LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA

DE LA RICKETTSIOSIS POR LABORATORIO

DGE-InDRE–RNLSP
2015

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PRIMERA EDICIÓN, 2015

RICKETTSIOSIS-RNLSP

ESTE DOCUMENTO FUE AVALADO POR LOS REPRESENTANTES DE LAS INSTITUCIONES QUE
CONFORMAN EL GRUPO TÉCNICO INTERINSTITUCIONAL DEL COMITÉ NACIONAL DE
VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA (CONAVE).

TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS CONFORME A LA LEY

© INDRE-DGE-SECRETARÍA DE SALUD

SE PERMITE LA REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL SI SE CITA LA FUENTE: “LINEAMIENTOS

PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE LA RICKETTSIOSIS POR LABORATORIO”. VERSIÓN
NO. 01. INDRE, 2015.

COLECCIÓN DE PUBLICACIONES TÉCNICAS DEL INDRE:

ISBN: EN PROCESO

INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS DR. MANUEL MARTÍNEZ

BÁEZ.
FRANCISCO P MIRANDA 177, COL. LOMAS DE PLATEROS DEL. ÁLVARO OBREGÓN, C. P.
01480, MÉXICO, D. F.
WWW.INDRE.SALUD.GOB.MX
TEL. (55)53-42-75-50

LA EDICIÓN ESTUVO A CARGO DE: DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑÓNEZ

EL DISEÑO ESTUVO A CARGO DE: LIC. BRENDA ESCOBEDO LÓPEZ

IMPRESO EN MÉXICO. PRINTED IN MEXICO

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 SECRETARÍA DE SALUD
DRA. MERCEDES JUAN LÓPEZ
SECRETARIA DE SALUD

DR. EDUARDO GONZÁLEZ PIER

SUBSECRETARIO DE INTEGRACIÓN Y DESARROLLO DEL SECTOR SALUD

DR. PABLO ANTONIO KURI MORALES

SUBSECRETARIO DE PREVENCIÓN Y PROMOCIÓN DE LA SALUD

LIC. MARCELA GUILLERMINA VELASCO GONZÁLEZ

SUBSECRETARIA DE ADMINISTRACIÓN Y FINANZAS

DR. GABRIEL O´SHEA CUEVAS

COMISIONADO NACIONAL DE PROTECCIÓN SOCIAL EN SALUD

LIC. MIKEL ARRIOLA PEÑALOZA

COMISIONADO FEDERAL DE PROTECCIÓN CONTRA RIESGOS SANITARIOS

DR. JOSÉ MELJEM MOCTEZUMA

COMISIONADO NACIONAL DE ARBITRAJE MÉDICO

DR. GUILLERMO MIGUEL RUIZ-PALACIOS Y SANTOS

TITULAR DE LA COMISIÓN COORDINADORA DE INSTITUTOS NACIONALES DE SALUD Y
HOSPITALES DE ALTA ESPECIALIDAD

LIC. RODRIGO REINA LICEAGA

TITULAR DE LA UNIDAD COORDINADORA DE VINCULACIÓN Y PARTICIPACIÓN SOCIAL

DR. NELLY AGUILERA ABURTO

TITULAR DE LA UNIDAD DE ANÁLISIS ECONÓMICO

LIC. CARLOS SANDOVAL LEYVA

DIRECTOR GENERAL DE COMUNICACIÓN SOCIAL

DR. JESÚS FELIPE GONZÁLEZ ROLDAN

DIRECTOR GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE PROGRAMAS PREVENTIVOS Y CONTROL
DE ENFERMEDADES

DR. EDUARDO JARAMILLO NAVARRETE

DIRECTOR GENERAL DE PROMOCIÓN DE LA SALUD

DR. CUITLÁHUAC RUIZ MATUS

DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGÍA

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 LIC. JUAN CARLOS REYES OROPEZA
DIRECTOR GENERAL DE INFORMACIÓN EN SALUD

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INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
DR. MANUEL MARTÍNEZ BÁEZ

DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑÓNEZ

DIRECTOR GENERAL ADJUNTO

M. EN C. IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ

DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA

QFB. LUCÍA HERNÁNDEZ RIVAS

DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TÉCNICO

LIC. ADRIANA CASTRO CABRERA

SUBDIRECTORA DE OPERACIÓN

BIÓL. NORMA ANGÉLICA MONTES COLIMA

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA

M. EN C. BELÉN TORRES LONGORIA

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA

QFB. ROBERTO VÁZQUEZ CAMPUZANO

JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIAS

M. EN C. JUAN CARLOS CARPIO PEDROZA

JEFE DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA

DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA

M. EN C. JUDITH ESTEVEZ RAMÍREZ

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS

DR. JOSÉ ERNESTO RAMÍREZ GONZÁLEZ

JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y VALIDACIÓN DE TÉCNICAS

M. EN C. CARINA BERENICE BRITO LORÁN

JEFA DEL LABORATORIO DE LEPTOSPIROSIS

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 GRUPO DE TRABAJO

M. EN C. CARINA BERENICE BRITO LORÁN

JEFA DEL LABORATORIO DE LEPTOSPIROSIS

QBP. ADRIANA GALICIA NICOLÁS

JEFA DEL LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA MOLECULAR

DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑÓNEZ

DIRECTOR GENERAL ADJUNTO

M. EN C. IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ

DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA

DR. HUGO MARTÍNEZ ROJANO

ASESOR TÉCNICO DE LA DIRECCIÓN GENERAL ADJUNTA DEL INDRE
COORDINADOR DE MEDICINA LABORAL

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LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA
EPIDEMIOLÓGICA DE LA
RICKETTSIOSIS POR LABORATORIO

InDRE-DGE-SS
2015

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Contenido
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 9
ANTECEDENTES ........................................................................................................................... 10
MARCO LEGAL .............................................................................................................................. 13
DEFINICIONES OPERATIVAS.................................................................................................... 14
OBJETIVOS..................................................................................................................................... 15
Objetivo general .......................................................................................................................... 15
Objetivos Específicos ................................................................................................................. 15
RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PÚBLICA PARA LA VIGILANCIA DE
RICKETTSIOSIS ............................................................................................................................. 15
ORGANIZACIÓN DE LA RED...................................................................................................... 15
FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED ................................................................. 16
Funciones del laboratorio de nivel central .............................................................................. 16
Funciones de los laboratorios estatales (LESP) ..................................................................... 16
Funciones de los laboratorios a nivel local ............................................................................. 16
TOMA, MANEJO Y ENVÍO DE MUESTRAS ............................................................................. 16
ALGORITMO DIAGNÓSTICO ..................................................................................................... 19
ESTÁNDARES DE CALIDAD ....................................................................................................... 19
Criterios de aceptación .............................................................................................................. 19
Criterios de rechazo.................................................................................................................... 22
ESTÁNDARES DE SERVICIO ...................................................................................................... 23
Captura de datos y resultados ................................................................................................... 23
CRITERIOS PARA LA LIBERACIÓN DEL DIAGNÓSTICO .................................................... 28
BANCO DE MATERIAL BIOLÓGICO ......................................................................................... 28
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ........................................................................................... 29
BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................. 29
Anexo I: TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS ........................................................................................ 32
Anexo II: CARACTERÍSTICAS EQUIPOS COMERCIALES..................................................... 41
Anexo III: PREPARACIÓN DE REACTIVOS ............................................................................. 42

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 INTRODUCCIÓN
Se conoce como Rickettsiosis a un grupo de enfermedades causadas por bacterias
del género Rickettsia y que presentan entre sí similitudes desde el punto de vista
clínico, en México se presenta la enfermedad en prácticamente todo el país.
La Rickettsia son pequeños microorganismos intracelulares obligados con aspecto
de bacilos cortos, Gram negativos. Aunque puede infectar varios tipos de células
incluyendo macrófagos y músculo liso vascular los blancos primarios de infección
en huéspedes mamíferos son las células endoteliales que revisten los vasos
sanguíneos. Se multiplican en el citosol y ocasionalmente en el núcleo de las células
infectadas mediante fisión binaria en un período de 8 a 10 horas.
La Rickettsia es transmitida por vectores infectados, como lo pueden ser la
garrapata, la pulga o el piojo, el modo de infección es por picadura o por
contaminación de heridas localizadas en la piel o las mucosas con vectores
aplastados o sus heces.
No existe trasmisión directa de persona a persona.
Las Rickettsias de mayor importancia epidemiológicamente son:
 Rickettsia rickettsii agente etiológico de la fiebre manchada de las Montañas
Rocosas transmitida por la garrapata, (principalmente Rhipicephalus
sanguineus) de la cual su principal reservorio es el perro.
 Rickettsia prowasekii agente del tifus epidémico, su vector principal es el piojo
de cuerpo humano, la gente infectada puede presentar una reincidencia
conocida como enfermedad de Brill-Zinsser, se desconocen las causas, las
personas reincidentes pueden generar nuevos brotes
 Rickettsia typhi, causante del tifus murino o endémico, los roedores son su
principal reservorio y los principales vectores son las pulgas de rata y gato.

