Determinación de Listeria spp y Salmonella spp y recuento de Staphylococcus aureus y

Clostridium sulfito reductor

Anny Marcela Sánchez Guerra; Daniela Guerrero Rivera; Emerson Yesid Zamora Adrada.
anny.sanchez01@usc.edu.co; daniela.guerrero04@usc.edu.co;
emerson.zamora00@usc.edu.co
Facultad de Ciencias Básicas, Programa de Microbiología, Universidad Santiago de
Cali
22/11/ 2022

Resumen

En esta práctica se realizó el análisis microbiológico de Salmonella spp de una muestra de

huevo tomando 15g de cáscara y 20g de Clara y Yema, se realizó por la técnica de ausencia y
presencia, la cual consistió en ejecutar un enriquecimiento no selectivo, un enriquecimiento
selectivo, siembras en dos medios selectivos XLD-Hektoen a 37°C, tinción de Gram y pruebas
bioquímicas. Para el análisis de Listeria se llevó a cabo con la misma técnica mencionada para
Salmonella, solo que en este caso se utilizó una muestra de 25g de tocineta, omitiendo la parte
de enriquecimiento no selectivo y sembrando en los agares selectivos Oxford- Palcam a 37°C,
tinción de Gram y pruebas bioquímicas. El análisis microbiológico de Staphylococcus aureus
por la técnica de recuento en placa consistió en pesar 25g de una muestra de empanada se
realizó diluciones seriadas de las cuales solo se sembraron 10-1 y 10- 2 en agar Baird Parker y
por último se realizó la prueba coagulasa. Para la determinación de Clostridium sulfito reductor
se utilizó la técnica de recuento en tubo por profundidad, la cual consiste en pesar 25 g del atún,
realizar diluciones seriadas, sembrar 10-1 por profundidad y después añadir el agar SPP en dos
tandas y se incubó a 37°C. Lo resultados obtenidos por estos análisis microbiológicos de los
diferentes alimentos fue que para Salmonella se determinó la presencia de esta bacteria
patógena que de acuerdo con la NTC 1240 y 5309 los alimentos no deben tener presencia de
esta bacteria, por lo que el alimento no se considera apto para el consumo humano, para Listeria
se determinó la ausencia de esta bacteria debido a que la morfología encontrada no
correspondía al género, la técnica de recuento para Staphylococcus aureus el crecimiento fue
<102 UFC/ 25 g de empanada que de acuerdo con la resolución 1407 de 2022 los alimentos no
deben contener más de 2 colonias de esta bacteria, por lo que el alimento como solo presentaba
1 colonia es apto para el consumo y para la determinación Clostridium en una muestra atún
los resultado fueron positivos ya que cumplen con los estándares de calidad a cuanto la
resolución 2195 de 2010 y las normas NTC 1276 sobre los atunes en conserva al no presentar
crecimiento microbiano.

Palabras clave: Análisis microbiológicos, Alimentos, Técnica de ausencia y presencia,

Técnica recuento en placa, Indicadores patógenos, Microorganismos causantes de ETAs.
Resultados

Para la determinación de Listeria spp a partir de tocineta, se sembró por agotamiento una asada
del caldo con la muestra enriquecido selectivo para Listeria (EB) en los medios selectivos
Oxford y Palcam por duplicado, de los cuales solo las placas A presentaron crecimiento
microbiano para ambos medios como se puede observar en las figuras 1 y 2, además de que en
el agar Palcam se evidencio un cambio de color en el agar de rojo a amarillo.

Figura 1. Siembra por agotamiento Figura 2. Siembra por agotamiento A

A en agar Oxford. en agar Palcam.

Para la identificación del género Listeria se realizaron tinciones de Gram para las colonias
presuntivas, como se puede observar en las figuras 3 y 4 que presentaron morfología de cocos
Gram positivos para las colonias en ambos medios de cultivo, también se efectuaron pruebas
bioquímicas como la de citrato, LIA, TSI, SIM, urea, catalasa y oxidasa que se pueden observar
en la tabla 1 con sus respectivos resultados.

Figura 3. Tinción de Gram de la colonia Figura 4. Tinción de Gram de la

en agar Oxford. colonia en agar Palcam.
 Tabla 1. Resultados de las pruebas bioquímicas para Listeria.
Citrato LIA TSI SIM Urea Catalasa Oxidasa

Negativo Negativa Positiva Movilidad Negativa Negativa Positiva

(+)

Para la determinación de Salmonella spp a partir de huevo, se sembró por agotamiento una
asada del caldo selectivo para Salmonella spp (Verde Brilla) en los medios de cultivo selectivos
XDL y Hektoen por duplicado, donde todas placas sembradas presentaron crecimiento
microbiano como se puede observar en las figuras 6, 7, 8 y 9.

