusin en gel de agar (AGID por sus siglas en ingles) y prueba de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Estas pruebas se basan en el hecho de que la actividad viral puede ser inhibida y/o las protenas virales se ligan a un anticuerpo especfico. Se prueban las diluciones del suero y se comunican los resultados como el reciproco de la dilucin mas elevada en la cual se observa actividad antiviral. De manera ideal, se compararan los resultados del suero colectado durante la fase aguda de la enfermedad con los resultados del suero colectado durante la convalecencia (dos colecciones de suero 14 - 21 das aparte). El diagnstico se confirma si se observa un incremento cuatro veces mayor de los ttulos de anticuerpos entre estos dos pares de muestras. Los resultados de una sola muestra de suero (no pareada) son ms difciles de interpretar. Para los virus que causan una infeccin aguda y se limitan as mismos, los resultados positivos solamente indican que el animal ha estado expuesto, ya sea naturalmente o a travs de una vacunacin. La interpretacin se hace ms fcil al muestrear un porcentaje de aquellos animales que estuvieron enfermos versus aquellos que no lo estuvieron, pues los ttulos ms altos generalmente indican una infeccin reciente. Para los virus que causan una infeccin persistente o latente (ejemplo los herpesvirus o retrovirus), una serologa positiva indica que el animal es un portador potencial del virus. Los resultados positivos de pruebas reguladoras son siempre significativos sin importar el ttulo de anticuerpo. Por sta razn, se han desarrollado otras pruebas serolgicas ms estandarizadas y en forma de estuche de muestreo (kit). Por ejemplo la prueba de inmunodifusin en gel de agar (AGID), conocida tambin como prueba de Coggins, para la anemia equina infecciosa y la prueba de ELISA y aglutinacin de ltex (LA) para seudorrabia. Los resultados de estas pruebas son comunicados como positivos o negativos. A continuacin una discusin sobre los diferentes procesos de diagnsticoempleados.
Aislamiento del virus

Empleo: aislamiento e identificacin del virus. Durante la fase aguda de la enfermedad es el mejor momento para demostrar y aislar virus. A medida que la enfermedad avanza, se desarrollan los anticuerpos, se reduce la excrecin de virus y el virus es despejado de los tejidos. Las manifestaciones clnicas de la enfermedad generalmente encausan la seleccin de la muestra clnica apropiada, tales como
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hisopos nasales y oculares en las infecciones de las vas respiratorias altas, heces de infecciones entricas, sangre de infecciones sistmicas, etc. Los virus requieren de clulas vivas para poderse replicar. En el laboratorio, se proporcionan clulas vivas como cultivos celulares, cuyas clulas han sido obtenidas por digestin enzimtica de tejidos animales. Las clulas son cultivadas en superficies de vidrio o plstico. Cuando las muestras clnicas que contienen virus son inoculadas en cultivos celulares susceptibles, el virus (si est viable) se replica y a menudo produce un comportamiento caracterstico de patologa celular, caracterizado por cambios en la apariencia celular, llamado efecto citoptico (CPE por sus siglas en ingles). En algunos casos, el virus se replica sin ningn efecto apreciable sobre las clulas y debe ser demostrado mediante pruebas de tinciones especiales que revelan cuerpos de inclusin viral o anticuerpos fluorescentes (AF), para detectar antgenos virales. El tiempo requerido para el aislamiento del virus flucta entre menos de 24 horas y hasta varias semanas.
