ssit0ina, 13:22 Garcia-Agulla Biotecnologia Vegetal, Vol. 7, Nam. 2 Artis Crttco ISSN 1600-1841 Version npresa) Issn Zora? (Ves slostrica} Aspectos basicos de la conservacién in vitro de germoplasma vegetal Leyanis Garcia-Aguila"*, Manuel de Feria, Karen Acosta?, “Autor para la correspondencia, * Instituto de Biotecnologia de las Plantas, Universidad Central Marta Abreu de Las Vilas, Carretera a Camajuani km. 5.5, Santa Clara, Villa Clara. Cuba. CP 54 830. e-mail: leyanis(@ bp.co.cu * Facultad de Ciencias Agropecuarias. Centro Universitario Vladimir Lenin. Las Tunas, Cuba RESUMEN La conservacién in vitro constituye parte esencial de la estrategia general de conservacién y el intercambio de recursos genétices en todo el mundo, Entre otras ventajas, offece la posibildad de almacenar un gran nndmero y variedad de muestras en un area reducida, ademas de garantizar la sanidad de las muestras @ incrementa la posibiidad del intercambio de materiales vegetales, Existen dos métodos de conservacién in vitro, cuya utiizacion varia en dependencia de la duracién que requiera el almacenamiento, El método de crecimiento minimo se emplea con més frecuencia para conservar durante un periodo de tiempo corto, mientras que la crioconservacién garantiza la conservacién in vitro por largos periodos de tiempo. En particular, la crioconservacién ha sido aplicada en muchas especies para la conservacién de_polen, ‘meristems, pices, embriones cigéticos, embriones sométicos y suspensiones celulares. Se reconocen dos. {grupos de técnicas en la crioconservacién: las técnicas clsicas basadas en la deshidratacién quimica parcial Con el congelamiento programado y las técnicas basadas en la viificacién con congelamiento rapido, Esta Uiima técnica evita la formacién de cristales de hielo en el interior de los tejidos, los cuales son los responsables del dafio mecanico que se produce a las membranas celulares durante la congelacion. Es por ello, que el éxito de la conservacion in vitro se encuentra estrechamente relacionado con el periodo de tiempo requerido para el almacenamiento y con la adecuada seleccién del método de conservacién. Este trabajo resume algunos aspectes basicos de la conservacién in vitro de germoplasma vegetal, asi como los principales resultados descritos por la comunidad cientfica nacional e internacional en la conservacién in vitro de diferentes especies vegetales, Palabras clave: crecimiento minimo, crioconservacién, deshidratacién, vitrficacién ABSTRACT ‘The in vitro conservation constitutes essential part of the general sirategy for the conservation and the exchange of genetics resources in the entire worl It offers the possibilty to store a great number and variety ‘of samples in a reduced area. It guarantees the sanity of the samples and it increases the exchange of plant ‘materials. Two conservation methods in vitro exist, whose use varies in dependence of the duration that requires the storage; the method of minimum growth is used with more frequency to conserve a litle time, while, the cryopreservation guarantees the in vitro conservation for long periods of time. In particular, the cryopreservation has been applied in many species for the conservation of pollen, meristems, apexes, zygotic embryos, somatic embryos and cellular suspensions. Two groups of techniques in the cryopreservation are: recognized: the classic techniques based on the partial chemical denydration and the programmed freezing ‘and the new techniques based on the vitrification that consist on the change from the liquid state to a vitreous denominated intermediate state and that it avoids the formation of glasses of ice responsible for the ‘mechanical damage {o the cellular membranes during the freezing. I is known that the membranes of the vegetable cells can be damaged by the action of different biophysical and biochemical factors and they need Special chemical protection during the cycle of freezing-unfreezing with treatments cryoprotectors with substances of a heterogeneous group of compounds that have great affinity for the water and that to certain ‘concentrations they are not toxic, Some basic aspects of plant germplasm in vitro conservation and the main results decribed by the national and international scientific community about in vitro conservation of different plant species are sumarized in this research. Key words: cryopreservation, dehydration, minimum growth, vitrification INTRODUCCION La conservacién de germoplasma vegetal como actividad cientiica fue propuesta en los afios 70 del siglo XX ‘con el objetivo de prevenir la erosién genética y mejorar la productividad agricola de muchas especies a partir de Ia conservacién de diferentes especies y genes de interés. Existen dos estrategias bésicas para la conservacion de germoplasma vegetal, la conservacion in situ y la conservacién ex situ (Nodarse of al. 1998) htpssrevista iop.co.cuindex.php/BViniprinlorFriendly/359/727 Bltecnooa Vee nessit0122, 13:22 Gareia-Agulla En la conservacién in situ las especies se mantienen en su habitat natural, generalmente en parques nacionales, reservas biolégicas y reservas ecolégicas. Mientras que, en la conservacién ex situ las especies se preservan fuera de su habitat natural, en bancos de semillas botdnicas, bancos de plantas en campo o en bbancos de plantas in vitro. Los bancos de semillas boténicas resultan de gran utlidad en especies que se propagan sexuaimente y cuyas semillas se mantienen viables durante un largo periodo de almacenamiento, pero no deben aplicarse para conservar especies de plantas con semillas botanicas de corta supervivencia, ni pueden emplearse en ‘caso de trabajar con plantas autoincompatioles, 0 plantas de propagacién vegetativa obligada. En estos casos, la diversidad genética de estas especies se puede conservar mediante bancos de plantas en campo 0 ‘mediante téenicas de conservacién in vitro (Graudal etal 1997). Los bancos en condiciones de campo tienen como limitante que se nacesitan grandes extensiones