pregunta problema ¿Cuál es la forma de aislamiento de las microalgas Chlorella

sp? Para ello le piden a usted como investigador, que trabaje en el protocolo de
aislamiento describa paso a paso a partir de 2 o 3 autores.

PROTOCOLO DE AISLAMIENTO DE MICROALGA CHLORELLA SP.

Generalidades de microalga Chlorella SP: SU nombre deriva de las palabras
griegas Chloros que significa verde, verde amarillo y ella de pequeño, posee
forma esférica y un tamaño aproximado de entre 2 a 10 µm, pertenece a la división
Chlorophyta y a la clase de las Chlorophyceae.
Según ALGOMED (s.f.) esta microalga se cultiva sobre todo en Asia, Europa y
EE.UU. para lo cual se tilizan diferentes métodos como estanques abiertos,
fermentadores o foto biorreactores.
Según Infante et al.(2012) y ALGOMED(s.f.) esta microalga se ha cultivado en
forma intensiva con fines de alimentación y obtención de metabolitos.

Materiales y metodos:
Toma de muestra:
Nunca recoga el agua en botella que utilice látex para el cierre de los extremos de
la botella, porque el tubo de goma de látex hace que el agua sea tóxica para las
algas según Price et al. 1986 (como se cita en Andersen 2005).
Realice para todo el material de vidrio esterelización, rotule los envases con la
información necesaria pero como minimo debe contar con: Nombre de quien toma
la muestra, fecha y Hora, localización, punto de muestreo (Giraldo Gomez, 1995)
La muestra se tomara como minimo por triplicado en recipientes de 500 ml de
acuerdo a lo recomendado por WPCF, APHA, AWWA (1992) (como se citó en
Tafur Alvares & Estrada Palencia, 2015)
Realice un muestreo superficial empleando una red para fitoplancton, de no contar
con una, realice la colecta directamente en el recipiente.

Traslade las muestras al laboratorio tan pronto sean recolectadas no es necesario

refrigerar.

Aislamiento de Chlorella sp.

Realice de ser necesario un prefiltrado de la muestra con un material de poro
mayor a 10 µm, para eliminar material de mayor tamaño que dificulte la
observación al microscopio u organismos no deseados.

Verifique en la muestra o en la solución madre la presencia de de la microalga a

traves de las micrografias empleando microscopio, y microscopio ópticos con
contraste de fases con aumentos de 10x en adelante

observe la presencia de la microalga de interes, selecione la muestra donde se

observe mayor precencia de microalga y tome esta como punto de partida, de lo
contrario descarte las muestras y repita el procedimiento de toma de muestra.

Desinfección de materiales y área de trabajo.

Lave el material de vidrio y el área de trabajo con agua de jabón, retire la solución
con agua destilada y desinfecte con una solución de Alcohol etílico al 70%

Preparación de medio de aislamiento y cultivo

Se utilizará Fertilizante Foliar (NPK) a 0.5 ml/l de agua purificada más agar-agar (6
gr/l) con pH 8,3. Para la fase de escalamiento del cultivo monoalgal de Chlorella
sp.

Esterilización del medio de cultivo

Realice la esterilización del agar bacteriológico (solución del paso anterior en un

Erlenmeyer) y de las placas Petri empleando una autoclave con las siguientes
condiciones 15 psi y 121 °C por un periodo de 15 minutos.

Cuando este enfriando y antes de gelificar, sirva el agar en las cajas Petri, para
esto se recomienda la utilización de los elementos de protección personal, así
como el uso del mechero de alcohol encendido entre el analista y el medio de
cultivo.
Deje reposar las cajas de Petri invertidas por 20 minutos antes de comenzar el
proceso de aislamiento

Aislamiento
Utilice método de estriado de placa, la siembra se realizará por diseminación en la
superficie de agar, para lo cual es necesario el uso del asa bacteriológica, caliente
su punta hasta el rojo vivo en la llama del mechero y deje enfriar cerca del mismo,
con el asa desinfectada y atemperada tome el inóculo y extiéndalo sobre la
superficie, sin hacer presión para no romperlo, repita el procedimiento en cada una
de las placas.
Después de realizar la siembra las cajas Petri deben almacenarse bajo las
siguientes condiciones: Posición invertida en lugar aislado, iluminación de dos
lámparas fluorescentes de 20 watts (luz día – 6500K), fotoperiodo 12:12, y una
temperatura de 28°C +- 2°C para estimular su reproducción.
Pasados 15 días se puede directamente sin destapar las cajas Petri ubicarlas en
el portaobjetos y verificar el crecimiento de la microalga Chlorella sp. En el agar,
de esta forma se elimina la posibilidad de contaminar el cultivo, se devuelven las
muestras hasta aproximadamente un mes, tiempo suficiente para alcanzar una
mayor densidad celular.
Pasado el tiempo estipulado en el paso anterior se procede a realizar las réplicas,
proceso que consiste en transferir el inóculo sembrado en las placas de agar a
unas nuevas placa agar (subcultivo), para lo cual se procederá de acuerdo a los
pasos mencionados anteriormente para la obtención de las placas agar.
En este paso es necesario desinfectar el microscopio con la solución de alcohol
etílico al 70%, tener el mechero encendido y el asa bacteriológica desinfectada, se
procede a destapar las cajas de Petri, se ubican en el porta muestra para realizar
una observación con el lente de 10x y ubicar la microalga, se pasa al lente de 40x
con cuidado de que el lente no toque la muestra, con esto se verifica la ubicación
exacta, se realiza nuevamente cambio de lente al de 10x para facilitar la captura
con el asa bacteriológica y diseminar nuevamente la microalga sobre la superficie
de cultivo. Este procedimiento debe repetirse el número de veces que sea
necesario hasta obtener el cultivo monoclonal y axénico de Cholorella.

Bibliografía
ALGOMED. (s.f.). Chlorella-Cultivo natural en alemania. Obtenido de
https://www.algomed.de/es/chlorella-2/

Giraldo Gomez, G. I. (1995). Manual de Análisi de agua. Manizales: Universidad Nacional de

Colombia Sede Manizales.

Infante, C., Angulo, E., Zárate, A., July, J. Z., Barrios , F., & Zapata, C. (2012,). PROPAGACIÓN DE LA
MICROALGA Chlorella sp. EN CULTIVO POR LOTE: CINÉTICA DEL. Avances en Ciencias e
Ingeniería, 159-164.

Tafur Alvares, J. E., & Estrada Palencia, L. (2015). Tratamiento de aguas residuales in vitro por
medio de la microalga Chlorella SP en el muncipio de Barrancabermeja Colombia. CITECSA,
5-19.