El estándar de oro para el diagnóstico serológico es la Inmunofluorescencia

Indirecta, que es realizada en muestras pareadas para demostrar un incremento de
cuatro o más veces el título de anticuerpos. Debido a que los anticuerpos
comienzan a formarse de 7 a 10 días después del inicio de síntomas, un resultado
negativo antes de 7 días no descarta la infección por Rickettsia sp. Los anticuerpos
IgM usualmente comienzan a desarrollarse al mismo tiempo que los IgG y ambos
permanecen elevados por meses o a veces por años, aunque cabe mencionar que los
anticuerpos IgM son menos específicos. Para la fiebre manchada de las Montañas
Rocosas los anticuerpos IgM comienzan a disminuir después de 3 a 4 meses,
mientras que los anticuerpos IgG persisten de 6 a 8 meses.
Por otra parte una técnica que puede ser utilizada previa a los siete días es la
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la detección de ácidos nucleicos
de la bacteria, de esta manera ambas técnicas se complementan para llevar a cabo
un diagnóstico oportuno dependiendo del tiempo en el que los pacientes acudan a
los servicios médicos.

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Particularmente México es un territorio que favorece la transmisión de
Rickettsiosis debido a sus condiciones geográficas, demográficas y
socioeconómicas, así como de marginación y pobreza, por lo tanto es de gran
importancia llevar a cabo la vigilancia epidemiológica correspondiente a dichas
enfermedades.

Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública

La Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP) es el conjunto de
laboratorios para la vigilancia epidemiológica con objetivos específicos que le han
permitido unificar métodos de diagnóstico, criterios de interpretación de
resultados, transferencia tecnológica, generación de conocimiento y formación de
recursos humanos. Es el soporte técnico-científico útil para la vigilancia
epidemiológica y que genera información de calidad para la toma oportuna de
decisiones a través de la confirmación de diagnósticos mediante estudios de
laboratorio en muestras biológicas.
La RNLSP depende de la Secretaría de Salud y es el Instituto de Diagnóstico y
Referencia Epidemiológicos (InDRE) su órgano rector en el área de vigilancia
epidemiológica. Tiene fundamento legal en la Norma Oficial Mexicana NOM-017-
SSA2-2012, Para la vigilancia epidemiológica y está conformada por 31
Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP) de las 32 entidades federativas del
país (el Distrito Federal envía sus muestras al InDRE).
El Marco Analítico Básico de la RNLSP consta de 27 diagnósticos, distribuidos en
16 redes de vigilancia específica.

ANTECEDENTES DE LA RED DE LABORATORIOS DE RICKETTSIOSIS

El Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos Dr. Manuel Martínez
Báez tuvo su origen en el Instituto de Salubridad y Enfermedades Tropicales
(ISET). A pesar de que se señala a 1939 como año de inicio de los trabajos del ISET,
desde 1935 se había designado una comisión para elaborar un proyecto de creación
y organización del Instituto para constituir un centro de investigación y docencia
para el estudio de las enfermedades de importancia en salud pública prevalentes en
México, fundamentalmente las enfermedades infecciosas. El ISET se inauguró
oficialmente el 19 de marzo de 1939 por el Lic. Rubén Leñero en representación del
entonces Presidente de la República el General Lázaro Cárdenas.

Es curioso mencionar la coincidencia de la ubicación del Instituto en la calle que

lleva el nombre del Dr. Manuel Carpio, ya que el Dr. Carpio fue un destacado
médico veracruzano (1791-1860), editor del Periódico de la Primera Academia de
Medicina de México (1851) y notable poeta de su época.

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En 1941 el Dr. Eliseo Ramírez fue designado director del ISET, sin embargo falleció
el 28 de diciembre del mismo año por lo cual se buscó al sucesor que en este caso
fue el Dr. Manuel Martínez Báez y posteriormente el Dr. Miguel E. Bustamante. En
aquel tiempo la organización interna del Instituto era por laboratorios, cada uno a
cargo de un importante investigador, así por ejemplo el Laboratorio de
Epidemiología y Bioestadística que estaba al frente el Dr. Miguel E. Bustamante; el
laboratorio de Bacteriología e Inmunología con el Dr. Alberto Ponce de León; el de
Protozoología con el Dr. Enrique Beltrán; en el laboratorio de Helmintología el Dr.
Luis Mazzotti; el de Entomología al Dr. Luis Vargas; el de Farmacología y Medicina
Experimental al Dr. Eliseo Ramírez; el de Química al Dr. Teófilo García Sancho; el
de Botánica a la Maestra en Ciencias Ester Luque; el de Anatomía Patológica al Dr.
Manuel Martínez Báez; en la Sección Clínica estaba el Dr. Samuel Morones; en el
Bioterio el Dr. Felipe Rulfo y en la Biblioteca, la Bibliotecaria Angelina Rohen. Poco
después, en 1941 se incorporó el Dr. José Zozaya en Terapéutica Experimental,
sustituyendo al Dr. Eliseo Ramírez y en laboratorios de nueva creación, el Dr.
Antonio González Ochoa en Micología y el Dr. Gerardo Varela en el Centro de
Salmonelas.

La mayor parte de este cuerpo brillante de investigadores prolongó sus actividades

por muchos años. Publicaron las más de sus investigaciones en la propia revista del
Instituto y formaron un número importante de nuevos investigadores que pronto
enriquecieron al propio ISET y a otros Institutos del país.

La actual organización departamental del InDRE tiene sus orígenes en propuestas

que datan de la década de los años sesenta y paulatinamente se han incrementado
en cuanto a su número y actividades que cada uno realiza, de acuerdo con los
cambios y necesidades del panorama de salud del país, así podemos decir que
prácticamente se encuentra en constante cambio . En 1978, se incorporó a la
organización del Instituto el Laboratorio de Investigaciones Inmunológicas que fue
fundado en el año de 1961 por el Dr. Mario Salazar Mallén.

El InDRE ha tenido a lo largo de su historia dos orientaciones diferentes: desde su

creación hasta 1985 fungió como hospital para enfermedades tropicales sujetas a
proyectos de investigación clínica y contó con médicos de gran reconocimiento
nacional e internacional. Esta actividad, a lo largo de los años, fue decayendo y la
retomaron paulatinamente otros institutos que se fueron creando en ese tiempo.
En 1985, se revisó el papel que el Instituto podía jugar en la nueva organización de
la Secretaría de Salud, decidiendo darle una nueva orientación con el propósito de
llenar algunas necesidades de los servicios epidemiológicos, particularmente como
infraestructura de los servicios de vigilancia de enfermedades transmisibles y para
apoyar los programas de vigilancia epidemiológica, es entonces como se dio

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prioridad al desarrollo y ejecución de técnicas eficientes para el diagnóstico y la
referencia, al fortalecimiento de redes nacionales de diagnóstico específico y a la
generación de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP). Bajo
estos nuevos criterios, en 1989, al cumplirse 50 años de su existencia, el Instituto
cambió su nombre por Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia
Epidemiológicos Doctor Manuel Martínez Báez (como un justo homenaje a uno de
los más ilustres fundadores del Instituto) e inició la incorporación de las redes de
diagnóstico de tuberculosis, paludismo y cáncer cérvicouterino, que funcionaban
de manera independiente, y se implementó la red de virus de inmunodeficiencia
humana (VIH) para bancos de sangre. A raíz de la última pandemia de cólera que
llegó a México en junio de 1991, el InDRE tuvo una actividad muy relevante y
organizó la habilitación de Laboratorios en todo el país para la identificación del
Vibrio cholerae.

El diagnóstico de Leptospirosis se comenzó a realizar en el año 1993, en el

“Departamento de Bacteriología y Micología” que estaba integrado por los
siguientes laboratorios: de Cólera y Bacterias Entéricas, el de Infecciones
Respiratorias Agudas, el de Brucela, y por el de Enfermedades de Transmisión
Sexual.