Anticuerpo fluorescente
Empleo: Para detectar antgeno viral en materiales clnicos o en cultivos celulares infectados. La prueba de anticuerpos fluorescentes (AF) detecta antgenos virales en clulas infectadas con anticuerpos antivirales especficos que han sido marcados con un colorante fluorescente (isotiocianato de fluorescena). Las pruebas de AF se efectan en secciones de tejidos congelados, frotis de sangre, impresiones tisulares, raspados o en cultivos celulares. Los resultados estn disponibles en menos de una hora y son exactos a condicin de que el anticuerpo sea especfico y las muestras estn en condiciones moderadamente buenas. Hay dos tipos bsicos de tcnicas de AF: directa (DFA) e indirecta (IFA). En la prueba directa se marca el antgeno antiviral. Este antgeno marcado se emplea para detectar los antgenos virales en secciones congeladas de tejidos, raspados, frotis sanguneos, etc. La tcnica IFA es un procedimiento en dos pasos: La muestra a ser examinada se hace reaccionar con un anticuerpo antiviral no marcado. Despus de proporcionar un perodo de incubacin suficiente para que haya una interaccin antgenoanticuerpo (generalmente una hora o menos), se lava la muestra y se incuba con un anticuerpo marcado dirigido contra IgG de la muestra en la cual se prepar el anticuerpo antiviral no marcado. Este anti-anticuerpo marcado se anclar al anticuerpo no marcado anclado al virus, y si esto ocurre, se observa la fluorescencia y la prueba se considera positiva. Ambas pruebas FA tienen ventajas y desventajas. La tcnica DFA se lleva a cabo ms rpidamente y se emplea ms a menudo debido a la disponibilidad de los conjugados DFA. La tcnica IFA, por otra parte, generalmente es ms sensible y especfica (si se emplean anticuerpos monoclonales); se tarda ms tiempo pero solo requiere un anticuerpo marcado si todos los anticuerpos antivirales son preparados en una sola especie. La prueba de inmunofluorescencia o anticuerpo fluorescente (FA) es la prueba ms til empleada rutinariamente en el diagnstico viral. Comercialmente est disponible un buen nmero de conjugados AF para la deteccin de virus. Los conjugados que detectan virus en perros y gatos estn disponibles comercialmente. Se emplea un mtodo indirecto llamado prueba de inmunofluorescencia para detectar y medir
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anticuerpos. Esto involucra el infectar un cultivo de clulas con un virus y despus prepararpuntos en lminas de microscopio con estas clulas infectadas. El suero puede entonces ser examinado para un anticuerpo especfico hacindolo reaccionar con las clulas infectadas seguido de una reaccin con el conjugado antiespecie IgG. Los "puntos" que fluorescen (resultantes de la uni anticuerpo srico ms conjugado anti-especie IgG) indica que el suero es positivo para la presencia de anticuerpos especficos.
Inmunoperoxidasa
Empleo: para detectar antgeno viral en materiales clnicos y cultivos celulares. La tcnica de inmunoperoxidasa es similar en principio al proceso de anticuerpo fluorescente. La diferencia est en que el anticuerpo es conjugado a una enzima (peroxidasa de rbano o fosfatasa alcalina), ms que a un compuesto fluorescente. Aunque la enzima est ligada al anticuerpo, esta permanece activa y cuando se le suministra su substrato, reacciona y da una reaccin en color. Esta tcnica tiene la ventaja sobre la AF de que no requiere de microscopio fluorescente y es especficamente til para localizar antgenos virales en lesiones histopatolgicas.
Prueba de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
Empleo: Para detectar antgeno o anticuerpo. La sensibilidad de ELISA es comparable con el radioinmunoensayo (RIA), el cual es similar en principio a la prueba de ELISA. Se emplea un sistema de fase slida para la mayora de las pruebas ELISA. Para la deteccin de virus, primero se adsorbe un anticuerpo especfico a la superficie de un tubo de poliestireno, placa de microttulo, etc. y se aade la muestra que contiene el virus sospechoso. Si el virus est presente, este se une al anticuerpo adsorbido. Despus de lavado, se adiciona un anticuerpo antiviral especfico marcado con una enzima (generalmente fosfatasa alcalina o peroxidasa de rbano). El anticuerpo marcado reacciona con el complejo, creando un "efecto Sndwich". Luego del lavado, se adiciona el substrato para la enzima, producindose una reaccin de coloracin. Algunas pruebas se interpretan visualmente, pero se obtiene una mayor sensibilidad mediante el anlisis espectrofotomtrico. Un proceso indirecto de ELISA es empleado para la deteccin de anticuerpos. El antgeno es primero adsorbido a una fase slida, seguido por la adicin del suero a analizar. Despus del lavado, se adiciona una anti-gamaglobulina marcada con una enzima, seguida de la adicin de substrato enzimtico. Las variaciones de la prueba corriente de ELISA incluye la competitividad de ELISA para detectar el anticuerpo, en el cual la anti-gamaglobulina marcada con una enzima es reemplazada con un anticuerpo antiviral marcado con una enzima. El desarrollo de la coloracin posterior despus de la adicin del substrato enzimtico es inversamente proporcional al nivel de anticuerpo presente en la muestra analizada. En otras palabras, si el anticuerpo especfico ha sido ligado, el anticuerpo marcado con una enzima no se ligar. As, las pruebas positivas son aquellas que no presentan una reaccin de color o una reaccin menor que aquella de los controles apropiados. Otra variacin es la cintica por ELISA,
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la cual se emplea para detectar anticuerpos contra la borreliosis canina (enfermedad de Lyme), virus de la leucemia felina, peritonitis infecciosa felina, toxoplasmosis felina y herpes virus bovino 1. En la cintica por ELISA, la reaccin se monitorea continuamente durante cierto perodo de tiempo, en lugar de pararla despus de un tiempo predeterminado. La prueba de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y los sistemas de aglutinacin de ltex (LA) detectan antgenos virales mediante la "captura" de los mismos con anticuerpos especficos adsorbidos a un substrato apropiado. Estas tcnicas proporcionan un diagnstico rpido y estn a menudo disponibles para su uso en "la oficina". Los estuches disponibles comercialmente incluyen los estuches de ELISA y LA para detectar rotavirus en heces de una gran variedad de especies animales, y estuches de ELISA rpidos para detectar parvovirus canino en las heces yantgeno de la leucemia viral felina en sangre.
