A TEM et} Sonia Aversa- Raul Cerolini LCF eit Ble] fo} MANUAL DE OOO W Oa @ Andlisis de muestras de sangre, semen, explosivos y restos de incendios @ Quimica balistica, documentoldgica y papiloscépica @ Cotejo de tierras, pelos y granos de polen ‘@ Revenido de nuimeros'en metales ‘@ Plancton y asfixia por sumersi6n @ Cromatografia gaseosa y espectromettia de masas @ Espectrofotometria de absorcién atomica ES Ediciones La RoccaLa quimica forense es, sin dudas, un pilar de Ia investi- gacién criminal del que no se escapa ninguna especialidad de ica. Ell indiee de este manual lo dice y por eso es para mi como criminalista, un honor prologar esta obra, ma— ime oi se tiene en cuenta que fui participo y testigo principal del crecimiento del laboratorio en cl cual ella se redacté. ‘Se exponen aquf todas y cada una de las técnicas con las que el Laboratorio auxiliz a Iu justicia desde la ciencia, pero guizas el mérito mas particular de la obra sea la sencillez con la que se exponen temas que, para un criminalista, lejos de la formacién quimica de un especialista, hace posible su realiza- cién El presente manual esta dirigido a todos aquellos que, siondo o no especialistas en la materia cientifica propiamente dicha —quimica forense—, se encuentren interesados en in- formarse acorea dol modo cn que los autores del presente tra- bajo han arribado —con capacidad y tes6n— a los logros que contribuyen grandemente a solucionar los problemas plantea- dos en las cuestiones de orden criminalistico Ng pyyde dejar de destacar los méritos de los autores de10 Mawuat be quianica FOREN: ra los demés, y que ha logrado sus metas con una constante inquietud por progresar, por buscar cosas nuevas, por inven- tar, modifiear, reemplazar, superando las bavreras que a otros han frenado, y eon un total desintorés y humildad hu coopere- do con otras instituciones del pats, compartiendo sus técnicas, sus observaciones y logres con un espfritu docente permanen- te que le ha hecho transmitir todo lo que sabe. ‘Tres de sus me- jores colaboradores han formado parte de este texto, perv no son los finiens; detrsis quodia un equipo que aprendis un modo de trabajo y de compromiso con el saber, que prolongaran la obra iniciada con tes6n hace veinte anos. Rusen B. GONZALEZ Parand, abril de 2004 * Comiserie Mayor (RE), Licenciads en eriminulisticn. Bx director de Criminalistica de le Policia de la provincia de Entre Kios (epublica Ar gentia,INDICE GENERAL AGRADECIMIENTOS PROLOGO srotssner Inronuccion Capituno Painex0 LUGAR DEL HECHO 1, Introduccion .. 2. Ordenamiento de la tarea en el lugar del hecho . @) Cereo de seguridad - b) Busqueda y demarcacién de indicios ... ¢) Potografindo sess 1. Fotografia panorémica . 2. Fotografias secuenciales uw 3. Indicios referenciados ... 4. Detalles .. a) Croquizacién e) Levantamionto P Testigos .. 252 Movin ine Quisica FORENSE Captruno Td ANATISIS DR MUBSTKAS DI SANGKLE 1, Fundementas tedricos .. 2. Sistamatica en el levaulunuiento de indiies @) Manchas secas Observaciones ooceene 4b) Sangre fresen entravagada Preservacién 1. Naluraleza del material. Identifiaacion fi sivo-quimiea f 1) Reaetivos ane oneran en medio aeide id) Reactivas que oporan en media slealino 1, Feente de origen de una mucstra de san gre {) buaune difusion radial. Test de Quch teriany (miudificads) id) Contza-irmunoclectroforosis, iu. Diagnéstiey individual. Hemotipificaciin 3. Sistemas de grupay exnguiness : ARO . 1. Bstructura y provledadtes fsicoquimicas de los aglutindgens ABO, 2. Investigaciin de aglutinégenas y agiutininas 3, Muestras de sangre (resca . 1 Grupo celclar faylotimacion directa) BD) Método en plea if) Método en Lubo ui. Grupo serio (prueba inversay 4, Discusion de lns resultados 1. Faclores Uenieas de error Ti. Factores wlohulanes a eeriens 1, Patologia de base potencial 5) Sistema Hhesusfynice ceNERAY as 1. Muestras de sangre parcial o totalmente des- hidratadas .. erases 63 1. Téeniez de absoreién. Klucién 63 it, Téenica operatoria weccwnennnnnennes 6b in. Discusién de los resultados... 61 2, Inmunoensayo no eompetitivo directo en fase sélida .. . 70 3. Naturaleza de la interaecion plastico ote a 4, Tipos de fases sdlidas semua EB captruto TIL ANALISIS DE SEMEN 1. Introduccién . 7 2, Mucatras " 8 @) La victima 78 2) Muestra sobre soportes absorbentes 79 ¢) Muestra sobre soportes no absorbentes .. 80 Be MMOS sissnsmsacingeresex 81 @) Analisis en la vietima 82 6) En soportes absorbentes 83 ) En soportes no absorbentes 83 4, Bl espermatozoide 83 5. Fosiatasa acida prostatica 89 6. Valder aneann- esis 86 7. Otras técnicas .... sarcomas BE 8, Antigenos del sistema AHO en semen 87 CaptreLo 1V QUIMICA BALISTICA 99 18 sobre el ALMA .ossuetnerunesneneni 904 Nanev, F Quinta EUREKA a) Tntrednerion b) Vrwebs de Ja dizeniiamina sulfariea 1. Materiates 2. Preparacién 3. Método 4, Fondsmeanto quimies 6) Beubs de Pater Gries-von Tloswa 1. Materiales 2. Métndas .. 1. Preparas 11, Reaccién TIL Sumdenenlo quimico a Anélisie nobre las manos del autor (dermotect) a} Introduedéa hy Analisis de metales 1, Matoriales .... 2. Métodos .. : 1 Toma de muastras 11. Procseamiento de las cintea para detcctar plomo ¥ barie i, Procavaniients de la cinta para detcctar AMEMIONID says vy, Operaciones practicadas para cheauear sensihilidad y expecificidad. Sas resulta- ¥. Otras observaciones 3. Diseusion 4. Analisis de pévera 5. Andlisis de componentes erganicas de las pal- YOPAS sone Ansilisis sobre ol blanco ¢) Introdvecién , 4) Bstudio de orificies sobre tela... Interpretacion de los resultados €) Estudios de orificios sobre otras blanens .. d) Fatadios de orificing sobre piel ©) Fl informe mn del papel reaetivo 90 a1 ot OL a1 92 ve 92 92 02 92 93 oF 95 oy 109, 109 10L 101 102 102, 104 105 107 108 110Beep isnice cesenat 5 Cavirue V COTEJO PERICIAL DE TIERRAS. Introducciin: 3 Levantamicnte de muestras ....... il4 Materiales ....se« u6 Método: 1s @) Tamizacién oan 17 8) Cotejo de la fraccion gruesa 17 ¢) Determinacién de la densidad de la race mfina 117 d) Determinacion del PH .. ssnnges 118 e) Curva de sedimertacién espontanea 118 A Sodimentaciéa por centrifugacién 2) Espectrofotometria ‘’h) Mieroseopia de comparacién 8) Anilisis organieo 121 J) Discusion ... 121 Capiruo VI (COTEJO DE PELOS Introduccion teorica .... 123 ‘Toma de muestras y montaje 124 . Observaciin microscepiea nr. 127 Composicién del pelo 198 a) Cotojo wee 198 &) Cuticula 128 ©) Valor de la cutieula en el cotejo .. 129 d) Corteza 131 ec} Médula .. 132 A Diseusién 135 tras consideraciones periciales 137Sa Pen r Manta DE GoIWcs FORENEE ei Fvoluciin ded pelo cou la edad 3) Rogidn del enerpo de Ia enal proviene 2} Palo eaido, eariade o arrunwiide d Determinaeiin de la cana ©) Otras estudins «. f) Enfermedades det pelo .... 4) Finfermedades nodulares is mdosa Iricoptilosis .. . Tricunudosis Cabellea de Faynet Monileiris. Bulermedades que provocan (a caida del cave Mo a a asic Lo 7 2, Cabellos on signe de admiracign 3, Cabellos cnilaveres 1. a 8. 4 h. lreldnas wenkienss Capirore VIL RRVENIDO DE NUMEROS EN METALES Introduceiéa .. Condiciones de ia supericie a Ualar Yorifieaciin previa ‘Tratamiento previa de las super Fl revenido quimicn Roouperacién de numeracionns eliminadas 6: ‘Ivatamiento recomendado pars hierre y acre dutlee ‘ 1. Mesedas de carvoecrias 2. Blocks de motor, chussis jorms, enadras de motocieletas y armas de Snes 4) Tratamiento recomendads para acaro duro Chasie de camiones, mayuinas visslos, ewadeos de motacielelas japonesas, caflones 137 138, 188 138 1389 139 140 140 140 140 140 140 141 wat uit wi. 143, 146 147 148 14g 152 153 18 154 164 134fnmice ceneRaL ” ¢) Tratamiento recomendado para aluminio y sus aleaciones .... +. 15 1. Blocks de rotor de motocicletas, armaduras de pistolas y revélveres, plaquetas auucnes 158 2. Blocks de automéviles vee LBB Capizito VII COTEJO DE GRANOS DE POLEN Introduccion ...... s 167 Levantamiento de muestras: 158 a) Ropas o calzados de tela ananeenrereeee 158 5) La muestra del lugar del hecho 168 1. Del suelo .. si 158 2. De muebles u otros objetos 159 Separacién de los granos de polen del soporte 160 Aislamiento de los grapos de polen es... 160 a) Centrifugacion .... 160 ) Bliminacion de carbonatas 16 o) Eliminacién de materia organica ..... exes, GL 1. Mezcla de Schulze sit 161 2. Mezela de Luber insiiccrmeanaancn LBL, a) Lavados . 161 ) Flotacidn de los granos de polen 161 fi Separacion de ios granos 162 8) Coloracién 162 i) Montaje i 162, i) Medio de montaje: preparacion 163 Estudio microsespico vcececcenensinnimennnersnen 168 Capiruto IX BUSQUEDA DE PLANCTON COMO DIAGNOSTICO DE MUERTE POR ASFIXIA POR SUMERSION La muerte por asfixia por sumersién .. 185w Macsirsr ne. gas 2 BI planeton 3. Papel del plancton sa lus astisias gor sumersioa 4. Investigacién del planeton 5. Métodos sa a) Pretestamivnto del material 4) Lavestigacién en cavidades © Lavestigacion on médula ) Diseusién de los resultados AnineLe X ANALISIS QUEMICO Dis EXPLOSIVOS, wt 1. Definieiones: previas wT a) Rxplosidn . - vessanicnte, SEPP 4) Explosive crite 178 2. Clasifieaeién dv las explosiones 178 a) De primer orden: detonaciones .... 1s BI De segundo orden: explasién prapiarsente dicha 178 Clasifieaviéa de los explosives a} Por su ennstitucicn 1. De una especie quimica 2 Mezclas de sustanclas uo ealosvas por at mismias Les 3, Mezela de varias sustaneins enn una mas Lis 178 explosives . 179 } Por au velocidlad de: propagacion cry 1. Lantos, progrsivos 6 bajos o deflagrantes .. 179 2. Hépides, eumpedores o altos 79 5. Inieiadres 0 prianarios o falminantes 0 dete nantes . 179 eb Por su estado lisivo casino, IE 1. Siting... 