Prolinaentejidosyexudadosderazcomorespuestaalestrssalinodecultivosderaces aisladasdepatronesfrutalesdelgneroPrunus J.A.Marin;P.Andreu;A.Carrasco;A.Arbeloa EstacinExperimentaldeAulaDeiCSIC Av.Montaana1005.50059ZaragozaEspaa jmarin@eead.csic.es Resumen Lasalinidadesunacausadeestrsabiticomuyimportanteparaeldesarrollodelasplantas yungraveproblemaparalaagricultura.Lapresenciadesaldisminuyelascosechasenuna granvariedaddeplantas,porloquelatoleranciaalasalinidadesuncarcterimportanteen mejoradeplantas.Sinembargo,estastcnicassonlargasycostosas,sobretodoenespecies frutalesdebidoasusdilatadosperiodosdecrecimientoysebeneficiarandeldesarrollode tcnicasdeseleccinprecoz.Porotraparte,laacumulacindeprolina,tantoenlostejidos dehojacomoderaz,hasidorelacionadaconelestrssalino,indicandounpapelesencialen latolerancia.

ia. Enestetrabajoseestudiaelcontenidodeprolinaenracesyensusexudados,apartirde cultivosaspticosderacesaisladascomomodeloexperimental,bajoestrssalino,para conocerelposiblepapeldelaprolinacomomarcadordetolerancia. Enlostejidosdelasraceslaprolinaaumentconelestrssiendomuyelevadaa180mMde NaClcuandonohubocrecimientodelasraces.Adems,lapresenciadeprolinaenel exudadoderacesaisladasestuvotambinrelacionadaconlaconcentracindesalysigui unpatrnsimilarentrespatronesfrutalesquepertenecenadiferentesespeciesdelgnero Prunus(P.insititia,'Adesoto101';P.cerasus,'MastodeMontaana'yP.dulcisxpersica,GF 677).Estosresultadosresaltanlanecesidaddenuevosestudiosparaestablecersilaprolina puedeser,endeterminadascondiciones,unmarcadordelatoleranciadelosfrutalesala salinidad.Losexudadospermitiran,entonces,estudiarlatoleranciacontestno destructivos. Palabrasclave:seleccinprecoz,NaCl,estrsabitico,Prunusinsititia,Prunuscerasus, Prunusdulcisxpersica

 Summary Prolinecontentinroottissuesandrootexudatesasaresponsetosaltstressofexcised rootculturesofPrunusfruittreerootstocks Theaimofthisworkistodemonstratethepresenceofprolineinbothroottissuesandroot exudatesasaresponseofexcisedrootxculturestosaltstressandtoascertainthepossible relationshipbetweenprolinecontentandNaClconcentration. RootsfrommicropropagatedPrunusrootstockshavebeenculturedinvitrounderincreasing NaClconcentrations(0,20,60and180mM)toearlydetecttheirtolerancetosaltstress. After3weeksofculture,theprolinecontentoftheMSbasedliquidmedium,inwhichroots werecultured,wasdetermined.Asfarasweknow,noattemptshavebeenmadeto determinetheprolinecontentofexcisedrootculturesandrootexudatesunderstress. Prolineconcentrationinroottissuesandrootexudatesfromallrootstocksincreasedassalt concentrationinthemediumincreased,followingatrendsimilartothatofwholeplant tissuesinallthreePrunusrootstocks(P.insititia,'Adesoto101';P.cerasus,'Mastode Montaana'andP.dulcisxpersica,GF677).Thisopensthepossibleroleofprolineexudates tostudyplantresponsestosaltstressusingnondestructivemethods.Inaddition,proline exudatescanbeofgreatinterestfortheearlydetectionofsaltstresstolerance,provided thatarelationbetweenprolineandsaltstresstolerancecouldbefound. Keywords:Earlyselection,NaCl,abioticstress,Prunusinsititia,Prunuscerasus,Prunusdulcis xpersica