Aglutinacin de ltex (LA)
Empleo: Para detectar antgeno o anticuerpo. Las pruebas de LA son similares en principio a la aglutinacin bacterial ya que las partculas de ltex cubiertas con anticuerpo, se aglutinarn cuando se mezclen con el antgeno correspondiente y as lo identificarn. A la inversa, las partculas de ltex pueden ser cubiertas con antgenos y emplearlas para detectar anticuerpos. Estas pruebas son fciles de efectuar y producen resultados en pocos minutos. Los estuches comerciales empleados "en la oficina" estn disponibles para detectar anticuerpos de algunas enfermedades y para detectar algunos virus.
Microscopio electrnico (ME)
Empleo: Para demostrar virus en muestras clnicas. En la tcnica de microscopia electrnica con tincin negativa, las muestras clnicas lisadas con agua destilada, se "tien" con una solucin de tomos pesados. Esta tcnica se emplea principalmente para el examen de aquellas muestras clnicas en las que se espera contengan un gran nmero de partculas virales, tales como heces (coronavirus, rotavirus y parvovirus) y lesiones vesiculares y similares a la viruela (herpesvirus y virus de la viruela). La preparacin de la muestra y el examen ME generalmente puede completarse en 30 minutos.
Microscopio inmunoelectrnico
Empleo: Demostracin e identificacin de virus. La tcnica de tincin negativa del microscopio electrnico mencionada anteriormente para la demostracin de virus, es tambin til para la identificacin. El virus se hace reaccionar con el suero inmune, produciendo una agrupacin que puede ser vista cuando se observa bajo el microscopio electrnico.
Neutralizacin del virus (NV)

Empleo: para detectar y medir anticuerpos. La neutralizacin del virus es el mtodo ms ampliamente empleado para detectar y medir anticuerpos virales de importancia en veterinaria. Esta prueba es considerada como la ms exacta de todos los procesos serolgicos, siendo menos propensa a variaciones y menos subjetiva en su interpretacin. El principio de sta prueba se basa en el hecho de que la replicacin y actividad del virus, ya sea el
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efecto citoptico (EC) en el cultivo celular, signos clnicos, lesiones o muerte en huevos embrionados y en animales, que pueden ser inhibidos por un anticuerpo viral especfico. Las pruebas De NV son casi siempre desarrolladas empleando cultivos celulares. La cepa de virus para utilizar en las pruebas se cultiva, se alcuota y se almacena a temperaturas ultra-bajas. Estos virus son dosificados varias veces para determinar la cantidad de virus presente. Las diluciones del suero de prueba se hacen en placas microtituladoras, seguido de la adicin de un volumen igual de una suspensin viral diluida para contener aproximadamente 100 a 300 dosis infectantes (una dosis infectante es el nmero mnimo de partculas virales necesarias para establecer una infeccin). Despus de incubar el suero + virus durante 1 - 2 horas a temperatura ambiente (algunos sistemas utilizan 37C o an 4C), se adicionan indicadores de cultivos celulares. Las placas se sellan, se incuban a 37C, y se observan diariamente para ver el desarrollo del efecto citoptico viral. La presencia de anticuerpo especfico en el suero a analizar inhibe la produccin de este efecto citoptico. La prueba de NV se emplea tambin para identificar un virus desconocido, aislado de la misma manera descrita anteriormente. La nica diferencia es que el anticuerpo es conocido y el virus es desconocido. Si el anticuerpo especfico inhibe el desarrollo de EC del virus desconocido, se realiza la identificacin.
