MANUAL DE TECNICAS DE LABORATORIO. t VOLUMEN 11 ‘SEGUNDA PARTE DIAGNOSTICO PARASITOLOGICO EDITORES OSCAR VELASCO CASTREJON CARMEN GUZMAN BRACHO LiCONTENIDO INTRODUCCION SECCION | MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO Principios generales Manejo de muestras SECCION II CUIDADOS DEL MICROSCOPIO Calibracién del microscépio para medicién SECCION II TECNICAS DE RECOLECCION Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS 1. MUESTRAS FECALES 1.1 Recoleccién de muestras 2.1 Examen macroscépico 2 Examen microscépico .3 Técnicas de concentracién 4 Técnicas de fincién permanente 1.2.5 Técnicas de Graham 1.2.6 Técnicas de kato y kato-katz 1 ig i 1 1.3 Reporte de Resultados 1.4 Envio de muestras al laboratorio de referencia 1.5 Desecho de muestras 1.6 Control de calidad 2. MATERIAL VAGINAL Y URETRAL 2.1 Recoleccién de muestras 2.2 Técnicas 3. SANGRE Y OTROS ESPECIMENES 3.1 Recoleccién de muesiras 3.2 Técnicas de tincién 3.3 Control de calidad 3.4 Técnica especifica para Plamodia 15 7 24 29 4) 43 a7 47 48 9 53 54 55 56 59 73.5 Evaluacién de resistencia a cloroquina en Plasmodium falciparum 68 3.6 Técnicas especiales para deleccién de Trypanosoma 70 3.7 Técnicas especiales para microfilarias 7 3.8 Técnicas especiales para leishmania 80 ‘4. ESPECIMENES DE LA PIEL 84 4.1 Recoleccién de muestras cn SECCION IV IDENTIFICACION DE ESPECIES PARASITARIAS 1. PARASITOS INTESTINALES 89 1.1 Helmintos 1.2 Protozoaries >ARASITOS HEMATICOS,INTRODUCCION SEGUNDA PARTE DIAGNOSTICO PARASITOLOGICO EDITORES OSCAR VELASCO CASTREJON ‘CARMEN GUZMAN BRACHO Las enfermedades parasitarias son responsables de una elevada morbilidad y mortalidad a nivel mundial a tal grado, {que en conjunto constituyen la enfermedad mas comin de la humanidad. Particularmente en los paises del tercer mundo donde repercuten muy desfavorablemente también en su economia. Frecuentemente se presentan con sintomas y signos inespecificos por lo que no es facil diagnosticarlas s6lo por el examen médico, por lo que es necesario recurrir a estudios de laboratorio que indiquen la presencia de algtin pardsito. EL laboratorio juega un papel preponderante al establecer el diagndstico confirmativo de la enfermedad parasitaria, por lo tanto es la clave para la seleccién del medicamento apropiado para el tratamiento. Por eso mismo las pruebas de laboratorio eben ser precisas y confiables para ayudar al médico y beneficiar al paciente. Este manual, est basado en el BASIC LABORATORY METH- Obs IN MEDICAL PARASITOLOGY de la OMS 1991, al cual hemos tratado de mejorarlo y hacerlo mas accesible para el personal técnico de los laboratorios del Sistema Nacional de Salud en México. Constituye una guia para el personal de estos laboratorios, quienes deben comprender que s6lo con la ejecucién cuidadosa de las técnicas descritas harén posible la observacién clara de los pardsitos durante el examen microscépico. PAR-LMANUAL DE TECNICAS DE LABORATORIO INDRE VOL, PARTE 2: DIAGNOSTICO PARASHTOLOGICS La secci6n I describe las medidas de seguridad requeridas endl laboratorio y las conductas a seguir durante el trabajo para evitar accidentes por el personal que ahi labora, La seccién I enlista los cuidados que deben tenerse con gf microscopio, una de las herramientas mas importantes que Jos técnicos de un laboratorio de parasitologia requieren en su trabajo cotidiano, asi como de las mediciones tan importantes en la parasitologia diagnéstica. La seccién III presenta las técnicas utilizadas para el examen de heces, sangre, orina y otras muestras