A lo largo de la historia la organización interna del InDRE ha variado en repetidas

ocasiones, algunas de ellas para apegarse a la legislación pero siempre con la
finalidad de buscar mejoras, así actualmente el InDRE cuenta con seis
departamentos que son el de Bacteriología, Biología Molecular, Enfermedades
Emergentes y Urgencias, Parasitología, Virología y Control de Muestras y Servicios.
Desde el 2008 el laboratorio de Leptospirosis pertenece al Departamento de
Bacteriología con la finalidad de hacer eficiente algunos procesos, modifica su
organización y queda integrado de la siguiente manera: Laboratorio de Cólera y
Enterobacterias, Laboratorio de Producción de Sueros, Laboratorio de Infecciones
Respiratorias Agudas Bacterianas, Laboratorio de Brucelosis, Laboratorio de
Bacteriología Molecular, Laboratorio de Leptospirosis, Laboratorio de Medios de
Cultivo, Laboratorio de Micología y Laboratorio de Micobacterias.

La pandemia de influenza AH1N1 ocurrida en el año 2009, vino a reforzar la

importancia de que el país cuente con una institución como el InDRE y de que este
se encuentre coordinando y al frente de la Red Nacional de Laboratorios de Salud
Pública. Así mismo el InDRE ha estrechado relaciones con los Centros de Control
de Enfermedades de los Estados Unidos de Norteamérica (CDC) que le han servido
a su vez como una referencia en pruebas inter-laboratorios y en el desarrollo de
nuevas metodologías de diagnóstico, hablando de diagnósticos que previamente no

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se realizaban y de pruebas que se van modernizando con el objetivo de mejorarlas y
simplificarlas.

En el año 2010 fue transferida al departamento de Bacteriología la técnica de

Inmunofluorescencia Indirecta para el diagnóstico de Rickettsiosis y con ella
también el propio diagnóstico, el cual era realizado anteriormente por el
Departamento de Virología. En la actualidad el diagnóstico de Rickettsiosis se
realiza en el laboratorio de Leptospirosis.

El InDRE es el órgano rector de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública,

con 31 Laboratorios Estatales de Salud Pública, así a lo largo de los años el InDRE
ha crecido en cuanto a personal, capacidades y necesidades, razón por la cual se
construyó una nueva sede en Francisco de P. Miranda No.177, Col. Unidad Lomas
de Plateros, Del. Álvaro Obregón, C.P. 01480, México D.F., esta construcción ha
permitido contar con instalaciones amplias y sobre todo adecuadas a las
actividades de un centro de referencia tanto nacional como internacional.

MARCO LEGAL

 Constitución Política de los Estados Unidos Mexicanos. Artículo 4. DOF

05/02/1917, Última Reforma D.O.F. 15/02/2012.
 Ley General de Salud. Artículo 3, XV; 59; 64, III; 133; 134, I; 136, 138, 139 y
141. DOF 7/02/1984, Última Reforma DOF 07/06/2012.
 Secretaría de Salud. Programa Sectorial de Salud 2013-2018. Diario Oficial
de la Federación DOF: 12/12/2013.
 Plan Nacional de Desarrollo 2013-2018. Diario Oficial de la Federación,
DOF: 20/05/2013, www.dof.gob.mx
 Secretaría de Salud. Programa de Acción Específico 2013-2018. Sistema
Nacional de Vigilancia Epidemiológica, primera edición 2014.
 Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012. Para la vigilancia
epidemiológica. (DOF: 19/02/2013)
 Norma Oficial Mexicana NOM-032-SSA2-2010. Para la vigilancia
epidemiológica, prevención y control de enfermedades transmitidas por
vector. (DOF: 01/06//2011)
 Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002. Protección
Ambiental-Salud ambiental-Residuos peligrosos-biológico-infecciosos-
Clasificación y especificaciones de manejo. (DOF: 17/02/2003)

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  Norma Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005. Que establece las
características, el procedimiento de identificación, clasificación y los listados
de los residuos peligrosos. (DOF: 23/06/2006).
 Norma Oficial Mexicana NOM-007-SSA3-2011. Para la organización y
funcionamiento de los laboratorios clínicos. (DOF: 27/03/2012).
 Lineamientos para programas de evaluación externa del desempeño de la
Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública, InDRE- Secretaría de Salud,
2014.
 Criterios de Operación para la Red Nacional de Laboratorios de Salud
Pública, InDRE-Secretaría de Salud, 2014.

DEFINICIONES OPERATIVAS
Caso sospechoso de Rickettsiosis: Toda persona que proceda de áreas donde
se identifiquen los vectores (piojos, pulgas o garrapatas), animales que los porten o
donde haya sido confirmada la ocurrencia de la enfermedad y que además presente
fiebre acompañada de cualquiera de los siguientes signos o síntomas: mialgias,
artralgias, escalofrío, dolor retrocular, astenia, adinamia, postración; en las
personas que puedan referirla se añadirá la presencia de cefalea.
Caso probable de Rickettsiosis: Todo caso sospechoso que adicionalmente
presente alguno de los siguientes: lesiones sospechosas de picadura, exantema
máculo-papular, petequias o sangrado a cualquier nivel, alteraciones respiratorias
(rinitis, rinorrea, faringitis, tos, dolor o ardor de garganta), alteraciones
neurológicas (fotofobia, convulsiones, alteraciones en el examen citoquímico de
LCR compatibles con infección bacteriana, incoordinación, alucinaciones, parálisis,
rigidez), alteraciones gastrointestinales (anorexia, nauseas, dolor abdominal tipo
cólico, diarrea, vómitos), alteraciones hepáticas (ictericia, aumento de las
bilirrubinas por encima del estándar y/o hipoalbuminemia, y/o elevación de las
transaminasas), alteraciones hematológicas; plaquetopenia <100,000/mm3,
bandemia absoluta >500/mm3, aumento de los tiempos de coagulación, anemia,
hiponatremia <135 mEq/L, elevación de DHL >350 UI/L y acidosis metabólica y/o
respiratoria.
Caso confirmado de Rickettsiosis: Todo caso probable en quien se confirme la
presencia de Rickettsia spp o valores significativos de títulos de anticuerpos contra
dicha bacteria mediante pruebas de laboratorio debidamente avaladas y
autorizadas por la autoridad competente.
Caso descartado. Todo caso probable que no sea confirmado mediante pruebas
de laboratorio debidamente avaladas por la autoridad competente.

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OBJETIVOS

Objetivo general
Establecer los procedimientos para la aplicación del algoritmo diagnóstico de
Rickettsiosis y el manejo adecuado de la información generada por el laboratorio, a
través de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP), en apoyo a la
Vigilancia Epidemiológica de la Rickettsiosis.

Objetivos Específicos
 Realizar un diagnóstico de Rickettsiosis por laboratorio que sea oportuno y
confiable.
 Mantener la vigilancia epidemiológica continua de la circulación de
Rickettsiosis en México.
 Generar datos de utilidad para efectuar estudios epidemiológicos y el control
de brotes.

RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PÚBLICA PARA LA

VIGILANCIA DE RICKETTSIOSIS

El InDRE realiza el diagnóstico de Rickettsiosis mediante la técnica de

Inmunofluorescencia Indirecta y PCR en tiempo real, para lo cual se ha contado
con capacitación de los Centros de Control de Enfermedades de Estados Unidos de
Norteamérica, así como comparaciones inter-laboratorio, se encuentra en proceso
de recepción de paneles de evaluación provenientes de la misma instancia, sin
embargo aún no se ha realizado la transferencia de estas técnicas a los Laboratorios
Estatales de Salud Pública, ni se ha realizado la evaluación mediante paneles ni
control de calidad a los diferentes laboratorios que puedan contar con alguna
técnica de apoyo al diagnóstico de Rickettsiosis, por lo que hasta el momento no se
cuenta con una Red Nacional de Laboratorios en materia de este diagnóstico.

ORGANIZACIÓN DE LA RED
No existe hasta el momento una Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública en
materia de apoyo al diagnóstico de Rickettsiosis por laboratorio.

