FTOS BIOLOGIA CELULAR APLICADA

1 MICROSCOPIA OPTICA
Microsopio óptico o fotónico:
Emplea lentes de vidrio en el q se emplea la óptica y fotónico xq se emplea la luz
Sirve pa aumentar la imagen con la < distorsión posible
La luz es una radiación electromagnética visible y detectable x el ojo, oscila entre 400 – 800 nm. X
encima hay UV y x debajo infrarrojos. Pa infrarrojos hay q hacer un cambio de fase. Pa UV se hace con
fluorescencia
Si tengo materia puedo hacer la la luz incidente es dif q la reflejada o la atraviesa o dispersa. Si sabemos
lo q llega y lo q sale podemos detectar alg dato de la muestra analizada
Cuando la luz incide en la materia hay modificaciones
- Absorción (selectiva): da lugar al color. Absorbe la muestra dif λ q permite tener color
- Reflexión/ dispersión: el haz q llega se rompe, es un reflejo difuso
- Desfase: al pasar la luz x la materia puede producir un desfase. Se pueden ver estruc x el desfase
- Polarización: luz polarizada se utiliza pa hacer contrastes
Si tengo un rayo luminoso se mueve en todas las direcciones
El filtro polaroid hace q solo vibre en un plano, el desplazamiento de la λ. Ejem mov: cuerda

- Refracción: ejem: lapiz en vaso

Modificación del haz luminoso en dirección

- Difracción (interferencia)
Al iluminar una estruc, alg ptos se transforman en focos 2º, esos nuevos ptos a través de las q luz
pueden interferir con las de otros. Se consigue ↑ la intensidad de luz o ↓

Luz laser: luz monocromatica, con una sola λ. Luz coherente, todas en fase

PARTES MICROSCOPIO
- Mecánicos: alim – nobles, pa sujetar
- Opticos

- Mecánicos
El microscopio tiene una base, sobre la base hay un brazo
Sobre esta hay un sist de enfoque, platina, revolver y tubo óptico, filtro, luz, diafragma, condensador,
objetivo

- Opticos
• Luz. Está dentro del microscopio, y si se necesita ventilación en el ext bombillas 100 -150 w, 12-
20 w las normales
 La bombilla + común es la de tungsteno. Modifica el color. ↑ la intensidad del rojo pa
llevarlo al azul
 Bombilla tungsteno halógeno: incluye un gas y ↑ la intensidad
 Vapor Hg, xenon: de luz intensa, balanceada de blanco bueno, tiene ptos de max intensidad
pa molec fluorescentes

• LED: mat plástico con 2 cables de luz sin continuidad. Con voltaje ↑ la luz. Emite a una λ.
Monocromáticos
Tienen filtros:
Verde: pa imágenes en blanco y negro
Azul: corrige la coloración rojo-amarillento
Grises: se eleva al max la intensidad y al pasar al gris se distinguen > nº de colores

• Condensador
Diafragma de campo o condensador
Generan un haz de luz lo + cilíndrico posible. Si es amplio pueden entrar part de polvo y llegar +
cant de luz q la q queremos
Condensador: lente q concentra la luz en un pto de la muestra pa conseguir la max iluminación.
Debe estar a una distancia adecuada con la muestra
 Técnica Koehler: se ajusta la altura del condensador
• Objetivo: lente q permite aumentar y resolver
Clasificación.
 Aumento: 2,5 -100. 40 telescopicos pa no romper la muestra
 Correción aberración, aberración cromática
 Correción aberración esférica
 Aceite

 Correción aberración cromática

Cada λ se dobla de forma dif x el cristal, x eso desdoblamos la luz
Al enfocar si está coloreado de verde se pierde diferenciación en coloración verde-azul, está
desenfocado. Pa ello se utilizan obj pa corregirlo q son:
o Acromático:- enfoca solo 2: verde y azul
o Fluorita correción
o Apocromático: + corrige los 3

 Correción aberración esférica: los focos marginales y paraxial tiene dif focos
Al mirar x los 2 oculares, el borde de la preparación está desenfocado con respecto a los
demas
Pa corregir se utilizan obj planos
Información objetivo
PLAN: lente plana
APO: apocromático
∞/ 0,17: grosor cubre
WD 0,21 dist trabajo: dist entre muestra y objetivo

 Aceite: entre la lente + baja del objetivo y muestra se utiliza un aceite

• Ocular: aumenta entre 10-20 veces

• Resolución: capacidad pa el ↑ ver 2 ptos prox como entidades separadas. Sucede x fenómenos de
difracción