1s 2. Liquidos 79 3 Gaoesosos 179noice. cmverat 13 Sistemas de encendidos sevsenee VB a) A mecha ... i" fone VID b) Meeanico 180 ce) Eléctrico z 180 @) Quimico 180 e) Combinados 180 Los primeros pasos en la investigacion de un explo RO. season 180 EI muestreo quimico 181 Anilisis de las muestras .. 182 Fase analitica sa...» 183 a) Las cromatografias 183, b) ‘Tratamiento de la fraccién acvosa .. 1, Investigacion de aniones 2. Investigacion de cationes 185, 3, Investigacién de sustancias insolubles 185, Capruto XI QUIMICA DOCUMENTOLOGICA Papel vues unui 187 Materias primas para el opel ceases 187 a) Fibras de b) Fibras de canamo 187 188 ©) Fibras de algodén 188 d) Celulosa savenice “A ©) Abmid6n casccsnsnesneinenein 138, f) Madera . =n 188 8) Residuos 189 ‘Tipos de pastas de parel . 189 a) Pasta mecénica . 189 b) Pastas quimicas vow 189 1. Pasta al su'fato wise, 180 2. Pasta ala coda 189 3. Pasta al sulfite vow 189Boe Noval, ue quince FonEsst 4. Pasta semiquimica Tipos de papel Analisis fisizo del papel Andlisis quimico det papel a) Analisis det encolasio i 1. Determinacién de a'miden 2, Determinacién de cols (o gelatnia) animal 1. Determinacin de resina (enlofonia) .. 4, Determinacién de cassina 5, Determinacion de agregadas plaslivos treat nas naturales o sinleticas, resinas de polia midas) 4) Analisis de Tignina ‘presente en papeles fica. dos con paste: macdaica de madera w obras fibras lignificadas como paja ni blanquewda) ©) Andlisis de eolorantes a) Analisis de Bhras ... L. Reactivo de Herzberg 2. Reactive de Sutermeisier 8. Reacliva *U? de Graft csc 6) Analisis de minerulos que constituyen Ja “ear- ga") Tintas .. a) Distintos tipos de fintas 1 le fargo de la historia 4) Colorantes smntaticos a la anilina ©) Analisis de tinias 1. Examen fisie 2. Andlisis quimicos 3. Resetivos para ens d) Cromatogratin de tintas « Fundamentos teonivos 2. Seleccidn de la “fase estact 4. 1 Aldmi A, Siliaayet 6 gel de siliee tit, Terra do diatonuas w lierva de infavorios (ddeselgahe) 190 iso 190 191 19 ig 1g 192 362 wwe 192 192 192, 193 198 193 194 197 197 198 199 199 199 199 200 200 201 202 202 203 209fume GENERAL ty, Celulosa microcristalina 4. Seleveidn de la “fase MOVIL" cases 1. Fase mévil tt, Fase mévil seleccionada it, Pureza del solvente W. Vieeosidad de! solvente .. ¥, Toxicidad ¢ inflamabilidad VI, Actividad del solvente .. i) Solventes préticos ... ii) Solventes apréticos 5. Tintasde bol tera (consistencia pastosay flui- da) 1. Materiales y reactivos 4. Técnica operatoria. .. . Notas complement arias... |. Mezclas resolutivas sugeridas Tintas luidas en general. Boligrafo, Marcadores de fibre sea Caputo XIL ANALISIS PERICIALES SOBRE RESTOS DE INCENDIOS . Acelerantes . Naturaleza de los acter . Materiales de muestreo | Deleceidn de acelerantes de la combustion median- te GC/MS . Motodologia de Urabaj a) Examen inicial de la muestra ...0. 4) Recuperacién de los acelerantes en las muestras ¢) Identifieacién de los acelerantes potencialment presentes Materiales e instrumentacion .... Lt Muestra 21 208 203 204 204 204 204 205 205 207 207 au au 212 219 220 220 295 226 228 228 231 281 238 2a 237 23722 MAKUGL DE QUIRICA RUIRERE 1 Insteumentaeion 2} Totouprotnciée do leo vooultedes 6. Conelu gee Capirero XU CROMATOGRAFIA CASEOSA ‘SPECTROMETRIA DB MAAS 1. Conceptos de cremutogralia . ai 2. Pundamentos de cromatograiia gaseosa de 3. Los detectores _ 245 4. Kl espectrdmelre de masas 247 Carineno XIV ESPECIRUFOTOMEPRIA DR ABSORCION ATOMICA Lntevduceién 2 Fundamenvos del metody . Capiecey XV QUIMICA PAPLLOSUOPICA 1. Tatreduccion 261 2. Consideraciones teéricas .. 2 3. Méiudes 264,INTRODUCCION La quimica forense es una especialidad fascinante. En ella se integra todo el saber de un quémico con todo el saber de uncriminadista y parte del saber de un médica forense. Fi ella no hay ratina, ‘Todos los dias se puede eroar. Cada caso es di ferente; lo que nunca hizo nadie se puede idear; las téenieas se pueden innovar y adapiar; los conocimientos se suman; el trae bajo es interdisciplinaria. El bioquimico aporta lo suyo, él L- cenciado en quémica lo que falta, el espectalisia en balistica completa un Area y et documentélogo otra, el bidloge cabre un vacio, ol biotecndlogo otros, y de este meda, un buen equipa de quinica forerese debe contac con todos. La quimica forense no se estudia como especialidad de posgrado en ninguna facuitad. El quimica forense se debe ha- cer solo, para lo cual el primer requisite es ser curios. En este libro se vierte todo lo que a lo largo de veinte aioe, comenzando de caro, se pude hacer en un laboratorio de quimica forense, revogivnde la experiencia de todos los que sa bian algo que nos era il y sumando toda la ereatividad de un equipo que no se cans6 de probar. De esta mamera, la obra que hoy damos a luz pretende ser una gufa util a la practica del anahiais forense, tanto para os quimicos y bioquimicos que desean encarar esia especiali-24 Manuinc i gcimaca PORENSE dad, cont para los ertminalistas que requieran aplicar algu- nas de lag Lecnivay espeeificas de su dro pericial. Sin embar g0, no completa el saber. Sin le base quimiea necessria, aru- hos «le las eaysitulos de este libro no serdn ulesnzables, y cin 1a formacién necesaria, los ocmipas especiales no se podran uti- jizar. Pern cada uno poded tomar de él una parte: el perite en papiloveopia pedza levantar rasitos mesfinnie reactivas quimni- 208, #1 documentétogo podra reslivarestudios detintas, of w ico forense submi qué muestras tomar para diaynoslicar ana asfixia por sumons:én, ol experta on eromatozrulia gaseosa po ded colaborar con ol perite de bemberros on cl eatudio de un in- cendio, ol biogaimica podré analicar manchas de sangre; en fin, un buen equipo de criminalistica eneontrard aqui ideas y wétados probadus y eficaces para su inyesLizacion pericial. PATRICIA M. Cano Purand, abril de 2004CartruLo PRiwtERO LUGAR DEL HECHO* 1. Inrrouccion La tarea del quimica forense no se limita al andlisis del lahoratorio. En la mayor parte de los easos, dicha tarea se ini- cia con la participacién del perito quimico on el escenario de Jos hechos, lo que implicw la necesidad de que el perito quimi- co forense pasea amplios conocimienios de criminalistica, a fin de lograr que los festigos mudus se explayen con toda su po- toncialided. Al respecto, nadie mejor que el propio perito para reali- nar la inspeccién minuciosa del escenario, ya que es él el eono- cedor de todos los indivios de valor forense y con posibilidad de ser analizados en el laboratorio para extraer informacién <0- bre el ocho, a la vex. que es él quien sabe la manera correcta de lovantar y proservar dichos indicios, sobre todo enando se trata de material biolégice, perecedoro por su propia natura~ ‘eza, u fin de no cometer errores que los hagan luego no idé- nens para cl andlisis. % Trabajo eluborade por Ia doctora Paricts M. Catto,26 ‘Mawtrar ne qomtues wows in embargo, el requerimients sapiencial ne eo agou en Jn manera corveela de levantar y preservur, sino queen diecha actividad cxiste una scrie de requisites procesales que darn validez v anularin ta prucha, lo que requiere del parito um prom funds conocimienio de las disposiciones del Cédigo Pracesul Ponal, asf como tstabién ma munera de Lrabajar, con eriterio critninalistien, que ordenard la taren de modo Lal que uo se espe nude al ojo inyuisidor del huscador de indicios, a la ver que permita cocamcatar convenientementa toda la operacion pare aportar prueha al tribunal. ‘edo Te eho demuestra una verdad includibie, cuales la neersidad de qua ol profesional egresado Ue las diversas 03 rra- ras con orientacién ala quimica, cuands ha clagide dedicarse «una especialidad tan apasionante como Io on la quiimica fo reasc, reciba Ja adeeuada preparicidn on la disciglina evimai- nalistica, lo gen si bien ao la haxé mejor qufmicy, le permitira esplolar sus conoeimiontos en la especialidad que ha logide dela manera més idénea, y sobre todo, aprenderd a hacer het blur con (oda su po.eueialidad a lus testagns mudos, ala ven ‘que pretegers sn Taber de li posibilidad de la invalidlex, judi. cial. 2 OlENamEN1O DF 14 Pane BN Rr. LewaR Dat. recKO AV sevibo del porcouul investigader al lugar dol hecho, ef anismo deberd organizar sn tarca de manora de se ‘gnir una se Hie de pusys sccuenciates que permican detactar tode date de interés ala eausa, 4 la vez que documontarle convenientemen tan fin de que el levantanieatu sea indiseutiblemente valido Gentro del juicio penal, y eur tal daenmontacivn se conatituyn en |e ojos del juez, obscrvande la esconn Part ello, se wranacriben a cuntinaneida los Paso: a sexuir en dicha tarea orpanizadn, para luvgo aportar detalles para la Taalizacién de cada uns de esos pasesLucian ott HECHO. 