biol6gicas para detectar la presencia de pardsitos y sus productos. También aqui se discuten algunos problemas de identificaci6n especifica de parasitos y se mencionan medidas de control de calidad. La seccién IV de este manual, describe los criterios morfol6gicos utilizados para la identificacién de los parisitos asi como la presencia de artefactos y la manera de reconocerlos Ademés, se incluye informacién sobre equipo y reactivos requeridos. En el anexo I se muestran las formulas e indicaciones para la preparacién de reactivos. El anexo II muestra las formulas y preparacion de medios de cultivo. PAR-2[INDRE | Principios Generales MANUAL DE TECNICAS DE LABORATORIO VOL, PARTE 2: DIAGNOSTICO PARASITOLOGICO, SECCION | MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO 1. Cada laboratorio debe contar con un manual escrito de medidas de seguridad, las cuales deben seguirse en todo momento. 2. El laboratorio debe contar con un botiquin de primeros auxilios y designar a una persona para impartir éstos, 3. No se permitira beber, comer, fumar 0 maquillarse en el laboratorio. 4. No se permitiré la entrada a ninguna persona ajena al laboratorio, particularmente a nifios. 5. El personal de laboratorio deberé utilizar bata dentro del rea de trabajo. 6. SE DEBERA LIMPIAR CON DESINFECTANTES LAS ZONAS DE TRABAJO AL FINALIZAR LA JORNADA O DESPUES DE MANEJAR MATERIAL INFECCIOSO. Los desinfectantes mas utilizados son: ~ Etanol o isopropanol al 96% (ésta solucién irrita la piel). - Solucién de fenol al 1% (solucién céustica y corrosiva, la solucién de hipoclorito alcalina es més agresiva que la neutra). PAR-3MANUAL DE ECHICAS DE LAROFATONG DHL LS VOL Il, PARTE 2: DIAGNOSTICO PARASITOLOGICO, = Formaldehido al 1% 0 glutaraldehido al 2% (soluciones t6xicas e irritantes). - No se recomienda el uso de desinfectantes en aerosol 7. El personal de laboratorio deberd lavarse las manos después de trabajar y antes de salir del laboratorio. ‘Manejo de Muestras Se deberé tener mucho cuidado durante la colecta y Procesamiento de las muestras. Asi mismo el personal de laboratorio debera utilizar guantes de hule al manipularlas. En caso de manejo de animales, emplear las medidas apropiadas de acuerdo al caso (como inyeccién de tranquilizantes para perros y animales silvestres), guantes gruesos, etc. Todas las muestras de sangre deberan considerarse como potencialmente infecciosas. Una gran cantidad de agentes patégenos pueden transmitirse por sangre (por ejemplo el vi- rus del SIDA y de la hepatitis B). Los riesgos particulares so Aj Punciones 0 cortaduras, Las agujas hipodérmicas, deberan extraerse de la jeringa utilizando equipo especial como el que se ilustra, para evitar la puncién de los dedos al tratar de tapar las agujas con su capuchén. Las agujas junto con otros artefactos, como lancetas. utilizados para puncién cutanea o venosa deberin sumergirse en un desinfectante 0 esterilizarse antes de ser desechadas, No se deberdn reutilizar. Tampoco se debers utilizar material despostillado o roto. B.- Contaminacién de piel o mucosas El laboratorista deberé cubrir cualquier herida con un vendaje impermeable. NO SE DEBERA PIPETEAR CON LA BOCA. Si la sangre cae en la piel, se deberé lavar inmediatamente con agua y jabon y posteriormente aplicar un desinfectante; si la sangre cae en los ojos, éstos se deberin lavar exhaustivamente con agua y enseguida aplicar algain dlcali o écido débil segin el caso. La sangre derramada en cualquier superficie sel Laboratorio deberé remojarse con hipoclorito y limpiarse Posteriormente con un trapo humedecido con la misma solucion, PAR-4ANAL 0E TECNICA BELABORATO! INBRE VOL I, PARTE 2: DIAGNOSTICO PARASITOLOG! :O C~ Muestras fecales. Se deberan evitar el contacto directo de la piel con estas muestras. Al finalizar su andlisis, las muestras se incinerarén © se colocarén en un recipiente con desinfectante antes de desecharse. D.