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FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED
Funciones del laboratorio de nivel central
El Laboratorio de Rickettsiosis del InDRE, es el Laboratorio Nacional de
Referencia y es el órgano normativa para el diagnóstico por laboratorio, dentro de
las funciones que le competen se encuentran las siguientes:
 Realizar el diagnóstico de Rickettsiosis mediante la técnica de PCR en
tiempo real o Inmunofluorescencia Indirecta según sea el caso.
 Proporcionar asesoría y soporte a la Red Nacional de Laboratorios de Salud
Pública respecto al diagnóstico de Rickettsiosis.
 Resguardar los antígenos de Rickettsia.
 Analizar la información derivada del diagnóstico de Rickettsiosis.
 Actualizar los lineamientos para el diagnóstico de Rickettsiosis de acuerdo al
análisis de datos pertinente.
 Dar a conocer las actualizaciones que se realicen en los lineamientos para el
diagnóstico de Rickettsiosis por laboratorio
Funciones de los laboratorios estatales (LESP)
 Conocer y aplicar los lineamientos del diagnóstico de Rickettsiosis por
laboratorio.
 Difundir la información que el InDRE le haga llegar respecto al diagnóstico
de Rickettsiosis a todos los niveles implicados.
 Certificar que las muestras enviadas al InDRE cumplan con los criterios de
aceptación establecidos en el presente lineamiento
Funciones de los laboratorios a nivel local
 Recepción, identificación, resguardo y envío de muestras
 Recibir capacitación y asesoría del Laboratorio Estatal de Salud Pública
correspondiente
 Aplicar las recomendaciones del nivel estatal
 Revisar que las muestras enviadas al LESP cumplan con los criterios de
aceptación establecidos en el presente lineamiento

TOMA, MANEJO Y ENVÍO DE MUESTRAS

Para realizar la toma de muestra de sangre los pacientes deben de contar con un
ayuno mínimo de 8 horas, y deben de estar en un lugar iluminado, cómodo y de
preferencia sentada (o) si se trata de un paciente ambulatorio, en el caso de los
hospitalizados se efectúa con el paciente acostado. Hay que localizar una vena
periférica, y de preferencia en la cara anterior del brazo, si se trata de la vena
basílica, cefálica o mediana del antebrazo hay que colocar el torniquete en la
porción proximal del brazo. Desinfectar el área con un algodón humedecido con

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alcohol al 70% e introducir la aguja con el bisel hacia arriba en la piel hasta
localizar el vaso sanguíneo elegido. Si la sangre no fluye espontáneamente presione
el tubo de ensaye hacia arriba. Al empezar a fluir la sangre hay que retirar el
torniquete y una vez que se haya obtenido la cantidad de sangre requerida (5 a 7
mL), retire la aguja y coloque una torunda con alcohol sobre el sitio de punción
ejerciendo presión para detener el sangrado. Para la obtención del suero hay que
utilizar un tubo sin anticoagulante (tubo Vacutainer con tapón rojo).
Para efectuar la separación de suero, una vez tomada la muestra dejar el tubo a
temperatura ambiente durante 15 minutos para permitir la retracción del coágulo,
separe el coágulo formado con un aplicador de madera estéril y en condiciones de
esterilidad, centrifugar de 2,500 a 3,000 rpm durante 10 min. Colocar el suero en
tubos estériles, de plástico con capacidad de 1.5 mL con tapón de rosca. Si la
muestra presenta indicios de contaminación debe de desecharse de inmediato
(realizar este paso en condiciones de esterilidad), rotular y sellar con papel
parafinado, si no se cuenta con la infraestructura para efectuar la separación del
suero se puede enviar el tubo en el que realizó la toma (principalmente aplicable a
laboratorios locales que envían muestras directamente al InDRE), almacenar a
temperatura de refrigeración 2-8 °C.
Para plasma hay que utilizar un tubo con citratos de preferencia o EDTA (tubo
Vacutainer de tapón azul o lila), una vez tomada la muestra hay que homogenizar
por inversión y colocar en una gradilla, rotular, sellar y almacenar a temperatura de
refrigeración 2-8 °C.
Cuando el paciente haya fallecido se puede realizar una biopsia post-mortem, esta
debe de ser de un tamaño aproximado de 3 x 3 x 1 cm y hay que colocarla en un
recipiente de plástico con boca ancha y tapa de rosca que contenga solución salina,
el volumen de debe de ser 10 veces el volumen de la muestra de tejido, hay que
rotularla, sellarla y almacenarla a temperatura de refrigeración 2-8 °C.
La toma del líquido cefalorraquídeo debe de ser efectuada por personal capacitado
y con experiencia, debe de efectuar bajo condiciones asepsia y antisepsia. Los
pacientes deben estar inmóviles, sentados o descansando de lado, con la espalda
arqueada hacia adelante de modo que la cabeza toque las rodillas durante el
procedimiento (posición fetal). Desinfectar la piel a lo largo de la línea entre las dos
crestas ilíacas, con alcohol al 70%, para limpiar la superficie y remover los detritos
y la grasa posteriormente aplicar la tintura de yodo o yodo povidona y deje secar.
Introduzca la aguja y cuando está adentro, obtenga las gotas de líquido
cefalorraquídeo en un volumen promedio de 3 a 4 mL, si es posible en tubos
estériles con tapón de rosca. Marque la muestra con la identificación del paciente y
la fecha y hora de la recolección de la muestra, cabe mencionar que no es la
muestra ideal, sin embargo se procesa en casos de no existir posibilidad de tomar
cualquier otra muestra al paciente.

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Una vez que se ha obtenido el LCR, este debe ser transportado al laboratorio para
ser examinado tan pronto como sea posible (de preferencia dentro de la primera
hora de haberse obtenido); almacenar a temperatura de refrigeración 2-8 °C.
Evitar calentamiento o enfriamiento excesivo de la muestra ya que pueden dejar de
ser útil y habrá que tomarla y enviarla de nuevo.
Transportar los tubos colocados en una gradilla que se encuentre dentro de una
hielera, estos deben de estar en posición vertical cubiertos por una gasa o apósito
grueso para evitar su movimiento, y sobre la gasa se deben de colocar geles
refrigerantes fríos para mantener la temperatura interior de la hielera entre 2 a 8
°C.
El transporte de las biopsias debe de efectuarse en frascos perfectamente sellados y
en una hielera que contenga geles refrigerantes para mantener la temperatura
interior entre 2 a 8 °C y evitar que los frascos se vuelquen.
La muestra debe ser enviada junto con el formato único de envío de muestras del
InDRE. Este debe de venir lleno incluyendo la fecha de inicio de los síntomas, fecha
de la toma de muestra, si se trata de la primera o segunda muestra, si el paciente ha
recibido algún tratamiento y en caso positivo incluir el nombre del fármaco, dosis
así como fecha de inicio y terminación, anexar también documento que incluya los
datos de identificación del paciente, unidad notificante, información de la muestra,
estadio de la enfermedad, antecedentes patológicos, datos epidemiológicos que
incluya contacto con animales y actividades al aire libre, cuadro clínico y exámenes
paraclínicos.

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ALGORITMO DIAGNÓSTICO

Figura 1. Algoritmo diagnóstico de Rickettsiosis

ESTÁNDARES DE CALIDAD
Criterios de aceptación
Las muestras deben de ser tomadas en aquellos individuos que presentan signos y
síntomas compatibles con el cuadro clínico de Rickettsiosis así como alteraciones
en los exámenes paraclínicos:
Síntomas generales
 Adinamia
 Artralgias
 Astenia
 Cefalea
 Dolor retrocular
 Escalofrío
 Fiebre
 Mialgias
 Postración

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Gastrointestinal
 Diarrea
 Dolor abdominal
 Náusea
 Vómito

Respiratorios
 Dolor o ardor de garganta
 Faringitis
 Rinitis
 Rinorrea
 Tos

Hemorragias y alteraciones hematológicas

 Hemorragia ocular
 Petequias
 Púrpura y/o sangrado
 Sangrado a cualquier nivel

Sistema Nervioso Central

 Alteraciones del citoquímico del LCR compatibles con infección bacteriana
 Alucinaciones
 Convulsiones
 Delirio
 Fotofobia
 Incoordinación
 Insomnio
 Parálisis
 Rigidez
 Tremor

Exantema y piel
 Exantema máculo-papular
 Eritematoso

Lesiones oculares
 Conjuntivitis
 Parálisis ocular

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Exámenes paraclínicos

 alteraciones hepáticas: ictericia, aumento de las concentraciones de

bilirrubinas por arriba del límite normal superior hipoalbuminemia, y
elevación de las transaminasas
 alteraciones hematológicas: plaquetopenia <100,000/mm3, bandemia
absoluta >500/mm3, aumento de los tiempos de coagulación, anemia
 alteraciones electrolíticas y enzimáticas: hiponatremia (Na+ sérico <135
mEq/L), elevación de LDH 350 UI/L y acidosis metabólica y/o respiratoria.