2 a) Cerco de seguridad— Cuando arriba el personal encargado de realizar el relevamiento del lugar de] hecho, su primer objelivo sera cercar convenientemente todo ol excens- rio, a fin de impedir compulsivamente el ingreso de curiesos que lo puedan alterar, Hevarse elementos adherides al calza- doo correrlos del lugar en que se hallan, aportar indicios aje- nos como pisadas, huellas, pelos propios, ete. Ello implica que el mismo personal que realiza la tarea se debe organizar a st mismo para evitar, una vez cercado el escenario, scr él mismo el que lo altere por moverse inadecuadamente dentro de 1, Es- ta organizacidn obliga a que sélo una persona asuma la direc- tiva de la operacién, indicando a cada uno lo que debe hacer, ‘engué momento y con qué criterio, Lo expuesto es una de lis premises principales de la labor que obliga a recalear que la tarea debe eer dirigida por una sola persona El cercade del escenario debe abarear no sélo los objetos involucrados en e} hecho, sino también su entorno, ya que los autores del hecho tuvieron que ingresar y egresar del lugar por algiin lado, pudiendo haber dejado indicios que tambien se de- ben investigar. $i un hecho ha ocurrido un el interior de una vivienda o edificio de cualquier tipo, deben ser aislades todas sua vias de ingreso y egreso, ineluyendo la calle que leva at mismo, ya que por dieha calle pudo haber circulado un vehi culo que transportaba a los autores, dejando hucllas en el sue- lo que deben sor estudiadas, y cuando se arriba con los movi les policiales, estampando nuevas huellas, ello se have imposible de realizar. De Ia misma manera, en el acceso pu- dieron haber quedado buellas de pisadas, regueros de sangre de algiin autor heride al rotirarse, ote., quo pueden ser pisa- das 0 alteradas por permitir la presencia de personas en esa zona. La experiencia nos dice que una de las empresas mais di- ficiles para cl investigador forcnse es lograr que se respete el ‘cerco por todas las ausoridades que concurren al lugar, kigien se el jel de policia, el juer, el fiscal, los abogados, ctc., por lo28 MancaL be Quikica romrtis que resulta de erucial impartaneia que el profesional que in mandara Tas tareas tenga suficionte autoridad yo personali- dad para suplirla, de manera de hacer eomprender la inapor- tancia de este roquisito de seguridad 8) Rrisqueda y demarenvidnse indicios-- Unaverque avien conduce ol operative hy ingresade al eseanaciv da ioe he- chos, reafizade una inepacciéa visual genoral de lado el ugar, interrogado algun tastigo y comprendido la naturalera del he- cha quo cst investigande, no se debe qucdar eu el centro de I eseona para comenzar a trabajar desiie dicho punto, sino gue se debe retirar y realizar una taren de inspeceidn desde ofuere hacia adentro, sistematizada y rainaciosa, acomparia- do de ios expering que: perian intorpretar los vlementas obace yados y darles a cada uno el valor de prueba que les corrospon- da, En esta organizacisn de la biiscunda de indicios wv pueden utlizar diferentes mévolos, habiendo quic:. preliere maverse siguiendo ol gito de Tas egsuias del reloj, harsiendo areas eiren- Jares, quien. opta por reslizar un rastrillaje par feanjas para- Jlas, quien divide ¢l eseenario en casdros, names vely los mis. mos ¥ reeerriende unis 4 1A, o quien gira un wpiral desde ol centry hacia la perforin. A veces, ln natimaleze del escenario es la gue determina endl de velas métados cs el may idSneo pa- re el eaco, Cualquicsn ne sea la metudologia empleada, 1oim- Portante os fijar waa ceterminada ¥ na mievarse sin algun ti po de ordenamiente, lo cual atenta contra la suguridad del hallazge de todos los indieios presentes. Como ejemplo s# vita que on ta investigacién de un acc donte de transite, el investigador s¢ debera mover recorries do estrictamente las Lrayactorias segmidas por los vehienlos en el proimpacty livsta Iegar al lugar de impacte, y desde alli en al posimpects hasta sus puntos de iemnvilidad final. Dasde este momento, ¢] invastipadar debe ser aenmpariae do por les testigns viviles exigides pay el Qidigge Prozosall, a fin do que ead hallazgo ges chacevadu wn conjunte, evn el objet de que mas tarde no se pueda invulidar la prucha con et ansLucan neL HecHo 29 mento de que Ia misma fue eolocada on el lugar por el propio investigador. Los testigos doben sor convenientermente instrai dos sobre la necesidad de que no toquen nada, no busquen por si mismos, ni de alguna manera alteren la escena, euidande los lugares en que pisen, desplazandose y actuando como me- ros observadores. En este primer paso de lé labor, el objetivo es la busque da, deteccién y demareacién de todos los indicios que puedan ser pasibles de estudios periciales pesteriores. De abi enton- ces la importancia de que esta bisqueda sea realizada por un profesional en criminalistica, o por el oficial encaryado de in- vestigar el hecho, acompaiiado por los expertos, quienes le se- fialardn qué es importante y qué no Ib es. (En numerosas ins- tituciones policiales del pais, los oficiales ncargados de esta tarea poscen conocimientos suficientes on cr:minalistica camo para poder realizarla sin la asistencia obligada de los peritos diplomados, pero ello debe ser juzgado por cada institucién.) En ese recorride del escenario desde ajuera hacia aden: tro, ¢] funcionario se ocupard de dejar debidamente sevialado cada indicio hallado, sin levantarlo, tovarlo ni moverlo, hasta tanto se hayan cumplido otros pasos previos. Para Ja demar- cacidn de los indicios se puede utilizar tiza, cuando ellos se en- caentren sobre superficies pasibles de ser escritas con elias, fechas de cartulina con mimeros o letras, o cartelitos seriala- dos can ellas, del tamaio adecuado para que puedan ser vi tos en la fotografia que luego se tomar. La ordenacién por nt meros o letras debera ser estricta, de maneré que en las tare: postoriores de fotografiado, croquizaciin y levantamiento, diz cha ordenucién permita asontar en Las actas los indicins levan- tados con los nameros 0 letras asignadas, motular los mismos con los mismos ndmeros o letras y redactarlos en el acts de inspeccién ocular en | mismo orden. 0). foinmgsiqdimm Vines Ae ja demerraian fin pelos bos. hide hallados, los oustios déberan sé¥ dicanicnvades fotogriificamente antes de ser removidos, ya que la fotografia30 Manual. ne quinica FORENSE constituyo la prucha a insertar en el expediente judicial, Al mismo tiempo, Ia fotografia debe cumplir Ja condici6n de ser Ja reproduccisn Ciel del escenario, de manera tal que analiza- das a lo largo del tiempo aporten toda la informacion como si se recorriera nuevamente el escenario. Para ello, se debe rea- lizar siguiendo una metodologia que se pucde dividir en cua- tro etapas: 1) panoramica;2) secuencis!; 3) indicios referencia- des, y 4) detalles. 1. Fotografia panorémiea. Ubicados en el acceso al es- cenario de los hechos, desde un punto desde el eual todo sea visto, se deberd realizar una toma panorcimica del lugar en la que se ubserve macroseépicamonte todo lo que se halla en él. De ser may amplio ol eseonario, y no poder ser captads por una sola toma, ode no contarse con un lente gran angular, es- ta tome panordmica se podra dividir en dos tomas que tengan la parte central en comin, para poder luego ser montadas jun- tas y representar la (olalidad de la escena. 2, Fotografias secuenciales, Desde el mismo punto en, el cual se ubieé el foldgrafo para la toma panoramica, o algo mas verca del centro de la escena, se fraccionara el escenario en cuatro o cinco partes, las que seran fotografiadas siguien- do una secuencia ordenada, de manera tal que cada tama abaraue algo de la anterior, 2 fin de que pasteriormonta todas pucdan ser enganchadas, reproduciendo lo mismo que se vio en la pancramiea, pero con mayor detalle do Ins abjelos en ea dauna. Estas dos etapas de fotografiado permiten documeotar la totalidad de los elementos que ya sc halluban en el lugar an- tes de la ocurrencia del hecho, quedando claro donde estan puertas, lis ventanas, Ios muebles, etc., mostrando tambien todo aquelio pertenuciente al hecho quese destaque, como pue- de ser la ubicacion de un cadaver, entre otzs elementos. 3, Indicios referenciados. A continuacién se fotogratia~ ran todos los indicios que fueron previamente senalizados me-Luca, EL HecHo 31 diante mimeros o lotras, siguiendo la secuencia de numeracién para no obviar ninguue de elles, pero estas tomas se deberin realizar con algin elemonto on cl fondo de la vista, que perce- nezea al lugar y que haya sido abareado anteriormente en las panorémicas y secuenciales, el cual obraré como referencia de Ta ubicacion del indicio fotografiado. Por ejemplo, una mancha de sangre en relacion con el mueble que tiene mas vereano, el cadaver en relacion con otro mueble ola ventana, un rebote de proyectil en la pared en relacién con la puerta, etcetera, 4, Detalles. Finalmente, si es necesario documentar en detalle, por ejemplo, una gota de sangre para someterla luego aestudics que permitan determinar la altura desde la que ca: y6,0 una huella de pisacia que mas tarde de lugar al cotejo con el calzada involuerado, un rebote en Ia pared que logre esta- Dlever la trayectoria del dispazo, ete., dicho indicio debera ser fotografiado con Ia camara fotagesfica colocada en forma per- pendicular sobre él y con una einta métrica al lado del # fin de tomar el detalle, sin deformacién y con posibilidad de ser medide con posterioridad. @) Croquizacion.— Finalizade el proceso de fotografia. do, corresponde realizar el eroquis referenicta! del lugar del he- cho. Dicho croquis comenzara por el escenativ veeio, es decir, si se trata de una vivienda, e plano de la misma o de los am- ientes invulucrados; si se trata de un espacio abierto descam- ado, el plano del lugar hasta donde haya side alcanzado por el hecho; si se trata dle la calle, el trazado de las arterias. En segundo lugar se ubicarsn sobre cl eseenario todas los elemer tos que hayan estado presentes on ol mismo antes de la comi- sign del hecho, como por ejemplo mucbles y ebjotos en el exps- do corrade, Arboles ea ol deseampado, automsviles en lax aalles, etc, Por ultimo se croquizard sobre lo anterior cada ano de los indicios que fueron sefalizados en el comienzo de la ta- rea, siguienda la secuencia ordenada para no perder ninguno y enumerando en el erquis de la mismia manera gue se hizoa2 Niven be avitica Farsi ca cl lugar, coineidiend enn los nurmeros que aparecen Leto graflados, Cada uno de estos indicins dchera ser ubivado exac- tamente eu el lugar duade esta, para Lo que se debersin tomar siempre desde ¢l mismo, dos medidas perpendicutares entre si y perpondiculares a lineas de referencia constituidas por pa- rades, bordes de calzadas, ote, Nunca so debera intentar toca- lizar un indicio eon una medida refurenviada am ponte, ya que dicha medida actéia como radia dé un cireale enyo eentro do girn es ese punta, y ol indie queda whiedu on forma exré tiea on todo cl porimatro dat a’roula, ©) Tevantarnienta.