Figura 6. Siembra por agotamiento A Figura 7. Siembra por agotamiento B

en agar XLD. en agar XLD.

Figura 8. Siembra por agotamiento A Figura 9. Siembra por agotamiento B

en agar Hektoen. en agar Hektoen.
Para la identificación del género Salmonella se realizaron tinciones de Gram para las colonias
presuntivas, como se puede observar en las figuras 10, 11, 12 y 13 presentaron morfología de
bacilos Gram negativos para las colonias en los cuatro medios de cultivo, también se efectuaron
pruebas bioquímicas como la de citrato, LIA, TSI, SIM, Urea, Catalasa y Oxidasa que se
pueden observar en la tabla 2 con sus respectivos resultados.

Figura 10. Tinción de Gram de la Figura 11. Tinción de Gram de la

colonia del agar XLD A. colonia del agar XLD B.

Figura 12. Tinción de Gram de la Figura 13. Tinción de Gram de la

Colonia del agar Hektoen A. colonia del agar Hektoen B.
Tabla 2. Resultados de las pruebas bioquímicas para Salmonella.
Citrato TSI Lia SIM Urea Catalasa Oxidasa

Negativa Positiva Negativa Negativa Negativa Negativa Positiva

Para el recuento de Staphylococcus aureus a partir de una empanada, se sembró masivamente

las diluciones 10-1 y 10-2 por duplicado en los medios de cultivo selectivos Baird Parker, de las
cuales solo las placas de la 10-1 A y 10-2 B presentaron crecimiento de una sola colonia como
se puede observar en las figuras 15 y 16. A estas colonias se le realizó una prueba bioquímica
rápida de Staph latex kit, la cual dio como resultado coagulasa positiva como se puede observar
en la figura 14.

Figura 15. Siembra masiva de la dilución Figura 16. Siembra masiva de la dilución
10-1 A en agar Baird Parker10-2 10-2 B en agar Baird Parker.

Figura 14. Prueba Bioquímica Staph latex kit

para Staphylococcus aureus.
Para la determinación de Clostridium a partir de atún, se sembró por profundidad las diluciones
10-1 y 10-2 por duplicado en tubos con medio de cultivo SPS, las cuales no presentaron
crecimiento microbiano como se puede observar en la figura 15.

Figura 15. Siembra por profundidad en agar SPS.

Discusión de resultados

La determinación de Listeria spp para detectar su presencia en alimentos se puede realizar por
el protocolo tradicional, el cual puede tener discrepancias según el alimento a analizar, debido
a que todavía no existe un solo método para su aislamiento e identificación que sea
completamente satisfactorio para todos los alimentos pero en esencia todos tiene un mismo
principio, el cual consta de varias etapas consecutivas donde primero se realiza un
enriquecimiento selectivo, luego siembras en placas de agar selectivos, que para este caso se
usaron Palcam y Oxford, y por último se deben efectuar pruebas de identificación de las
colonias por medio de pruebas bioquímicas. Los medios selectivos utilizados para este análisis
como se puede observar en las figuras 1 y 2, no presentaron los cambios respectivos para el
género de Listeria spp, ya que para el caso de Oxford debían crecer colonias que formaran un
complejo de color negro gracias al hidrolisis de la esculina y crecieron colonias que no
presentaron ningún complejo, mientras que para el caso de Palcam debían crecer colonias que
formaran un complejo color café gracias a la hidrolisis de manitol y crecieron colonias que
cambiaron el color del agar de rojo a amarillo.

Las colonias que crecieron en los agares diferenciales y selectivos dieron como resultado para
la tinción de Gram una morfología de cocos Gram positivos (Ver figura 3 y 4) lo que significa
que no corresponde al género de Listeria spp debido a que según la bibliografía esta
corresponde a bacilos Gram positivos que presentan movilidad, además de ser catalasa
positivo, oxidasa negativo, indol positivo, urea negativo, LIA positiva para fermentación de
glucosa, SIM negativo y sin producción de ácido sulfhídrico.