de tierra, los costos por mantenimientos asociados a las labores agrotécnicas son altos, se hace necesario controlar plagas y enfermedades y ademas son vulnerables a los desastres climaticos. Es por ello, que el desarrallo de nuevas técnicas de conservacién, han permitide preservar mejor los recursos genéticos importantes para ‘muchos paises (Ortiz, 2000), En particular, los avances alcanzados en el cultivo in vitro en diferentes especies vegetales dieron la posbbilidad de desarrollar nuevas alternativa para la conservacién ex situ, al permitir disponer de suficientes Individuos en periodos de tiempo relativamente cortos y faciltar la manipulacién del material vegetal al ser plantas con un desarrollo fisiolégico homogéneo. Desde entonces, la conservacién in vitro de germoplasma vegetal constituyé una herramienta de trabajo que apoyé Ia conservacién de semllas boténicas y la ‘conservacién en campo, ya que permitié tener duplicados seguros de aquellos genotipos de particular interés (Engelmann y Takagi, 2000). Esta via de conservacién puede efectuarse a través de dos métados: el crecimiento minimo y la crioconservacién. El método basado en el orecimiento minimo es el mas generalizado, se basa en modificar las condiciones 6plimas de cultivo, para disminuir la velocidad de crecimiento normal de la especie objeto de estudio, con lo ‘cual se reduce la frecuencia de transferencia de las plantas a medio de culo fresco, ‘A mediados do los afos 90 del siglo XX, la conservacién de germoplasma vegetal implcé ademas, la Inmersién directa de los explantes en nitrégeno liquide (crioconservacién) y dentro de este método' de conservacién, el procedimiente de vitrficacién demostré ser el més efectivo y empleado por muchos autores (Lambardi et al, 2000; Tsukazaki et al., 2000; Hirai y Sakai, 2003; Wang et a., 2004; Caccavale et al, 2005). TTeniendo en cuenta los aspectos anteriormente descritos este trabajo tuvo como objetivo mostrar através de tuna descripcién bibliografica aspectos basicos de la conservacién in vitro de germoplasma vegetal, asi como los principales resultados descrtos por la comunidad cientifica nacional e intemacional en la conservacién in vitro de diferentes especies vegetales. IMPORTANCIA DE LA CONSERVACION IN VITRO DE GERMOPLASMA VEGETAL La conservacién in vitro constitye parte esencial de la estrategia general para la conservacién y el intercambio de recursos fitogensticos 2 nivel mundial. La misma ofrece la posibilidad de almacenar un elovade nimero y variedad de muestras en un area reducida y facilta el acceso a ellas para su evaluacién. Sus condiciones asépticas garanlizan mayor sanidad de las muestras y en consecuencia permiten incrementar el intercambio de materiales vegetales sanos. Sin embargo, para establecer cualquier estrategia de conservacién in vitro, se hace indispensable el dominio de una metodologia de propagacién que garantice altos porcentajes de supervivencia, El principal objetivo de los bancos de germoplasma in vitro es conservar las especies que presentan semilas boldnicas de corta y poca viablidad, cultivos de propagacién vegetativa o clonal, @ que son allamente heterocigdticos y requieren ser propagados vegelalivamente para conservar su inlegridad genética. También se han incluido raices y tubérculos de corta vida en el proceso de almacenamiento, como Solanum ‘tuberosum L. (papa), Ipomoea batata L. (boniato) y Manihot esculenta Crantz (yuca) (Frankel, 1996). Caracter 8 fisiolégicas de los. nin vitro jidos vegetales para la conserva: El origen del material vegetal a conservar puede ser in vivo o in vitro, especialmente este diimo offece la ventaja de esiar en condiciones aséplicas, libres de microorganismos contaminantes (Dereuddre y Engelmann, 1987). Como regia general, debe ser escogido en estado juvenl. Las eélulas meristematicas en activa divisi6n son mas resistentes a las bajas temperaturas por tener un tamafio pequefio, citoplasma denso y pocas vacuolas, razones por las cuales el contenido de agua inlracelular es bajo, aspecto importante a tener en cuenta para evitar darios durante el proceso de congelacién (Engelmann, 2000), Las plantas cultivadas in vitro para ser conservadas deben haber sido objeto de un subcultivo reciente a ‘medio de cullvo fresco. En este sentido, Harding y Staines (2001) expresaron que la susceplibilidad de los pices de papa a la congelacién aumenté @ medida que las plantas in vitro tenian un mayor niimero de dias de subculivadas a medio de culivo fresco, METODOS DE CONSERVACION IN VITRO hitpstrevisa.iop.co.clindex.phplBViprilerFriencly959/727 anassit0122, 13:22 Gareia-Agulla Existen dos métodos de conservacién jn vitro cuya ullizacién varian en dependencia de la duracién que requiera el almacenamiento,Para corto © mediano plazo el objetivo es reducir la velocidad de crecimiento del material vegetal, en este caso, puede ser empleado el método de crecimiento minimo, por su parte la crioconservacién garantiza la conservacién in vitro por periodos prolongadas de tempo, Método de crecimiento minimo El método de crecimiento minimo ha sido ampliamente uliizado en la préctica para la conservacién de germoplasma, existen varios ejemplos de su aplcacién en la creacién de bancos in vitro. Entre otros, se pueden mencionar los casos de Saccharum sp. (cafia de azticar) (Taylor y Dukin, 1993), yuca (Roca et al, 1984) y papa (Toledo y Golmirzaie, 1998). Este método constituye una de las principales variantes que puede garantizar el éxito de un programa de conservacién, debido a que es relativamente sencillo y puede ser establecido con faciidad con el equipamiento que normalmente existe en un laboratorio de cultvo de tejdos. Para reducir la velocidad de crecimiento de las plantas in vio es necesaro alterar las condiciones Sptimas de cultvo. Para ello se realizan modificaciones en la composicién del medio de cultivo, como pueden ser la disminucién del contenido mineral (Rayas ef al, 2002), la adicién de agentes osméticos actives yio la incorporacién