Prueba de inhibicin de la hemoaglutinacin
Empleo: Para detectar y medir anticuerpos. La prueba de inhibicin de la hemoaglutinacin (IH) es similar en principio a la prueba NV, excepto que la actividad viral inhibida es la hemoaglutinacin. Las pruebas IH son muy sensibles y altamente especficas, y particularmente tiles para medir anticuerpos contra aquellos virus hemoaglutinantes que se replican mal en cultivos celulares o producen poco o ningn efecto citoptico. Los ejemplo s de tales virus son el virus de la influenza Tipo A en la mayora de las especies, el virus de Newcastle de las aves y el parvovirus porcino. Las pruebas IH se efectan en placas microtituladoras. Se hacen las diluciones del suero a analizar, seguido de la adicin de un volumen igual de suspensin viral diluida que contenga aproximadamente 4 a 8 unidades HA (una unidad HA es la dilucin ms alta de la muestra viral que produce una hemoaglutinacin completa). Se aade una suspensin apropiada de glbulos rojos y las placas se mezclan suavemente y se dejan en incubacin por 1 - 2 horas a 4C (para la mayora de los virus). Si esta presente el anticuerpo especfico en el suero a analizar, se inhibir la aglutinacin de los glbulos rojos y estos se posarn en un "botn" bien definido. Las clulas aglutinadas, en contraste, se posarn completamente en una capa delgada sobre todo el fondo del pozo de la placa o formarn un botn de borde desigual e irregular. El suero a analizar contiene frecuentemente inhibidores no especficos de la aglutinacin y debe primero ser adsorbido con glbulos rojos antes de hacer la prueba.
Prueba de fijacin de complemento
Empleo: Deteccin y medicin de anticuerpos. Las pruebas de fijacin de complemento (FC) son ms tiles como ayuda en el diagnstico de una infeccin viral aguda o reciente, porque estas detectan primero
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IgM, la primera clase de inmunoglobulinas en responder a la infeccin. La prueba impone el empleo de antgenos virales, complemento de cobayo y un sistema indicador de CRS de oveja sensibilizadas. Al reaccionar directamente al anticuerpo dirigido contra los antgenos virales, sensibiliza los CRS de oveja. Este anticuerpo anti- CRS de oveja se refiere como hemolisina y se prepara en conejos. El antgeno y el complemento son dosificados y diluidos. Si no hay presencia de anticuerpos especficos en el suero problema, el complemento queda libre para reaccionar con los CRS sensibilizados produciendo lisis. Si estn presentes suficientes anticuerpos, el complejo antgeno-anticuerpo especfico habr fijado al complemento y no se presentar lisis de los CRS.
Inmunodifusin
Empleo: Para detectar anticuerpos y antgenos especficos. Las dos tcnicas ms empleadas de inmunodifusin son el sistema de placa de dobledifusin y la imunoelectroforesis. Ambas pruebas se realizan en medio semislido generalmente agar o agarosa. La diferencia esencial entre estos mtodos es que en la imunoelectroforesis el antgeno es previamente fraccionado electroforticamente antes de ser cubierto por el anticuerpo. En ambos mtodos, el antgeno y el anticuerpo se funden uno contra otro formando una lnea de precipitacin en donde ellos reaccionan. El sistema de placa de doble-difusin es la prueba de diagnostico ms comnmente empleada. El ejemplo ms conocido es la "Prueba de Coggins" para la anemia equinainfecciosa. La prueba de inmunodifusin se puede hacer ms sensible empleando un marcador radioactivo, el cual permitir la deteccin de reacciones antgeno-anticuerpo no visibles al ojo humano. El marcador radioactivo generalmente es el yodo (125I),tanto el antgeno el anticuerpo pueden ser marcados. El marcaje ocurre por el acoplamiento de 125I al aminocido tirosina. Las pruebas se leen cubriendo las placas o laminillas con una pelcula de rayos x (radiografa) que registran las lneas radioactivas (precipitacin).
Pruebas de proteccin
Empleo: identificacin de virus. Las pruebas de proteccin se emplean para la identificacin de virus cuando no se dispone de otros mtodos menos engorrosos. Estas pruebas involucran la produccin de una inmunidad activa o pasiva en un animal o animales seguidos por desafos por el agente en cuestin. Un ejemplo de la prueba de proteccin empleada anteriormente, es para la identificacin del virus del clera porcino. La prueba se llevo a cabo mediante la inyeccin de suero de anti-clera porcino simultneamente con sangre o suspensin de bazo de animales sospechosos de tener clera porcino. Si el agente era el virus del clera porcino, la inmunidad pasiva aportada por el suero anti-clera porcino podra proteger al cerdo de la dosis de desafo. El control, un cerdo no protegido, padecera el clera porcino.
