BLOQUE 5

UNIDAD 11.1
CLONACIÓN

Ariadna Medina
OBJETIVOS
1. Comprender qué es la clonación molecular.
2. Describir los componentes de la clonación.
3. Aprenderemos las fases del proceso de clonación.
4. Conocer las aplicaciones de la clonación molecular.

Ariadna Medina
Concepto de clonación
CLONACIÓN = proceso de amplificación selectiva de una secuencia o fragmento específico de ADN.
¿Para qué? Conseguir elementos genéticamente idénticos entre sí e idénticos al elemento de partida  CLON.

CLONACIÓN MOLECULAR
Ariadna Medina
Concepto de clonación
CLONACIÓN MOLECULAR = proceso de amplificación “in vivo” de secuencias de ADN utilizando TECNOLOGÍA
DE ADN RECOMBINANTE (rADN).
• Tecnología que utiliza enzimas de restricción
¿Qué es? para cortar y unir secuencias de ADN de interés.

• Las secuencias de rADN se colocan en vectores

que transportan el ADN hacia el lugar adecuado
1
de la célula huésped donde será copiado o
expresado.

1 2
FORMACIÓN DEL ADN
RECOMBINANTE AMPLIFICACIÓN
(In vivo)
(In vitro) 2

Ariadna Medina
Concepto de clonación
CLONACIÓN MOLECULAR VS PCR
Mismo objetivo  amplificar secuencias de ADN
CLONACIÓN MOLECULAR CLONACIÓN ACELULAR (PCR)
In vivo In vitro
Se usa la capacidad replicativa de una célula Se generan las condiciones para la replicación
Técnica manual Automatizada
Tarda días Tarda horas
Obtención de cantidades ilimitadas de secuencias Cantidades limitadas por el número de ciclos
Amplificación de hasta millones de bases Amplificación hasta 35kb

Ariadna Medina
Componentes para la clonación molecular
Esquema general

1 Endonucleasas de restricción

2 Vector de clonación

3 Inserto

4 Célula hospedadora

Ariadna Medina
Componentes para la clonación molecular
1 Endonucleasas de restricción

Enzima que corta y degrada ácidos nucleicos mediante hidrólisis del enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos.
• ORIGEN = bacteriano
• SITIO DE CORTE  diana de restricción
• Degradan ADN ajeno
TIPOS
I II III
Actividad Endonucleasa / Endonucleasa /
enzimática
Endonucleasa
Metilasa Metilasa
Punto de corte (2 Corte inespecífico a Corte específico en Corte inespecífico
Tijeras moleculares
hebras) 1000pb del SR el SR en el SR
Interés en ingeniería
genética
No Sí No

Numerosos Eco PI
Eco K
Ejemplos (siguiente Eco P15
Eco B
diapositiva) Hinf III

Ariadna Medina
Componentes para la clonación molecular
1 Endonucleasas de restricción

Enzima que corta y degrada ácidos nucleicos mediante hidrólisis del enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos.

Ariadna Medina
Componentes para la clonación molecular
1 Endonucleasas de restricción

Enzima que corta y degrada ácidos nucleicos mediante hidrólisis del enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos.

Extremos
romos

TIPOS DE Extremos cohesivos

CORTE con saliente 5’

Extremos cohesivos
con saliente 3’

Ariadna Medina
Componentes para la clonación molecular
2 Vector de clonación

CARACTERÍSTICAS
 Molécula de ADN de tamaño pequeño de secuencia conocida
 Fácil de aislar
 Debe tener mínimo un sitio de inserción (ORI)
 Fácil de introducir a una molécula anfitriona
 Capacidad de replicación autónoma en la célula anfitriona
 Debe tener un gen marcador  identificación
(ej: genes de resistencia a antibióticos)

• Plásmidos
TIPOS • Bacteriófagos
• Quimeras

Ariadna Medina
Componentes para la clonación molecular
2 Vector de clonación
TIPO
 PLÁSMIDOS

ADN bacteriano extracromosómico con capacidad autónoma de replicación.