— Recidy ea este momento el perso- nal ju nie se encuentra en condiciones de proceder ul levantamiento de los indicios, ol que realizara siguienda las metodologiag que correspondan a cuda especialidad, de neuer- do con el indivig de que we Leate, Dado que lox testigos civiles obsorvaren la busqueda y de smaurcacién de los indicios, acompanarén ahora al levantador da Jos mismog en su larva, a lin de vorroborar que se Jevantan, on yasan y sellin realrnenie aquellos elementos que fuoron cnesn Lados en el escenario ¥ no otros. Tos envases contenedores de cada elemento deburdn ser rotutados co los datas dela eausa y el nmeee de indicia perlinente, de acuerdo con la onurneracion tortor, quo go eorreapondexd con les fotografiae y ol erequis. Hl cierre de tos contenedares debord asegurar au invinkehilidad has ta su utribe a los laboritorios donde seran astudiados, Una ves canetuida 1a (area, 2 deberain confeccionar dos aetaa, las que serin suscriptas por los testi- Bos que presenciaron toda la upurucidie: In primera deellas es Clacta de inspeceici jucdiviad, en La cual se describirs tede lo observado, y que se entuentra a cargo el oficial sumariante, ylaseeunda es ol acta de fevantemirate ele iudicéos, en la que se dorallard toda aquelly que we retire dal Ingar del hecho, pa- Ta somoter a pruehas perivintos poslerioresCarituto IL ANALISIS DE MUESTRAS DE SANGRE * 1. Fuxpamenros re6nrcos Dentro del espectro de muestras biolégicas que se presen tan regularmente como evidencia en relacion con un ilicito, la sangre ocupa un sitial predominante, y esto es légico si se con- sidera que, por un lado, una accién violenta muy factiblemen- te derive en lesiones mas o menos graves en uno o mas de las sujetos involucrados en la misma, v por tru, que es muy im portante el volumen de este fluido biolégieo —en condiciones fisiolégicas— on concurso con una muy amplia distribucion de la red vascular que permite su vehiculizacién, Es do esta manera como cn ol laboratorio con orientacisa quimico-forense, el estudio de manchas presuntas de sangre colectadas como veidencia se enmarea en una baterfa de ensa- yos denominados genericamente como andilists de rutina, El material aislado de una 0 varias manchas considera dus, a priori, como sangre al momento de efectuarse el releva- miento de ios lugares en donde se desarrollaran los heehos, © Trabajo elaborado por el doctor Ganiuet. Derost Mastad, ve @Leaiea nant puede presentar extremada yanapilidad en cuarite 2 las con disionay de comsrvacinn y a la eantidad dapositada, lv qua condiciunara el protaealo de engayes que seleceionard el peei- taal momento de efvetivizar ol estudio, Se debon considera’ cumo evidentia, 10 sdlo el weaterial que pueda ser recuperada del Hua de los becbus y euye Teen te puede recultar incierta en las actuationes preliminares, si- no también las muestras qué puedan cer oxtraidas por prote sional competente, tanto de lu o las vietimas, como de los imputados primariamente en Ta causa, El personal con especialiwacién crimmatisticg, que tenga a su carga le detecetin y recuperacién de indicios deba, en wna primera fase, evaluar globalaeate el eseenarin sircunstancial epayade en sus conocimientos técnices y medianie un andlisis biggies, contends on lu posible ton informavise aporteadi por ta instrureidn actwonte, interiancdo inferir, a.partir del cuartra de situacicn, una cadena de acontecimientos probable, lo que s wwnstituiré vx dirvctriz de laxoperaciones a practioerse en na sesinswde, fase: pare. conceeltie ob featedennivnses ie uqueellas: ninestras qise estcoadenn dle csontecimientasastableride: habres sefiatado como evidencia dentro del ampli espectro de mate vinles que se enciuniven ent ef sitio de referencts 3. SIgMMirICn AW ab LENANTAMIENTO DE INDICIOS Fi desarrollo da lag operaciones de levantamienta dee doncias debe seguir un orden necesarin y exigibhs, Sa requie- re ¢! trabajo eonjunto del perite quimico forense, personal es peviatizado eu planiunctria y croquizadon urbana, y personal del gubinete folugesficn, a ubienciéa original de los indieias a ser recuperadns, duedard fehacientemente esvablecida riediante ducumenta- sido fologreifice ¢ {flmica, con detaile de la localizacidn relati- sade cada elemente en el contexta gener. ras la eual ae rea- lizard el relevamiento plarimétrico del esecnario, En elANALISIS DE: MUBSFRAS OB SANGRE 6 eroquis de referencia, quedard correctamente estableeida la posicidn de cada evidencia a través de dos medidas exactaa, acrtadas on un extreme comtin por el elemento objeto de le- vantamicnto y cn cl otro por una catruetura no removiblo di ferente en cada toma. En el croquis quedaran senalados estos sitios posiciona- dos de tal manera, mediante una nomenclatura que guarde trecha correspondencia con Ia utilizada, tantoen la conic del detaile de elementos recuperados obrante en el acta de Te- vantamiento respectiva como en el rotulado de los revipientes colectores, El material constitutivo de una mancha considerada evi- dencia se aisla de la manera deseripta a continuaciéa. a) Manchas secas— Se embeben hilos de gasa hidrs- fila on solucién fisioldgien y se depositsn sobre 1a superficie de Ja mancha, ejerciendo ligera presidn de contacto, rotande pe- riddicamente hasta completar el levantamiento. Seguidamen- te se depositan en tubos 9 frasquitos de vidrio, viales Epeo- dorft, ete., rotulados convenientemente. En soportes impermeables ¢ insolubles esta operacién vs rapida y eficiente, Observaciones. Caben las siguientes: — El temaiio del reearte de gasa utilizado debe guardar relacién con el velumen de muestra presente, De este modo, en términos generales se utilizardn cories de 0.5 cm x 0.3 em, que contendrén varias capas de yasa. superpuestas. Cuando la mancha sea muy reducida se podrén extraerse mediante pin zaalgunos kilos de gava de uno de estas cortes, oon el objeto de concentrar la muestra en la menor cantidad de hilo posible. —La operacién de cortado de la pieza de gasa se debe efectuar con guantes, de lo contrario, sie! operador peree ii a 100 OU grupo sunguinco al coulactar las gauss con cl ser oe des He nos.“Mlorcar. or qunerca rome — Si se precume que porte del soporte se podria salubili zor en lu soluctin salina, y arrastrarse contamunando la muesira, os pusde practicur un raspude con bietur’ sin hidra- tacicn previa, depositordose ius excnrnns ubitenidas on, sobres de papel o vialis coma los detatiados, commenientemente roru- acl. — Sise dotertan menchas vn elemvatus fieilovate trons portubles, vs conveniente levantar directaments el soporte y ar- chivarte en recipientes de vidsio o papel. — Frente o ta presencia de materin’ absorbido er sopar- tes porasos (tierra, arena, aserrin. ete.) lo ideal es la remacitie del drea manchada, ex ly posible en su totaliclad, eon el ccuxi- Tio de bisturi, cuchara 0 simil, por enante se desennaee ep cipio qué voluman de con mucetra se podrd recuparar a partir de exon soportes hi Sangre fresea catravasade.— Se aspira con pipela Tastcur, jerings » gulero y s¢ deposila et vial con anticoagu- Jante. Esto permite en la mayoria de les cases, la determina- cién de grupo 7 factor sanguimeo por téenica directa Gott lox sucros hemotipificadores respectivos, previo a Lo cus se deb va constatar microsedpicamente el grado de eonseevacién de la masa eritrociteria Presorvariin, Tn este proveso, cacdauieres yeve seer ee déc- niea de recoloceién., se debe tener en cusriter give irateinelse de material bioligice vo altemente probable ox descomposicicn si transeasee in Ixpan prolongada entre el tevantamionta y te re- misién of laboraturin, to que hace necesarto proceder wl seeade inmedioto de los miwestras antes de su ent, Paso elke tos viates que contienen las gasas soportes man chadas ve debertin dejar rabiertos a la atmasfera, en lugar vei filacdo, sin exponer directamente al sol. hasta sue tatal secede: huegn se verrariin: herredticurente. Los soportes absurbentes nasvhados ron stangre (prendas, ropa de cama, ete.) se deberén exponer al cire (no al soll hastaANALISIS DE AIUESTHAS DE SANGRE 37 su seeucly total, antes de acondicionar para su envioal labora: torio Es recomendable ts utilizaciin de papel para el embataje de todo material con manchas biolégicas, yet que la colocacion en bolsas de nylon frecuentemente provoca condensacion de hu medad en la cara interna de tas mismas, con lo cual esiaremos enerando un micro ambiente éptimo para el desarrello micro: biano que resultard en un acelerado proceso desnaturalizante (por degradacion putrefaetiva) del material bioldgico de inte res, De no mediar determinaciones sereening sobre el terreno, 1a consideracién de una maneha eualesquiera como sangre ¢ su descarte est fuertemente condicionada a la impresién y ex- periencia personal del perito actuante, por lo que es condicién nocesaria la formacién acabada del personal con orientacién criminalistica, tanto en el plano teérico como en el experimen- tal. Sobre todas las manchas incluidas como evidencia de pre- sunta saugre, se practicara un protocolo de ensayos estandar que intentara aportar definiciones sobre tres cuestiones cen- trales, a saber: NATURALEZA del material componente de la mancha ORICEN HUMANO o ANIMAl.de la sangre. HEMOmPIFICACION. 