de retardadores de crecimiento (Espinosa et al, 2002), Este método es conocido también como crecimiento reducido pues como se ha explicado se basa en la disminucién de la division celular y el metabolismo de la planta. Tiene como objetives incrementar la ongevidad in vitro de los culivos sin que se produzcan cambios genétices, por tanto, no hay una detencién total de los procesos celulares sino una disminucién en la velocidad conque ocurren los mismos y asi se reduce la frecuencia de transferencia de las plantas a medio de cultivo fresco (Roca et a, 1994). La modificacién en la composicién de los medios de cultive es una forma de limitar el crecimiento, por ejemplo, el crecimiento in vitro de plantas de yuca disminuy6 proporcionalmente con el contenido de ritségeno total de! medio de cultivo; concentraciones por debajo de 10mM, en término de numero de tallos y ‘nudes por tallos resultaron penuciciales (Roca ef a1, 1994). Autores como Gareta ef al. (2004) conservaron, con calidad y durante seis meses sin realizar subcultves, plantas in vitro de cafia de aziicar, con la reduccién de las sales propuestas por Murashige y Skoog (1962) fentre 25 y 50% de su concentracién normal La limitacién del crecimiento por efecto de la concentracién osmética se debe a la reduccién de la adsorcién de agua y nutrientes del medio de cultivo. La sacarosa como es altamente metabolizable, puede actuar como agente osmético en concentraciones elevadas, Otros agentes osméticos no metabolzables, como el manitol y al sorbitol, son més efectivos en la limitacién del crecimiento, porque interactian con el contenido de Ssacarosa y la temperatura de conservacion (Bhat y Chandel, 1993) ‘Autores como Bertrand ef a. (1992), estudiaron la respuesta de microesquejes de cafeto en presencia de diferentes concentraciones de sacarosa y su interaccién con la temperatura, ellos observaron que las bajas ‘concentraciones redujeron el crecimiento, enraizamiento y porcentaje de supervivencia, después de siete meses de conservados a 20 °C, Los mejores resultados los obtuvieron en un medio de cultivo que contenia ‘como minimo 20 g."" de sacarosa y una temperatura para el crecimiento de 20 °C. Por su parte, Panis ot a. (1996) trabajando con Musa sp. indujeron la formacion de brotes meristematicos en presencia de altas concentraciones de 6-bencilaminopurina (6-BAP) y estas estructuras fueron més resistentes a las bajas temperaturas que los propios meristems. ‘Suksa of al, (1997), lograron altos porcentajes de supervivencia en apices in vitro de Carica papaya L. (papaya), después de 12 meses de conservacién a 16 °C y comprobaron que la adicién 5.0 yM de dcido absicico al medio de cultivo ivluyé satisfactoriamente en la disminucién del crecimiento de los épices. Estos autores observaron ademas, una severa suculencia de los apices de papaya conservados en medio de Cultivo que contenia manitol y comprobaron que la adicién de altas concentraciones de sacarosa al medio de cultivo no mejoré la resistencia de los apices al tio De igual forma, Garcia ef al. (2004) redujeron el crecimiento en longitud de plantas in vitro de cafa de azuicar con el incremento de la concentvacién de manital en el medio de cultvo, de esta forma las plantas se pudieron conservar durante 12 meses consecutivos a una temperatura de 15 °C Eventualmente en los cultives conservades in vitro, debido a las bajas temperaturas, la alta concentracién ‘osmética, la reduccién de la concentracién de sales inorganicas y la presencia de inhibidores del crecimiento, se puede producir un oscurecimiento de los tejidos, seguido por desfoliacién, Esto se atribuye a la oxidacién fendlica y a la induccién de senescencia por la presencia de determinadas concentraciones de gases como el etileno, especialmente cuando se ulllizan frascos pequefios o han sido sellados herméticamente. Roca et al, (1934), observaron una disminucién de la desfoliacion y una reduccién de la tasa de crecimiento a la rmitad, en dos variedades de yuca, al adicionar al medio de cultivo un 0.25% de carbén activado, La intensidad y calidad de Ia luz, son otros factores importantes en el control de la velocidad de crecimiento, especialmente en su inleraccién con la temperatura, que como ya se ha expresado, es otro de los factores, ‘mas utlizados en la conservacion mediante el método de erecimiento minima, hitpstrevisa.iop.co.clindex.phplBViprilerFriencly959/727 anassit0122, 13:22 Gareia-Agulla Método de crioconservacion Para conservar a largo plazo se emplea la rloconservacién (almacenamiento en nitrégeno liquide a -196 °C), ya que se detienen todos los procesos metabdlicos y la divisién celular, ademas, el material vegetal crioconservado se puede preserva en espacios reducidos, en condiciones seguras, sin variabilidad genética yssin grandes costos de mantenimiento (Hirai y Sakei, 2000), ‘Segin Engelmann y Takagi (2000), se reconocen dos grupos de téenicas en la crioconservacién: las técnicas clasicas basadas en la deshidratacién quimica parcial con osmoprotectantes y congelamiento programado y las nuevas técnicas basadas en la vitificacién, que consisten en el cambio del estado liquido a un estado intermedio llamado vitreo que evita la formacién de cristales de hielo, los cuales son la principal causa del dao mecénico @ las membranas durante la congelacién (Towill, 1996), Dentro de estas nuevas técnicas se reconocen siete procedimientos que incluyen: encapsulacién- deshidratacién, vitificacién per se, encapsulacién-vtrficacién, desecacién, precrecimiento, precrecimie desecacién y técnica de la microgota (Engelmann, 2000), La crioconservacién en nitrégeno liquide, ha sido aplicada on muchas especies para la conservacién de polen, meristemos, dpices, embriones cigéticos y somiticos, suspensiones celulares (Huarte y Rigato, 2001; Baek ef al, 2003; Martinez ef a, 2004; Keller ef al, 2005; Ochatt, 2005). Existen mecanismos que determinan cémo los sistemas biolégicos responden ante la disminucién de las temperaturas y la solidifcacién