Introduccin Lasalinidadesunfactorabiticodeestrsmuyimportanteparaeldesarrollodelasplantas (SenguptayMajumder,2009)yungraveproblemaparalaagricultura,especialmenteen tierrasirrigadasdezonassemiridasdondeel2030%delastierrasestnseriamente daadasporlasal(FAO,2002).Altasconcentracionesdesalenlossuelosdisminuyenlas cosechasenunagranvariedaddeplantasentodoelmundo(GoraiyNeffati,2007). Latoleranciaalasalinidadesportantouncarcterimportanteenmejoradeplantasquede estaformaincrementaranlascosechas,principalmenteenzonasmarginales(Trkany Demiral,2009).Mediantetcnicasdeseleccinymejoratradicionalessehaconseguido mejorarconsiderablementelatoleranciaalasalinidaddeplantasconimportanciaagrcola (AshrafyHarris,2004)aunqueestastcnicassonlargasycostosas.Estoseaplica especialmentealaseleccindematerialvegetaldefrutalesdebidoasuslargosperiodosde crecimiento,porloquesebeneficiaradeestrategiasquepermitieranacortarestos procesos. Elcultivoinvitrohademostradoserunatcnicaaplicableparaelestudiodelestrssalino (NaikyWidholm,1993;WoodwardyBennett,2005)yrecientementehasidousadoparala seleccindeplantasdetomateyVignaradiatatolerantesalasalinidad(Hassanetal.,2008). Porotraparte,laacumulacindesolutoscomolaglicinaolaprolinahasidorelacionadacon estrshdrico,salinoyotrosestresesabiticosdelaplanta(AshrafyHarris,2004; Munnsy Tester,2008;Luetal.,2009)indicandounpapelesencialenlatoleranciaaestosestreses.La prolinaseacumulabajoestrssalinoenlostejidostantodehojacomoderaz(Azizetal., 1999)atribuyndoleunposiblepapelprotectorfrentealpotencialosmticogeneradoporla sal(Watanabeetal.,2000;Chenetal.,2007). En este trabajo se propone el estudio de la acumulacin de prolina en relacin al estrs salinoconunnuevoysimplificadomodelobasadoenelcultivoinvitroderacesaisladasde patronesfrutalesdePrunus(MarnyMarn,1998).Estasracessometidasaconcentraciones salinascrecientes(Andreuetal.,2009)presentarondiferenciasenelcrecimientoenlongitud yacumulacindealmidnentreespeciescondistintatoleranciaalasal.Elmodelopermite estudiar el efecto del estrs en el lugar donde se aplica, en lugar de estudiarlo en planta entera o en zonas alejadas del origen de la fuente de sal. El cultivo de races in vitro ha mostrado en trabajos previos una cierta correlacin con trabajos de tolerancia en organismosenteros(Vijayanetal.,2003)yharesultadoserunmodeloeficazenladeteccin precozdelatoleranciaalasalenPrunus.Unapatentehasidosolicitadaparalaproteccin deesteprocedimiento(Andreuetal.,2008).Sinembargo,elcrecimientoencondicionesde estrsnohasidorelacionadoconlaacumulacindeprolinaenlostejidosoelexudadodela raz.Lacomposicindelexudadodelasracespodratenerfuncionesdeproteccin,ajuste de pH o potencial redox, entre otras, en condiciones de estrs para la planta y dada la influencia de los miroorganismos de la rizosfera en el metabolismo de estos exudados

