las tcnicas al

Aplicacin de

cromatogrficas

anlisis qumico
de los Bienes Culturales

L
Francisco Gutirrez Montero Asesor Tcnico-Laboratorio Departamento de Anlisis Centro de Intervencin del IAPH

a cromatografa es una tcnica analtica descrita por primera vez a principios de siglo por el botnico ruso Tswett, que la aplic a la separacin de pigmentos de plantas. Le dio el nombre de cromatografa haciendo referencia a las bandas coloreadas de pigmentos que se separaban por su adsorcin selectiva sobre sulfato clcico. El uso de la tcnica se fue extendiendo, a la vez que se desarrollaban distintas versiones: cromatografa de reparto, de papel, de capa fina, etc. Un momento importante en la historia de la cromatografa lo constituy el desarrollo de la cromatografa gas-lquido (Martin y James, 1952). Esta tcnica encontr rpidamente aplicaciones de gran importancia, lo que llev al desarrollo de la teora de la separacin cromatogrfica (Van Deemter, 1956; Giddings, 1965, etc.) as como al desarrollo de una instrumentacin que permita un mayor control de las condiciones de trabajo. Actualmente no existe campo de la qumica, biologa, medicina, etc. en el que no se utilice la cromatografa

PH Boletn24

46

IDEA

en alguna de sus formas, tanto en su vertiente preparativa como en la analtica. Las tcnicas cromatogrficas tambin tienen aplicacin en el anlisis qumico de los bienes culturales, concretamente en el anlisis de compuestos orgnicos. Estos compuestos orgnicos aparecen como aglutinantes, adhesivos, consolidantes y barnices de capas pictricas y como colorantes de fibras textiles. Las distintas tcnicas cromatogrficas se basan en la separacin de los componentes de una mezcla por reparto entre dos fases: una fase estacionaria y una fase mvil. Dependiendo del tipo de fases utilizadas aparecen los distintos tipos de cromatografa. Se considera a

continuacin la aplicacin de la cromatografa en capa fina a la identificacin de colorantes naturales en fibras textiles y la cromatografa en fase gaseosa a la identificacin de aglutinantes y barnices en capas pictricas.

Cromatografa en capa fina La cromatografa en capa fina es aquella que utiliza como fase estacionar ia una capa fina (de 0.25 a 2 mm.) de sustancia adsorbente (gel de slice, almina o celulosa) sopor tada sobre alguna superficie plana (vidrio o aluminio). La separacin se consigue por el movimiento capilar ascendente de la fase mvil. El anlisis por cromatografa en capa fina se realiza siguiendo la tcnica de anlisis por desarrollo, que consiste en aplicar las muestras a separar en forma de manchas circulares sobre uno de los extremos de la cromatoplaca, con ayuda de un microcapilar. Junto a las muestras a analizar se aplican los patrones correspondientes. A continuacin se introduce la cromatoplaca en una cubeta cerrada que contiene la fase mvil (disolvente). La separacin se produce por el ascenso capilar de la fase mvil a travs de la fase estacionaria. A medida que asciende el disolvente, la muestra se ve arrastrada por la fase mvil y adsorbida por la fase estacionaria. Dependiendo de la afinidad qumica, unos componentes sern ms desplazados (mayor afinidad con la fase mvil) que otros (menor afinidad), consiguiendose la separacin. La visualizacin de los componentes separados se realiza por pulverizacin de un revelador y posterior observacin de la fluorescencia bajo luz ultravioleta de 254 nm. Tras el desarrollo, la identificacin de cada componente de la mezcla se realiza midiendo el desplazamiento relativo de cada mancha en la placa respecto al frente del disolvente, definindose para cada banda su valor Rf, como: Rf = desplazamiento del compuesto / desplazamiento del frente del disolvente Los valores Rf, as como la fluorescencia bajo luz ultravioleta, se comparan con la de los patrones correspondientes.