AN (apertura numérica): cant de luz q capta el objetivo

AN= n. sen o
n: indice refraction > con aceite de inmersión pa abrir el ángulo
resolución: nos interesa q sea la < posible
poder de resolución: a + peq la r
r aumento AN
1,34 10 0,25
0,83 20 0,40
0,51 40 0,61
0,26 100 1,3-1,4 oil

Ejem:
Tf= TR. Obj, FO. AMP
FF= 2. 20. 2,5. 15= 1500 µm
FO: x delante de la cámara hay un ocular
TF= 2. 100. 2,5. 3= 1500 µm
20x tiene r 0,83 x lo q no puede resolver ya q están a 0,5 µm
El objetivo ↑ y resuelve. Si amplificas solo amplias, no resuelves
TIPOS MICROSCOPIOS OPTICOS
- Simple: un lente entre muestra y ojo
- Comp.: 1 o + lente
Se dif entre nº de lentes entre muestre y ojo

- Comp.:
• Estereoscopicos/lupas
• Simples/obj común

• Estereoscopicos
Trabajo bajo ↑ 2-50 aumentos
No hace inversión de imagen
Distancia de trabajo grande
Tiene 2 obj x lo q cada una ilumina un ojo

• Simples
Aumenta 25-50 hasta 1000
Dist trabajo peq 0,1-2 nm
Inversión de imagen
Solo hay un objetivo. Se ve x los 2 ojos xq hay un prisma

- Imagen analógico
Alg microscopios no tienen
Puedes ver tu imagen con tus propios ojos

- De campo claro
Se ve un campo con luz
Pa muestras con mucho contraste

- De campo oscuro
Filtro cuya parte central es opaca
No puede entrar la luz si no hay muestra
Con muestra al chocar contra ella la iluminación
Se ve un campo negro y la muestra iluminada con fondo oscuro
Una variante es Reinberg. El filtro es coloreado, la zona ext de un color y la int de otro. Si no pongo
muestra veo el fondo de color verde
Si pongo muestra es naranja y con fondo verde

- De polarización.
Si los filtros van en fase, el 1º polariza y el 2º pasa la luz. Se desfasan y siguen, pasada de luz
Si el 2º está cambiando el sentido no pasa la luz
Si desvía el plano de polarización el mat es birrefringente. El 1º filtro es polarizador y el 2º
analizador, permite ver o no la muestra

- Contraste de fases
Al atravesar la mat la onda puede tener un retraso y se produce un desfase
Este transforma los desfases en dif lumínicas.
• +: fondo claro y obj oscuros
• -: fondo oscuro y obj iluminados
Permite observar las cells sin teñirlas
Tiene poca resolución xq genera una estruc q es el halo de fase
Asociadas a la óptica invertida. Obj e iluminación cambian de posición

- DIC (contraste x interferencia diferencial) o Nomaski

Poner en evidencia interferencias
Poner en evidencia dif índices de refracción
 Se transforma en dif intensidades de luz, y genera una imagen q se llama pseudoralieve
Si pongo una estruc de 0,2 nm. Si se ilumina de lado la sombra es > q el obj y se ve
Se pueden ver estruc q de otra forma son imposibles de ver
Se asocia a cámaras de ↑ resolución
Pa observar secciones coloreadas y sin colorear, cultivos dnd se gana resolución y no existe el halo de
fase
Son caros
Emplea luz polarizada, y prismas de Wollaston
• Variante M de Hoffman:
Es + barato xq en vez de llevar óptica de Nomaski, lleva 2 placas (filtros)
Permite analizar muestras de plástico, útil pa cultivos

- Fluorescencia
Anticuerpo q al ser iluminado con luz UV emite rayos de luz
Al ser iluminado con una λ emite una λ >. Si λ2 es > λ1 mejor. Se utiliza pa infrarrojos, UV,
fluorescencia
Lleva 3 filtros: 2 filtros barrera y filtro divisor de haz
Quiero un fluorocromo q se excite a 500 nm y emita a 600 nm
La luz tiene q ser monocromática
Toda λ < 550 la refleja y > 550 atraviesa. Pongo el filtro barrera q deja pasar solo 600 nm
Si no hay fluorescencia el fondo es negro
Si hay fluorescencia solo pasa la de 600 nm y la luz correspondiente se ve iluminada y fondo negro
La + habitual es tener ligado un fluorocromo a un Ac, si se ve una luz es q está unido a un Ag
Si se emplea una molec se una al Ca el FURA-2. una vez ligado se hace un cambio conformacional y
se ve verdoso xq emite luz
La GFP al iluminar fluorece. Se puede aceptar el gen de la GFP a la del gen q quiero. Al iluminar veo
dnd va esa pot en la cell.
La fluorescencia tb puede emplearse en otras técnicas:
FRET, FLIP, FRAP
FRET: si tengo una fluorocromo y quiero ver si interaccionan, los tengo q marcar con fluorocromos
coherentes. Si λ q emite uno es captado x el otro. Si cuando emite con luz veo la otra estarán muy
próximas
Si emite luz solo capta una, no están asociados