(Suzuki et al., 2009) el estudio de los exudados en condiciones aspticas como las desarrolladas en este mtodo de cultivo de races aisladas permitir la comparacin en distintascondicionesdeestrssalino. Elobjetivodeestetrabajoesestudiarlapresenciadeprolinaenracesaisladasysurelacin conelestrssalino.Paraladeterminacindelaprolina,serealizapreviamenteunapuestaa puntodelmtodoconestetipodetejidoscrecidosenaltasconcentracionesdesacarosa, quepuedeninterferirenlamedidadelaprolina(MagnyLarher,1992;TrotelAzizetal., 2000). Adems,seestudiaporprimeravezlapresenciadeprolinaenlosexudadosderaces sometidasaconcentracionescrecientesdesalenelmediodecultivo.Estemtodo posibilitaraenunfuturoeldesarrollodeuntestdetolerancianodestructivo,analizandoel medioenelquesedesarrollanlasracesyviendolarespuestafrentealestrs. Materialymtodos Materialvegetal Racesdelospatrones'Adesoto101'(Prunusinsititia),GF677(P.dulcisxP.persica)y'Masto deMontaana'(P.cerasus)micropropagadosyenraizadosinvitroseusaronparasupuesta encultivoencondicionesdeestrs(Andreuetal.,2009). Cultivoderacesaisladas Seutilizaronpicesderacesde10mmdelongitud.Lospicesennmerode10por tratamiento,secolocaronenfrascosdecultivocon30mldemedioMS(MurashigeySkoog, 1962)conun3%desacarosaysinreguladoresdecrecimiento(AndreuyMarn,2005).El estrssalinoseaplicaadiendoalmediodecultivoconcentracionescrecientesdeNaCl:0 (control),20,60y180mM.Enelmediodecultivoa25Claconductividad(E.C.)totalfuede 6,0;8,2;12,5y23,6dS.m1respectivamente.Semantuvieronenlacmaradecultivoa24C, enoscuridadya90rpmenunagitadororbitaldurante3semanas(Andreuetal.,2009).Los experimentosserepitieron2veces. Determinacindelaprolina LadeterminacindelaprolinaserealizsiguiendoelmtododescritoporBatesetal.(1973) basadoenlareaccindelaprolinaconlaninhidrina.Elmtodosevalidparalaposible interferenciadesacarosa(MagnyLarher,1992;TrotelAzizetal.,2000),presenteenel mediodecultivo,medianteladeterminacindelaprolinaensolucionesdecido

sulfosaliclico(3%)condistintasconcentracionesdeprolinaalasqueseaadi,ono, sacarosa(90mM)aunaconcentracinsimilaraladelmediodecultivodelasracesaisladas. Finalmentesecompararonlosresultadosdeabsorbanciaobtenidos.Paraladeterminacin delaprolinalasdilucionessemezclaronenunaproporcin1:1:1conninhidrinaciday acidoacticoglacial,incubndosea100Cdurante1hora.Lareaccinsedetuvoenunbao dehieloyelcromforoseextrajoaadiendo4mldetolueno.Laabsorbanciasemidia520 nmenunespectrofotmetroBioMate(ThermoSpectronic).Losresultadosseanalizaroncon ANOVA. Laconcentracindeprolinaenexudadosytejidosderazsedetermindespusdetres semanasencultivoencondicionesdeestrs.Posteriormentesemidilalongituddelas racesysemantuvieroncongeladashastaelmomentodesuutilizacin.Elexudadosefiltr conunfiltroAcrodisccondoblemembranade0,8y0,2mysemantuvocongeladohastasu liofilizacinenunliofilizadorGenesis25EL(Virtis,Gardiner,EEUU).Elexudadoliofilizadose resuspendicon1,2mldeacidosulfosaliclicoal3%yunavezcentrifugado(10mina12000 rpm)semezclenunaproporcin1:1:1conninhidrinacidayacidoacticoglacial.La reaccinydeterminacindelaprolinaserealizdemanerasimilaralodescrito anteriormente. Laconcentracindeprolinaentejidosderazsedetermintriturandolasracescongeladas. Posteriormente0,5gdetrituradosemezclaroncon2mldeacidosulfosaliclicoal3%.El sobrenadantedespusdelacentrifugacinsemezclenunaproporcin1:1:1con ninhidrinayacidoacticoglacial.Lareaccinydeterminacindelaprolinaserealizde manerasimilaralodescritoanteriormente.Serealizaronlascorrespondientescurvaspatrn paracadadeterminacindentrodelrangodedeteccindelmtodo(039g.ml1). Resultados 1.Interferenciadelasacarosa Lapresenciadesacarosa,alaconcentracinutilizadaenelmediodecultivo,noha interferidodeformasignificativaenlamedidadelaconcentracindeprolinadesoluciones patrndeprolinadeconcentracionescrecientesanalizadassiguiendoelmtododeBates (Batesetal.,1973).Enlafigura1semuestraquenoexistierondiferenciasapreciablesenla determinacindeprolina,exceptounamenorvaloracindelaconcentracinmsalta(25 g.l1)enpresenciadesacarosa(90mM).Lacomparacindelosdosconjuntosdedatosde prolina,conysinsacarosaaadida,notuvodiferenciassignificativassegnelANOVA correspondiente(F=1.42,p=0.286,con1y5g.l.) Dadoquelasacarosaincluidaenelmediodecultivonointerfirideformasignificativaenla cuantificacindeprolina,seutilizestemtodoenlasdeterminacionesdeprolinadeeste trabajo. 2.Determinacindelaprolinaencultivosderacesaisladasysometidasaestrs