del agua liquida, por ello, es necesario conocer los aspectos basicos que tienen lugar durante la congelacién del agua como evento decisivo para desarrllar una metodologia de ctioconservacién. En este sentido, se destacan los procesos de nucleacign y vitrficacién. Nucleacién Diferentes autores han realizado definiciones aclaratorias sobre los fendmenos que ocurren durante la formacién de los cristales de hielo a bajas temperaturas. Por ejemplo, Zachariassen y Kristiansen (2000) cexplicaron que para ollos la definicién de punto de congelacién de una solucién, es la temperatura donde el Uikima y més pequefe cristal de hielo se derrta cuando una solucién congelada se calienta lentamente, a ‘este momento también se le denomina temperatura de congelacién en equilbrio o punto de fusién. Esios autores plantearon que el fenémeno por el cual las soluciones se encuentran aun en estado liquido a la temperatura de congelacién en equilbrio se le conoce como subenfriamiento y la temperatura os denominada como punto de subenfriamiento de la solucién. Ademds, diferencian que de manera no generalizada pueden aparecer cristales de hielo a determinada temperatura sin afectar el punto de fusién de la solucién y denominan a este fendmeno como histéresis térmica y la temperatura a la que ocurre como unto de congelacién de histéresis Otros autores como Belous of a. (1987) plantearon que existen diferencias entre los procesos de nucleacién homagénea (formacién esponténea de nucleos de cristales de hielo) y helerogénea (adicién de algin catalizador para inducirlos). Zachariassen y Kristiansen (2000) apoyan estas diferencias y definen que la rhucleacién homogénea es causada por las propiedades de atraccién electrostética entre las partes polares. de las moléculas de agua para formar agregados en forma de cristales de hielo a medida que disminuye la temperatura y que la nucleacion heteragénea es cuando la agregacién de las moléculas de agua se cataliza por sustancias diferentes a estas moléculas. Posteriorments, Wilson etal. (2003) se oponen a esta diferenclacién y demostraron que la nucleacion en las soluciones biolégicas son todas heterogéneas y el término de nucleacién homogénea debe ser evitado. Estos autores plantean que en la practica la nucleacién homogénea es poco probable de lograr en Condiciones de laboratorio y solamente el término debe ullizarse en situaciones muy precisas como en el caso de pequerias muestras de agua ultra-pura emulsionadas en aceite que tiene una temperatura alrededor de los -40°C. Vitricacién Cuando una solucién esta altamente concentrada y por ende viscosa, ésta no permit la iniciacion de cristales de hielo ni su crecimiento. Si se aisminuye répidamente la temperatura a valores muy bajos, la solucién puede llegar @ convertrse en un s6lido amorfo (vireo) sin la formacion de ctistales de hielo (Franks, 2003). Este proceso se denomina vitiicacin y ene lugar ala temperatura de transiién vitea (Ta). Para realizar la erioconservacién mediante la vitificacién, Fahy ef al. (2000) propusieron que se requiere de luna congelacién por debajo de la temperatura de transicién vitrea de la mezcla crioprotectora y un recalentamiento sin la formacién de hielo. Ellos plantean ademas, que el problema de la toxicidad del crioprotector se minimiza cuando se utliza la menor concentracién posible de la mezcla crioprotectora y que sia concentracién minima se determina por la concentracién donde la temperatura de nucleacién homagénea (T,) se inlercapta con la temperatura de transicién viteea A concentraciones més bajas, la muestra debe atravesar la zona enive Ty y Ty donde la nucleacion homogénea del hielo es inevitable. A concentraciones altas, la vitrficacién es teéricamente posible a ‘cualquier velocidad de congelacién o recalentamiento sila nucleacién heterogénea no esta presente, hitpstrevisa.iop.co.clindex.phplBViprilerFriencly959/727 anassit0122, 13:22 Gareia-Agulla Sin embargo, segiin Franks (2003), en la préctica la nucleacién heterogénea siempre esté presente como obstaculo a ia vilficacién. Este autor explca, ademas, que después de la vitricacién se necesita una velocidad de calentamiento répida para evtar el crecimiento de los cristales de hielo (desvtriicacién) que comienza a temperaturas cercanas a la terminacién de la congelacion @ inicio del recalentamiento El proceso de vitrficacién es de gran importancia para la supervivencia de las células vegetales congeladas hasta -196 °C, ya que previene la formacién intracelular de cristales de hielo. El sélido amorfo (vitreo) presenta una menor presién de vapor de agua que el correspondiente sélido cristalino, y no permite la sobre- deshidratacion causada por la congelacién extracelular. Como consecuencia, el sélido amorfo ademas disminuye la contraccién celular, el aumento de la concentracién de solutes intornos y las alteraciones en el pH de la célula. Ademas, como la formacién vitrea es muy viscosa, ésta puede detener todas las reacciones quimicas que requiere una difusién molecular, de esta forma, la vitificacién de las oélulas vegelales garantiza la dormancia y establlidad durante el tiempo de almacenamiento en ritrégeno liquide (Franks, 2003). Estrategia de deshidratacisn de! material vegetal Una metodologia tnica de crioconservacién que sea aplicable de manera exitosa para los diferentes tipos de fejidos vegetales alin no se ha desarollade. Sakai (2000) distinguid cuatro estrategias posibles: |) doshidratacion osmética del material vegetal previa a la congelacién; Il) deshidratacién del material vegetal por congelacién lenta; ll) deshidratacién del material vegetal por vitrifieacién completa; IV) deshidratacién del ‘material vegetal por secado al aire. De las cuales, las mas utllzadas se describen a continuacién: Estratogia de doshidratacién de! material vegotal por virifcacién completa ‘Se refiere a la formacién tanto intracelular como extracelular de una estructura séida amorfa estable (vitrea) ‘cuando se someten las células a la temperatura