Fig. 1. Algunos de los principales colorantes naturales

Aplicacin de la cromatografa en capa fina a la identificacin de colorantes naturales Las aplicaciones de la cromatografa en capa fina para el anlisis qumico de bienes culturales son numerosas. Se considera la identificacin de colorantes naturales en fibras textiles.

Colorantes naturales Los colorantes naturales provienen tanto de plantas como de insectos, aunque estos ltimos son nica-

PH Boletn24

47

mente la fuente de colorantes rojos. Estn restringidos a rojos, amarillos, azules y marrones. El resto de colores se obtiene de la mezcla entre ellos o de la utilizacin de diferentes mordientes. Colorantes rojos Los principales colorantes rojos de origen natural son:

La extraccin del colorante de la fibra se realiza mediante hidrlisis cida en medio alcohlico (cido clorhdrico / metanol). En estas condiciones se rompen los enlaces fibra-mordiente-colorante y se consigue la disolucin del colorante. 2. Purificacin del colorante extrado.

Granza, obtenida de las races de la planta Rubia tinctorum y otras especies. Su color rojo es debido a la presencia de diferentes componentes, todos ellos derivados antraquinnicos, cuyas proporciones pueden variar dependiendo de la procedencia de la planta y del proceso de extraccin del colorante. Los tres componentes principales son alizarina, purpurina y pseudopurpurina. Kermes, obtenido de las hembras del insecto Kermes illicis L. El principal componente es cido kermsico. Cochinilla americana, obtenido del insecto Dactylopius coccus. El principal componente es cido carmnico. Otros colorantes rojos de origen vegetal son: Palo Brasil, obtenido de distintas especies de Caesalpinia. La principal sustancia colorante es la brasileina. Orchilla, obtenido de distintas especies de lquenes (Roccella). El componente principal es la orcena. Colorantes amarillos Son fundamentalmente compuestos flavonoides, ampliamente distribuidos en el reino vegetal. Los principales colorantes son: Gualda, obtenida de la planta Reseda luteola. El componente principal es la luteolina. Zumaques o fustetes obtenidos de las plantas Chlorophora tinctoria y Rhus cotinus. Contienen morina y fisetina. Quercitrn, obtenido del Quercus tinctoria. El componente principal es quercitina. Azafrn, obtenido de la planta C. sativus. El componente principal es crocetina. Bayas persas, obtenidas de distintas especies de Rhamnus. Contienen ramnetina, quercitina y hemodina Colorantes azules El principal colorante azul es el ndigo obtenido de distintas especies de Indigofera. El componente principal es la indigotina.

3. Desarrollo cromatogrfico Las muestras y los patrones correspondientes se aplican sobre uno de los extremos de la cromatoplaca (fase estacionaria: gel de slice 60 con indicador de fluorescencia a 254 nm) con ayuda de un microcapilar de 1 l. A continuacin se introduce en una cubeta cerrada y en atmsfer a satur ada de fase mvil (tolueno / formiato de etilo / cido frmico en la proporcin 5: 4: 1 v/v). El desarrollo cromatogrfico concluye cuando el frente de disolvente alcanza el extremo superior de la cromatoplaca. Se evapora el disolvente y se roca con revelador (2-aminoetildifenilborato en metanol). A continuacin se observa la fluorescencia bajo luz ultravioleta de 254 nm. La comparacin entre los desarrollos cromatogrficos de la muestra y los patrones permite la identificacin del colorante utilizado. Se ilustra con dos separaciones: A) Identificacin de colorantes rojos: En la Fig.2 se obser va la aplicacin de patrones y muestras sobre la lnea base de la cromatoplaca. Constituye el momento de inicial de la separacin cromatogrfica. De izquierda a derecha: 1. Patrn de alizarina 2. Patrn de purpurina 3. Patrn de cochinilla americana 4. Patrn de kermes 5. Muestra de hilo rojo del Pendn de las Navas de Tolosa 6. Muestra de hilo rojo del Pendn de San Fernando