PLÁSMIDO PBR322  Plásmido E.coli

• Bajo peso molecular (4363pb)
• Genes resistencia antibióticos  Tetraciclina (TC) y Ampicilina (Amp)
• Corte con EcoRi  no corta los genes de resistencia
• Corte con BamHi  Corta el gen de resistencia a tetracilinina
• INSERTO= 3,5-5KB

Mapa genético y físico de pBR322 que muestra las posiciones de dos genes de
resistencia a la ampicilina (amp) y la tetraciclina (tc), el punto de partida de la
replicación (ori) y los lugares de corte más importantes de las endonucleasas de
restricción.

Ariadna Medina
Componentes para la clonación molecular
2 Vector de clonación
TIPO
 BACTERIÓFAGOS

Virus que infectan a bacterias

Una vez infectada a la célula  Ciclo lítico o ciclo lisogénico

Fago λ
• Virus que infecta a E.coli
• ADN lineal-circula bacteriano 48502pb
• Se usa el fago modificado con menos sitios de restricción
• Gen marcador lacZ
• INSERTO= 20KB

Ariadna Medina
Componentes para la clonación molecular
2 Vector de clonación
TIPO
 CÓSMIDO
Formados por parte del Fago λ + plásmido
• Secuencia COS del fago + Ori del plásmido + gen de resistencia a antibiótico + marcado lacZ
• INSERTO =50kb

Ariadna Medina
Componentes para la clonación molecular
2 Vector de clonación
TIPO
 CROMOSOMAS ARTIFICIALES  BAC
Cromosoma artificial bacteriano
INSERTO= 300kb
Permite la construcción de genotecas

Ariadna Medina
Componentes para la clonación molecular
3 Inserto

Fragmento de ADN de interés que se quiere clonar

Para conseguirlo es necesario usar enzimas de restricción (tipo II)

VECTORES
4 Célula anfitriona Bacteriófagos
Plásmicos
Cósmidos
Cepa K12 E-coli
PROCARIOTAS Bacterias Bacillus subtilis
Streptomyces
Sacharomyces cerevisiae
Levaduras
Pichia pastoris
VECTORES
EUCARIOTAS Células Plasmido Ti de Agrobacterium
animales y tumefaciens
vegetales Insectos= Baculoovirus
Mamíferos = Retrovirus

Ariadna Medina
Fases de la clonación
1 Creación del ADNr 2 Introducción del ADNr en la 3 Selección de clones con
célula anfitriona secuencia diana

Preparación del inserto

Extracción y purificación ADN

+
Endonucleasas de restricción

Preparación del vector

Endonucleasas de restricción

Inserción del inserto en el vector

Mezclar con ligasas

Ariadna Medina
Fases de la clonación
1 Creación del ADNr 2 Introducción del ADNr en la 3 Selección de clones con
célula anfitriona secuencia diana

MÉTODOS

Transformación Transfección Transducción Microinyección Electroporación

bacteriana

ADNr se introduce por ADNr se introduce Aplicación de descargas

Bacteria ADNr se
acción de un virus mediante microjeringas eléctricas a la célula
COMPETENTE introduce en
anfitriona para permitir el
capta el ADNr células eucariotas
paso del ADNr al interior

Ariadna Medina
Fases de la clonación
1 Creación del ADNr 2 Introducción del ADNr en la 3 Selección de clones con
célula anfitriona secuencia diana

MÉTODOS DE DETECCIÓN

Genética Inmunohistoquímica Hibridación

Mediante anticuerpos Mediante sonda marcada

Mediante marcadores genéticos
(como genes de resistencia a
antibióticos)

Ariadna Medina
Aplicaciones de la clonación molecular
INVESTIGACIÓN BÁSICA
• Secuenciación de ADN de organismos de interés
• Estudios filogenéticos
• Conocer diversidad genética de una población

INVESTIGACIÓN APLICADA
• Producción de insulina, factor de coagulación, hormonas de crecimiento
• Producción de enzimas y catalizadores
• Crear microorganismos metabolizadores de productor tóxicos, petróleos, mercurio…
• TERAPIA GÉNICA  transferencia de genes normales a una célula somática
o Sintesis normal de productos génicos

• RATONES TRANSGÉNICOS  Ratón con ADN modificado

RATONES KNOCKOUT RATONES KNOCKIN

Ariadna Medina
 BLOQUE 5
UNIDAD 11.2
SECUENCIACIÓN

Ariadna Medina
OBJETIVOS
1. Dominar las técnicas de visualización de fragmentos e interpretación de
resultados mediante la electroforesis.
2. Conocer los métodos de secuenciación.