del nitrégeno liquido (Sakai, 2000). Ello se logra al deshidratar el material vegetal y de forma répida por la accién de una solucién vitificadora altamente concentrada la temperatura del mismo se hace variar de 25 a 0 °C antes de colocar las muestras directamente en ritrégeno Iiquido. Las soluciones vitrificadoras no sélo reducen el contenido de agua en la Célula sino que también penetran en los espacios interstciales y contribuyen a inhibir la formacién de los ctistales de hielo en el medio intra y extra-celular durante el enfriamiento répido (Panis, 1995). Sin embargo, el problema fundamental de la vitrficacién completa radica en la necesidad de controlar la duracion del tiempo de exposicién a las soluciones vitrifcadoras ya que pueden causar dafos por una deshidratacién ‘excesiva o por toxicidad debido a una alta concentracién de la misma (Reed, 2001). Los primeros estudios sobre la crioconservacién de plantas basada en la vitrficacién completa fueron realizados por Uragami et al. (1989) con embriones somatices de Asparagus officinalis L. y Langis et al (1989) con suspensiones celulares de Brassica campestris. Desde entonces, la aplicacién de esta estrategia ha permitido que hayan sido almacenados un elevado nimero de materiales vagetales como células nnucleares de Citrus sinensis (Sakal et al, 1990) y protoplastos de Secale sereale (Langis y Steponkus, 41981), apices vegetativos de Ananas comosus (pita) (Gonzalez et al-, 1998), yuca (Charoensub et a, 1999), boniato (Pennycooke y Towil, 2000) y Anigozanthos humilis (Turner etal, 2001), entre otros. Diferentes soluciones vitificadoras se han utllizado, pero la reconocida como Plant Vitnfcation Solution # 2 que contione 30% de glcerol, 15% de atilenglcol, 15% de dimetilsulféxido y 0.4 mol" de sacarosa ha sido la ‘mas emoleada (Sakai, 2000), Estrategia de deshidratacion de! material vegetal por congelacién lenta ‘Se basa en la disminucién de la temperatura mediante un enftiamiento lento hasta una temperatura de precongelacién (-40 °C), sequido de la inmersién répida de las muestras en ritrégeno liquido (Sakai, 2000). La reduccién lonta de la temperatura durante el enttiamiento conduce a la deshidratacién de las células por la aparicién de cristales de hielo extracelulares, que causan la disminucién del volumen celular isoténico y producen el incremento de la concentracién de salutes. Generalmente una velocidad entre 0.5-2.0 °C.min'* se considera como lenta aunque en ocasiones velocidades tan bajas como 0.1°C.min“ o tan répidas como 10°C. min’ también se aplican (Withers, 1980), Cuando se obtienen temperaturas entre -35 6 ~40°C, el material vegetal se transfiere a nitrageno liquido y se asume que en estas condiciones toda el agua congelable abandoné la célula y el medio intracelular esta altamente concentrado (Sakai, 2000). La principal limitante para aplcar la estrategia de deshidratacién por congelacién lenta en un gran numero de laboratorios @ nivel intemacional radica en que se necesita un equipamiento programable de la velocidad de enfriamianto con un alto costo, par lo que los centros de investigacién-desarrollo con escasos recursos no pueden utilizar esta modalidad criogénica (Reed et al, 2001). Tratamientos crioprotectores La mayoria de los todos vegetales hiratados necesitan una proteccién quimica especial durante el ciclo de congelacién-descongelacién, para ello se emplean ratamients crioprotectores con sustancias de un grupo hitpstrevisa.iop.co.clindex.phplBViprilerFriencly959/727 en2ssit0122, 13:22 Gareia-Agulla heterogéneo de compuesios que tienen gran afinidad por el agua y que a determinadas concentraciones no resullan tdxicos al sistema (Chen y Kartha, 1986). Estos tratamientos pueden aplcarse mediante pre-cultivos, fen base semisélia 0 liquida que sirven de medio de suspensién para las células y los tejidos durante la congelacion Han sido descrtas dos categorias de sustancias crioprotectoras: penetrantes y no penetrantes (Panis, 1995), En al primer grupo se encuentran el dimetisulf6xido, metanol y el glicerol y en el segundo estén presentes los azticares, alcoholes azucarados y aditivos de alta masa molecular. La aplicacién de los cxioprotectores penetrantes incrementa el volumen de la solucién intracelular, evitan una excesiva concentracion de electrditos tdxicos en la fase no congelable 0 aumentan la permeabilidad de la membrana citoplasmética contrbuyendo a la deshidratacién. Acicionalmente, 2 los crioprotectores: ppenetrantes se los atribuye la accién de disminuir ol punto de fusion de la solucion intracelular, factor decisivo para evitar la formacién de cristales de hielo en el medio intracelular (Mazur, 1984), Los compuestos no penetrantes actin fundamentalmente como agentes osméticos desde el medio extemo y contribuyen a reducir la cantidad de agua intracelular que puede congelarse. Sin embargo, segin Panis (1995), no existia una explicacién convincente de cémo funcionaban las sustancias crioprotectoras o donde Se encontraban los sitios evticas de proteccién. Estas interrogantes alin no cuentan con respuostas comprobadas. Generaimente, se han empleado con buenos resultados las mezclas de sustancias crioprotectoras. Esto se dobe a las ventajas que oftece la combinacién de las sustancias clasificadas como penetrantes y las no penetrantes, como por ejemplo, la mayor estabilidad fisica de las mezclas a las bajas temperaluras on relacién con la de un componente simple y la accién protectora ante la toxicidad de unos compuestos con respecio a otros (Kartha of al, 1988). Sin embargo, segiin Reed etal. (2001) hasta entonces, la seleccién del tipo y concentracién de los agentes croprotectores atin se realizaba de manera empirica en dependencia de la tolerancia de las células a crioconservar. Descongelacién La descongelacién es un proceso sencilla, pero esta considerado como el paso mas criico durante la ctioconservacién. Mazur (1984) explicé que el objetivo fundamental es evitar la fusién de los microcristales de hielo