trEZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin, formato sin peso

Introducción

Thermo Scientific™EZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin (sulfosuccinimidyl-6-[biotinamido]-6-

hexanamido hexanoate) permite el etiquetado de biotina simple y eficiente de anticuerpos,
proteínas y cualquier otra macromolécula que contenga amina primaria. El marcaje específico de
las proteínas de la superficie celular es otra aplicación común para estos reactivos únicos
impermeables a la membrana y solubles en agua.

Los productos Thermo Scientific™ No-Weigh™ son reactivos especiales que se proporcionan en un
formato de alícuotas previas. El empaque prepesado evita la pérdida de reactividad del reactivo y
la contaminación con el tiempo al eliminar la apertura y el cierre repetitivos del vial. El formato
permite el uso de un nuevo vial de reactivo cada vez, eliminando la molestia de pesar pequeñas
cantidades de reactivos y reduciendo las preocupaciones sobre la estabilidad del reactivo.

La biotina es una pequeña vitamina natural que se une con gran afinidad a las proteínas avidina y
estreptavidina. Debido a que es tan pequeña (244Da), la biotina se puede conjugar con muchas
proteínas sin alterar sus actividades biológicas. Las proteínas marcadas se pueden purificar a partir
de proteínas no marcadas usando geles de afinidad de estreptavidina y avidina inmovilizados (ver
Productos Thermo Scientific relacionados), y se pueden detectar fácilmente en aplicaciones ELISA,
dotblot o Western blot usando sondas conjugadas de estreptavidina o avidina.

Los ésteres de biotina N-hidroxisuccinimida (NHS) son el tipo más popular de reactivo de
biotinilación. Las biotinas activadas por NHS reaccionan de manera eficiente con los grupos amino
primarios (-NH2) en tampones de pH 7-9 para formar enlaces amida estables. Las proteínas,
incluidos los anticuerpos, generalmente tienen varias aminas primarias en la cadena lateral de los
residuos de lisina (K) y el extremo N de cada polipéptido que están disponibles como objetivos
para marcar con reactivos de biotina activados por NHS. Se encuentran disponibles varios ésteres
de biotina NHS diferentes, con diferentes propiedades y longitudes de brazo espaciador. Los
reactivos de éster de sulfo-NHS son solubles en agua, lo que permite que las reacciones se realicen
en ausencia de disolventes orgánicos como DMSO o DMF.

La biotinilación de la superficie celular es una herramienta importante para estudiar la expresión y

regulación de receptores y transportadores, la diferenciación de proteínas de membrana
plasmática de aquellas localizadas en membranas de orgánulos y la distribución de proteínas de
membrana en células epiteliales polarizadas. La especificidad de los reactivos Sulfo-NHS-LC-LC-
Biotina para el marcaje de la superficie celular se ha demostrado en estas aplicaciones.1,2 Debido
a que estas moléculas se disuelven fácilmente en soluciones polares y están cargadas por el grupo
sulfonato de sodio en el anillo de succinimidilo, no pueden permear la membrana celular.
Mientras la célula permanezca intacta, solo las aminas primarias expuestas en la superficie se
biotinilarán con estos reactivos Sulfo-NHS-LC-LC-Biotina.
Información importante del producto

• Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin es sensible a la humedad. Guarde los viales de reactivo a -20°C con

desecante. Para evitar la condensación de humedad en el producto, equilibre los viales a
temperatura ambiente antes de abrirlos.

• Como se indica en el procedimiento, disuelva el reactivo de biotina inmediatamente antes de

usarlo. El resto de éster de NHS se hidroliza fácilmente y se vuelve no reactivo. Deseche cualquier
reactivo reconstituido no utilizado.

• Evite los tampones que contengan aminas primarias (p. ej., Tris o glicina), ya que competirán con
la reacción (consulte la Figura 2). Si es necesario, dialice o desalinice de otro modo para
intercambiar la muestra de proteína en un tampón libre de aminas, como solución salina
tamponada con fosfato (PBS; consulte Productos Thermo Scientific relacionados).

• Cuando se biotinilan proteínas en solución, el exceso de biotina que no ha reaccionado y los

subproductos de la reacción se eliminan fácilmente mediante exclusión por tamaño utilizando
columnas de desalinización o diálisis (consulte Información adicional y productos Thermo Scientific
relacionados). Una columna de desalinización de 10 ml es la más adecuada para procesar
reacciones de biotinilación que implican 1-10 mg de proteína en aproximadamente 0,5-2 ml. Para
cantidades más pequeñas de proteína y/o volúmenes de reacción más pequeños, tanto la reacción
de biotinilación como el posterior intercambio de tampón se pueden realizar en una sola unidad
de diálisis Thermo Scientific™Slide-A-Lyzer™MINI. Para volúmenes de reacción más grandes de los
que se pueden procesar con una columna de desalinización, divida la muestra entre dos columnas
o use un casete de diálisis Slide-A-Lyzer adecuado para los pasos de intercambio de tampón.