Ariadna Medina
Secuenciación de ADN
Proceso de determinación de la secuencia de nucleótidos que componen una molécula de ADN
Para qué
• Segmentos codificantes
Determinar la información que contiene un segmento específico de ADN • Segmentos reguladores
• Segmentos mutados
Investigación básica

¿Qué sabemos hoy en día?

Diagnóstico de patologías
genéticas El genoma humano contiene alrededor de tres mil
millones de pares de bases.
Diagnóstico de
APLICACIONES enfermedades infecciones

Farmacogenética

Medicina forense

Ariadna Medina
Métodos de secuenciación de ADN
Hasta 1kb
DE PRIMERA GENERACIÓN Químico de Maxam y Gilbert
CLÁSICOS Enzimático de Sanger
DE PRIMERA GENERACIÓN
Basado en Sanger
AUTOMATIZADOS

Paseo cromosómico
MÉTODOS DE A GRAN ESCALA Shotgun
SECUENCIACIÓN
DEL ADN Pirosecuenciación
DE NUEVA GENERACIÓN Terminación reversible cíclica
Por ligación
1kb-
genoma
SMRT-Seq
completo
DE TERCERA GENERACIÓN Ion Torrent
Nanoporos

Ariadna Medina
Métodos de secuenciación de ADN
1.1. CLÁSICO. MÉTODO QUÍMICO DE MAXAM Y GILBERT
• Método basado en la modificación química y rotura del ADN Daimetil Modifica GUANINA
Tubo 1
Sulfato
• Secuenciar fragmentos cortos de hasta 20 nucleótidos
Ácido Modifica GUANINA y
• Requiere gran cantidad de ADN purificado Tubo 2
fórmico ADENINA

PROTOCOLO Hidracin Modifica CITOSINA y

Tubo 3
a TIMINA
1. MARCAJE DEL ADN Marcar el extremo 5’ con 32P Tubo 4
Hidracin Modifica CITOSINAS
a + NaCl

2. MODIFICACIÓN
Reacción química de modificación de bases nitrogenada
QUÍMICA DE LAS BASES

3. HIDRÓLISIS QUÍMICA SELECTIVA Se añade PIPERIDINA: Rompe la cadena por la base modificada

4. ANALIZAR PODUCTOS Electroforesis en gel de poliacrilamida 🡪 separa los fragmentos según tamaño
Añadir Urea 🡪 Impide la formación de Puentes de Hidrógeno

Ariadna Medina
Métodos de secuenciación de ADN
1.1. CLÁSICO. MÉTODO QUÍMICO DE MAXAM Y GILBERT

Ariadna Medina
Métodos de secuenciación de ADN
1.1. CLÁSICO. MÉTODO QUÍMICO DE MAXAM Y GILBERT

Al desnaturalizar solo son revelados

los fragmentos marcados.
Los fragmentos de la hebra no
marcados también se distribuyen
por el gel pero no son detectados.

Ariadna Medina
Métodos de secuenciación de ADN
1.2. CLÁSICO. MÉTODO ENZIMATICO DE SANGER
• Método de terminadores de cadena
• Se basa en interrumpir la elongación durante la replicación in vitro – MEDIANTE ddNPT (Nucleótidos didesoxi).
• Secuenciar fragmentos de hasta 900 nucleótidos.
• Requiere gran cantidad de ADN purificado
PROCEDIMIENTO
1. SÍNTESIS DEL ADN COMPLMENTARIO (Elongación)
• Desnaturalizar el ADN
• Añadir cebadores que se hibriden en el extremo 3’ del ADNmonocatenario
• Dividir la mezcla en 4 alícuotas
• Añadir los ddNTPS concretos a cada tubo

2. ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS

• Electroforesis en gel de poliacrilamida  Separa los fragmentos según tamaño

• Añadir Urea  Impide la formación de Puentes de Hidrógeno
• Revelado = Autorradiografía
• Lectura = De Abajo  Arriba (5’  3’)

Ariadna Medina
Métodos de secuenciación de ADN
1.2. CLÁSICO. MÉTODO ENZIMATICO DE SANGER

Ariadna Medina
Métodos de secuenciación de ADN
1.2. CLÁSICO. MÉTODO ENZIMATICO DE SANGER

En cada tubo se consiguen

fragmentos que comienzan con el
cebador 5’ y terminan en 3’ con el
mismo nucleótido (ddNTP).

