GUIA LABORATORIO N°2: RECUENTO DE HONGOS Y LEVADURAS

Basado en Norma ISO 7954:1987

1. INTRODUCCIÓN

Comúnmente se da el nombre de mohos a ciertos hongos multicelulares, dotados de un micelio verdadero,

microscópicos y cuyo crecimiento en alimento se conoce por su aspecto aterciopelado y algodonoso. Las
levaduras son hongos que crecen generalmente en forma de agregados sueltos de células independientes.
Debido a su amplia dispersión en todos los estratos bióticos e inertes, se considera su fácil y frecuente aparición
como contaminante en productos alimentarios, ya que estos, constituidos por sustancias inorgánicas y orgánicas
más o menos complejas, constituyen excelentes medios de reproducción y crecimiento. La presencia de
contaminantes fúngicos en alimentos no solo se interpreta como una fuente potencial de deterioro sino la
posibilidad de que muchos de ellos puedan producir toxinas.

2. OBJETIVOS
 Adquirir destreza en la determinación de hongos y levaduras en alimentos.
 Conocer la cantidad de hongos y levaduras que contiene un alimento.
 Aprender a calcular y reportar la presencia de hongos y levaduras en un alimento.
 Realizar informe de resultados obtenidos por la muestra analizada.

3. PREGUNTAS PRELIMINARES
a) De acuerdo con esta norma colombiana, ¿Cuál es el criterio microbiológico para recuento de mesófilos,
en el alimento que va a usar en este laboratorio?
b) ¿Cuál es la composición del Agar OGY?
c) ¿A qué tipo de alimentos se les realiza recuento de hongos y levaduras? De 3 ejemplos
d) Describa las diferencias entre hongos y levaduras

4. MATERIALES
 3 Cajas de Petri estériles
 3 Pipetas de 1 ml estériles
 1 Frasco de dilución con 90 ml de agua peptonada al 0,1%
 1 Pipeta de 10 ml (para muestras de alimento liquidas)
 3 Tubos de 16x150mm tapa rosca con 9 ml de agua peptonada 0,1%
 Asa de Drigalsky
 Papel estéril
 Marcador de vidrio
 Vinipel

5. MEDIOS DE CULTIVO
 60 ml Agar OGY o Extracto de levadura-glucosa-cloranfenicol (YPG)

6. EQUIPOS
 Pipeteador
 Incubadora a 25°+/- 2°C
 Contador de colonias
 Balanza con sensibilidad de 0,2 g
 Baño de agua –control termostático 45+/- 1°C para templar el agar

7. PROCEDIMIENTO

a) Tomar 10 g de muestra y macerarla; en caso que la muestra sea liquida tome 10 ml en pipeta esteril y
agregue en el frasco que contiene 90 ml de agua peptonada al 0,1% mezclando para homogeneizar la
dilución.
 b) Realizar diluciones en base 10 del alimento (10-2, 10-3, 10-4 ) transfiriendo 1ml de la muestra previa en 9 ml
de agua peptonada 0,1% (evite muestrear espuma). Agite todas las diluciones 20 veces
c) Sembrar en superficie 0,1 ml de cada una de las diluciones seleccionadas, en Cajas Petri con Agar OGY
separadas y debidamente marcadas.
d) Extender cuidadosamente el inoculo sobre la superficie de la placa con la ayuda de una varilla de vidrio
acodada y estéril (asa de Drigalski, esterilizar el asa con alcohol y flameado en la llama de un mechero –
ver https://youtu.be/7g7IjQagYFs
e) Invierta las Cajas de Petri solidificadas
f) Incubar rápidamente a 25°C por 5 dias

8. RECUENTO (rango de conteo 15-150)

Contar las colonias de cada placa a los 3 , 4 y 5 días de incubación.

9. EXPRESIÓN DE RESULTADOS

9.1 Criterio de selección: Después del periodo de incubación, retener las placas que contengan un máximo de 150
colonias, si es posible al nivel de 2 diluciones sucesivas (rango 15-150 colonias).

Calcular el número N de hongos y levaduras presentes en la muestra para análisis, se calcula como la media
corregida de dos diluciones consecutivas, utilizando la siguiente ecuación:

N= ∑C
V * ( n1 + 0,1*n2) * d
Dónde:

∑C: es la suma de las colonias contadas en todas las cajas Petri que contienen dos diluciones consecutivas,
donde por lo menos una de ellas contiene un mínimo de 15 colonias
V: es el volumen de inóculo utilizado en cada caja, en mililitros;
n1: es el número de cajas retenidas en la primera dilución
n2: es el número de cajas retenidas en la segunda dilución
d: es el factor de dilución correspondiente a la primera dilución retenida

El resultado calculado se redondea a dos cifras significativas. Cuando se realiza esta operación:
- si la tercera cifra es inferior a 5, no se modifica la cifra anterior;
- si la tercera cifra es igual o superior a 5, la cifra anterior se incrementa en una unidad.
Preferiblemente el resultado se expresa como un número entre 1.0 y 9.9 multiplicado por la potencia de 10
adecuada, o como un número entero con dos cifras significativas.
El resultado se expresa como número de hongos y levaduras N por mililitro (para productos líquidos) o por
gramo (para el resto de productos).