Laconcentracindeprolinaenlostejidosderacesaisladasdelpatrn'Adesoto101' cultivadasinvitroysometidasaconcentracionescrecientesdeNaClsedetermintrastres semanasdecultivo.Laprolinaenlostejidosdelasracesaumentconelestrssiendomuy elevadaa180mMdeNaCl(Figura2A),dondeprcticamentenohubocrecimientodelas races. Porotraparte,sehademostradolapresenciadeprolinaenelexudadodelasracesaisladas, determinandolaconcentracindeprolinaenelmediodecultivo.Laconcentracinde prolinaenelexudadoaument,aligualqueenlostejidosderaz,segnaumentelestrs salinoalquefueronsometidos(Figura2B). 3.DeterminaciondelaprolinaenexudadosdepatronesdedistintasespeciesdePrunus ElanlisisdelexudadoderacescultivadasdepatronesdedistintasespeciesdePrunus(P. insititia,'Adesoto101';P.cerasus,'MastodeMontaana'yP.dulcisxpersica,GF677)y sometidasaconcentracionescrecientesdesaldemostrlapresenciadeprolinaenlos exudadosdelastresespeciesestudiadas.Losexudadosincrementaronsucontenidoen prolinaconformeaumentlaconcentracindeNaCl.Alamayorconcentracin,180mM,de NaCllastresespeciespresentaronunosvaloresmuyelevadosyvariables:'Adesoto101', 1.67g/ml;GF677,1.07g/mly'MastodeMontaana',17.64g/ml.Elincrementode prolinaobservadoamenoresconcentracionesdeNaCl(060mM)mostrunpatrnde aumentosimilarenlostrespatrones,enrelacinalaumentodelaconcentracindesaldel mediodecultivo(Figura3). Discusin Losresultadospresentadosenestetrabajomuestranque1)laprolinaseacumulaenlas racesaisladascultivadasinvitrocomorespuestaalaaplicacindeunestrssalino,de formasimilaraloquesucedeenplantaenteray2)laprolinaseencuentraigualmenteenlos exudadosdelasraces,recogidosenelmediodecultivolquido. Ladeterminacindeprolinaserealizadesdeantiguoennumerosostrabajosdeseleccin frenteaestresesabiticoscomolasequayposteriormente,lasalinidad,medianteun mtodorpido,sencilloysuficientementepreciso,basadoenlareaccindelaprolinaconla ninhidrina(Batesetal.,1973).Sinembargo,sehadescritounainterferenciadelasacarosa conlaprolinaquepodraafectarsudeterminacin(MagnyLarher,1992;TrotelAzizetal., 2000).Dadoqueelmodeloexperimentalempleadoenestetrabajoconsisteenelcultivode racesaisladasinvitroenunmediodecultivolquidoconunaconcentracindesacarosa relativamentealta(88mM),seefectuunavaloracindesolucionesdeprolinade concentracincrecienteencidosulfosaliclico(3%)conosinsacarosa(90mM)aadida.Sin embargo,lasabsorbanciasa520nmdelresultadodelareaccindelaninhidrinamostraron queaesaconcentracindesacarosa,elposibleefectodelasacarosanoessignificativo. Consecuentemente,paraladeterminacindelaprolinaenestetrabajoseutilizelmtodo