Materiales adicionales requeridos

• Solución salina tamponada con fosfato (PBS) u otro tampón libre de aminas que tenga un pH de
7-8 para usar como tampón de reacción (consulte Información importante del producto y
productos Thermo Scientific relacionados)

• Columnas de desalinización o unidades de diálisis para el intercambio de tampones (consulte

Información importante del producto y Productos Thermo Scientific relacionados)

Procedimiento para Biotinilar Proteínas en Solución

A. Cálculos

El alcance del marcaje con biotina depende de la distribución de los grupos amino en la proteína y
de la concentración y cantidad de proteína que se va a marcar. Mediante el uso de la proporción
molar apropiada de biotina a proteína, se puede controlar la extensión del marcaje. En
comparación con las reacciones que involucran soluciones de proteínas concentradas, las
reacciones de marcado con soluciones diluidas requieren un exceso molar mayor de reactivo de
biotina para lograr el mismo nivel de incorporación. En general, use un exceso molar de biotina ≥
12 veces para proteínas a 2-10 mg/mL o un exceso molar de biotina ≥ 20 veces para proteínas a ≤
2 mg/mL. Ajuste la relación molar del reactivo de biotina a la proteína para obtener el nivel de
incorporación deseado.
1. Calcule los milimoles de reactivo de biotina para agregar a la reacción para un exceso molar de
20 veces:

2. Calcule microlitros de solución de reactivo de biotina 10 mM (preparada en el Paso B.3) para

agregar a la reacción:

B. Reacción de marcaje con biotina

1. Retire un vial de reactivo de biotina del congelador y caliéntelo a temperatura ambiente antes
de abrirlo en el paso 3.

2. Disolver 1-10 mg de proteína en 0,5-2,0 ml de PBS según el cálculo realizado en la sección A.

Nota: la proteína que ya está disuelta en un tampón sin aminas a un pH de 7,2 a 8,0 se puede usar
sin intercambio de tampón ni dilución con PBS. Las proteínas en Tris u otros tampones que
contienen aminas deben intercambiarse en un tampón adecuado.

3. Inmediatamente antes del uso, prepare una solución 10 mM del reactivo de biotina agregando
150 µL de agua ultrapura a cada vial. Disolver pipeteando repetidamente la solución o vortex con
la tapa en su lugar. El volumen máximo utilizable de cada tubo es de 800 µL.

4. Agregue el volumen apropiado (consulte Cálculos en la sección A) de solución de reactivo de

biotina 10 mM a la solución de proteína.

5. Incube la reacción en hielo durante dos horas a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Nota: Aparte de la posibilidad de degradación de proteínas ordinarias o crecimiento microbiano,

no hay daño en reaccionar por más tiempo que el especificado.

6. El marcaje de la proteína está completo en este punto, y aunque el exceso de biotina hidrolizada
y sin reaccionar permanece en la solución, a menudo es posible realizar pruebas preliminares de la
proteína marcada mediante ELISA o Western blot. Una vez que se ha confirmado la función y el
marcaje adecuados de la proteína, la proteína marcada se puede purificar para obtener un
rendimiento y una estabilidad óptimos mediante desalinización o diálisis. Si se va a utilizar el kit de
cuantificación de biotina Thermo Scientific™ Pierce™ (ensayo HABA; consulte Productos Thermo
Scientific relacionados) para determinar el nivel de incorporación de biotina, primero se debe
desalinizar o dializar la proteína para eliminar la biotina que no ha reaccionado.

Procedimiento para Biotinilar Proteínas de la Superficie Celular

Existen muchas variaciones de este procedimiento en la literatura (ver Referencias de productos).

El marcaje se puede realizar en células en suspensión o en células adherentes en placas de cultivo.
En esta última situación, la difusión del reactivo Sulfo-NHS-LC-LC-biotina a todas las superficies de
las células será limitada y el marcado se producirá predominantemente en la superficie expuesta.
Los medios de cultivo deben lavarse de las células; de lo contrario, los componentes que contienen
amina competirán y apagarán la reacción a las proteínas de la superficie celular. El uso de una
suspensión de células más concentrada es más efectivo porque se requiere menos reactivo de
biotina en la reacción. Por lo general, una concentración final de reactivo de biotina de 2-5 mM es
eficaz. Las reacciones de NHS ocurren más rápidamente a un pH más alto; por lo tanto, se usa pH
8.0 en el siguiente ejemplo para que el etiquetado pueda completarse lo más rápido posible.

1. Lavar las células tres veces con PBS helado (pH 8,0) para eliminar de las células los medios de
cultivo que contienen aminas y las proteínas.

2. Suspender las células a una concentración de ~25 × 106 células/ml en PBS (pH 8,0).

3. Agregue 1 vial (1,0 mg) de reactivo Sulfo-NHS-LC-LC-Biotina por ml de suspensión celular (da
como resultado un reactivo de biotina ~1,5 mM). Alternativamente, agregue 150 µL de la solución
de reactivo de biotina 10 mM (consulte el paso B.3 en la página anterior).

página) por ml de suspensión celular.

4. Incube la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Nota: realizar esta incubación a 4 °C puede reducir la internalización activa del reactivo de biotina.

5. Lave las células tres veces con PBS más glicina 100 mM para extinguir y eliminar el exceso de
reactivo de biotina y los subproductos.

6. Lise y/o analice las células marcadas con biotina según lo requiera el método de investigación.