Hibridacin del cido nucleico
Empleo: Para detectar secuencias de AADN o ARN viral en el cido nucleico extrado de muestras clnicas. La hibridacin del cido nucleico consiste en lo siguiente:
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La doble cadena del cido nucleico de un virus es desnaturalizado con un lcali par separar las cadenas. Las cadenas sencillas del cido nucleico se unen a un soporte slido, generalmente nylon o membrana de nitrocelulosa, para prevenir que las cadenas se vuelvan a unir. El cido nucleico se une a la membrana por medio de su columna vertebral de azcar-fosfato; de esta forma las bases de nitrgeno estn proyectadas hacia el exterior. Una sondas de referencia (molcula de ADN o ARN de cadena sencilla de origen conocido conteniendo la secuencia de nucletidos especfica del virus blanco marcada con una enzima o tomo radioactivo) es aadida a la membrana. Ocurre la formacin de uniones de hidrgeno entre las bases complementarias. Las sondas de referencia que no reaccionaron son removidas mediante lavado y se detecta la hibridacin mediante un ensayo para detectar a la sondas de referencia. Se emplean diferentes formas de ensayos de hibridacin de fase slida: Hibridacin de Southern. Es una tcnica empleada para identificar la presencia de un fragmento especfico de ADN. Hibridacin de Northern. Se emplea para detectar secuencias especficas de RNA. Hibridacin de mancha (Dot Blot). Es un proceso similar al Southern y al Northern y puede emplearse para detectar tanto AADN como ARN. La diferencia es que el cido nucleico es colocado dentro de la nitrocelulosa en un aparato que se enfoca sobre los puntos individuales en reas de concentracin, parecido a las placas microtituladoras. Hibridacin in situ. El principio de estas tcnicas es similar a la hibridacin de Southern y de Northern (deteccin de secuencias especificas de nucletidos mediante una sondas de referencia marcada) excepto en que ms que la extraccin del cido nucleico y su transferencia a una membrana de nitrocelulosa, se prueban las clulas intactas o secciones de tejido al microscopio. Esta tcnica se emplea poco en el diagnostico rutinario, sin embargo es muy valiosa en estudios de investigacin y patognesis. Las tcnicas de anlisis de restriccin enzimtica, reaccin en cadena de la polimerasa y anlisis de datos obtenidos de microarreglos de ADN, son particularmente tiles y se discutirn enseguida.
Anlisis de restriccin de enzimas
Empleo: identificacin de virus especficos. El anlisis de restriccin de enzimas utiliza las enzimas llamadas endonucleasas de restriccin para "perfilar" la secuencia del genoma de los virus. La presencia de mutaciones y/o variaciones genticas en los sitios potenciales de clivaje en algunas cepas virales, producen diferentes modelos de fragmentos cuando son separados en un gel de agarosa. Este anlisis es llamado polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP) y se ha empleado para caracterizar y comparar entre muestras aisladas en el campo de un virus dado. La tcnica requiere gran cantidad de ADN viral purificado o parcialmente purificado, un juego de enzimas restrictivas para clivar el ADN, la capacidad para separar los fragmentos de ADN resultantes por electroforesis y un mtodo para documentar los resultados.
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El clivaje por restriccin del genoma de virus con genomas grandes, tales como los citomegalovirus, puede producir 20 a 50 bandas ADN, mientras que los virus con genomas ms pequeos como los adenovirus, generalmente producen solo cinco a diez bandas ADN. No hay una forma fcil, ni es por lo general necesario, para correlacionar el modelo (bandas faltantes o extras) con mutaciones de localizaciones especficas en el genoma sin un estudio amplio de hibridacin molecular o an de secuencias del genoma que se est comparando. Una limitacin distinta del mtodo es que la presencia de una mutacin no puede ser detectada a menos que esa mutacin se encuentre dentro de la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restriccin que se esta empleando la digestin del ADN. El empleo de diferentes enzimas de restriccin optimizar la probabilidad de deteccin mutaciones en un genoma en particular o en una porcin de genoma.