descritoporBatesetal.(1973)quepresentaventajasimportantescomosurapidezy sencillez. Elcultivoderacesaisladasharesultadoserunmodeloexperimentalmuyadecuadoparala deteccinprecozdelatoleranciaaestresesabiticoscomolasalinidad(MarnyMarn, 1998;Hossainetal.,2004;Suzukietal.,2009,Andreuetal.,2009).Entrelasventajasdel modeloseencuentralarpidarespuestadelospicesradicalesalestrs(3semanas)con crecimientoslongitudinalesdecrecientesamedidaqueelestrsaumenta.Adems,se observunaacumulacindealmidnenlazonademaduracindelarazqueestaba relacionadaindirectamenteconelestrsaplicado.Porotraparte,seencontrunabuena correspondenciaentrelarespuestaalestrsdelasracesaisladasydelaplantaentera,lo quepermitesuutilizacincomoherramientaenlaseleccinprecozdepatronesdeespecies frutales(Andreuetal.,2008).Asimismo,elmodelonospermiteestudiarlosexudadosdelas racesalaplicarlesdistintaspresionesdeestrsencondicionesaspticas,sininterferenciade microorganismosdelarizosfera(Suzukietal.,2009). Numerososestudioshanrelacionadolaacumulacindeprolinafrentealestrssalino(Aziz etal.,1999;MunnsyTester,2008)atribuyndoleunposiblepapelprotectorfrenteal potencialosmticogeneradoporlasal(Chenetal.,2007;Hoqueetal.,2008).Estemodelo hapermitidoobsevarsilaacumulacindeprolinaseencontrabaentrelasrespuestasdelas racesaisladasalestrssalino.Tantoenlostejidosdelasracesaisladas,comoensus exudados,sehanencontrado,porprimeravez,concentracionescrecientesdeprolinaen respuestaamayoresconcentracionesdeNaCl.Adems,losexudadosmantienen,aligual quelasraces,unafuerterelacinconlaconcentracindesaldelmediodecultivoenelque crecieronlasraces,esdecir,conlaintensidaddelestrs(coeficientesdecorrelacinde0.99 para'MastodeMontaana'yGF677yde0.97para'Adesoto101'enelrangode0a60mM deNaCl).A180mMdeNaClelestrsesmximoenrelacinalasmayoresconcetraciones deprolinaencontradasenelexudado,apesardequelaactividaddelasracesaesta concentracinesmnima,noaprecindosecrecimientolongitudinal. ElhechodequepatronespertenecientesaespeciesdiferentesdePrunusmuestrenuna respuestasimilaralestrsmediantelaacumulacindeprolinaentejidosyexudados permitesugerirqueesunmecanismomuyconservadoenelgneroPrunus,queadems podrageneralizarseaotrosgnerosfrutalescomoMalusyPyrus. Losresultadosdeestetrabajoresaltanlanecesidaddenuevosestudiosparaestablecersila prolinapuedeser,endeterminadascondiciones,unmarcadordelatoleranciadelosfrutales alasalinidad.Laevaluacindelarespuestaalestrssalinodelaacumulacindeprolinaen lostejidoso,preferentemente,enlosexudadosdelaraz,puedeestarrelacionadaconel gradodetoleranciaalasalinidaddelosdistintosclones.Losexudadospermitiran,entonces, estudiarlatoleranciacontestsnodestructivos.