Fig. 2. Cromatografa en capa fina de colorantes rojos. Aplicacin de patrones y muestras

Fig. 3. Final del desarrollo cromatogrfico. Observacin con luz visible

Fig. 4. Final del desarrollo cromatogrfico. Observacin con luz ultravioleta

Identificacin de colorantes naturales El anlisis por cromatografa en capa fina de colorantes naturales comprende las siguientes etapas: En la Fig. 3 se aprecia el momento final del desarrollo cromatogrfico con observacin bajo luz visible.

IDEA

1. Extraccin del colorante de la fibra.

PH Boletn24

48

IDEA

En la Fig. 4 se aprecia el momento final del desarrollo cromatogrfico con observacin bajo luz ultravioleta de 254 nm. Se observa que el colorante rojo del Pendn de las Navas de Tolosa es cochinilla americana y que el rojo del Pendn de San Fernando es kermes.

tengan polaridades similares, pero distinta volatilidad, los componentes ms voltiles estn ms tiempo en la fase mvil, y por lo tanto, se desplazan por la columna ms rpidamente que los menos voltiles, que estn ms tiempo en la fase estacionaria lquida. El funcionamiento de un cromatgrafo de gases es el siguiente: Un lquido voltil se inyecta, a travs de un septum de goma, en el inyector, que se calienta para vaporizar la muestra. El gas por tador (suele ser helio o nitrgeno) arrastra la muestra vaporizada hacia la columna, que es donde tiene lugar la separacin. La columna est dentro de un horno, cuya temperatura puede controlar se para favorecer la separacin. Despus, los componentes separados salen de la columna y van al detector. El sistema de deteccin debe ser capaz de sealar la elucin de un componente de la muestra y ofrecer al mismo tiempo una seal proporcional a la cantidad de sustancia que pasa por el detector. Los detectores utilizados en cromatografa de gases son de tipo diferencial, no ofrecen seal cuando pasa por ellos solamente gas por tador y miden alguna propiedad que vare cuando el gas por tador se encuentra mezclado con la sustancia eluida de la columna. El detector ms utilizado para la identificacin de compuestos orgnicos es el de ionizacin de llama (FID). En este detector se genera una llama con hidrgeno y aire que produce la combustin de los componentes separados que van saliendo de la columna. El sistema de deteccin mide los cambios en la conductividad elctrica de la llama de forma que cuando slo sale gas por tador la seal es mnima y aumenta al salir un componente de la muestra. Este aumento en la seal del detector es proporcional a la cantidad de muestra separada. La seal del detector, debidamente amplificada y tratada, se representa grficamente frente al tiempo de retencin (tiempo transcurrido desde la inyeccin de la muestra hasta la salida por el detector) obtenindose el cromatograma. El cromatograma consiste en una serie de picos con forma gaussiana a distintos tiempos de retencin. Actualmente los cromatgrafos de gases van acoplados a un ordenador que realiza el control de todas las variables del sistema y la adquisicin y tratamiento de los datos.

Fig. 5. Cromatografa en capa fina de colorantes amarillos. Aplicacin de patrones y muestra

B) Identificacin de colorantes amarillos En la Fig. 5 se observa la aplicacin de patrones y muestra sobre la lnea base de la cromatoplaca. Constituye el momento inicial de la separacin cromatogrfica. De izquierda a derecha: 1. Patrn de morina 2. Patrn de fisetina 3. Patrn de azafrn 4. Patrn de gualda 5. Muestra de hilo amarillo del Pendn de San Fernando En la Fig. 6 se aprecia el momento final del desarrollo cromatogrfico con observacin bajo luz visible. En la Fig. 7 se aprecia el momento final del desarrollo cromatogrfico con observacin bajo luz ultravioleta de 254 nm. Se observa que el colorante amarillo del Pendn de San Fernando es gualda.