formados durante la congelacién, fenémeno conocido como re-cristaizacién. Si tal fusién legara a ‘ocurtr, entonces se podrian formar grandes cristales de hielo que dafarian la integridad celular. Tratamientos de post-congelacién ‘Se basan en cultivar el material vegetal descongelado en condiciones que permitan una correcta recuperacién, En general, es importante tomar todas las medidas para recuperar la especie vegetal en ‘cuestién en esta etapa del proceso, por ejemplo, incubar a niveles bajos de luz o en algunos casos en la completa oscuridad (Benson, 2000); atenuar el choque osmético causado por una inmeciata transferencia a lun medio de cultivo con bajo potencial osmético mediante la sucesiva transferencia a medios de cultivo con ‘menos concentracién de sacarosa (Schrmakers y Van lren, 1995); utlizar cambios de medio de cultivo somisdlide a liquidos para mejorar el recrecimiento (Dussert ef al, 1992) y eliminar progresivamente las sustancias crioprotectoras mediante lavados (Gnanapragasam y Vasil, 1992). ‘Se recomienda que posterior a la descongelacién los explantes se cultven sobre papel de fitro colocado en lun medio de cultvo semiséiido. Esto posibilta fa transferencia simple del material vegetal hacia un medio de Cultivo fresco y la lenta difusién de los crioprotectores, lo cual es beneficioso para la recuperacién celular ya que evita un estrés osmético (Withers, 1987), Efecto del genotipo ‘Autores como Reed et al. (2001) plantearon que se necesita siempre tener en cuenta el factor genotipo para validar cualquier protacolo de crioconservacién. Tumer ef al. (200%) demostraron que results eficiente utilizar primero una especie indicadora (en su caso Anigozanthos viridis que tenia un alto coeficiente de ‘multiplicacién in vitro) para mejorar un protocolo de crioconservacién y después aplicarlo a otras especies relacionadas, pero clasificadas como material vegetal de gran valor. Engelmann (2000) explicé que en una ‘metodologia de crioconservacién se debe tener en cuenta el genotipo y que existe un rango de temperatura fen que la especie vegetal se puede conservar mejor y que sobre esa base podria ser conveniente mejorar la eficiencia del procedimiento para un genotipo élite, lo cual justficaria la realizacién de alustes al protocolo de CRIOCONSERVACION DE APICES Método de vitrificacién El principio del método por vitificacién es deshidratar un pice por la exposicién de este a una solucién de vitnficacién con alto potencial osmético (Wang y Deng, 2004). El método incluye bésicamente los siguientes, pasos: 1) Preparar y seleccionar los apices; 2) precultivar los pices para el desecado con agentes ‘osmaticos; 3) tratamientos con soluciones con crioprotectores; 4) deshidratar por exposicién a una solucion de vitrficacién con una disminucién de la temperatura desde 25 hasta 0.0°C; 5) inmersién cirectamente en hitpstrevisa.iop.co.clindex.phplBViprilerFriencly959/727 enassit0122, 13:22 Gareia-Agulla ritségeno liquido y almacenaje; 6) descongelacién répida; 7) remover la solucién de vitificacién y finalmente pponer los apices en condiciones apropiadas para su recuperacion Este método ha sido descrito para la crioconservacién de cultivos embriogénicos de especies de coniferas (Cyr, 2000; Haggman et a, 2000; Touchell et i., 2002) Método de encapsulacién-deshidratacién Este método se basa en la encapsulacién del dpice para protegerio y preculivario en un medio de cultvo tenriquecide con agentes osmaticos lo cual lo hace mas tolerante al desecado con aire (Wang et al., 2005}, E| método consiste basicamente en: 1) preparar y selecclonar los apices: 2) encapsular los pices de brotes desecados en gotas de alginato; 3) precultvar en presencia de agentes asméticos (sacarosa, sorbitol glicerol, entre otros); 4) desecar en una cabina de flujo laminar 0 con silica gel; 5) inmersién répida en rits6geno liquido y almacenar; 6) descongelacién répida y 7) colocar los apices en condiciones apropiadas para su recuperacién. Este método ha sido aplicado para suspensiones celulares, embriones somiaticos y apices de numerosas especies vegetales de origenes templado y tropical (Shibi ef a, 2001), Otros métodos desarrollados y aplicados con éxito Existen otros métodos que a pesar de ser operacionalmente simples, han sido aplicados a un limitado indmero de casos para apices de brotes. Ejemplo de ello es el método de precrecimiento-desecacién descrito fen Asparagus officinalis L. por Uragami ef a. (1990) que consistié en: 1) Precultivo con agentes osméticos, 2) deshidratado en cabina de flujo laminar, (3) inmersién directa en ritrogeno liquido, (4) descongelacén ‘pida y 5) cultivo en condiciones apropiadas de recuperacién, o el método mejorado por Escobar of al (1997) para dpices de brotes de yuca que combind ademés de los pasos anteriores, una lenta congelacién fen sustitucion del tercer paso anteriormente descrito, Con la aplicacién de etros métodos como la encapsulacién-vitificacién se han podido crioconservar brotes: apicales de plantas in vitro de boniato (Pennycaoke y Towil, 2001) y yuca (Danso y Ford, 2003; Charoensub et al, 2004). Otros autores como Wang ef al. (2005) se han referido a este método de encapsulacién- vitnficacién como el procedimiento de mayores resultados en Ia crioconservacién de brotes apicales in vitro para la especie Rubus idaeus L. (frambuesa) donde obluvieron una alta supervivencia (85%) y regeneracion (75%) de los brotes apicales crioconservados. La papaya (Carica papaya L.