El resultado arrojado para la prueba bioquímica de citrato fue negativo (Ver tabla 1) debido a
que el microorganismo inoculado no cuenta con la capacidad de metabolizar el citrato, por lo
tanto, no se evidencio el cambio de color de verde a azul dada por la alcalinización del medio.
Para la prueba de LIA (Ver tabla 1) se evidencio que el microorganismo inoculado es capaz de
fermentar glucosa, pero no cuenta con actividad enzimática de lisina descarboxilasa ya que el
medio de cultivo presento un viraje en su totalidad de color amarillo, por lo tanto, se dice que
la prueba dio como resultado negativo. Para la prueba de TSI (Ver tabla 1) se evidencio que la
bacteria inoculada dio como resultado positivo como fermentador de glucosa, lactosa y/o
sacarosa lo que ocasiono un cambio de color en el medio de rojo a amarillo en su totalidad, sin
embargo, dio negativo para la formación de gas y producción de ácido sulfhídrico (H2S) ya que
estos se reflejan con movilidad del medio de cultivo y ennegrecimiento respectivamente. Para
la prueba de SIM (Ver tabla 1) se evidencio que la bacteria inoculada dio resultado negativo
para producción de ácido sulfhídrico (ennegrecimiento), pero positivo para movilidad ya que
hubo crecimiento fuera de la línea de siembra. Para la prueba de urea se visualizó que el
microorganismo sembrado no tiene la capacidad de hidrolizar la urea debido a que el medio de
cultivo no presentó un cambio de color de amarillo a rojo. Para la prueba catalasa que se puede
observar en la tabla 1, la bacteria no cuenta con la enzima catalasa por lo tanto no ocurre un
cambio de color a azul. Para la prueba oxidasa se puede evidenciar un resultado positivo ya
que el microorganismo cuenta con el sistema citocromooxidasa, el cual oxida el citocromo
ocasionando la liberación de oxígeno. Las pruebas bioquímicas no corresponden con los
resultados de Listeria spp, por lo tanto, se afirma que la tocineta analizada no contaba
contaminación por Listeria spp aunque sí presentaba contaminación microbiana, sin embargo
no se puede conocer en qué proporción debido a que se preparó un pre-enriquecimiento y no
se realizó recuento en placa de la muestra, de modo que no se puede confirmar si el alimento
era apto o no para el consumo humano.

Se debe tener en cuenta que como la principal vía de entrada de esta bacteria en el cuerpo
humano es por medio oral se hace inminente su análisis en los alimentos, principalmente a
embutidos, mariscos y alimentos listos para consumir, ya que consumir estos alimentos
contaminados pueden llegar a ocasionar listeriosis (a pesar de ser poco frecuente), también es
capaz de crecer y diseminarse en el refrigerador, por lo tanto si se refrigera algún alimento
contaminado con Listeria spp puede contaminar los otros alimentos que se encuentren allí o
formar biopelículas en el refrigerador, por lo tanto se considera un indicador patógeno, dando
a conocer que no se han implementado de manera correcta las BPM (Buenas Prácticas de
Manufactura), las buenas prácticas higiénicas de los manipuladores de alimentos o que hubo
contaminación post-proceso.

La determinación de Salmonella spp en los alimentos por medio de ausencia-presencia es de

gran interés microbiológico e industrial ya que permite junto con otros análisis asegurar la
inocuidad de los alimentos. Salmonella spp son bacterias de la familia Enterobacteriaceae
constituidas por bacilos Gram negativos anaerobios facultativos no esporulados móviles
flagelados. La infección por esta bacteria en humanos sólo se da por vía oral generando así una
gran importancia para el análisis en los alimentos ya que los alimentos indican el inadecuado
uso de las Buenas Prácticas de Manufactura, el método para la determinación de Salmonella
spp puede variar dependiendo de los alimentos a analizar, pero básicamente lo que se hace es
un enriquecimiento no selectivo, enriquecimiento selectivo, siembra en placas de medios
selectivos y identificación por medio de pruebas bioquímicas. De acuerdo a la forma de
tratamiento de la muestra alimenticia para la detección de salmonella no se puede afirmar si la
bacteria se encontraba dentro o fuera del huevo ya que se analizó en conjunto tanto como la
cáscara, la yema y la clara, por lo tanto se debe tener en cuenta que la infección por Salmonella
spp en el interior de las aves generaría que el huevo salga contaminado tanto interno como
externo, como consiguiente si el huevo se almacena a temperatura ambiente sin refrigeración
la concentración de bacterias comienza a aumentar ya que las sustancias inhibitorias no logran
frenar el proceso por eso se recomienda cocinarlo a temperaturas superiores a los 60°C.