Reaccin de cadena de la polimerasa
Empleo: identificacin/ deteccin de virus especficos o secuencias especificas de un gen. La reaccin de cadena de la polimerasa (PCR) un mtodo in vitro de replicacin de ADN, es capaz de amplificar segmentos de ADN por ms de un milln de veces. Una sola copia del genoma viral se ampla - si est presente en el material clnicoproduciendo millones de copias que pueden ser fcilmente detectadas por electroforesis. Esto es logrado al crear una reaccin mixta que, adems de la muestra de ADN (conteniendo potencialmente el genoma blanco), contiene dos sondas de referencia de oligonucletidos que complementan los extremos opuestos de cada cadena de la secuencia blanco, deoxinucleosidos trifosfatos y una polimerasa termoestable de ADN (polimerasa Taq). La mezcla de reaccin est entonces sujeta a un ciclo de temperatura con el fin de facilitar la replicacin ADN y as aumentar la cantidad de ADN. Lo siguiente representa un ciclo tpico: El primer paso del ciclo PCR es la desnaturalizacin de la muestra ADN mediante calentamiento de la mezcla de reaccin a 95C. Segundo, la mezcla es enfriada para permitir que los fragmentos se unan al ADN blanco. Tercero, la mezcla es calentada a 72C para permitir la polimerizacin del ADN por la polimerasa Taq ADN. Se repite el ciclo de temperatura del PCR, tpicamente 35 a 40 ciclos. De esta manera se pueden obtener ms de un milln de copias del ADN. Una vez completado el nmero de ciclos deseados, se separa el ADN blanco por electroforesis en gel y se analiza midiendo las bandas ADN o mediante la hibridacin de Southern con sondas de referencia especficas. En la actualidad se dispone comercialmente de cierto nmero de pruebas diagnosticas basadas en PCR. La PCR es aplicable al estudio de virus ARN si se emplea primero la transcriptasa reversa para hacer un cADN a partir del ARN blanco; denominado PCR transcriptasa reversa. Otras alternativas de PCR son la PCR "en tiempo real", la cual analiza simultneamente las muestras espectrofotometricamente para visualizar la polimerizacin y la PCR anidada, la cual emplea un segundo equipo de sondas de referencia dentro de la regin amplificada por el primer grupo. Cualquier tcnica es til cuando los niveles de
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cido nucleico viral son bajos. La eficacia del PCR "en tiempo real" en diagnostico clnico todava tiene que ser establecido.
Radioinmunoanlisis
Empleo: Para detectar antgeno o anticuerpo. En la actualidad, los sistemas de radioinmunoanlisis se utilizan rara vez en los laboratorios de diagnostico veterinario. Hay dos sistemas bsicos de radioinmunoanlisi (RIA), fase lquida y fase slida. En el sistema de fase lquida, los complejos antgeno-anticuerpo son precipitados por la subsiguiente adicin de antigammaglobulina. El precipitado se recolecta por centrifugacin y secado. La cantidad de radioactividad en el precipitado comparado con el total de radioactividad es una medida cuantitativa de la reaccin antgeno-anticuerpo. El marcaje se hace con 125 I (ver inmunodifusin) y cualquiera de los tres componentes puede ser marcado. En el sistema de fase slida, se cubre el interior de un tubo de poliestireno con el anticuerpo y entonces reacciona con el antgeno. Brevemente, la muestra se adiciona al tubo de poliestireno previamente cubierto con un anticuerpo antiviral. Si el antgeno est presente, este se fijara al anticuerpo que cubre el tubo. Despus del lavado, se adiciona el anticuerpo antiviral marcado con 125 I, el cual reacciona con el complejo produciendo un "efecto Sndwich". Se lava el tubo y se determina la cantidad de radioactividad. Mientras que las tcnicas mencionadas para la deteccin de antgeno se emplean como la primera aproximacin para el diagnostico viral, en muchos casos estas tcnicas no son aplicables porque frecuentemente las muestras apropiadas de animales vivos no estn disponibles. Adems, los sistemas de deteccin rpida del antgeno no estn disponibles para muchas enfermedades virales. En estos casos, se intenta el aislamiento del virus.