Es importante tomar en cuenta, si el paciente proviene de zonas endémicas donde

haya sido confirmada la enfermedad, así como también el contar con el
antecedente de contacto y/o picaduras de piojos, pulgas, garrapatas o de animales
que puedan portar a los mismos; perros, ratas, ganado u otros mamíferos
silvestres, además de actividades al aire libre que expongan al contacto con el
vector como en los caso de los campamentos, excursiones, caza, pesca, actividades
ocupacionales, etc.

Es de vital importancia que también se envíen la historia clínica especificando la

fecha de inicio de los síntomas así como la de toma de la muestra, indicando si se
trata de la primera o segunda muestra y si el paciente ha recibido algún
tratamiento, incluyendo el nombre, la dosis y fecha de inicio y terminación.

Los sueros para la búsqueda de anticuerpos mediante la técnica de

Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) deben de ser obtenidos de los pacientes que
tengan de siete o más días de haber iniciado con los signos y síntomas
característicos. Para el caso de muestras para la realización de la técnica de PCR los
pacientes deben tener de 6 o menos días de evolución. Cabe mencionar que en caso
de muestras valiosas; como son el caso de las defunciones, o cuando no sea posible
tomar una muestra adecuada se pueden realizar las pruebas de laboratorio a pesar
de que no se cumpla con ciertos criterios de aceptación, sin embargo se debe
considerar la posibilidad que, debido a no ser la muestra óptima, puede obtenerse
resultados falsos negativos por lo que se deben interpretar con cautela, de
preferencia se debe poner en contacto con el laboratorio de Rickettsiosis localizado
en el InDRE para informar el envío de estas muestras sospechosas.

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Criterios de rechazo

Se rechazan muestras cuando se presenten las siguientes características:

 tubo o envase roto

 volumen menor a 400 µL en caso de Líquido Cefalorraquídeo
 volumen menor a 1 mL en caso de sangre total
 volumen menor a 300 µL en caso de sueros o plasma
 muestra contaminada
 muestra contenida en tubos o recipientes de vidrio
 muestra de contactos asintomáticos
 muestra de sangre total para el diagnóstico por la técnica de PCR que hayan
sido tomadas después de 6 días de empezados con los signos y síntomas.
 muestra de sangre total que no contenga como anticoagulantes citratos o
EDTA
 muestra de sangre total para la técnica de PCR que no cuente con
sintomatología aguda: exantema, alteraciones en neurológicas o hemorrágicas
 muestras de sueros para diagnóstico por la técnica de IFI que hayan sido
tomadas antes de 7 días de haber iniciado con los signos y síntomas
característicos
 muestra derramada
 muestra hemolizada
 muestra lipémica
 muestras conservadas a temperatura ambiente
 muestra que no coincida los datos con los de su correspondiente
documentación
 muestra de pacientes que no presenten sintomatología característica del
cuadro clínico de Rickettsiosis
 muestra que no cuente con la fecha de inicio de síntomas
 muestra sin etiqueta o rotulo de identificación
 muestra sin fecha de toma
 sin datos completos en el Formato Único de Envío de Muestras del InDRE o
Historia Clínica

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ESTÁNDARES DE SERVICIO

El estándar de servicio para el diagnóstico por laboratorio de Rickettsiosis es de 5

días.

Captura de datos y resultados

La captura de los resultados se realiza en el programa INFO-LAB Ver 3.0 dentro de

la base de datos “RICK”.
1. Se selecciona la opción “laboratorio” y después “ver muestras recibidas”.

2. Se abrirá una nueva ventana donde se debe elegir en “Laboratorio” la opción

“RIK”, en “Año” el año en curso, en “Tipo de búsqueda” la opción “Número” y
finalmente seleccionar “Aceptar”.

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3. Se abrirá una ventana donde se despliegan todas las muestras que se han
recibido en el año seleccionado para el diagnóstico de Rickettsiosis, las que se
encuentran en “Status” “Asignado” corresponden a las que no se les ha
registrado un resultado, se debe colocar el cursor sobre alguna de ellas y
posteriormente oprimir la tecla “Enter”, se abrirá entonces una ventana que
contiene toda la información correspondiente a la muestra, se debe
corroborar que todo este correcto, de lo contrario se debe corregir mediante
una solicitud al área de Recepción de Muestras.

4. Cuando se ha comprobado que los datos de las muestras son correctos se

cierran esas ventanas oprimiendo la tecla “Escape” hasta regresar a la ventana
inicial (así se cierran todas las ventanas siempre que se desee) y ahí se
selecciona la opción “Laboratorio” y después “Proceso”.

5. Después se abre una nueva ventana y se deben seleccionar en “Laboratorio” la

opción “RIK”, en “año” el año en curso, en “Status” la opción “Recepción” y

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 finalmente “Aceptar”, se abrirá una ventana con todas las muestras que han
sido capturadas para el diagnóstico de Rickettsiosis y que están pendientes de
resultado, se coloca el cursor en alguna o varias de ellas y luego se oprime la
tecla “Enter”, estás muestras pasarán así a otra ventana, la de “Actualización”,
donde se pueden capturar los resultados correspondientes.

6. Se cierra la ventana anterior y se abre una nueva, se deben seleccionar en

“Laboratorio” la opción “RIK”, en “año” el año en curso, en “Status” la opción
“Actualización” y finalmente “Aceptar”.

7. Se coloca el cursor sobre la muestra que se vaya a capturar y se oprime la tecla

“Enter”, aparecerá una pantalla como la que se muestra a continuación (si el
resultado es el mismo para varias muestras consecutivas se puede capturar

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 por bloque, de lo contrario por única muestra, eso se elige en la opción
“Desde” y “Hasta”) y se oprime la opción “Aceptar”.

8. Se abrirá una nueva ventana donde se debe elegir en “Diagnóstico inicial” la

opción “RIK, Rickettsiosis”, posteriormente en “Técnica” la opción “IFI” o
“PCR” según sea el caso, luego se elige el resultado correspondiente
“Negativo”, “Positivo” o “Indeterminado”(en caso de resultado positivo en IFI
además se agrega el valor de “Dilución” para la especie correspondiente) en la
casilla de observaciones se incluye la que corresponda al resultado emitido y
finalmente en la parte inferior de la ventana “Diagnóstico de lab” se vuelve a
capturar solo el resultado final (positivo, negativo o indeterminado), se
oprime la tecla “Enter” y aparecerá una ventana que pregunta “¿Desea salvar
los cambios realizados?”, en caso de ser correctos los datos se selecciona la
opción “Si”, de lo contrario la opción “No” y se vuelve a capturar.

9. Una vez que se ha capturado de manera correcta toda la información se

procede a realizar la impresión de los resultados, en la ventana principal se
elige la opción de “Laboratorio” y posteriormente la de “Impresiones”, se

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abrirá una nueva ventana en donde se debe elegir en la barra de herramientas
la opción “RIK”, luego la opción del “Año” que corresponda y finalmente el
“Status” que igualmente corresponda a la muestra que se desea imprimir
(usualmente se elige la opción de “No impreso”) y se oprime la tecla
“Aceptar”, de ahí se desplegará una nueva pantalla con las muestras
disponibles para impresión, se debe colocar el cursor en alguna de ellas y
posteriormente oprimir la tecla “Enter”, se abrirá una ventana donde se deben
introducir los números de las muestras que se desean imprimir y finalmente
se elige la opción de “Aceptar”, una vez impreso se vuelve a revisar que toda la
información sea correcta, de ser así, los resultados se firman y se entregan al
área de recepción de muestras para su envío o entrega, de lo contrario se
solicita la corrección de los datos erróneos al área de recepción de muestras.

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10. El envío de resultados cuando se trata de muestras enviadas por los LESP se
realiza por correo electrónico diariamente a la una de la tarde, posteriormente se
envían por mensajería, el día puede variar, sin embargo el envío a cada LESP se
realiza por lo menos una vez a la semana. Los resultados de muestras que llegan
de manera particular se pueden enviar por fax, o por correo electrónico también,
si dejan los datos correspondientes o por mensajería si se deja alguna guía
pagada, de lo contrario se deben recoger directamente en el InDRE.