Ariadna Medina
Métodos de secuenciación de ADN
2. PRIMERA GENERACIÓN AUTOMATIZADOS BASADOS EN SANGER
Tras el desarrollo de la PCR, el método de Sanger se fusionó con la PCR y surgieron secuenciadores automáticos
de 1ª generación.

• Se utilizan 4 FLUOROCROMOS. EN 1 TUBO METEMOS:

EJEMPLOS DE FLUOROCROMOS EMPLEADOS • ADN molde

NOMBRE NOMBRE COMPLETO COLOR • Cebadores
COMÚN EMITIDO
• Taq-polimerasa
FAM 5 o 6 carboxilofluoresceína Anaranjado • 4 dNTPs
JOE 5 o 6 carboxi-4’,5’-dicloro-2’,7’- Rojo Púrpura • 4 ddNTP cada uno marcado con un
dimetoxifluoresceína fluorocromo diferente.
TAMRA 5 o 6 carboxitetrametilrrodamina Púrpura
ROX 5 o 6 carboxi-X-rodamina Azul Verdoso
ELECTROFORESIS CAPILAR

Los fluorocromos se excitan con un láser y emiten fluorescencia que ELECTROFEROGRAMA

valorada por un equipo informático específico

Ariadna Medina
Métodos de secuenciación de ADN
2. PRIMERA GENERACIÓN AUTOMATIZADOS BASADOS EN SANGER

Ariadna Medina
Métodos de secuenciación de ADN
3.1 A GRAN ESCALA. PASEO CROMOSÓMICO

contig contig contig

clonación

Ariadna Medina
Métodos de secuenciación de ADN
3.2 A GRAN ESCALA. SHOTGUN
1. Realizar una PCR
2. Obtención de pequeños fragmentos superponibles
mediante el uso de enzimas de restricción.
3. Secuenciación y alineamiento mediante programas
bioinformáticos.

Ariadna Medina
Métodos de secuenciación de ADN
4. DE NUEVA GENERACIÓN. PIROSECUENCIACIÓN.
VENTAJAS
• Secuenciación masiva
• Rápido y barato
• Permite la secuenciación de genomas completos
Técnica que mide la liberación de pirofosfato – Emisión de luz por reacciones enzimáticas.

PROCEDIMIENTO
1. El genoma se fragmenta al azar. Los fragmentos
de ADN se unen a oligonucleótidos = cebadores
universales que amplifican todos los fragmentos.)

2. Mediante uno de los adaptadores se unen a

esferas

3. Amplificación (PCR) en cada microesfera

Ariadna Medina
Métodos de secuenciación de ADN
4. DE NUEVA GENERACIÓN. PIROSECUENCIACIÓN.
VENTAJAS
• Secuenciación masiva
• Rápido y barato
• Permite la secuenciación de genomas completos
Técnica que mide la liberación de pirofosfato – Emisión de luz por reacciones enzimáticas.

PROCEDIMIENTO

Ariadna Medina
Métodos de secuenciación de ADN
4. DE NUEVA GENERACIÓN. PIROSECUENCIACIÓN.
PROCEDIMIENTO
1. El genoma se fragmenta al azar.
2. Cada fragmento de AND se unen a una
microesfera mediante adaptadores universales.
3. Amplificar (PCR) cada microesfera
4. Añadir microesferas a un chi de pocillos.
5. Reacción de pirosecuenciación.
6. Detectar la luz emitida

Ariadna Medina
Métodos de secuenciación de ADN
4. DE NUEVA GENERACIÓN. PIROSECUENCIACIÓN.

Ariadna Medina