Anlisis de datos obtenidos de microarreglos de ADN
Empleo: identificacin de virus especficos o secuencias virales especficas. El desarrollo de los microarreglos ha sido propulsado por la aplicacin de la tecnologa robtica de rutina en la biologa molecular, ms que por cualquier descubrimiento fundamental. Las tcnicas de hibridacin de Southern y de Northern para la deteccin de ADN especfico y especies de mARN aporta la tecnologa bsica para la hibridacin de microarreglos. La construccin de microarreglos implica el ver secuencias especficas de ADN sobre una lmina de vidrio o contenedor de slice con la ayuda de tecnologa robtica. La lmina de vidrio puede contener ms de 50 000 genes. Las lminas son expuestas a una fuente de ADN marcado fluorescentemente. Un computador monitorea la fluorescencia sobre la lmina, indicando en done el ADN marcado se ha unido a la secuencia de ADN sobre la lmina. Puesto que muchas de las secuencias ADN pueden presentarse sobre una lmina, es posible para el anlisis de microarreglos el muestrear mltiples patgenos simultneamente. Esto es particularmente importante para la determinacin de armas biolgicas y en el diagnostico de enfermedades. Se dispone comercialmente de varias microarreglos, tales como el sistema de deteccin CapitalBio_
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SARSarrayTM-1.8 para identificar estados iniciales de infeccin con el virus de SARS . Adems de los microarreglos de cidos nucleicos, tambin se esta llevando a cabo el anlisis de microarreglo de protenas. En este caso, uno est buscando la presencia de una protena en particular.
Coleccin y remisin de especmenes

El diagnostico de laboratorio de enfermedades clnicas depende en gran parte de la clase y condiciones de las muestras remitidas. Tambin depende de que el veterinario y laboratorio trabajen en estrecha colaboracin. Puesto que muchas de las pruebas de laboratorio son para agentes especficos de enfermedad, todas las remisiones deben ir acompaadas de una historia clnica adecuada. Esto permitir al personal del laboratorio el hacer pruebas adicionales si es necesario. Las guas generales para la coleccin y remisin de muestras se presentan abajo. La mayora de los laboratorios proporcionan un formulario de remisin de las muestras que puede ser completado con la informacin pertinente disponible. En ausencia de un formulario, el veterinario podr proporcionar una historia clnica tan completa como sea posible. Los veterinarios deben contactar al laboratorio de diagnostico si tienen cualquier pregunta.
Animales
Se prefieren animales vivos o enfermos a animales muertos. Siempre que sea posible, los animales deben ser remitidos directamente al laboratorio de diagnostico para una necropsia completa. Si hay problema de hato, se debe remitir ms de un animal. Se puede emplear el servicio de correo para embarcar animales pequeos, siempre y cuando sean empacados en contenedores hermticos aislados con suficiente hielo o "paquetes fros". No congelar animales que sern remitidos para necropsia.
Tejidos
Para minimizar la contaminacin durante la necropsia, es mejor recolectar rutinariamente un grupo de tejidos, antes del examen completo. Los tejidos recomendados son pulmn, rin, hgado, bazo, intestino delgado, intestino grueso y ndulos linfticos mesentricos. Tejido cerebral o la cabeza deben tambin ser colectados si se sospecha de enfermedad del sistema nervioso central. Deben recolectarse otros tejidos que presenten anormalidades notadas durante el examen completo. Una porcin de estos tejidos debe colocarse en bolsas plsticas hermticas y colocarlas en refrigeracin. Mientras que se recomienda que cada tejido sea colocado en una bolsa separada, es absolutamente esencial que el intestino est separado de otros tejidos, de otra manera el examen bacteriolgico estar comprometido. Los tejidos deben ser llevados directamente al laboratorio o enviados en refrigeracin por correo certificado servicio de noche, autobs, o por servicio de mensajera. Los tejidos recolectados durante la segunda parte de la semana deben congelarse y enviarse el lunes. Puesto que muchos virus producen lesiones microscpicas caractersticas, pequeos trozos de cada tejido (1/4 de pulgada de grueso) deben colocarse en formalina buferada al diez por ciento para examen
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histopatolgico. Debe remitirse una mitad longitudinal completa del cerebro. Estas muestras no deben congelarse.
Heces
Las heces pueden ser recolectadas de animales con enfermedad aguda y colocadas en recipientes hermticos. Mientras los hisopos bien saturados son adecuados para muchos de los exmenes virolgicos individuales, algunos mililitros o gramos de heces permiten un trabajo de diagnostico ms completo, incluyendo el examen bacteriolgico y parasitario. Las muestras deben ser remitidas al laboratorio empleando "paquetes fros" como refrigerantes.