CRITERIOS PARA LA LIBERACIÓN DEL DIAGNÓSTICO

Para que un Laboratorio Estatal de Salud Pública se integre a la Red de Diagnóstico
de Rickettsiosis debe de contar con la infraestructura indispensable, dispositivos
médicos, reactivos e insumos indicados por el InDRE, además de contar con
personal profesional que tenga la capacitación en servicio en el InDRE, este
personal será designado por el LESP para la realización del diagnóstico y debe
contar con una antigüedad mayor a los 6 meses al momento de iniciar el
diagnóstico.
Una vez que el laboratorio cumpla con los requisitos antes mencionados se debe de
notificar el inicio del diagnóstico por vía oficial al InDRE y entonces ya se puede
comenzar a realizar el diagnóstico, de manera inmediata se evaluará su desempeño
mediante el control de calidad y paneles de evaluación externa.
En caso de que su desempeño sea deficiente; menor al 80%, el personal deberá
capacitarse de nuevo en las instalaciones del InDRE, en caso de que el desempeño
sea consecutivamente sobresaliente durante un período de tiempo ya definido se
liberará el diagnóstico al laboratorio correspondiente, quedando abierta la
posibilidad de que el InDRE solicite muestras para referencia.

BANCO DE MATERIAL BIOLÓGICO

Se mantiene un banco de muestras positivas y negativas, las muestras negativas
solo se conservan tres meses debido a que la cantidad de estas es grande, por otra
parte la cantidad de muestras positivas de este diagnóstico es baja, todas son
conservadas y almacenadas por un año como mínimo.
El objetivo de mantener un banco de sueros es el de contar con un resguardo de
controles secundarios positivos y negativos que pueden ser utilizados para el
diagnóstico o evaluación, validación y verificación de las pruebas diagnósticas.

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CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Cuadro 1. Cronograma de actividades para el diagnóstico de Rickettsiosis

ACTIVIDAD ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL AGO SEP OCT NOV DIC

Propagación xxx xxx xxx xxx

de células
Vero E6
Diagnóstico xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx
de
Rickettsiosis
Trámites para xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx
envío de
Rickettsia por
parte de los
CDC
Producción y xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx
evaluación de
antígeno de
Rickettsia
para IFI, PCR
y resguardo
Gestión para xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx
realizar
pruebas inter-
laboratorio
de
diagnóstico
de
Rickettsiosis

BIBLIOGRAFÍA
1. Centers for Disease Control and Prevention [Internet]. Atlanta, EU: Centers for
Disease Control and Prevention; 04 Noviembre 2010 [actualizado 04 Noviembre
de 2010; acceso 9 de mayo de 2013]. Rocky Mountain spotted fever (RMSF):
Symptoms, Diagnosis and Treatment [6 pantallas].
http://www.cdc.gov/rmsf/symptoms/index.html.
2. Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta GA, EU. Diagnostic.
Rickettsiology Workshop. 27 de mayo de 2011.
3. Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades: Centro Nacional para
las Enfermedades Infecciosas y Organización Mundial de la Salud [Internet].
Atlanta, Georgia USA; fecha de publicación 2004 [fecha de actualización no
disponible; acceso junio 2013].

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4. Manual de Laboratorio para la Identificación y Prueba de Sensibilidad a los
Antimicrobianos de Patógenos Bacterianos de Importancia para la Salud Pública
en el Mundo en Desarrollo [410 páginas].
http://apps.who.int/medicinedocs/documents/s16330s/s16330s.pdf.
5. Clements M, Dumler J, Fiset P, and et al. Serodiagnosis of Rocky Mountain
spotted fever: comparison of IgM and IgG enzyme-linked Immunosorbent
assays and indirect fluorescent antibodies test. J Infect Diseases. 1983; 148
(5):876-80.
6. Comité Nacional de Vigilancia Epidemiológica. Aviso epidemiológico
Rickettsiosis: Incremento de casos de Rickettsiosis en Coahuila. 1ª edición.
México: CONAVE; 15 de Noviembre de 2012 [consulta 8 de mayo de 2013].
http://www.facmed.unam.mx/deptos/salud/vigilanciaepidem/aviso_rickettsios
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7. Dantas F. Rocky Mountain spotted fever. Lancet Infect Disease. 2007; 7:724-
732.
8. Kato C, Chung I, Robinson L, et al Assessment of real-time PCR assay for
detection of Rickettsia spp. and Rickettsia rickettsii in banked clinical samples.
J Clin Microb. 2013; 51(1):314-317.
9. Manual Estandarizado para la Vigilancia Epidemiológica de las Enfermedades
Transmitidas por Vectores de la Dirección General de Epidemiológica. 2012.
10. Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012 para la vigilancia epidemiológica.
11. Norma Oficial Mexicana NOM-032-SSA2-2010 para la Vigilancia
Epidemiología, Prevención y Control de Enfermedades Transmitidas por Vector.
12. Walker David H. Rocky Mountain Spotted Fever and Other Rickettsioses. En:
Schaechter Moselio, Medoff Gerald, Eisenstein Barry I, editors. Mechanisms of
Microbial Disease. 2a edition. United States: Williams Wilkins; 1993. p. 358-
367.
13. Miller MJ, et al. Guidelines for safe work practices in human and animal medical
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14. Guidelines for Biosafety Laboratory Competency. MMWR. Supplement/Vol. 60;
2011.
15. World Health Organization. Guidance on regulations for the Transport of
Infectious Substances 2013-2014; Geneva: WHO Press; 2012.
16. Chosewood C & Wilson DE. Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories–5th ed. CDC-NIH; 2009.
17. European Committee for Standardization. CWA 15793:2011 Laboratory biorisk
management standard. Brussels: CEN; 2011.
18. World Health Organization. Laboratory Biosafety Manual–3rd ed. Geneva:
WHO Press; 2004.

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ANEXOS

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Anexo I: TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS

Inmunofluorescencia indirecta
Recepción de la muestra
 Se reciben las muestras en el laboratorio de Rickettsiosis.
Registro de la muestra
 Se asigna un número consecutivo a la muestra y se registran los datos del
paciente.

Sensibilización de antígenos en los portaobjetos recubiertos con teflón blanco.

Se permite que el vial del antígeno inactivo a sensibilizar se descongele, o cuando
sea el caso se hidrata con agua grado biología molecular conforme a las
especificaciones impresas en cada vial, después se introduce un capilar de vidrio en
el antígeno y se coloca en los pozos de portaobjetos cubiertos de teflón un volumen
de 2 a 3 mL, se dejan secar y se colocan dentro de un desecador durante 2 horas,
pasado este tiempo se sumergen en acetona al 100% durante 15 a 20 minutos. Los
portaobjetos con el antígeno ya seco y fijado se colocan en cajas para portaobjetos,
las cuales se guardan dentro de una bolsa de plástico con cierre hermético,
finalmente se conservan a una temperatura de -70 °C hasta su uso. Una vez
descongelado o hidratado, el antígeno debe utilizarse en su totalidad y no volverse
a congelarse ni refrigerarse.

Preparación de la muestra
Las muestras se ordenan, de igual forma se ordenan las placas de reacción para
asignación y rastreo de cada una de las muestras, así como los controles en los
diferentes pozos de la microplaca.
Para evidenciar la presencia de anticuerpos de la clase IgG en una primera
muestra, se prepara una dilución 1:64 de la muestra de la siguiente manera: 150 µL
de diluyente PBS-Albumina y se agregan 10 µL del suero de la muestra, obteniendo
una dilución inicial de 1:16 posteriormente efectuar diluciones seriadas 1:32 y 1:64
en los pozos de la microplaca, para finalmente colocar la dilución 1:64 de la
muestra en los portaobjetos con los antígenos fijados correspondientes. Por cada
corrida se incluyen controles positivos y negativos, en el caso de los controles
positivos se deberá probar la dilución óptima.
En caso de presentarse un cruce entre dos o más especies de Rickettsia durante la
lectura de la reacción, se procede a realizar diluciones seriadas de la muestra hasta
encontrar aquella dilución en la que sólo presente reacción positiva una especie,
ese será el título de corte y la especie que se informe como positiva.
Para evidenciar la presencia de anticuerpos de la clase IgG en una segunda muestra
se prepara una dilución inicial de 1:16 de la siguiente manera: a 150 µL de PBS-
albúmina, se le agrega 10 µL del suero de la muestra, se realizan las diluciones

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seriadas, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256 en los pozos de la microplaca, para posteriormente
colocar la dilución 1:256 de la muestra en los portaobjetos con los antígenos fijados
correspondientes. Nota: solo se solicita la segunda muestra cuando la primera no
presentó títulos de anticuerpos.
En caso de presentarse un cruce entre dos o más especies de Rickettsia durante la
lectura de la reacción, se procede a realizar diluciones seriadas como se describió
para el caso de las primeras muestras.
Para muestras de seguimiento realizar diluciones seriadas, se puede comenzar con
las más cercanas al título de la última muestra.