1, Naturaleza del material. Identificacion fisico-quimi. ca: La mancha reciente depositada sobre soportes con esca sa coloracion de base presenta color rgjo brillante, tornindase ‘paca si la matriz. del mismo es absorbente. La opacidad se ha- co més evidente si queda expuesta a la luz solr, evolucionan- do el color al pardo rojizo por formacién de hematina. Siel soporte es oscuro, la macula puede quedar enmasca- rada; en tal caso, se examinara bajo luz UV, contrastando la mancha (opaca) contra la imagen fluorescente del soporte, 0 bien dirigiendo un haz de luz potente con diferentes angulos de incidencia (artificio también aplicado en la Incalizacin de elementos pilosos adheridos a matrices tejidas o similes),ae ‘MANUAL Dp Quinoa FoRENSE Kn el awilisis quimica del material compononte de una tancha se ulilizan Wenicas sereening que, en general, presen- tan como rasgo diferencial una elevads sensibilidad (lo que asoguen la uplienbitidad dal ensayo aun ante cantidades de maselra a nivel de irazu. Noson de alta enpeeiticidad, por lo cual son osoncialmente titiles cuando el resultado obtenido aa nogativo, lo que indica ue no existe sangre como compenen: le dle ta mancha en estudio o bien que s¢ encuentra en tenor infimo, por debajo del limite de sensibilidad, agotandose Ia in- vestiguciin en este punto, ya que no soran viables determina- clones posteriores, Ctra caracteristics de estos ensayas us la rapidey y sim- pleza de operaeién que vequieren y la eseasa complejidad de equtipamiento necesaria Todos se basan cn fa eapntidudl potenetal que posce el grupo hemo de la malécula de hemoylobina de ejarcer neti dad de peroxidasa, Aportando al sistema reaccionsnle ayia oxiyenada (poréuido de hidrégeno), el hema induce despre dimionto do ouigoas pur dasernposieién dol porévide, el cual actin sobre un sualrate uryistico reducido (bencidiva, fenolf taleina, luminol, ote.) transformandalo en su iorma dsiduda cromatica, Debernos hacer una disuincidin entre los sustratas organi. ens que reaccionan en medic atido y aquellos que lo hacen on medio alealino, por cnanta estos citings impliean waa menor probabilidad de error en los resultades obtenidos al acotar la invideniin de falsos pasitivos (principalmeate ante la cxisten- cia de contaminantes de origen vegetal que exhiben uetividad tipo peroxidasa) i} Reactives que operan en media deido: A. Reaetiva de Apirn: Sulvcién en medio ucétice 0 etilicn de aeNcinINa. Renctivo £; Disolver 0,01 yr de bencidiaa en 6 ml de fi de acétice glacial, o bicn saturar un yolumen de etanol con el sustraty. Reuctive 2: Agus oxigenada de 10 voluimenes. Técnica operatortaANALISIS DE MUSSTRAS DE SANGRE Et — Se prepara una bateria con tantos tubos de hemélisis como muestras incdgnitas a chequear existan y se anexan dos tubos mas, los cuales cumplirén la fancién de control positive yeontrol negative de la prueba. — Se colocan en los tubos inedgnita uno dos hilos de ga- sa impregnados con e] material de la mancha. — En el tubo control positive se colocan uno © dos hilos impregnados con sangre testigo y en el control negativo se de- positan uno o dos hilos de gasa limpia, — Agregar 0,5 ml de reactivo de Adler a cada tubo. — Descargar 2 gotas de agua oxigenada en cada tubo. Se observa de inmediato la aparicidn de color azul verdoso inten 50 (azul de bencidina}, que vira lvatamente al pardo. El tubo control positive debe presentar la coloracién dos- eripta; lo inverso es esperable en el contro! negativo. Si el control positive no presenta color azul, es muy pro- able que la causa sea la pérdida de actividad del perdxido de hidrogeno. B. Reactive de Muneinaex: Solucion en medio acético de Ieuenbase del verde de malaquita (colorante derivado del dia- minotrifenilmetano). Reactivo 1: Disolver 0,10 gr de colorante en 5 ml de acido acética, luego agua destilada csp, completar 20 ml, Reactivo 2: Agua oxigenada de 10 volimenes. Técnica operatoria Idéntiea secuencia a la detallada en el ensayo anterior. Desarrollo de color VERDE se interprota como ensayo po. sitivo. Verificar ambos controlos segtin los considerandos he- hos con al reactive de Adler. ii) Reactivos que operan en medio alealino: A. Reacti- vo de kasTLE-SCHEEDE-HteYeK: Fenolftaleina reducida en pre- sencia de cine, Fenctiva ¢- Galorar en in matraz 50 mide nna enineisn 4N de KOH, Agregar 1 gr de Fenolftaleina y 10 gr de cine en polvo. Montar un refrigerante para trabajar en condiciones de0 DiatuaL DB quivica FonESer veflujo y mantener la misma hasla tolal deenloraciin de la augechs reveciomeute Filirar en salients. Dejar enfriar y adicioar 10 ml de eta- nol absclnto. Conservar en frusea culos earainels con geanallas de eine para preservar el ambiente reductor Reaction 2; Agua oxigensda de 10 vahimenes. Técnica operatoria Sc ejecutan de igual modo que en los estudios preceden- tes los patos 1 y 2, pero previo al agregadu del agua oxigens~ da, se controla que no haya desarrollo de color en los tubos {in- dicative de interferencial, El ensayo se positiva von color rojo fucsia de intensitadt variable on funeién de le cantidad de muestra que impreyna Toshilos. Con bajoa tenorea de sangre, eo cbtione coloracién ro saen la solucién y si la eantidad es muy escasa sdlo se tifien do rosa las hilos, La senaibilidad se estima en 1/1.000.000. B, Reneiinn « base de S-aminonaftithidrazida (Lusernor) Reactivo 2: Dos formulactones ean posibles, x eaber: 1) Divolver 0,07 gr de porborato de sodio, 0,01 gr de 3-ami nonattilhidrazida ¥ 05 gr de carbonata de sodio anhidto on 10 ml de agua destilada, Inn este caso, no se requiere un segundo reactive, i) Disalver 0,5 gr de earbonate de sodio anhidro 7 0,01 gr de 3+ amminonallihidravida en 10 ml de agua destilada, Se necesita la concurreneia dr un Reaction & Agua uxigensda de 20 valdmenes. Bole andlisis estd indicalo pare investigaciin de sangre 2 nivel de trazas y es aplicable en relevamientos de superfi- fies extensas que presnmihlemente han sido lavadas para bo evident. ‘Venice operatoria Se peactieara la prueba on anseneia de lax. de enalqnicr arigen, Se axpersions el direa cnn el resielive farrnulacisin Ty se obeANALISIS DE MUESTRAS DE SANGRE a sorvaré la aparicién de liminiseoncins maiz o menos sectoriza- das. Se pueden regenerar las maculas con nueva aplicacién de roactivo. Si oo emplea la formulacién 11, se aspersiona como on ol caso anterior con la misma y luego se hace una segunda asper- sign con agua oxigenada. Como se dijo, todos los ensayos detallados son de orienta. cin y requieren confirmacion a través de métodos que certifi- quer In presencia de sangre; no abstante ello, un resultado ne- gativo obtenido en los mismos adquiere valor quimico legal debido a la alta sensibilidad de las reacciones involucradas. En nuestro Laboratorio, no se practican de rutina ensayos eonfirmatorias de la naturaleza de una mancha (los elasi¢os métodos microsedpicos, micro cristalograficos, eromatografi- cos, etcétera). 1. Fuente de origen de una muestra de sangre: Las manchas que arrojan resultado positive en los andlisis practi- cados para determinar la naturaleza del material que la com- pone, es decir aquellas que revelan ser de sangre, ingresan una segunda bateria de determinaciones, en procura de csta- blecer su fuente de origen. Dentro de los métados aplicados a este diagndstico dife- rencial de especie, el que a nuestzo criterio demuestra una ma- yor perfomance es la inmunoprecipitecisn en medio gelosado, conclusién a la que se arriba a través de la evaluacién de los siguientes parametras: —volumen de muestra requerido; — reproducibilidad en condiciones de trabajo estandsri- zadas; —simplicidad de técnica operatoria; — confiabilidad de los resultados en funcién de la inciden- cia de falsos positives y negativos; — complejidad de equipamiento necesario, — robustez de la tecnica chequeada con muestras que ex: hiben estados de conservacion muy disimiles.2 Mawera. ox guise roRense Fundamenta Se ovidencia ln presencia de proteinas plusmiticas o st rieas de origen Inman, planteanda un sistema veaccionante donde la muestra en estudio Ifraceidn antigéniea) se enfrenta aun suern con ospecificidad anti proteinas humanas totales (exceidn anticuerpe}, ‘neurporsos s un medio semiadtido del tipo de los denaminados continues Ames especies difender. una hacia Ia otoa hasta intesne- dlupar entre si La intergceién primaria antigena-anticuorpo avolueinna a una intcraceiin de tipo seoundario; de esta manera, ls reae- cin inmune se hace delectable por la yeneraciiin de inmunoe precipitados ex forza de arca, cuya opacidad comurasta mar~ ¢adameate con la imagea trashicida del medie soporte. La preeipitacién mmune como fundamento Ue La Véenica es vdlida ya. que se trabaja com fraccion antugenica soluble, Se admiten como variantes: 1) una modalidad en que lus reactantes difundan.cn el gel base sia oientacidn dirigida (te- nomeno de inmunodifusion radial a partir de ua pucillo ces tralt; i!) o bien se puede orientar la migravitin a través de! so- porte, qnedando nerfectamente establacidos, tanta Ia dirceeién como el sentido de Ia misma para cada especie on reaceidn (contra inmunocloctraforesis i) tumune difnsidn radial. Tost de Ourterenuoay imodi ficvclo): Materiates y reactive —= Portuahjeios, lirmpivs y desengiszadas ennservados en una mezela etancl-ster. — Sheahan — Micrujeringas. — Agar noble (difeo a oxoid}. —Solueidn de NaCl al (8%. No utilizar s gica sin la correspondiente diluetén, sa que el L an ésta ex de 0,85% ucida fsiols- uur de NaClANSLISIS DE MIUBSTRAS TH SANGILE 48 — Suero, plasma testig (control positive). —Suaro, plasma o sangre (ai el volumen es muy escas0) testigo de animales (control negative). “ Macerado de la mancha de sangre inedgnita obtenide por resuspensisn en solucidn fisiolégica. La concentracién del macerado debe ser alta, Si la sangre a examinar es fresea, pe- Tose cuenta con escasa cantidad, practicar diluciéa al medio; si esta en proceso de coagulacién diluir ligeramente (alta vis cosidad). $i el volumen lo permite, centrifugar y trabajar con el sobrenadante. Técnica operatoria Preparar solucién al 1% de agar noble en solucién de clo- muro de sodio al (0.8%. Llevar « RM hasta disolucién total, debiendo quedar el gel bien trasparente y fluido. Simultaneamente, mantener en eatufa a 50°C pipetas de 5 ml y de 10 ml y los portaobje- tos. Se vierte el gel sobre el porta (apoyado en plano horizon- tal bien nivelado) cubriendo toda la superficie sia que desbor~ de, y se deja solidificar a temperatura ambiente de 10 a 15 n autos, Durante este tiempo, mantener ¢] gel en bape de agua caliente y las pipetas en estufa, Aplicar sobre esta primera capa, un papel de filtro hasta que se aprecie totalmente htimedo, sin deshidratar excesiva- mente y retirarlo. ‘Verter otra carga de gel sobre la primera y dejar secar a temperatura ambiente, Graficar en una hoja la disposicién de los porillos (dibu- jar un pocille contral y los otros situados radialmente a éste, 4.6 mm) y referir la muestra a inoeular en cada uno. Superpo- ner a este esquema cl porta y practicar en el gel las perfora- ciones con el sacabocados, para lo cual, manteniéndo presio- nada la pera de goma, introducirio en el gel y liberar la pera para que succione La colamna ce material. Bl didmeteo del sa- caboeados es de aproximadamente 1 a 1,5 mm. Sembrar en el pocillo central el antisuero, con microjerin-“4 Marat ne guinica roxenae a8 Lipo Hamilton, inocalande de 1a 10 oil, von extreme cul dade para wvilar deshordes. Tejar absorber unos minutes ¥ resembrar usa ¥ £n 10s pocillos periferieas se siembran las suers 0 plas mas coatrulus y el 9 lus macerados de muostras inedgnitas en idéntico volumer al antisuero; repotir la operacidn 3 vees con al maceradle ¥ los sueros animales Disponer el portanhjetas en caja de Petri conteniendo un algodin medianamenta humedecido y tapariedmara himeda) Lievar a estufi de 37 a 40°C » olservar a partir de lox 90 4120 minutes Ta formacitin ds urcos de prucipitaeién entre aquallos pocillos que contengan snares humanos eunteoles y el peeille ventral, y ausencia de areos enire los pocilluy que purtan sue. ros animales y el pucille control. Si eetas condiciones se cum plen, se evaluard la presencia de Jas bandas de precipitade en- tre ol macerado de inuestra ent estuitio y el antisuero. Alus 90-120 minutos ya s# aprecia un arco de precipita- cidn en musatras da xangre humana, obsorvands Ia placa lige- ramente a trastuz. Elandlis's eomplets supone la aparieiin de 5 arcos en un Japso no superior u les 4-8 horas de incubsciin ala tempera tora refietida. La presencia de areos de previpilaciin entre el pacilln dal antisuers y el de la muesira en estudio revela corresponden- cia anligeno-anticuerpa antre ambes ronetantes. Se considera sangre de origen humano aqnella muestra que: a) Rayolo arco: de precipiaci 6) Esos arcos so fusionan pcrfectamente, en ura imayen de identidad lal, con tos obtenidos usando tos vestigos, Discusion dei metodo y sus resultados 1. Ubteacion de los arses: Fis fineuin del Litule del anti- suero y de la concentracién antigénice de la muestra en estu- fia, Las handas de prec:pitaeién se povivionardin mais carca del pocillo que prosonte el reaclive eon titulo menorANUA818 DE MUBSTRAS DE SANGRE 45 Eoto os particularmente visible cuando se trabaja con ma- corados muy diluidos (bien porque el material del cual se par- tees escaso 0 porque al preparar el macerado se utiliza un ex- eso de solucion fisioldgica en la disolucién). 2. Forma de los arcos: Enfrentando los reactivos en pro- porciones equilibradas, la linea arqueada de precipitacin orienta su coneavidad hacia e! pocitlo que contiene la especie de mayor peso molecular (antigeno 0 anticuerpo), debido esto ala menor velocidad de difusién de las moléculas mayores a través de ia matriz del gel. 3. Titulo del aniisuero: Puede no ser reproducible de par- tida a partida, aun dentro de una misma marea comercial, por Jo que se recomend (itularloo bien liacer una evaluacién se- nicuantitativa mediante inmunodifusién radial, enirentindo- lo. aun pool de sueros tostigo diluido 1/2, U4, U6 y 1/8 en siem- bra tinica, cotejando mimero de arcos, posicién c intensidad cel precipitado obtenido. 4, Temperatura de operacién: El test de OUCHTERLONY elé- sico reconoce varias modificaciones citadas en la bibliografia en general. En ouestre Iaboratario, hemos instrumentado un cambio en ka técnica, consistente en dar curso a la reaccidn, no a tem- peratura ambiente, sino incubando en estula a 37-40°C. El sentido de esta variante es acortar el periode de forma- Gdn de inmunoprecipitados, partiendo de la hipotesis de que Jos sueros anti proteinas totales se oatienen de animales (ca- bra, conejo, etc.) hiperiamunizados, por lo que la especificidad buseada so oncnontra presente en los mismos, mayoritaria- mento, bajo la forma de inmunoglobulinas IgG, cuya tempers tara éptima de trabajo ee de 87°C (en inmunizaciones reprt das de un mismo espécimen animal se verifican cambios a nivel respuesta inmune, entre ellos, un titulo de anticuerpos creciente a expensas de IgG). Para la puesta a punto de la técnica planteada sobre la hase de astas premisas, se efectuaren ensayos en paralelo a 37-40°C, a temperatura ambiente (en un rango entre 15-25°C) y.a4°C itemperatura del refrigerador) con muestras de plas-a Marat pi actin roms ma, sucro y sangre ontera humana testigo y rauestras de san- gre animal (perm, nutria, caballo, eordo, cabra, vaea, ovoja, carpineao, pate, martincta, perdiz, gallina, pate, peces devin, ste), contralandn el Ispsa que mediaha entre la siembra y 1s formacisn de areas de precipitacién. Los resultadas ahtenidas sm enharentes con al planta hi- ius india Si ol antisuera ostuvion canstituide Randamentalmen te por Ae clase IgM, la renceién operada 4°C scrin la que arrojara mejores resultados y en un lapan menor. Bi no exise viera un predominio de una clase en particular de iamuny- globulina, el desarrolio de 1a reaesion a Vie2i*C! seria La ra comendable, para no trabajar en les extremos del ranga de temperatura Si el antisuero, seein hipstesis, ¢s rico on IeG, se debe ria obtener una mejor perlimance ineubandd 4 37°C. La mejor definieién en cuanto acantidad de arcos y tiem- po requuridl para que conn evidenciables macrosedpicamen- te ve obturo trabajando on estufa de esterilizacién a 37 40°C, en cémara himeda, delweldidose el pelaws arco entee las $0 ¥ 120 minutes de inieiada fa incubasiin. Ya en usie punt es observable el perfecto solapamiento entre las bandas genera- das por las sangres testigos y las inedgaitas de naturalcen hu- mana, #1 total de eubacion. 5. Inlerpretavitin de poirones de damanndifusiin: Ante wna imagen de lineas de precipitaciin confiuentes, hablames de ideniidad inmunoligica, pero ciertaraente nes reforimos a reaccidn identica frente 6 us mismo antisiero, lo que no signi- fica nacasariamiente idenridad matecular, La aparicion de un cruee partial de areas --espolon— es indicativo de antigenos parcinlmente ralacionados, que com- parten un determinante pero exhiben diferencias en ing otros Un cruce neta de lineas o areas de procipitacién se obtie- ne en presencia de material entigénice no relacionado. cos (5 61 se complet a la cuurta hora de in-ANALSIS DE MHURSERAS Wf; SANGRE a = ri a & a ee evra mENHOAD PAGING po weKmo4o Figura 1 Falsos positivos 1) Posterior a las 5 horas de ineubacién a 87°C se detee- ta.unarco de precipitacién tinico eon algunas muestras de ori- gen equino, pero no se verifica confluencia perfecta con nin- guna de las bandas que genera una muestra de sangre humana. 2) Un halo de precipitado continuo en la periferia de un posillo os indicative de desnaturalizacidn del reactante, gene- rada probableraento por exceso de temperatura en la ineuba- cion 0 por deficit de humedad en la cAmara 3) lias condiciones de traimjo éptimas exigirian que se uti lice para las siembras en los pocillos micrajeringas distintas para el antisuero, los testigos y la incdgnita. De no ser factible, se debera proceder al lavado exhaustivo del accesorio con fisio logica luego de cada aplicacion, de otra mado se corre el riesgo de arrastrar material de ung siembra a otra, contaminando, por ejemplo, un pocilla con muestra ineignita o con sangre tes- tigo de un animal con fracciones proteieas humanas proceden- tes de la inoculacién de los testigos de origen human, Falsos negatives D La precipitaeién de los complejos inmunes se cuando antigenos y antieuerpos eontactan en proporeiones de equivaloncia. La clase de complejo inmune a formarse duran- tc una reaccion inmunologica se puede prever a traves dol ana lisis de la siguiente grafica:3K Maras ne quisacs roRuxse uovonwe becptactin j Exnato ae dove Ewzeen9e sate wwiwems —anigere ‘00 itrosna, a) Figure 2 Ea el punte de equivalencis, toe el antigenc apregade seré acomplejade en el precipitado con todo, cb anticuerpa prevente; en estas condiciones ge originan cslructuras de cir- culacion en rod, que derivan en grandes ayrerrados que preci- pitan por interneeiones entre lax regiqnes Fede los Ac involu cragos. Fuera de la zona de equivalencia, operan lox denomina- dos fenémenos de pro y puslarua. En a prozona (eveesn de onticwerpes) hay cireulacidn do cousplejus itmures (circulacién primaria) intrinsecamente in- solubles, pero no existe suticiente eantidad de complejos pene- rados on condiciones de equivaleneia para yencrar el copraci- pitado, En la postzona (exceso de antigens), no existen eomplejos incrinzecamente inselubles (ontenibles anve vxcesu de anti- cucrpos cn el medio de rezeritin) que son los que se requieren, para generar los niiclens de circulaciéa. Fn cualquiera de las dos estractaras da eireulacioa, ta unign inmune no sera evideaciable 1 través de nucetra técni- ca al no producirse la cirenlaeion secundaria untigeno anti- cuerpo.ANALISIS OE MUSSTRAS DE SANGRE 49 Cuando ol titule del antisuera no guarda cireulacién con Ia cireulacién antigénica de la muestra en examen, nos situa- romos on Los fenémenos deseriptos, no visualizaremos bandas de cireulacién, y oato condicionaré que una muestra de san gre de circulaciin humana pueda ser interpretada como ani mal. 2) Las condiciones a las que estuve expuesto el material previo a su levantamieato, asi como las de cireulacién y tra: porie circulacioa, pueden inducir la desnaturalizacién de las fracciones proteicas que constituyen nuestro antigeno blanco. Esto determina pérdida de complementariedad estructu- ral entre fraccién antigénica y fraceién anticuerpo; no se pro- duciré, entonces, la reaccién inmune, y se diagnosticard como sangre de origen animal una muestra desnaturalizada de ori- gen humano. 