Fig. 6. Final del desarrollo cromatogrfico. Observacin con luz visible

Cromatografa en fase gaseosa La cromatografa en fase gaseosa es una tcnica de separacin en la que la fase mvil es un gas, den o m i n a d o g a s p o r t a d o r. L a s muestras a separar son gases o lquidos fcilmente volatilizables. La fase estacionaria suele ser un lquido de baja volatilidad, que recubre el inter ior de la columna (columna capilar) o la superficie de pequeas par tculas que estn rellenando la columna (columna empaquetada). Al igual que en todos los mtodos cromatogrficos, la separacin en cromatografa de gases se debe a la migracin diferencial de los componentes de una mezcla a travs de la columna. Hay un fenmeno de reparto entre dos fases, la fase gaseosa mvil (gas portador), y la fase lquida estacionaria (en la columna). En una mezcla de sustancias, que

Fig. 7. Final del desarrollo cromatogrfico. Observacin con luz ultravioleta

APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFA EN FASE GASEOSA. IDENTIFICACIN DE AGLUTINANTES Y BARNICES EN CAPAS PICTRICAS

Identificacin de aglutinantes Los compuestos orgnicos que pueden aparecer en las capas pictricas y de preparacin deben su uso a sus propiedades filmgenas (son sustancias que se aplican en estado lquido y al secar son capaces de for-

PH Boletn24

49

mar capas o pelculas), utilizndose para la preparacin de aglutinantes, adhesivos, consolidantes y barnices. Corresponden a los siguientes grupos de sustancias: protenas, polisacridos, ceras, aceites secantes, resinas naturales, materiales bituminosos y sintticos. Vamos a considerar la aplicacin de la cromatografa en fase gaseosa a la identificacin de los dos grupos principales de aglutinantes: protenas y aceites secantes.

La muestra inyectada contiene los derivados voltiles de los aminocidos que componen la protena objeto de identificacin. La separacin de estos aminocidos se consigue en las siguientes condiciones:
Fase mvil: Fase estacionaria: Nitrgeno, presin en cabeza de columna 25 psi. Polidimetilsiloxano (columna HP-1, 30 m, 0.25 m, 0.25 mm d.i.)

Identificacin de aglutinantes proteicos Las protenas estn constituidas por polmeros naturales formados por la unin de aminocidos mediante enlace peptdico. En su composicin entran los L-aminocidos siguientes: histidina, triptfano, lisina, hidroxiprolina, arginina, cido aspr tico, cido glutmico, glicina, alanina, valina, isoleucina, leucina, serina, treonina, prolina, fenilalanina, tirosina, cistina, metionina. La diferenciacin entre los tres tipos fundamentales de sustancias proteicas utilizadas en restauracin (colas animales, huevo y casena) estriba en las distintas proporciones de aminocidos que entran en su composicin, por lo que la identificacin del tipo de protena implica el anlisis de los aminocidos que las componen. El procedimiento analtico consta de las siguientes etapas: 1. Hidrlisis de la protena para liberar los aminocidos al medio Este proceso suele realizarse con cido clorhdrico 6N durante 24 h. a 110C. 2. Purificacin del hidrolizado Adems de aminocidos, el hidrolizado contiene impurezas (sales, carbohidratos, etc.) que deben ser eliminadas. La eliminacin de impurezas se consigue por filtracin del hidrolizado a travs de una resina de intercambio inico. 3. Derivacin Un requerimiento fundamental para poder analizar una muestra por cromatografa en fase gaseosa es que la muestra sea voltil. Caso de no serlo, como ocurre con los hidrolizados proteicos, hay que recurrir a la obtencin de derivados voltiles. Existen varios procedimientos para la obtencin de derivados voltiles de aminocidos. El procedimiento analtico utilizado en el Laboratorio de Qumica del I.A.P.H. implica la obtencin de trimetilsililderivados de aminocidos, mediante la utilizacin del reactivo derivante bis-trimetilsililacetamida. 4. Inyeccin de la muestra en el cromatgrafo de gases Una vez obtenido el derivado voltil, se introduce la muestra en el sistema de inyeccin del cromatgrafo con ayuda de una microjeringa.