Ensayo de la muestra
Se adicionan 15µL de las diferentes diluciones, previamente preparadas, en el pozo
del portaobjetos correspondiente a cada una de las especies de Rickettsias y/o
Ehrlichia dependiendo de la solicitud que haya realizado el LESP o el médico
tratante. La dilución seleccionada para realizar el ensayo de determinación de
inmunoglobulinas tipo IgG en primera muestra es 1:64 y para la segunda muestra
1:256. Se incuba en baño húmedo a 37 °C durante 30 minutos. Se lavan con
solución de PBS 1X (con una pizeta) cada uno de los portaobjetos, se colocan en
una rejilla y esta se introduce en una caja de tinción donde se realizarán 3 lavados
en PBS. Se vacía PBS en la caja hasta que cubra completamente lo pozos, se deja
agitando lentamente 5 minutos a temperatura ambiente con ayuda de un agitador
magnético, se desecha el líquido y se repite el paso otras dos veces, después de
finalizar el último enjuague se dejan secar completamente a temperatura ambiente
dentro de un desecador.
Una vez secos se adicionan 15µL de anticuerpo anti IgG humano conjugado con
isotiocianato de fluoresceína (FITC) (el cual fue previamente titulado para conocer
la dilución óptima de uso y diluido con PBS-albúmina) en cada uno de los pozos de
los portaobjetos, se incuban en baño húmedo a 37 °C durante 30 minutos, se lavan
con solución de PBS 1X con una pizeta cada uno de los portaobjetos, se colocan en
una rejilla para que se realicen 2 lavados de 5 minutos con PBS empleando un
agitador magnético lentamente, al finalizar el segundo lavado no se desecha el PBS
y se agregan 2 mL de negro de eriocromo al 1.65% como colorante de contraste, se
dejan agitando durante 5 minutos y se desecha la solución, se lava nuevamente con
PBS 1X por 5 minutos, se dejan secar a temperatura ambiente dentro de un
desecador hasta que no se observen rastros de humedad en los pozos, después se
adicionan en cada uno de los pozos de los portaobjetos una gota de líquido de
montaje y se coloca un cubreobjetos.

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Lectura microscópica
Observar al microscopio de fluorescencia con objetivo 40X y registrar la lectura.
Las reacciones positivas exhiben fluorescencia citoplasmática color verde-manzana
brillante distribuida homogéneamente a lo largo y ancho de todo el pozo. Para las
muestras positivas en dos o más especies de Rickettsias incluyendo Ehrlichia, se
procede a repetir el ensayo aumentando las diluciones seriadas, hasta obtener
reacción positiva exclusivamente en una especie de Rickettsia y/o Ehrlichia.
Las reacciones negativas son aquellas que:
No exhiben fluorescencia
Presentan fluorescencia menos intensa respecto al control positivo (opaca)
Presentan color verde extracelularmente indicativo de precipitación de reactivos
Presentan fluorescencia que no es homogénea a lo largo de la preparación y que
tiende a acumularse en la periferia

Informe de resultados
Las lecturas se registran en bitácoras (los títulos obtenidos de las diferentes
especies analizadas o negativo a todas).
Se transfieren los resultados al sistema INFOLAB, en las muestras positivas se
informa como positiva la especie de Rickettsia que presente el título más alto y el
resto como negativa o cuando sea el caso negativo a todas las especies,
posteriormente se imprimen y envían al área de recepción de muestras.

Interpretación de resultados
En la primera muestra un título de ≥1:64 en cualquier especie es indicativo de
exposición a, o infección por, el antígeno.
En la primera muestra que no se encuentre título de anticuerpos ≥1:64 se informa
como indeterminado y se solicita una segunda muestra.
En una segunda muestra (tomadas de 2 a 6 semanas de diferencia) un aumento de
cuatro o más veces el título de la primera muestra es indicativo de infección o
exposición al antígeno.
Una segunda muestra (cuando la primera fue indeterminada) títulos menores a
1:64 se informan como negativa.

PCR tiempo real

Recepción de la muestra
Se reciben las muestras en el laboratorio de bacteriología molecular, las cuales son
entregadas por el laboratorio de Rickettsiosis junto con un formato de solicitud de
PCR donde se integran los datos de las mismas; número InDRE, diagnóstico
solicitado, tipo de muestra, etc.

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Muestras útiles para el diagnóstico
*Sangre total con citratos de preferencia, o con EDTA si no cuenta con el anterior,
enviar un tubo en red fría, con un volumen entre 3 a 4 mL y como mínimo 1 mL.
*LCR, enviar en un contenedor adecuado, con un volumen mínimo indispensable
de 400 L y a temperatura de refrigeración 2 a 8 °C.
*Biopsias; hígado, cerebro, pulmón, bazo, riñón, ganglio o petequias en piel, enviar
en contenedor adecuado con solución salina fisiológica y a temperatura de
refrigeración 2 a 8 °C.

Registro de la muestra
Se asigna un número consecutivo interno del área de bacteriología molecular a la
muestra y se registran los datos de la misma.

Preparación y extracción de muestras

Se realiza con estuches comerciales de la compañía QIAGEN para sangre y tejidos

Muestra de sangre
Homogenizar suavemente la sangre
Pequeñas cantidades de muestras se pueden ajustar a 200 µL con agua o buffer AE.
Para obtener el paquete de células blancas (buffy coat) poner 1 mL de sangre en 2
tubos de 1.5 mL y centrifugar a 3500 rpm por 10 minutos a temperatura ambiente,
retirar el plasma de la superficie y tomar cuidadosamente la fracción intermedia, si
no se distingue tomar 200 µL de la sangre de la superficie de cada tubo y
depositarlos en un tubo limpio (en total serán 400 µL de muestra)
Un tiempo largo de incubación a 56 °C no afecta el rendimiento o calidad del DNA
Centrifugar a máxima velocidad no afecta el rendimiento del DNA
Incubar la columna con el buffer de elución por 5 minutos a temperatura ambiente
incrementa el rendimiento de DNA
Para concentrar la muestra es recomendable eluir hasta en 50 µL de buffer AE o
agua

Protocolo
1. Adicionar 40 µL de proteinasa K a un tubo de 1.5 mL, posteriormente
adicionar los 400 µL de muestra; paquete blanco o sangre de la superficie
2. Agregar 400 µL de Buffer AL y agitar en un vórtex
3. Incubar 15 min a 56 °C
4. Adicionar 400 µL de etanol y agitar en un vórtex hasta homogenizar
5. Transferir la mezcla a una columna y centrifugar a 14000 rpm por 1 min.
Descartar el filtrado y transferir la columna a otro tubo colector; repetir este
pasó 2 veces

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 6. Adicionar 500 µL de buffer AW1 y centrifugar a 8000 rpm por 1 min,
descartar el filtrado y cambiar de tubo colector
7. Adicionar 500 µL de buffer AW2 y centrifugar a 14000 rpm por 3 min,
descartar el filtrado y cambiar de tubo colector
8. Centrifugar nuevamente a 14000 rpm por 1 min
9. Transferir la columna a un tubo de 1.5 mL y adicionar 35 µL de buffer AE e
incubar por 5 min a temperatura ambiente, posteriormente centrifugar a
8000 rpm por 1 min
10. Adicionar nuevamente 35 µL de buffer AE y centrifugar a 8000 rpm por 1 min
11. Conservar el DNA eluído a 4 °C o -20 °C hasta su uso

Muestra de Líquido Cefalorraquídeo

Homogenizar suavemente el LCR contenido en el tubo, se toman 200 L y se
colocan en un vial de 1.5 mililitros. A estos 200 µL se les realiza la extracción
conforme el estuche comercial QIAamp DNA Blood Mini kit.
Al final adicionar 25 µL de buffer AE o agua grado biología molecular en la
columna, se incuba 5 minutos, se centrifuga y se repite este paso, para tener un
volumen final de 50 µL.