- Muestras de orina, Se debera evitar el contacto directo de la piel con estas muestras, Estas serdn desechadas por el sistema de drenaje, después de afadirle un desinfectante. Los portaobjetos deberan sumergirse en una solucién de hipoclorito de sodio al 1% 0 de mezcla crémica. PAR-SINDRE MANUAL DE TECNICAS DE VOL l, PARTE 2: DIAGNO: SECCION II CUIDADOS DEL MICROSCOPIO 1. Cubrir el microscopio con una funda de pléstico o tela cuando no se utilice. 2. Proteger el microscopio del polvo y la humedad. 3. Proteger las lentes y prismas del microscopio del crecimiento de hongos en lugares htimedos y calientes, por lo que se debe: - Guardar el microscopio en cuartos frescos y libres de humedad, si es posible con aire acondicionado. - Guardar el microscopio en cajas herméticamente cerradas con un desecador gel de silica. - Colocar la caja del microscopio cerca de una fuente de calor, éste puede generarse con focos de 15 6 25 watts. 4. Al terminar de utilizar el microscopio, limpiar el aceite de inmersién de los objetivos con una tela suave y humedecida con una solucién de etanol/éter (3:7) 0 bencina/etanol/éter (2:2:1) y secar con una tela libre de pelusa 5. Limpiar los oculares con una tela suave y libre de pelusa, como alternativa utilizar papel seda 0 paiuelos faciales 6. Para limpiar los oculares no utilizar la misma tela con la que se limpié el aceite de inmersién. 7. No utilizar alcohol para limpiar el microscopio. PAR-7CALIBRACION | DEL MICROSCOPIO PARA MEDICION Principio Materiales [INDRE | MANUAL O€ TECHICAS 0€ LABORATORIO DRE VOL It, PARTE 2: DIAGNOSTICO PARASITOLOGICO. 8, No desmontar las piezas del microscopio dificiles de alcanzar, a menos que se esté adiestrado en ello. 9. No dejar al descubierto la entrada del objetivo al revélver, cuando éste sea desmontado, utilizar una tapa apropiada o una cinta adhesiva para cubrir la entrada. 10. No intercambiar lentes de microscopios de diferentes marcas, © diferente especificacién. EI tamaiio es un criterio importante para la identificacién de muchos parasitos, particularmente quistes y huevos. Fl tamaiio puede determinarse utilizando una camara de Neubauer 0 una escala calibrada Hamada micrémetro. Micrometria: Es la parte de la microscopia cuyo objetivo principal es la medicién al microscopio; sus instrumentos principales son: el micrémetro ocular u ocular micrométrico y el micrémetro objetivo. Los micrémetros oculares estén grabados con una escala fija que consiste en 50 lineas paralelas. Cada division del micrémetro ocular representa diferentes medidas, segiin el poder de resolucién del juego de objetivos utilizados en un microscopio compuesto. Por lo tanto, para cada juego de oculares ¥ objetivos utilizados, la escala ocular se debe comparar con una escala calibrada conocida. Es importante recordar que una vez efectuada la calibracién con un determinado juego de oculares y objetivos, éstos no pueden ser intercambiados con los componentes correspondientes de otro microscopio. Micrémetro ocular de escala fija Micrémetro de platina con divisiones de 0,1 y 0,01 mm Microscopio compuesto estindar Micrometro ocular: Es un pequeno disco de vidrio de 12 mm de diémetro, en el cual