INTRODUCCCIN A partir de los 50 comenzaron a desarrollar las tcnicas de Fertilizacin in Vitro (IVF).

En 1959 fue reportado el nacimiento del primer conejo producido por IVF. Y la primera IVF de bovino con semen capacitado en el oviducto o en tero de una vaca, pero el nacimiento del primer bovino por transferencia de un embrin de cuatro clulas en el oviducto de una vaca fue reportado por Brackett en 1981. En este experimento los ovocitos habian sido madurados in vivo y la fecundacin se realizo in vitro con semen capacitado en una solucin con alta concentracin ionica. Finalmente los primeros terneros nacidos de ovocitos maduros, fertilizados y cultivados in vitro fue reportado en 1987. Biotecnologas disponibles como la maduracin y fertilizacin de ovocitos in vitro y el cultivo in vitro de los embriones nos ofrece nuevas posibilidades para mejorar los porcentajes de ganancia genetica anual. Nuevas tegnologias aun mas potentes para elmejoramiento gentico estan siendo desarrolladas dia a dia. Actualmente se esta trabajando intensamente en la produccin de animales transgenicos que a su ves puedan ser clonados y cultivados in vitro y transferidos a receptoras. 1. PRODUCCIN DE EMBRIONES IN VITRO. La fertilizacin in vitro, que literalmente dignifica Fertilizacin en vidrio, es es un frase genrica que abarca los procedimientos de Maduracin in vitro (IVM), Fertilizacin in vitro (IVF) y cultivo in vitro (IVC), es decir los mecanismos de maduracin del ovocito, la interaccin de este con el espermatozoide en un ambiente creado en el laboratorio y el desarrollo de estos embriones hasta, generalmente, el estado de blastocito. Tambien se denominan estas tres etapas como Produccin in vitro (IVP) de embriones. La utilizacin comercial de embriones producidos por INP es an limitada por la falta de eficiencia y repetibilidad de los resultados de los sistemas in vitro. Tales sistemas deben proporcionar el ambiente de cultivo necesario para que los embriones puedan desarrollar hasta estadios preimplantacionales avanzados para su eventual criopreservacin y/o transferencia. En este punto describiremos las caractersticas de un laboratorio de IVF y las etapas principales de la tecnica. 1.1 Organizacin y manejo del laboratorio. Cuando se comienza a organizar un laboratorio para producir embriones de bovino utilizando Maduracin, Fecundacin y cultivo in vitro, una de las etapas ms importantes es la instalacin del laboratorio. a. Lugar. Un laboratorio de IVF debe tener un lugar especial en el edificio en el que esta ubicado y debe estar dedicado exclusivamente a IVP. Generalmente consta de una habitacin grande dividida con un parte dedicada al cultivo (Laboratorio de cultivo) y la otra porcion dedicada a la preparacin de medios, preparacin de semen, manutencin de materiales de vidrio, etc.

El laboratorio debe tener temperatura constante de aproximadamente 26-28C y su acceso debe estar restringido s{olo al personal que trabaja en IVP, extremando las medidas de asepsia. Esta pieza estar equipada con el incubador, lupas y microscopio invertido. Generalmente se le instalan tubos de luz ultravioleta que son encendidos en la noche, cuando el laboratorio no esta en funcionamiento. La recuperacin de ovocitos de ovarios de matadero debe realizarse en un lugar retirado de estos laboratorios para prevenir contaminacin. En el caso de los laboratorios de IVP dedicados a la produccin comercial de embriones, la obtencin de ovocitos se hace generalmente por aspiracin folicular en la manga. En este caso el laboratorio debe estar ubicado lo mas retirado posible de los corrales de dadoras y receptoras. b. Equipos. A continuaciones describen los equipos esenciales para el funcionamiento de un laboratorio de IVP. Existen gran variedad de cada uno de ellos en el mercado por lo que sealaran solamente las caracteristicas principales y su funcin dentro del laboratorio. Sistemas de purificacin de agua: Uno de los factores que ms influye en los resultados de un laboratorio de IVF es la calidad del agua que se utiliza en la preparacin de los medios. Los pirogenos y bacterias son factores importantes que influyen en los resultados de los cultivos. Exite una clasificacin del agua pura indicando el tipo: I, II y III. En IVF debe utilizarse agua tipo I que es aquella que tiene la menor cantidad de contaminantes. Estufa de cultivo: Generalmente son el centro de atencin de los laboratorios de IVP ya que en ella se fertilizan y desarrollan los embriones. Su principal caracterstica es tener control automatico de gases. Algunos poseen control de CO2, O2 y N2 y otras solo de CO2. Generalmente una estufa mantiene diferentes cultivos (ovocitos en maduracin, en fertilizacin, embriones endesarrollo), por lo que se abre constantemente. Es importante mantener temperatura y concentracin de los gases constantes por los que existen estufas con una segunda puerta, generalmente de vidrio, y adamascada estante con puertas independientes. Estereoscopios y microscopios: Estos instrumentos son crticos durante todas las etapas del manejo de los gametos y embriones: busqueda y seleccin de ovocitos, evacuacion del semen y clivaje, control del desarrollo de los embriones durante el cultivo, etc. Por lo que debe se r de buena calidad y tener diferentes aumentos. Un microscopio invertido y uno compuesto con contraste de fase son necesarios para el trabajo con semen (determinar concentracin y mobilidad) y ovocitos (determinar maduracin o fecundacin). Ademas se lo puede equiparar con equipos de fotografia y video, tiles especialmente en laboratorios de investigacin.