}es uno de los cultivos en los que se han experimentado notables avances. ‘Autores coma Ashmore ef al. (2000) desarrollaron técnicas y procedimientos para la conservacién in vitro y crigconservacién de brotes axlares y yemas apicales de plantas in vitro través de un simple protocolo de vitrficacién. Igualmente, Buerhing (2003) desarrolé un protocolo de crioconservacién para al suministro continue de cultivas embriogénicas para realizar transformacién genética y Wang ef al. (2004) emplearon Spices de cuatro a sels semanas de cultivo de plantas in vitro de seis cullvares que fueron crioconservados. con éxito también por vitrifcacion DETERMINACIONES ANALITICAS COMO INDICADORES DE LOS DANOS INDUCIDOS POR LA ‘CRIOCONSERVACION EN LAS MEMBRANAS CELULARES. Durante la ctioconservacién, las membranas celulares de las células vegatales pueden dafarse por la accién de diferentes factores (Leununa y Keller, 2005) entre los que se encuentran la exposicién de las células a las bajas temperaturas, la formacién de cristales de hielo y una severa deshidratacién durante Ia congelacién ‘Ademas, puede ocurrirla formacién de radicales libres, desacoplamiento metabslico y peroxidacién lipidica Para todas las células, Mazur (1970) propuso la hipétesis de dos factores de dario por congelacién basado fen los efectos biofisicas de la formacién de los cristales de hielo y en los efectos dinémicos de la velocidad de enttiamiento. Al utiizar una velocidad de enfriamiento rapida aparecen cristales de hielo intracelulares de Un tamaiio considerable que causan dafies irteversibles y por lo tanto, consttuyen el primer factor de esta hipstess. El segundo factor se atrbuye a la deshidratacién causada por la formacién de los cristales de hielo. Si se ‘emplea una velocidad lenta de en‘riamiento, la formacién de los cristalas de hielo se induce primero en el compartimiento extracelular, el dao se atribuye entonces a una extrema deshidratacién osmatica (también denominada efecto de solucién), provocada por la salida del agua hacia el exterior de la oélula para compensar el deficit de vapor que produce el evento de congelacién (Steponkus y Webb, 1992) La respuesta de las células a la congelacién, depende de las propledades de las membranas colulares. Los lipidos de las membranas sufren una transicién de fase desde liquida-cristalina hasta gel. La coexistencia do ambas fases, en la estructura de las membranas, causa la pérdida de electrolitos y por lo tanto, las células: mueren (Steponkus y Webb, 1992). Debido a que no todos los lipidos tienen la misma temperatura de transicion de fase, la separacién de las fases puede tener lugar, formando dominios ricos en fases en estado de gel. Durante el calentamiento, estos dominios pasarén a formar estructuras no-lamelares, lo cual causa también le pérdida de electroltos y la muerte celular (Quinn, 1985), Seguin Usami etal, (1995) durante la exposicion @ las bajas temperaturas, las proteinas de las membranas se pueden inactive hitpstrevisa.iop.co.clindex.phplBViprilerFriencly959/727 m2ssit0122, 13:22 Gareia-Agulla Una crioconservacién exitosa durante una congelacién lenta de las células vegetales con sustancias ctigprotectoras puede ser posible, si se evita la formacién del hielo en las células con la nucleacién en el ‘medio extra-celular. Sin embargo, las membranas pueden sufrir dafios por las fuerzas mecnicas de los cristales de hielo en cracimionto y su adhesién a la superficie de las membranas (Grout, 1995). La etapa de deshidratacién es neceseria para evitar la formacién de hielo intracelular, que provoca el ‘aumento de Ia concentracién de solutos en las células y una fuerte plasmélisis de éstas (Towill, 1990). Los problemas asociados a las plasmolisis aumentan durante la congelacién, cuando las células se desplasmolizan. Por ejemplo, la contraccién osmética conlleva a la formacién de vesiculas endocitticas, lo ‘cual proveca la lisis celular durante la expansién osmética debido a que el material membranoso no est disponible répidamente para faciltar la desplasmélisis. También, las membranas pueden sufrr fusiones. ‘cuando estan en contacto cercano durante la plasmélisis (Steponkus y Webb, 1992). Eventos biaquimicos tales como la formacién de ragicales libres, desacoplamiento metabélico y peroxidacién lipioica promueven varios cambios sub-letales como el desacoplamiento metabélico que conlleva a la produccién de radicales libres t6xicos. Estas moléculas tienen electrones impares que causan dao por la extraccién de electrones en macromoléculas esenciales como lipides, protefnas y acido desoxinibonucleico, EI acoplamiento metabslico estable y una proteccién antioxidante eficiente, bajo condiciones fisiolégicas nnormales para las células, aseguran que los dafios por los racicales libres no ocurran (Dumet y Benson, 2000). El estrés a que esta sujeto el material vegetal durante la crioconservacién puede promover la produccién de radicales libres (Benson, 2000). Los més importantes son el radical hidroxilo, el radical superéxide y el pperdxido de hidrogeno. Estos radicales libres atacan Ia fraccién lipiaica de las membranas, lo que trae como resultado la formacién de los peréxidos de lipidos y éstos a su vez son inestables y forman productos téxicos de la oxidacién secundaria (Esterbauer ef al, 1988). Los productos de la peroxidacién lipidica son aldehidos ‘muy citot6xicos, entre los mas dafinos se encuentran el malondialdehido y el hidroxi-2-nonenal (Adams ot al, 1989) Existon evidencias que sugieren la presencia de las radicales libres mediados por ol estrés oxidativo durante la aplicacién de protocolos de crioconservacién, desecacién y manipulacién en el cutivo de tejidos (Benson, 2000). Esto se ojempliica por la deteccién indirecta (Benson y Dutra, 1988) y directa (Magill et al, 1994) do los radicales libres en células vegetales que han suftido tratamientos de congelacién, crioconservacién y desecacién. También, se han detectado productos de peroxidacién lipiaica secundaria en suspensiones Celulares (Benson et a., 1995) y en tejdos estresados por el cultvo in vitro (Robertson et al, 1995). Debido a la pérdida de agua, los componentes celulares se concentran y se convierten en agentes téxicos, que coagulan o se precipita, Varios trabajos sobre el estudio del comportamiento de las prote/nas durante la deshidratacion por la congelacién convergen en que las enzimas solubles, las proteinas asociadas a la membrana y al citoesqueleto y las subunidades ribosomales se encuentran sujetas a cambios con el incremento de los solutos celulares (Guy, 1989). 