Muestra: biopsia
Evitar congelar y descongelar las muestras
Retirar dentro de un gabinete de seguridad la envoltura de los contenedores de las
muestras
Desinfectarlos y cambiar de guantes las veces que sea necesario
Cortar 50 mg del tejido que se va a trabajar a (si es bazo no usar más de10 mg).
Tomar la parte del tejido que se vea necrosada o afectada
La disgregación o maceración del tejido puede ser
 con Bisturí
 con mortero y con un poco de arena estéril
 con Nitrógeno
Se sugiere macerar directamente en un tubo tipo Eppendorf con ayuda de un
aplicador de madera y arena estériles, 50 mg ocupan aproximadamente la mitad de
la marca de 0.1 en el tubo de 1.5 mL, como se muestra en la imagen.

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 MARC

El cerebro se puede trabajar inmediatamente después de macerar, dejando

solamente 20 minutos para la digestión, después se procede tal como lo indica el
manual de QIAGEN.

Protocolo
1. Disgregar de 25 a 50 mg del tejido directamente en el tubo (adicionar un poco
de arena estéril) con 80 µL o menos de la solución de su transporte o agua
grado biología molecular.
2. Adicionar 100 µL de solución buffer ATL y 20 µL de proteinasa K, agitar en un
agitador tipo vórtex.
3. Incubar a 56 °C de 1 a 2 h, si es posible agitar en un vórtex ocasionalmente.
4. Adicionar 200 µL de Buffer AL y agitar en un agitador tipo vórtex el tiempo
suficiente hasta obtener una suspensión homogénea, posteriormente incubar
durante 15 min a 70 °C.
5. Centrifugar a 14000 rpm por 30 segundos para separar el tejido no digerido,
pasar el sobrenadante a un tubo limpio.
6. Adicionar 200 µL de etanol y agitar en un vórtex hasta homogenizar.
7. Transferir la mezcla a la columna y centrifugar a 8000 rpm por un minuto, si
no pasa todo el volumen aumentar la velocidad. Descartar el filtrado y
transferir a otro tubo colector.
8. Adicionar 500 µL de solución buffer AW1 y centrifugar a 8000 rpm por un
minuto, descartar el filtrado y transferir a otro tubo colector.
9. Adicionar 500 µL de solución buffer AW2 y centrifugar a 14000 rpm durante
3 minutos, descartar el filtrado y transferir a otro tubo colector.
10. Centrifugar nuevamente a 14000 rpm por un minuto, descartar el filtrado.
11. Transferir la columna a un tubo de 1.5 mL y adicionar 50 µL de buffer AE e
incubar por 5 minutos a temperatura ambiente, después centrifugar a 8000
rpm durante un minuto.
12. Adicionar de nuevo 50 µL de solución buffer AE y centrifugar a 8000 rpm
durante un minuto.
13. Conservar el ADN eluído a 4 °C o a -20 °C hasta su utilización.

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Desarrollo de la PCR en tiempo real
Reactivo crítico
Estuche para PCR (illustra PuRE Taq Ready-to-go PCR Beads) GE Healthcare,
como alternative se puede usar el estuche Taqman Gene Expression Master Mix
Applied Biosystems.
Iniciadores y sonda de Rickettsia spp
CS-F5’ TCG CAA ATG TTC ACG GTA CTT T 3’
CS-R5’ TCG TGC ATT TCT TTC CAT TGT G 3’
CS-P5’ -6-FAM-TGC AAT AGC AAG AAC CGT AGG CTG GAT G-BHQ-1-3’
74pb Detección del gen citrato sintetasa como blanco para grupo Rickettsia. Región
altamente conservada, secuencias completamente homólogas para estos iniciadores
y sonda.
Iniciadores y sonda de ARNsa P
RNaseP-F CCA AGT GTG AGG GCT GAA AAG
RNaseP-R TGT TGT GGC TGA TGA ACT ATA AAA GG
RNaseP-P FAM-CC CCA GTC TCT GTC AGC ACT CCC TTC-BHQ1

1. Preparar la mezcla de reacción, existen dos opciones (a y b): Reactivos:

Taqman Gene Expression Master Mix Applied Bio systems. Preparar en un tubo la
siguiente mezcla y posteriormente adicionar 20 µL de ésta a cada pozo

Vol. por Reacción X No.

Reactivo Vol. total (µL)
(µL) Muestras
Gene Expression 12.5
RNAsePF 10 pmol/µL 1
RNAsePR 10 pmol/µL 1
RNAsePP 10 pmol/µL 0.5
Mgcl2 25 mM 2.5
*H2O 2.5

X No.
Reactivo Vol. por reacción (µL) Vol. total (µL)
Muestras
Gene Expression 12.5
CSF 10 pmol/µL 1
CSR 10 pmol/µL 1
CSP 10 pmol/µL 2
Mgcl2 25Mm 2.5
*H2O 1.0

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*Vol. muestra: 5 µL
Si el volumen de la muestra varia se deberá ajustar la cantidad de agua.
a) Reactivos: Illustra™ puReTaq Ready-To-GoTM PCR Beads GE Healthcare.
Preparar en un tubo la siguiente mezcla y posteriormente adicionar 20 µL de
ésta a cada pozo que contiene la perla de reactivos.

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 Vol. por reacción X No.
Reactivo Vol. total (µL)
(µL) Muestras
CSF 10 pmol/µL 1
CSR 10 pmol/µL 1
CSP* 10 pmol/µL 2
MgCl2 25 mM 2.5
*H2O 13.5
*Vol. muestra: 5 µL
Si el volumen de la muestra varia se deberá ajustar la cantidad de agua.

Vol. por reacción X No.

Reactivo Vol. total (µL)
(µL) Muestras
RNAsePF 10 pmol/µL 1
RNAsePR 10 pmol/µL 1
RNAsePP 10 pmol/µL 0.5
Mgcl2 25 mM 2.5
*H2O 15

2. Llevar a cabo el siguiente programa en el Equipo 7500 Fast de Applied

Biosystems.

50 °C 95 °C 95 °C 60 °C
2 min 5 min 20 segundos 40 segundos
50 ciclos

3. Una vez concluido el desarrollo, se obtienen los resultados. La presencia de una

curva sigmoides bien definida donde se distingan claramente las tres fases de la
reacción de PCR y presente un Ct ≤41 significa presencia de DNA.
4. Una amplificación con Ct mayor a 41 se considera un resultado indeterminado,
lo que indica un bajo rendimiento de DNA que puede ser un falso negativo.
5. La presencia de una línea horizontal sin aparente curva significa la ausencia de
DNA en ese producto.

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Anexo II: CARACTERÍSTICAS EQUIPOS COMERCIALES
 microscopio binocular para fluorescencia, con objetivo de 40x, iluminación
halógena 6V/30W
 baño de agua de 37 °C
 equipo 7500 Fast de Applied Bio systems
 calentador en bloque (thermoblock)
 gabinete de bioseguridad clase II tipo A2
 agitador tipo vórtex
 agitador magnético
 cabinas para PCR
 centrífuga para microplacas
 microcentrífuga
 centrífuga refrigerada
 micropipeta
 ultracongeladores
 refrigerador
 congelador

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Anexo III: PREPARACIÓN DE REACTIVOS
PBS

Se utiliza PBS 10X comercial o se puede preparar de la siguiente manera:

Reactivo Cantidad
Fosfato dibasico de sodio 17gramos
Fosfato monobasico de potasio 4 gramos
Cloruro de sodio 85 gramos

Se mezclan los diferentes reactivos hasta su completa disolucion en agua destilada,

se ajusta el pH entre 7.2 a 7.4 con hidroxido de sodio o acido clorhidrico, se afora a
1000 mL en un matraz aforado, finalmente se filtra en una unidad de filtracion de
0.22 µM.

Diluyente de muestra
Preparación del diluyente de las muestras

Reactivo Cantidad
Albumina serica bovina 2.5 gramos
Timerosal 0.25 gramos
PBS 1X 250 mL
Suero de conejo descomplementado 2.5 mL

Se disuelve el timerosal en el PBS, se agrega la albumina hasta disolverse, se

incorpora el suero de conejo previamente descomplemntado a 56 °C durante 30
minutos y finalmente se filtra con una unidad de filtracion de 0.22 µM. Conserve en
refrigeracion hasta su uso y utilicese en condiciones de esterilidad.

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