Programa de temp: De 90C a 220C, gradiente 2C/min. Inyeccin: Detector: Splitless a 250C. FID a 250C.

Fig. 8. Separacin e identificacin de aminocidos por cromatografa en fase gaseosa

Fig. 9. Separacin e identificacin de cidos grasos por cromatografa en fase gaseosa

Las colas animales se caracterizan por la presencia del aminocido L-hidroxiprolina, no presente en el huevo ni en la casena, asociada a altos niveles de L-prolina y L-glicina (20%). El huevo se caracteriza por su alto contenido en L-serina (10%) y la presencia de grasas en la yema. Mientras que la casena presenta niveles de cido L-glutmico superiores al 20%. En la Fig. 8 se observa el cromatograma de una capa de preparacin de la obra D Leonor y D Mencia de Cabrera e hijas de Pedro de Campaa. La distribucin

IDEA

5. Separacin de los aminocidos

PH Boletn24

50

IDEA

de aminocidos es acorde con una cola animal (presencia de L-hidroxiprolina asociada a altos niveles de L-prolina y L-glicina).

Acidos grasos insaturados: cidos oleico, linoleico y linolnico. Los principales aceites secantes utilizados en restauracin son aceite de lino, de nueces y de adormidera. La diferenciacin entre estos tres tipos de aceites implica el anlisis de los cidos grasos que los componen. Los cidos grasos insaturados (oleico, linoleico y linolnico) son los responsables de las propiedades secantes de los aceites ya que a travs de transformaciones qumicas, pr incipalmente de oxidacin, conducen a la formacin del polmero linoxina. La destruccin de este polmero conduce la formacin de cido acelaico, cido dicarboxlico no presente en la composicin original del aceite. El procedimiento analtico para la identificacin de aceites implica las siguientes etapas: 1. Hidrlisis del triglicrido para liberar los cidos grasos. 2. Preparacin de los derivados voltiles de los cidos grasos para poder ser inyectados en el cromatgrafo. Al igual que ocurra en el caso de los aminocidos, los cidos grasos no son voltiles por lo que hay que recurrir a la preparacin de derivados voltiles. Existen varios procedimientos para la obtencin de derivados voltiles de cidos grasos. El procedimiento utilizado en el Laboratorio de Qumica del I.A.P.H. supone la obtencin de trimetilsililderivados de cidos grasos mediante la reaccin con el reactivo derivante bis-trimetilsililacetamida. 3. Inyeccin de la muestra 4. Separacin de cidos grasos La separacin de cidos grasos se consigue en las siguientes condiciones:
Fase mvil: Nitrgeno, presin en cabeza de columna 25 psi.

Identificacin de aglutinantes oleosos Desde el punto de vista qumico los aceites estn constituidos por triglicridos de cidos grasos. Un triglicrido es un ster formado por la reaccin de esterificacin entre un alcohol (glicerina) y cidos grasos. Los cidos grasos que entran en la composicin del triglicrido son: Acidos grasos saturados: cidos palmtico y esterico.

Fig. 10. Cromatografa de colofonia

Fig. 11. Cromatografa de almciga

Fase estacionaria: Polidimetilsiloxano (columna HP-1, 30 m, 0.25 m, 0.25 mm d.i.) Programa de temp: De 150C a 230C, gradiente 10C/min. Inyeccin: Fig. 12. Cromatograma de dammar Detector: Splitless a 230C. FID a 250C.