15 de los dafios Importancia de las técnicas analiticas para elucidar las bases biofisicas y bioquit inducidos por la crioconservacién ‘Como se ha mencionado, los dafos a la membrana durante la congelacién-descongelacién son numerosas; por lo tanto, un estudio mediante técnicas anallicas ayudaria a comprender y elucidar las bases biofisicas y bioquimicas de los dafos inducidos por la crioconservacién, Sin embargo, hasta la fecha las investigaciones. realizadas no son numerosas y algunas que se ejecultaron son caras y complejas (Dumet y Benson, 2000) y tuvieron como objetivo detectar y visualzar en tiempo real los dafios celulares, razén por la cual, la mayoria de las investigaciones solo hacen uso de técnicas analticas indirectas. Entre estas téonicas utlizadas para evaluar el efecto del estrés de la deshidratacién y las bajas temperaluras, se encuentran la determinacién de la pérdida de electroltos (Sun, 1999), de la peroxidacion lipidica (Ait Barka of al, 2000) y la de cambios en el metabolismo de las proteinas (Sun et al., 2002; ‘Svensson ef al, 2002) La pérdida de electrolitos, se ha utlizado para estudiar la sensibilidad a la desecacién y al ffo en semilas botdnicas poco viables de Quercus rubra (Sun, 1999). Ademas, se han usado para evaluar fos darios en las ‘membranas por las bajas temperaturas a diferentes genotipos de Coffea sp. (Scott etal, 2003), Los cambios de peroxidacién lipidica por su parte, raen asociado la formacién de aldehidos téxicos durante tuna oxidacién secundaria (Cassells y Cury, 2001; Gaspar et al, 2002). Entre los aldehidos més citot6xicos ‘8 encuentra el malondialdehido (Adams et a, +999), tras investigaciones han inveluerado también los cambios en el metabolismo de las protelnas, los cuales: pueden resultar en la adquisicién de tolerancia al proceso de crioconservacién (Thierry ef al, 1999; Watanabe et a, 1999), Ademas, se ha informado que las plantas poseen proteinas anticongelantes que son potentes inhibidores de los cristales de hielo (Clarke et l,, 2002) ESTABILIDAD GENETICA EN EL FENOTIPO DE MATERIALES VEGETALES CRIOCONSERVADOS, Harding (2004) manifest® que el concepto de estabilidad genética ain no tiene una correcta definicién cientiica cuando se rofiere a juzgar la estabilidad de las plantas después de la crioconservacién. Este autor hitpstrevisa.iop.co.clindex.phplBViprilerFriencly959/727 anassit0122, 13:22 Gareia-Agulla propone el término de Criobionémica a la ciencia biolégica que estudia el comportamiento de los organismos ctioconservados y su habitat después de su reintroduccién a las condiciones naturales del medio ambiente, Esto se debe basicamente a que existe poca infomacién sobre los efectos de la crioconservacién en la estabilidad genética del material vegetal y las diferentes técnicas utlizadas para medirla poseen algunas limitaciones lo que hace muy dificil una evaluacién acertada (Engelmann, 2000; Tuer et al, 2001; Heliot ef al, 20028; Harding, 2004), ‘Ademas, Harding (2004) plantea que son necesarias las investigaciones sobre la estabilidad genética de las plantas regeneradas a partir del material vegetal crioconservado para que se inicien las bases aceptables de lun consenso internacional donde sea aprobada su liberacién y reintraduccién en el medio ambiente y su uso en las diferentes aplicaciones tecnolégicas. ‘Autores como Fukai ot al. (1994) encontraron modifcaciones fenotipicas que afectaron el color en las flores del crisantemo después de la regeneracién de apices crioconservados. Sin embargo, la mayoria de los studios realizados indicaron que las plantas no presentaron cambios morfolégicos después de la crioconservacion. De igual forma, plantas regeneradas in vitro a partir de apices de plantas del género Prunus mostraron un desarrollo competente normal y crecieron iguales al progenitor (Heliot etal, 2002). En otras muchas especies como cafta de azdcar (Paulet et al, 1993), cafeto (Dussert of al, 1998), papa (Benson ef al, 1998), arroz (A-Forkan ef al, 2001), kiwi (Wu ef al, 2001), uva (Zhao et al, 2001) y Eucalyptus (Blakesley y Kieran, 2001), tampoco se han observado diferencias en el desarrollo de los ccaracteres morfoldgicos y agronémicos entre las plantas derivadas de un control no crioconservado y las obtenidas de pices crioconservados. Sin embargo, la mayoria de los estudios fenotipicas carecen de eximenes detallades cuando se comparan las plantas controles y las obtenidas del material vegetal crioconservado y se caracterizan como andlisis ‘cualtativos sin realizar andlisis estadisticos de los aspectos morfolégicos (Harding y Staines, 2001). La aplicacién de estudios biométricos de conjunto con los caracteres fenotipicos se ha utlizado por pocos autores para evaluar las variaciones genéticas, aunque éstos son mas indicadores de los cambios fenotipicos como resultado de las interacciones totales del genotipo y de los cambios temporales en la cexpresién génica (Harding, 2004). CONCLUSIONES: La aplicacién de diferentes métodos de conservacién in vitro se ha convertide en una altemativa para la preservacién de material vegetal con fines investigativos, para la propagacién masiva de plantas & Intercambio de germoplasma y han permitido el fomento y desarrollo de bancos de germoplasma in vitro que han tributado a la comunidad cientfica y al mantenimiento de una importante biodiversidad REFERENCIAS ‘Adams, UK, Benson EF Steines Hl, Branier DM, lan 5, Oeighlan N (1995) Elects ofthe lid peroxidation produce ryt ‘onorsl snd malondaldshyde oe poferston and morprogeneedovlopment nvr pts cls 1 lon hy 185° 376388, ‘ML Bark, Kalai S, Maxhout J, Ae 2000) ects of WV.C tradition on Ubi paroxdation markers ding ripening f tomato heapericn esclonum ruts: Aust Plan Pry 27 87-182 ‘suspensions of indica noe (Oryza sative L.). Cryoetire 22 367-374 ~ Ashmore, SE, Saunders R, Drow R (2000) In wo conservation ané cryopreservation of papaya. En: Engelmann F Takagi M. 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