Los resultados de las siembras de la muestra de huevo en el agar XLD, el cual es un medio
selectivo y diferencial para el aislamiento de patógenos entéricos Gram negativos como
Salmonella spp y Shigella spp, como se puede observar en las figuras 6 y 7 arrojaron resultados
negativos para la identificación de Salmonella spp, ya que el agar no presento un cambio de
color de amarillo a rojo, además de que la coloración de las colonias debía ser negra, y lo que
se apreció fueron colonias de color crema, la tinción de Gram de estas colonias dieron bacilos
Gram negativos como se observa en las figuras 10 y 11, con estos resultados tanto con la
coloración de las colonias y la tinción de Gram se asume que el posible genero bacteriano
arrojado por los resultados obtenidos sea Shigella spp. Los resultados de las siembras de esta
muestra en agar Hektoen, el cual es un medio selectivo para el aislamiento de microorganismos
Gram negativos entéricos y principalmente para el aislamiento de géneros como Shigella spp
y Salmonella spp, como se puede evidenciar en las figuras 8 y 9 se presentaron cambios de
color en el agar, ya que el agar al principio presentaba una coloracion roja y cambio a color
verde, por lo que se puede atribuir este cambio al crecimiento de Salmonella spp, además los
resultados de la tinción de Gram que se pueden observar en las figuras 12 y 13 fueron bacilos
Gram negativos, lo que corresponde a lo morfología del género Salmonella spp .

Las pruebas bioquímicas como Citrato, LIA, TSI, SIM, Urea, Catalasa y Oxidasa utilizadas
para la identificación del género de Salmonella, se les realizó a las colonias que crecieron en la
muestra A del agar Hektoen, de acuerdo con la tabla 2 de los resultados de las pruebas
bioquímicas para la determinación de Salmonella, arrojaron resultados negativos en las pruebas
como citrato, LIA, SIM, Urea, Catalasa y Oxidasa, mientras que la prueba bioquímica de TSI
arrojó un resultado positivo debido a su cambio de color en el medio de rojo a amarillo, ya que
este agar contiene azucares como lactosa, glucosa y sacarosa, entonces la degradación o
fermentación de estos azucares producen un cambio de color del indicador rojo de fenol que
cambia a amarillo por la acidificación del medio. Los resultados negativos de las otras pruebas
bioquímicas se pueden atribuir al poco tiempo de incubación de las pruebas, por lo que no se
puede descartar la opción de falsos positivos o falsos negativos, como consiguiente no se puede
confirmar o negar la presencia de este género por medio de la prueba bioquímica a pesar de
que los resultados en los agares Hektoen dan una respuesta positiva para el crecimiento del
género. Estas pruebas bioquímicas para la determinación de Salmonella spp deberían tener los
resultados de fermentación positiva para glucosa con producción de gas, Oxidasa negativa,
Catalasa positiva, Citrato positivo y LIA positiva.

De acuerdo con la normatividad de la NTC 1240 para el consumo del huevo, estos deben estar
frescos para el consumo humano y según la NTC 5309 deben presentar Buenas Prácticas de
Manufactura, por lo tanto, no contar con la presencia de microorganismos patógenos. Con los
resultados, el posible género identificado en el huevo se dice que este alimento probablemente
no estaba apto para el consumo humano debido a la presunta presencia de Salmonella spp y
Shigella spp.

Para el recuento en placa por superficie de Staphylococcus aureus coagulasa positiva se sabe
que son bacterias anaerobias coco Gram positivos que se agrupan en racimos, los cuales se
encuentran en una cantidad significativa dispersa en el ambiente y en la flora natural de los
seres humanos encontrándose principalmente en la piel, zonas de la nariz, pliegues inguinales
y en las axilas, por lo tanto son transmitidas a los alimentos comúnmente por la mala
manipulación a la hora de preparar los alimentos, produciendo enfermedades infecciosas al
consumidor como gastroenteritis. Esta bacteria contamina alimentos crudos y productos listos
para el consumo y su método de detección es por medio de la utilización de medios especiales
que permitan fácilmente su identificación gracias a las enzimas y toxinas que este
microorganismo produce, por ende, se hace uso de medios diseñados específicamente para
aislar esta bacteria y poder realizar un recuento en placa adecuado además de la identificación
del mismo por medio de pruebas bioquímicas para confirmar el género aislado.