Hisopos
Se emplean hisopos nasales u oculares para el aislamiento de virus de animales con infecciones del tracto respiratorio superior. Las infecciones genitales tambin pueden diagnosticarse por el examen de hisopos recolectados del tracto reproductivo (vagina, pene, mucosa etc.). Estos hisopos deben recolectarse de animales con enfermedad aguda y deben ser colocados directamente en tubos con tapa de rosca que contienen un medio de transporte viral. El muestreo de varios animales en diferentes estados de la enfermedad incrementa la posibilidad de aislar el agente causal. Los hisopos tambin son tiles para el muestreo de lesiones vesiculares. Las vesculas frescas deben romperse y saturar el hisopo con el lquido exudado. Se deben recolectar dos hisopos, uno para el aislamiento de virus y uno para microscopa electrnica. Los hisopos para el aislamiento de virus deben ser colocados en medios de transporte viral y los hisopos para microscopa electrnica deben colocarse en un tubo con tapa de rosca que contenga una o dos gotas de agua destilada. Tambin se debe remitir el material de costras de lesiones ms avanzadas.
Laminillas
Un nmero de enfermedades infecciosas puede diagnosticarse mediante el examen de laminillas preparadas con sangre y tejidos. Los frotis de sangre se emplean para el diagnostico de leucemia felina, mientras que los frotis de sangre y raspados conjuntivales se emplean en el diagnostico de distemper canino. Los raspados conjuntivales en particular son tiles para el diagnostico de infecciones por herpesvirus y clamidia en gatos. Impresiones hechas del hgado, bazo y pulmones son especialmente tiles para el diagnostico de infecciones por clamidias y herpes virus en psitacinos. Las laminillas deben tener suficiente cantidad de clulas para permitir un examen completo y no ser demasiado gruesas lo cual podra causar dificultades a la tincin. El raspador conjuntival o algn otro implemento (extremo romo de una hoja de bistur) debe emplearse para raspar la conjuntiva; los hisopos de algodn no son adecuados. Los ojos con secrecin deben limpiarse y enjuagarse antes de raspar la conjuntiva. Las impresiones de tejido deben hacerse mediante ligeros toques sobre la laminilla de microscopio con cortes frescos de tejido previamente secados con una toalla de papel para absorber algo de sangre. Las laminillas deben secarse al aire y ser enviadas al laboratorio en cajas para laminillas para prevenir que se
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rompan. Algunas laminillas permiten un trabajo de diagnostico ms completo, incluyendo los exmenes citolgicos.
Suero
Las muestras de sangre deben ser recolectadas en tubos estriles sin anticoagulantes. Estos deben remitirse al laboratorio en recipientes de poliestireno especialmente diseados para evitar que se rompan. Las muestras de sangre no deben congelarse o permitir su sobre-calentamiento. Si las muestras no pueden ser enviadas al laboratorio dentro de un tiempo razonable, puede removerse el suero y refrigerarlo o congelarlo.
Glosario
Alcuota: Dividir en partes iguales (como una solucin) Sondas de referencias: Estos son pequeas extensiones de ADN o ARN empleadas para iniciar la sntesis de cido nucleico. Una sonda de referencia se hibridiza con una cadena modelo de cido nucleico y suministra la terminacin 3 hidroxlica para la iniciacin de la sntesis. Estas sondas de referencia s delimitan la regin que ser amplificada. En PCR, dos (a veces ms) sondas de referencia s sintticos de oligonucletidos (con cerca de 20 nucletidos cada uno) que son complementarios a las regiones en cadenas opuestas flanqueando la secuencia blanco; la terminacin 3 hidroxlica es orientada una a otra. En PCR la secuencia blanco de una muestra tiene entre 100 y 2000 bp de longitud. Se emplean sondas de referencia diseadas y los sondas de referencia arbitrarias ("directamente de la repisa"). Pruebas regulatorias: Estas son pruebas se llevan a cabo bajo el auspicio de agencias oficiales de control de enfermedades, con el fin de controlar importantes enfermedades animales infecciosas. Endonucleasas de restriccin: Son enzimas derivadas de bacterias que reconocen y clivan secuencias especficas ADN. Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin: Estos revelan muchas diferencias en las secuencias ADN entre individuos de una especie. RFLPs son producto del clivaje de ADN por enzimas de restriccin, separacin de los fragmentos por electroforesis en gel y visualizacin de las bandas (fragmentos de ADN) por tincin con bromuro de etidio fluorescente. Polimerasa Taq: Esta es la polimerasa de ADN empleada en PCR. Es derivada de la bacteria Thermus aquaticus que vive en riachuelos de agua caliente; la termoestabilidad de la polimerasa hace posible el PCR.
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