puede verse grabada una escala de 5 mm, dividida en 50 partes y, generalmente, numerada de 10 en 10. Este disco se coloca sobre el diafragma de cualquier ocular, trasformandolo asi en ocular micrométrico. Cada division de esta escala mide 100 micras, PAR-8MANUAL DE TECNICAS DE LABORATORIO RIE 2: DIAGNOSTICO PARASMTOLOGICO, Ocular micrométrico: Es esencialmente lo mismo pero la lente ocular va montada sobre un corto tubo que puede acortarse © alargarse a voluntad, por deslizamiento, en el tubo externo, Permitiendo asi enfocar con toda precisién la escala micrométrica intercalada entre él, Micrémetro objetivo o de platina: Es un portaobjetos en cuyo centro se halla grabada una escala de 1 6 2 mm, dividida en 100 6 200 partes; cada division mide 10 micras. Coeficiente micrométrico: Es una cifra que expresa la equivalencia en micras de una division de la escala del micrémetro ocular, al emplear cada objetivo del microscopio. Suele denominarse “factor” y la operacién para obtenerlo “calibracién del microscopio” El coeficiente micrométrico es inversamente proporcional al poder de amplificacién de los objetivos utilizados. Habitualmente se obtienen 3 coeficientes micrométricos para cada microscopio: uno para cada objetivo, usando un solo ocular micrométrico y los objetives 10X y 40X (seco débil y seco fuerte) y 100X (de inmersién); pero puede hacerse cualquier combinacién de ocular y objetivo. Para obtener el coeficiente micrométrico, realizar la siguiente técnica: Técnica 1. Retirar el ocular del microscopio. Si se utiliza un microscopio binocular, se acostumbra retirar el ocular 10X derecho. 2, Desenroscar la lente superior del ocular e insertar la oblea del micrémetro de modo que se apoye en el anillo del diafragma dentro del ocular. Colocar el micrémetro con el lado grabado hacia abajo. El micrometro debe manipularse con pano para lentes y se debe evitar por todos los medios que algiin hilo quede adherido a la superficie. 3. Reinsertar el ocular. Al observar a través del ocular, la escala del micrémetro aparece como una serie de divisiones alineadas. La escala del micrometro del ocular esta dividida en 100 divisiones pequefias. (Figura 1A). PAR-9INDRE MANUAL DE TECNICAS DE LABORATORIO VOL It, PARTE 2: DIAGNOSTICO PARASITOLOGICO Calculos 4. Colocar el micrémetro de platina bajo el objetivo del microscopio que se ha de calibrar. Enfocar la escala del micrémetro de platina, que se ve como una serie de divisiones de 0,1 y 0,01 mm, su longitud total es de 1 mm. (Figura 18). 5, Ajustar el micrémetro de platina de modo que la linea “0” de la escala de! micrémetro ocular se superponga exactamente con la Iinea “0” de la escala del micrémetro de platina. (Figura 1C). 6. Sin efectuar ninguna otra manipulacién, observar ambas escalas y hallar el préximo par de lineas que coincidan exactamente. Anotar el nimero de divisiones de acuerdo a la medida de la regla. Por ejemplo: 50 divisiones del ocular equivalen a 0.75 mm, 10 divisiones del ocular equivalen a 0.15 mm. (Figura 1D). 7. El objeto de la calibracién es determinar cuanto mide en micras (um) cada division de la escala ocular cuando se calibra contra la escala del micrémetro objetivo. Realizar la conversion de mm a micras (1 mm = 1000 ym). Por ejemplo 0.015 mm = 15 um. 8. Repetir estos mismos pasos para cada objetivos requerido. 9. Calibrar cada microscopio de manera individual. 10. Para hacer las mediciones microscépicas, se sustituye el micrémetro objetivo por la preparacién que contiene el objeto por medir. Con la escala del micrémetro ocular se cubren totalmente las dimensiones del objeto, se registra numero de divisiones que abarca el objeto. 