48) Si la cireulacion salina del medio os excesiva, se legan ainhibir los procesos que so desarrollan on La cireulacién se- candaria a la cireulacién del complejo inmune inicial, o sea, cireulacién con circulacién de los agregados. Esto suele ocurrir cuando se practican repetidos banos Maria para fluidificar cl agar base solidificado preservado en heladera, lo que resulta en un enriquecimiento gradual de la fraeeion acuosa en cloruro sodico (en la formulacion original esta presente al 0,8%) por circulacién. Por ello se recomienda preparar circulacién de medi necesario para Wrabajar, Olra causa de exceso de soluto salino es la preparacién del agar con soluvin fisiolégica, la eual tiene una circulacién de 0,85% o/y, cuando se requiere una formulacién de salina de 0,8% ply. ii) Contre-inmunoelectroforesis: Se intenta movilizar una o mas especies orgdnicas cargadas a través do un soporte mediante la aplicacién de un campo eléctrico externo. La fucrza eléctrica ejercida sobre las molécvlas cargadas induce movilidad; a este movimiento se opene una fuerza de iin giVAIT A IN Ypleyidad dg les moleeulas aumentars Hasta qué AMBAS fudezts se IUAleN, Esa cireulacidn, para ese campo aplicado, sera funcién de50 ‘Manual bi uuitntea YORESEE dos caracteristivas proplas de la mulecuda: Lat cange y «dl eoull= Gente de frieeis fesie illinia a su yer serd variable cn funcién del soivente inc uide en el medio soporte y de la lirnia y ‘arta To de Ia especie que nigra) ‘Toda proteina contiene grupos éeidos y basicos pt efectiva o promedio eatard condlieinnada por cl Ph de Incién que Jas contione, La movilidad bajo secidn de un po eléetrico es directamente proporcional a esta carga, u sea que indireelamercte, serd Juneién del Ph seleecianads de tra- baja. Para montoner ¢l Ph soleccionada on un valor eanstanta ale largo de toda la prucha se ulilizan sulucioaes bul Se practica la electrofuresis en medio yslosudo. Sc sicmbran la incegnita y cl antiquero en pocillos die- westos sobre una ntisma Tne orientada en la direceién de cireulacion de eorviente y so apliea una diferencia de potencizt Los catzones presentes en la fase liquida constituyente del gel generan un flujo clectrocndasmotice hacia el eatodo a tra: wis del soporte, AT Ph de trabajo 48,6} Jas protefnas séricas se canman ne gativamente, aunque la densidad de carga es diferente para pada una de las frneciones, Jas muestras cbjete de ensayo (portadras de proteins séricas cue s¢ eanstituyen en La fraccion antigenica a reveliar) #9 ubiean en pocillos préximos al eétodo yo} antisuoro enol la- teral carraapondiante al dado. Apkeado el compa eléctsien, ol movimionta de los renctan- y aU care 0 apoestas: una on seuticln de eircutseddn de la corriente fhacia al anodo) y otra dirigida al catodo ejercida por flujo eiactraen- sosmatiro. De las fracciones eematitubivs del auligenn, lis repre. tadas por albimina, aft y bela globelina presentan wns mae yor densidad de earga negativa y migran dirigidas por la eo rrlente hacia el aincdn, Por et eontrarin. da fraecidn gamiain con jaja densidad de cars os arrastrada por electroendosiansis, havia el catodo.ANALISIS DF MURSTRAS DE SANGRE ot Las moléculas del antisuero. predominantemente frae- cién gamma, se desplazan hacia el catado, arrastradas por el flujo electraendosmético El sector entre las eubotas on ol que las especies renccion nantes contacten en proporciones equivalentes evidencieeri Ix presencia de las bandas de precipitaciin caracteristicas Materiales y reactivos — Portaobjetos limpios y desengrasados. — Microjeringas. —Sacaborados, — Cuba electroforética. — Agar noble purificado, — Buffer de Veronal de P! 8,6 (fuerza idnica 0,05), Preparaciin del buffer - Acido dietilbarbitirico: 1,4 g ~ Dietilbarbiturato de sodio: 10.4 Agua destilada es.p.: 1000 er. Preparecion del ogar base El agar noble se disuelve al 2% en agua destilada, Preparacion del ogar tamponado Mezclar un volumen del agar base con un volumen de buffer, con lo que se obtiene una solucién al 1%. ‘Téenica operatoria Obtenido el agar tamponado, depositar una capa unifor- me sabre un portaabjetos apoyado en superficie nivelada sin que desbords (se consumen unos 2 rl), dejar solidificar a tem- poratura ambiente. Apoyar sobre Ia suporficie del gel un pa- pel de filtro hasta que se humecte, sin deshidratar exeosiva mente. Aplicar una nueva carga de gel sobre la capa primaria, dejar solidificar a temperatura ambiente de 10 a 15 minutos. Practicar las porforaciones en el gel, ubicando los pocillosa Manuot os qciiuca rons asembrar con la muostra test’go de sangre humane, !4 mues- tra teatigo de vangre animal y le muestra incdgnita, sabre li neas parnielas vrientadas en la dineesidn de virculaciin de co- rriente y prdvimas ol cdtodo. Las poeillos que se enfrentan cada una de las mucatras antarianze se ubican on el extrema del portaokjetos correspondiente al edtado, Hi: taco | memo |e ® TIE ge | eeome LT @ => Sana Figura d cargan lus conipurtirientos de fos elentrevios con igual volumende soluviin buffer Dispaner el porl asbro al puonte de la cuba y utilizar papvt de filtro para wstablocer contacto entoe Ja eoluesén reguledora y el suporte golifienda {luv puen tes cordin dol misao ancho que ol portacbjetcn), Seaplican 1.8 mA por porta 7 a0 evaliia la aparivién deli: neag de precipitacion a partir de los 29 minutes. Discusivin de tus reseetados By le tenien de eleceién en tas cess en que ta cantidad dle nuestra a enalizns es muy eseasa, 0 evando se reguicre un resultado on wn lapse muy breve. La cletcién del buffer utilizado tiene yu fendamento en aue las especies constituyenles del mismo estan pureiulm te iuaizadas en solucitn; du esta manera, ostos iones Lumbien forman parte de! flujo iénica total en el procese olectralftieo, Cada inn presente en solucién baes un aporte diforoncial & la conductividuel total dei sistema, la ual es funeién de !a soncmtrarién, carga y movilided desuxrotlacin por la especie vargada,ANALISTS DF MUESTRAS DE SaNORE 58 Si Is concentracién electrolitiea es exeesiva, el aumento legico de conductividad implicard un aumento en Ia intensi dad de corriente (trabajando avoltaje constante) y subsecuen- temonto an ol ealar decarrollado on el sistema. Si trabajamos a intcnsidad de corriente constante y au. mentames | conductividad clevando la concentracién salina, el voltaje tiende a disminuir (V = 1/C), lo cual implica una dis- minucién en Ia fuerza eldetriea impulsora del proceso electro- forético, un retardo en la migracién y un aumento en la difu- sin, ‘Ambas situaciones detalladas son perjudiciales para el andlisis; esto obliga a fijar la fuerza idnica del buffer en valo- res medios. Por otra parte, el tipo de reguladora elegida contribuye poco a la fuerza idniea al ser iones univalentes, y al ser volu- minosos migran Jentamente, lo que en conjunto resulta en una conductividad razonablomente baja 11, Diagnéstico individual. Hemotipificacién: El espec- tro antigénico presente en la membrana del eritrocito madu- ro determina un polimortismo significative entre individuos. La cxistencia de estos aloantigenos hace permisiva la ti pificacion serologica de una muestra de sangre. ‘Aquellas sustancias relacionadas —en términos de anti- ‘genos eritrocitarios—, que son expresidn fenotipica de un ge- notipo independiente, definen un sistema de grupo sanguinieo particular La scrotipificacién tiene como objetivo, entonces, estable- cer para una poblacién eritrocitaria dada y dentro de un sis tema de grupos sanguinens preestablecido, qué antigenos ca ractarizan su membrana ‘La mayor parte de los genes que controlan antigens cri. trocitarios Lienen carter dominante, y la ausencia de esta sustancia en membrana dentro de un grupo se interpreta co mo fenotipo no deteriable determinade por un gen amorfo. En varivs sistemas de grupo sanguineo son demostrables estos xe- nes particulares.be TMAPEAL Dm eres ri A, SISTRWAS DR GREPNS saNcrtiNEOS a) Sistema ABO. Los antigens ger tivos de esta grupo sun brew: A, B Se demuestiran ya en el segundo meade vida fetal; sin enbaryy, no obstante su desarrollo, s¢ completan aproxim: damente al ane de wacirnietlin Tas enstancins A y B ostin codificadas par un sistema ge- nétice indepundieate dal que delermiag la presancia de TT, mas copecificamunts ve considera a H come ta estrnsture precur- sora, controlada independientemente, sobre la que Wa actividad dc los alelos Al, AZo B. El gon Al y ol B son cedominantes, ol A2 es de baja pene- trancia frente aA. Se pueden demostrar variants do Ins aloantigenins Ay H, que definen snbgrupos. Los de mayor relevancia corresponden al A.dobiondo eitarse el antigeno Al (mayor insunogenividad y frecuencia de apar.cion), ol AY, y suatancias de muy baj einancia y déhiimente inmunigenas (Ad. Ax, Am, Muehas glébulos rajos fetales o de recién navides que respondion al grupo Ao AB reaeeionan en lis eximenes irs wie fro comp si porvaran en membrans una sustancia de baja po- tencia (ipu AD); esta vircunstancia se puede modifiear den. tro del primer aio de vida y ol grupa se dofinird como Alo AIB. Los aglntindgenns A y B se caracterizan por su potencia auligénica y eevonocen aglutininas naturales presentes de ma- era coustanieen el plasma de los sujetos que ne les expresan en sus glddulos tojos, La oxistorcia de subgrupas de A condicivna, a su ved, ta presencia de dos clases de hemoaglutininas con actividad aa, # A en el plasma de os individlugs grupo *O" y“B" denomina- das anti Ay antiA) ‘La IgM anti A cs eapas de aglutiner los hematies que por-ANALISS DE DIUESTRAS DE SaNORE 55 tan homoaglutindgenos AT 0 A2, la IgM anti A1 sélo los expro- sa on membrana, especificaments al antigeno AL Las aglutininas del sistema ABO ae desarrollan on ol ni Av entre lus tres y los seis meses posteriores al nacimiento; las que se detectan en sangre umbilical son de origen materno. 