En el cromatograma de aceites se obser van fundamentalmente los cidos palmtico, esterico y acelaico. La presencia del cido acelaico es consecuencia del proceso de secado del aceite. Las diferencias entre los tres tipos de aceites utilizados en restauracin estn en las distintas proporciones de cidos palmtico y esterico. Palmtico / Esterico Aceite de lino Aceite de nueces Aceite de adormidera 0.7 - 1.4 2.5 - 3.5 4.0 - 5.0

PH Boletn24

51

En la Fig. 9 se observa el cromatograma de una policroma roja del Retablo de la Iglesia de la Encarnacin de Albolote (Granada). Se detectan los cidos acelaico, palmtico y esterico. La relacin cido palmtico / cido esterico (1.2) se corresponde con un aceite de lino.

Resinas diterpnicas, tambin denominadas resinas duras: colofonia, sandaraca, mbar. Resinas triterpnicas, tambin denominadas resinas blandas: almciga, dammar. El procedimiento analtico empleado para la identificacin de estas resinas es similar al descrito para la identificacin de aceites secantes.

IDENTIFICACIN DE BARNICES

La cromatografa en fase gaseosa tambin tiene aplicacin en la identificacin de las resinas naturales empleadas en la formulacin de barnices. Estas resinas estn constituidas por polmeros derivados del isopreno. En su composicin aparecen cidos e hidrocarburos terpnicos. Pueden clasificarse en dos grandes grupos:

En las Fig. 10, 11 y 12 se observan los cromatogramas de colofonia, almciga y dammar, respectivamente.

Bibliografa

GMEZ GONZLEZ M L. Examen cientfico aplicado a la conservacin de obras de arte. Ministerio de Cultura 1994. PARRA, E. Anlisis de materiales orgnicos. Tcnicas y aplicaciones. Curso de tcnicas de diagnstico aplicadas a la conservacin de los bienes muebles. Granada 1996 C. J. SERNA. Espectroscopa IR, visible y UV. Cromatografa. Introduccin a la ciencia de materiales: tcnicas de preparacin y caracterizacin. CSIC 1993 KLEBE J. F., FINKBEINER H. and WHITE D. M. Silylations with bis(trimethylsilyl)acetamide, a highly reactive silyl donor. Journal of the American Chemical Society n 20, 1966. MILLS J. S. and WHITE R. The organic chemistry of museum objects. Ed. Butterworths, 1987. MILLS J. S., WHITE R. The gas-chromatographic examination of paint media. Some examples of medium identification in paintings by fatty acid analysis. Conservation and restoration of pictorial art. Ed. N. Brommelle and P. Smith. 1976. WHITE R. The characterization of proteinaceous binders in art objects. National Gallery Technical Bulletin n 8, 1984.

PANCELLA R., BART R., FURLAN V. Application de la chromatographie en phase gazeuse lidentification des matires organiques dans les couches picturales. Methods for the preservation of cultural properties. Ed. Schweizer and Villiger. 1989. DE PABLOS F. Cromatografa en fase gaseosa. Prcticas de Laboratorio. Departamento de Qumica Analtica. Universidad de Sevilla. MASSCHELEIN-KLEINER L. Contribution to the study of aged proteinaceous media. Conservation and restoration of pictorial art. Ed. N. Brommelle and P. Smith. 1976. MASSCHELEIN-KLEINER L, HEYLEN J. et TRICOT-MARCKX. Contribution lanalyse des liants, adhsifs et vernis anciens. Studies in Conservation n 13, 1968. MASSCHELEIN-KLEINER L, MAES L. and ZRAMENSKI FESTRATES N. Etude technique de la tapisserie tournaisienne au XVe siecle. Les colorants. Bulletin de lIRPA XI, 1969. HOFENK-DE GRAAFF J. H. and ROELOFS W. G.Th. On the occurrence of red dyestuffs in textile materials from the period 14501600. ICOM Committee for Conservation 3rd Triennial Meeting. Madrid 1972.

Fotografas: Eugenio Fernndez Ruiz Centro de Intervencin del I.A.P.H.

IDEA