11, Este niimero se multiplica por el coeficiente micrométrico especifico para obtener la longitud en micras del segmento medido. PAR-10NDRE Figura 1 Escalas del micrémetro ocular y de platina roe Figura 1B I a Figura 1D PAR-1111.1 RECOLECCION DEMUESTRAS MANUAL DE TECNICAS DE LABORATORIO IAGNOSTICO PARASIOLOGICO SECCION III TECNICAS DE RECOLECCION, PREPARACION Y EXAMENES DE MUESTRAS 1, MUESTRAS FECALES Las muestra fecales se examinan para buscar protozoarios y larvas 0 huevos de helmintos. Las formas de protozoarios que se encuentran habitualmente en heces son trofozoitos y quistes, mientras que las formas de helmintos son huevos y larvas, aunque también se pueden encontrar gusanos adultos y segmentos de tenias que son visibles macroscépicamente. Los huevos, larvas, trofozoitos y quistes por su pequeno tamaiio solamente se observan al microscopio. Con el fin de observar estas estructuras la muestra debe Prepararse adecuadamente y examinarse con cuidado y en caso necesario observarla en su totalidad, antes de descartarla como negativa. Debido a la fragilidad de algunos pardsitos intestinales, y a la necesidad de mantener su morfologia para asegurar su identificacién, el diagnéstico microscépico adecuado no puede hacerse a menos que la coleccién de las materias fecales se haya preparado correctamente. 1.- Por lo tanto al solicitar la muestra, es necesario entregar al paciente lo siguiente: - Un caja encerada o un vial de plastico con tapa. - 2 aplicadores de madera, PAR.NDRE MANUAL DE TECNICAS DE LABORATORIO VOL Il, PARTE 2: DIAGNOSTICO PARASITOLOGICO Si no se tiene la caja encerada o el vial de plastico, pueden darse cajas metalicas o frascos de vidrio. Las hojas de vegetales, como las de plitano 0 cajas de cerillos no son recipientes apropiados para la recoleccién y mantenimiento de la muestra fecales. En los programas de control, es suficiente examinar una sola muestra, pero para el diagnéstico de rutina deben revisarse 3 muestras o mas, en un intervalo de 3 dias, para poder detectar practicamente todas las infecciones parasitarias del tubo digestivo. Una gran variedad de sustancias puede interferir con el examen de las muestra fecales (laxantes, antiacidos, medios de contraste ingeridos, ciertos antibiéticos y particularmente los antiparasitarios). 2- Explicar al paciente que la muestra debe pasarse directamente al recipiente, 0 depositarla en un pedazo de papel y transferirla con el aplicador de madera al recipiente, si no dispone de papel se puede colocar la materia fecal en una hoja limpia, como las de platano, Sin embargo la materia fecal debe transferirse de inmediato al recipiente adecuado. La muestra no debe permanecer sobre la hoja o Ilevarse tardiamente al laboratorio. 3.- Algunos organismos, especialmente los trofozoitos de amiba, y Giardia se comienza a desintegrar 0 a deformarse dentro de lun periodo corto de tiempo y se vuelven identificables. A temperaturas altas se precipitan los cambios, por lo tanto las muestras, particularmente las diarreicas, deben Ilevarse al laboratorio con prontitud (es decir, dentro de los primeros 30 a 60 minutos después de recolectada). Si ésto no es posible, la muestra debe tratarse con conservadores. (ver incisol.4). 4- El recipiente con la muestra debe contener la siguiente informacion: - Nombre del paciente o ntimero. - Fecha de coleccién. - Tiempo transcurrido desde la colecta y de que manera se realiz6. PAR-14