1. Estructura y propiedades fisicoquimicas de los agiu tindgenos ABO. Hasta ahora, nos hemos referido a los anti genos de este sistema como constituyentes dela membrana del homatio; no obstante, su distribucién es mucho mas amplia, € inelaye: a) Otras células hematicas: leucocitos y plaquelas. 1) Células de higado, riaéa, corazin, bazo, pancreas, miis- culo, estémago, epidermis y endotelio. ‘c) Clandule tiroides, suprarrenal, hipéfisis y préstata ) Secreciones: semen, jugo gistrico, sudor, lagrimas, sa- liva, exudado vaginal, liquido amniéticc, meconie y orina. Esta distribucion generalizada es propia de los individuos denominados secretores, los cuales portan, al menos, un en del par de alelos “se” en su genotipo (80% de la poblacién en general). Existen diferencias quimicamente determinadas entre el antigeno presente ea la membrana eritrocitaria y cl demostra- ble en secrecionas. Los aglut:ogenns de membrana son glicolipidos, solubles en alcohol, y son los tinicos detectables en los sujetos no secre- tores (homocigotas para el alelo *se" Los datos de que se dispone se refieren fandamentalmen- te ala forme soluble de estos inmundgenos. Se conuce que to dos los indivicvina sintetizan una sustancia procursora de al to peso molecular, que en esencia es una glicuproteina, con eje estructural proteico; entre los hidratas de carbone asoriades a dicho eje se deslacan: L-fucosa, D-galactoa y dos aminoazt- cares derivados de glucosa y galactosa, Tanto en los antigenos de membrana como en los de na- ‘turuleza proteica (bidresolubles) la especificidad antigenica es: ta determinada por el monosacarido terminal reducido, EseEd MaNcat be arn Hurst azicar inmunodominante serd el principal panto de contacto con ol sitio du combinngién de lu aglutinina correspondiente, Los alvantigenos Il, A y B sun la expresisn individual de Ja actividad de transterasue especitiens. Sobre la base de un precursor con caduna lateral disard- Tida eonforacada por el puemte: N-sertil-D-glacosumina —D. galactosa (unién beta 1-8) aciaard una L-fuevsil transfornsa, enya actividad es controlada per el loeue Hh, que aeoplaré ura nnidad de L-furosa al carbone 2 de D-galactosa mediante unit alfa 1-2 para generar la espenificiclad H. Hote, a su vex, serA transformada por ennvimas endifiea- das por el locus ABQ), De este modo, una N-acetil-D-geluctosaminil transtvra- sa acopla N-acetil-D-satactosamina ala D-gatactoss cle la ca dena lateral riai ahors. precursor H mediante unidn alfa lily define ln aspecificidad A en sujelos portadores del gen homé- logo. Coteligadn por una D-galactasil (ransferasa, se unirsi ama segunda molécula de D-zalaciasa a In ya presente un ol hidro carbonado laters! de H ‘umién alfa 1:4), configurandose la e- mcificidad B on pmrtadores de! gen correspondiente. Fn los porladeres de ambc: gene 09 manilealnré la acti vided de amas transfornsas y presentaran hrs dos aglutin’- neaus dol grapo AB, 2. Inewstigacion de ayslutindgenes y uylutininas. El tie node onsayo aplicable esta candicimado al estado de conser vauidn que exhile el material objeto de andlis Las nuestros de sangre en las que los eritncilos manti aon si: inlegridad de membrana se estudliun par pruebas d yectaa Sila muestra ests cieshidratsda, cm visible desorganiza- Gin de a membrana ylobutar, la hemolip!fieacién es ine la, por euante ta evidencia del antigens presente en los frag: mentos dé niembrana s¢ logra con el auxitio de paneles de sidbulos raion intactos de grupo eonovido, No obstante las oporatotias diferenciales, todas estan Lée-ANALISIS DE MUESFRAS DE SANGRE 8r nicas invelueran reacciones de aghutinacitin, es decir agrupa- mionto y sedimentacién de los glébulos rojos {antigeno particu- ado) mediada por intoraceién inmune (interaccién primaria) La hemoaglutinacién se verifica por formacién de puon. tes entre los anticuerpos polivalentes del suere hemoclasifica dor (suero anti) y miltiples detecminantes anligénicos idéati- cos de la membrana globular. De este modo se generan conglomerados de alto peso molecular que decantan de la sus- pensién, Los antisueros comerciales utilizados en estas determina- cignes son inmunoglobulinas de clase M de origen monoclonal. Por su tamaiio y polivalencia, la [gM es significativamente mas eficiente que la IgG para formar empalmes intereclulares y veneer Ja repulsién entre glabulos detarminada por la carga ne- ta negativa conferida a la membrana por los residuos de seido sidlico de la misma, 3. Muestras de sangre jresca. 1. Grupo celular (agli tinacién directa): [a sangre a tipificar se enfrenta con sue rus hemoclasificadores de especificidad conocida. Como los an- tisueros comerciales anti Ay anti B son de alto titulo, este ensayo se puede practicar tanto en placas de vidrio 0 cerémi- ca como en tubos i) Método en placa: En un portaobjetos depositar ana gota de anti A, una yota de anti B y ana gota de suero de san- gre grupo “O” (especificidad anti AB por la presencia de las aglotininas)o bien una gota de antisuero comercial especifici- dad anti AB. Colocar una gota de suspension de GR incdgnita al lado de cada antisusro y homogencizar con varilla. Oscilar la pla- ca cn forma rotatoria observando la prosencia @ ausencia de aglutinacién, Las lecturas se efectuaran dentro de los dos mi- nutes. La suspension utilizada es al 10% y se pr tidn fisiologica o ct plasma separade previann te globular lavado 2 veces con salina isoténica, para con solu- ile y el paque-Mastiat-ne 6 Si se preficre eperar con sangre entura en lugar de la sospensi6a globular. la cantidad de muestra debers guariar crrrespmndencia en su contenido oriteocitarin con el presen- We en la gota de suspensidn al 10%, puesto yue bn exces de sangre puede car lugar a reaceiones de dudosa interprela- cidn ii} Método en tubo: Kixde mayor sensibilidad. Se desti- nan 2 Lubes de hemélisis para cads espécimen a analizar, ro- talados Ay B. La suspensitia globular ike trabajo us al d% y de preparacién reciente Una gota de anti 4 on el tubo A, uaa de anti D en al By y tina de susponsion on eada tba, Mezelar bien. Contrifugar « 2900 cpm. durante 1 minuto, Resuspon- dor suavemente ¢l sedisnento glebular y observar la presencia vausencia de grumes caracterislicus de aglutinacion. Se puc- de aplicar aumento a esta eoniprabacion, UW. Grupa sevice tprucbu inverse): A través de este ane wy se intenta determinar para la muestra de sangre on es. tudo, las aglutinina- (+i las hubiera) presentes en el plasma, afin de confraniar est resultado con el obteaide en In-evalua- cidu de Ins aglutinégenas de membrana. Se utiliza un panel de GR de urupo Al yun panel de gru- po Ben forma dis suspensisn al 4% — Para calla muestra en ensave s¢ dostinan 2 tubos de homolisis, otuladar A y B. Se enlouan 2 goige de e2ere a tipifiver en cada tubo. Se augroga 1 gola de suspensidn do cada grupa fi Tus Luhens encrese pmdientes, Mezelar bien, Cenurifuger a 2000 rp.m, durante 1 minute. — Koxuxpender elsedimento y leer agsutinueisin eon aya da del inicruscapio. ‘Como los anticuergos naturales prosontes en plasma son de baja patents y Litulo, el grupo sérieo sélo se practiea ev Lu hos, puesto que la contrifugaciin intensifies la imagen de agho. tinarionANALISIS DE MUESTHAS DR SANGRE 08 4. Diseusién de los resultados. Si no existe eorrespon- dencia entre grupo eolular y grupo sérico, sa debera estable- cerla causa de la misma evalvando errores atribuibles al ope- rador o detectando alguna caracteristica atipica de la muestra en ensayo. L. Factores técnicos de error: Scguidamente se incluye un detalle de las mismos. 1) Una centrifugacién escasa 0 cxcesiva en tiempo o velo- cidad on las pruebas e tbo puede derivar en un falso nega- tivo o positivo respectivamente. 2) Una resuspensién de los sedimentos globulares dema- siado enérgica puede romper aglutinacionos débiles y se leera ‘un falso negativo. 3) Si en la prueba sérica no se controla la posibilidad de hemdlisis (de probable ovurreacia por la presencia de sistema ‘complemente on sucros frescos ante el cual las aglutininas na- turales se pueden tornar hemolizantes), se puede obtener un falso negative. Sila hemélisis es muy marcada se considerard positivo el ensayo para la aglutinina correspondiente. Un auor froseo s¢ inactiva an relacién con Is actividad de hemolisinas por incubacién 30 minutus a 56°C (se destruye la fraccidn complemento}. 4) El uso de antisueros de bajo titulo puede condicionar un falso negativo. Mas comin que esto es que cl antisuero pre- sente impurezas y el resultado obtenido en estas condiciones siempre requiere confirmacién (generalmente por aparicidn de aglutinacinnes inespecificas.) 5)'Tanto la pruebe globular como la sérica exigen una eon centracion adecuada de las suspensiones globulares; un defec- fo 0 un exceso de coneentracién punde llevar a resultados fal- sos negativos, 6) Maturiil dy visrio sucio o poros que retienc antisuero de ensayo 2 falso positivo. (cordmica de placas) , puede generar un