Los resultados en el agar Baird-Parker, el cual es un medio selectivo y diferencial para el

aislamiento de Staphylococcus aureus, que se pueden observar en las figuras 15 y 16 presentan
crecimiento de una sola colonia en cada agar, las colonias son brillantes de tamaño mediano
con un color negro, pero no presentaba un halo de hidrolisis alrededor, por lo tanto, da a
entender que no hay actividad lipolítica.

Las pruebas bioquímicas como coagulasa es una prueba muy sensible y específica para
Staphylococcus spp, por lo tanto, se utiliza para determinar y diferenciar especies dentro del
mismo género. Staphylococcus aureus tiene la capacidad de coagular el plasma gracias a que
la proteína coagulasa que puede unirse al fibrinógeno y convertirlo en fibrina insoluble, la cual
tiende a formar un depósito donde Staphylococcus puede agregarse, al realizar la prueba en un
tubo con una dilución de plasma de conejo esta no se solidifico dando así un resultado negativo
a S. aureus, sin embargo no es un resultado confiable ya que el plasma de conejo utilizado se
encontraba viejo, lo cual se puede confirmar gracias a que la prueba de aglutinación rápida en
placa, el cual es un método confiable para la identificación de S. aureus dio positivo para
coagulación, por lo tanto se puede afirmar con esta prueba rápida que el alimento se encontraba
contaminado por Staphylococcus aureus.

Los resultados obtenidos para el recuento en placa fue <1x102 UFC de S. aureus/ 25 gr de
empanada, en la resolución Colombiana 1407 del 2022 para los criterios microbiológicos que
deben cumplir los alimentos y bebidas destinados para consumo humano, un alimento que
cuente con buena calidad debe presentar <102 UFC Staphylococcus aureus/ 25 g del alimento
listo para el consumo y solo se permite la presencia de 2 colonias de Staphylococcus aureus,
por ende la empanada no incumple la resolución establecida ni la dosis mínima que una persona
puede consumir, también se debe tener en cuenta que no se ha establecido un modelo oficial
que de valores a la cantidad exacta que se necesita para causar una infección alimentaria aunque
se reporta que un rango estimado sería entre 0,1- 1,0 µg/kg, por lo tanto la concentración
relevante tiene que ser superior a 105 UFC/gr para enfermar al consumidor.

Para la determinación de Clostridium sulfito reductor por medio de recuento por profundidad
en tubo, se conoce que esta bacteria tiene forma de bacilos Gram positivos anaerobios
esporulados, por lo tanto, se sembró en un medio salino SSP, el cual permite el aislamiento de
Clostridium y permite una mayor selectividad de las colonias de este microorganismo gracias
a la adición de sulfadiazina y polimixina en su composición.

Este microorganismo es un patógeno causante de ETAs gastroenteritis y botulismo por comer

un alimento y/o enlatados contaminados, por ende, debe haber una normatividad que regule
Clostridium en los alimentos, para poder garantizar su inocuidad y calidad al momento de
vender el producto. Colombia cuenta con la resolución 2195 de 2010 que habla sobre el
reglamento técnico y los requisitos que se deben cumplir durante el proceso térmico de
alimentos envasados herméticamente de baja acidez y acidificados que se fabriquen,
transporten, expendan, distribuyan, importen, exporten y comercialicen para el consumo
humano, en el cual se controla cada punto de los alimentos enlatados dando una seguridad al
consumidor.

A la muestra de lata de atún que se le realizó la prueba como se puede observar en los tubos de
la figura 15, no hubo ningún crecimiento microbiano por lo que el resultado arrojado fue
positivo ya que el producto cumple con los estándares de calidad a cuanto la resolución 2195
de 2010 y las normas NTC 1276 sobre los atunes en conserva.

Conclusión

Se evidencio que de los 4 alimentos analizados solo 2 (Atún en lata y la empanada) son aptos
para el consumo humano, es decir para el análisis de huevo se encontró presencia de salmonella
y posible Shigella, por lo que según la norma colombiana NTC 1240 y 5309 no es apto para el
consumo y para el análisis de la tocineta el alimento aunque no contaba contaminación por
Listeria spp si presentaba contaminación microbiana pero como no se puede conocer en qué
proporción no se puede confirmar si el alimento era apto o no para el consumo humano. Como
se puede evidenciar con los resultados encontrados en los análisis microbiológicos de los
alimentos es inminente y muy relevante el rol de la microbiología en los procesos alimenticios,
ya que en conjunto con las normas y resoluciones colombiana aseguran la inocuidad del
alimento previniendo así la contaminación por microorganismos causantes de ETAs,
garantizando así al consumidor un alimento apto para el consumo,
Bibliografía

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