Campana de flujo laminar: es necesaria para la preparacin de medios y su manipulacin en ambientes expuestos a contaminacin. Otros instrumentos: Existen numerosos equipos importantes en la preparacin y almacenamiento de medios como: osmometro, peachimeto, freezer, tanque de N 2 liquido, balanza analitica, centrifuga, platina trmica, hemocitmetro, micropipetas, filtros de diferentes tamaos, heladera, etc. 1.2. Procedimiento. EL procedimiento General se puede dividir en cuatro etapas principales que comprenden la coleccin de los complejos cmulo-ovocitario, la maduracin de estos cmulos, la fertilizacin y finalmente el cultivo de los embriones. A continuacin describiremos brevemente cada una de estas etapas. a. Recuperacin de los complejos cmulos-ovocitarios (COCs) de los ovarios. Morfologiamente el complejo cmulo-ovocitario comprende el ovocito, la zona pelcida y las celulas que rodean la zona pelcida denominadas cumulus ooforus. El conjunto cmulo-ovocito es el denominado Complejo Cmulo-Ovocitario (COCs). Bsicamente podemos, obtener los COCs de dos formas: De material De matadero o de hembras vivas. Los COCs provientes de ovarios de matadero se obtienen por aspiracin del liquido folicular, ya sea con una bomba aspiradora o con una jeringa (folculos de 2 a 6 mm), o por desmenuzamiento de ovario (folculos >2mm). De hembras vivas se pueden obtener por aspiracin folicular transvaginal con ayuda de la ultrasonografa, con aguja y endoscopio o por laparotoma. Una vez obtenido el lquido folicular se realiza la busqueda de los COCs bajo la lupa, y se los lava en PBS. Luego se hace la seleccin y clasificacin y se loscoloca en medio de maduracin. La mayoria de los trabajos publicados describen y categorizar los COCs de acuerdo a la morfologa de las celulas cmulos oophorus y a las caractersticas de ovoplasma. En la siguiente tabla esta descrita la clasificacin de los COCs de acuerdo a las caractersticas de la envoltura y del ovoplasma. Tabla 1. Esquema de clasificacin para evaluar las estructuras de los ovocitos bovinos.
Estructura Envoltura Descripcin de la categora Completo, cumulus oophorus presente; ms de tres capas; compacto. Parcial, cumulus presente ya sea rodeando completamente al ovocito o parcial pero con ms de 3 capas; compacto. Expandido, cumulus presente; el componente celular Muestra expansin; cumulus celular aparece amontonado y en diferentes lugares. Desnudo, sin cumulus; ovocito rodeado slo por la zona pelcida. Puntaje 1 2 3 4

Ovoplasma

Granulacin homogenea que le da al ovocito una apariencia polvorienta; el ovoplasma llena el espacio rodeado por la zona pelcida. Granulacin en racimos o con distribucin heterogenea en el ovoplasma, puede estar localizada en el centro del ovocito dejando clara la periferia o puede estar condensada formando un solo monton de apariencia obscura en el ovoplasma; el ovoplasma llena la zona pelcida. Ovoplasma contraido lejos de la zona pelcida llenndola irregularmente; ovoplasma degenerado, vacuolizado, fragmentado, o en pedazos; zona pelcida vacia.

1 2

Fig. 1 Clasificacin de los ovocitos El xito de la aspiracin se mide por mximo porcentaje de COCs obtenidos respecto al nmero de folculos aspirados, con puntaje de 1 y 2 (Fig. 1) uno de los factores que ms influye en la calida de los COCs, es la presin durante el proceso de aspiracin, cualquiera sea el mtodo utilizado. En la siguiente tabla vemos un ejemplo de la influencia de la presin sobre la calidad de ovocitos obtenidos con diferentes presiones de aspiracin con una aguja de 17G y 57cm de longitud de ovarios de matadero. Tabla 2. Efecto de la presin de aspiracin sobre la calidad de ovocitos. Cada grupo son 30 varios. Presin de la bomba Calidad de ovocitos 100 mmHg 75 mm Hg 50 mm Hg Nmero de ovocitos Cmulo completo 36 128 147 Desnudo 170 32 18