 Agradecimientos Estetrabajohasidofinanciado,enparte,comoGrupodeExcelenciaA43porelGobiernode Aragn.AgradecemosaM.Joy(CITADGA)suayudaenlaliofilizacindelasmuestrasde exudados. Bibliografia AndreuP,MarinJA2005.InvitrocultureestablishmentandmultiplicationofthePrunus rootstock'Adesoto101'(P.insititiaL.)asaffectedbythetypeofpropagationofthedonor plantandbytheculturemediumcomposition.SciHort.106:258267. AndreuP,ArbeloaA,AndreuP.2008Mtodoparaladeteccinprecozdepatronesde frutalestolerantesalestrssalino.SolicituddepatentealaOficinaEspaoladePatentesy MarcasnumP200803727 AndreuP,ArbeloaA,LorenteP,MarnJA2009.ExcisedrootculturesofPrunusrootsocks wereaffectedbyincreasingNaClconcentrationsinaccordancetotheirsalttoleranceinvivo (enviado) AshrafM,Harris,P2004.Potentialbiochemicalindicatorsofsalinitytoleranceinplants. PlantScience166:316. AzizA,MartinTanguyJ,LarherF1999.Saltstressinducedprolineaccumulationand changesintyramineandpolyaminelevelsarelinkedtoionicadjustmentintomatoleafdiscs. PlantScience145:8391 BatesL,WaldrenRP,TeareID.1973.Rapiddeterminationoffreeprolineforwaterstress studies.PlantandSoil39:205207 ChenZ,CuinTA,ZhouM,TwomeyA,NaiduBP,ShabalaS2007.Compatiblesolute accumulationandstressmitigatingeffectsinbarleygenotypescontrastingintheirsalt tolerance.JournalofExperimentalBotany58:42454255 FAO,2002.CropsandDrops.Makingthebestuseofwaterforagriculture.FoodAnd AgricultureOrganizationOfTheUnitedNations.Roma,26pp. GoraiM,NeffatiM,2007.GerminationresponsesofReaumuriavermiculatatosalinityand temperature.Ann.Appl.Biol.151:5359. HassanN,SeragMS,ElFekyFM,NematAllaMM2008.Invitroselectionofmungbeanand tolerancetoNaCl.AnnApplBiol152:319330.

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Figura1.Efectodelasacarosa(90mM)enladeterminacindeprolinaensolucionespatrn Figure1.Effectofsucrose(90mM)inprolinedeterminationofstandardsolutions Figura2.Concentracindeprolinaen(A)racesaisladascultivadasy(B)enelmediode cultivo(exudado) Figure2.Prolineconcentrationin(A)culturedexcisedrootsand(B)intheculturemedium (exudate) Figura3.Concentracindeprolinaexudadaenelmediodecultivoporlasracesde diferentespatronesdelgneroPrunus(P.insititia,'Adesoto101';P.cerasus,'Mastode Montaana'yP.dulcisxpersica,GF677). Figure3.Prolineconcentrationexudatedintotheculturemediumfromexcisedrootsof differentPrunusrootstocks(P.insititia,'Adesoto101';P.cerasus,'MastodeMontaana'and P.dulcisxpersica,GF677).

Fig. 1

2 sinsacarosa consacarosa y=0.0749x 0.0295 R=0.9991

Absorb bancia(520nm)

1.5

y=0.0635x+0.0017 R=0.9994

0.5

0 0 5 10 15 20 25

Prolinag.ml1

Fig. 2

Raz
1200 1000 4

Exudado

Prolina(g.ml1) ml

Prolina(g.g1) .g

3 2 1

800 600 400 200 0 0 20 60 180

0.50225

A
0 0

B
NaCl(mM)
20 60 180

NaCl(mM)

Fig. 3

0.8 Adesoto101 GF677 0.6 Prolina(g.ml1) MastodeMontaana

0.4

0.2 02

0 0 20 NaCl(mM) 60