- De imagen digital
Tienes q digitalizar espacio y luz
El espacio se digitaliza partiéndolo en peq partes q son pixeles, no tiene tamaño fijo. El voxel es
volumétrico, se hace una muestra, tamaño de pixel y altura q le hemos dado
r= 300 ppp (pixel x pulgada)
Si el ojo ve a 200 µm y con 300 de resolución, no puede ver el pixel xq se ve a 85. xo si la resolución
es a 100 es 254 µm/pixel x lo q lo veo
Al ampliar se ↑ el tamaño de pixel x lo q ↓ resolución, no ↑ el nº de pixel
Cuanto < nº de pixel la imagen pesa +
Luz B/N
Color RGB (rojo, verde, azul)
CMYD (cian, magenta, amarillo, negro) tb blanco
8 bit 1 Byte
1 bit es una posición del sist binario, 2 valores

Si se parte de un pto negro hasta un pto blanco, cuando parto la luz en 156 tramos
Al ↑ los bits se frag en 256 niveles de luz
Pa formar la imagen, el pixel le aplico un nivel de gris y se obtiene la imagen
Color
RGB 28. 28. 28 = imagen de 3B
Multiplica las posibilidades de cada color, el peso es + grande. Cada pixel lleva un nº de bit y el
CMYK
 Se emplea sist binario pa evitar errores q se producirán x un sist decimal ya q el binario solo lleva 2
opciones 0 o 1

- Confocal de barrido
Trabajan con imagen digital
Se barre la imagen x ptos hasta formar la imagen pixel a pixel
Se trata de hacer lonchas a la muestra o secciones ópticas
Lente confocal, una deter la posición de la otra
El confocal solo capta la luz q sale del pto de max iluminación, elimina la zona de arriba y debajo de
fluorescencia, barre la imagen solo de una sección sin cortar en deter muestras

- Multifotónico
En el M confocal el trabajo con fluorescencia y discrimina arriba y abajo, se producen esp reactivas
de oxígeno q cambian la muestra
En el multifotónico, si hay pulsos peq de luz. Si la [] de fotones es suficiente
Solo pa estimular la molec fluorescente, solo aparece fluorescente el pto de max iluminación. La luz
q detecta solo proviene de un pto y abajo. No hay luz de arriba. No es confocal. Es de barrido
Se utiliza pa muestras vivas

- Deconvolucion
Se acopla una platina con motorizacion preciso pa poder hacer ligeros desplazamientos. Se hacen
fotos x cada mov de la platina
Se aplica con el neg de deconvolucion. De las imágenes barre lo q no cree q es de la imagen (ruidos
de fondo) y lo monta proyectándolos todos juntos en un plano
La imagen es como la del confocal xo + barata

- 4ª dimensión o videodigital
Se mueve en el espacio, hace barrido en el eje X, Y, Z y en el tiempo se puede volver a repetir
Es uno microscopio DIC/hof con cámara de ruidos. Con sist de motorizacion y un software de
tratamiento de imagen
Se toma una imagen, se analiza, se obtiene una máscara y a partir de ella se suavizan las formas
La tecnología DIC permite ver ciertas estruc

- De captura laser
Microdisector, sist de disección microscopica
Se pretende obtener tipos cells puros sin contaminación
• Fusión: pongo encima del porta una sección. Pongo un plástico y con laser caliente, se funde y
penetra. Con pinzas levanto y uno llevo dnd el mat plástico hay penetrado
• Ablación: el plástico encima del cristal y tej. Con laser quema atravesado sección y plástico. El
último pto se queda sin quemar
Se pega un chorro de luz y desde abajo. Se levanta, cojo con tapa de tubo eppendorf y doy un
golpe pa q salte
Permite aislante específico

PREPARACION DE MUESTRAS MICROSCOPIA OPTICA

Montaje completo o total
- Secciones: procesado de un tej entre 2 cristales
Fijación
Inclusión
Corte
Tinción
Montaje

- Completa: estruc delgadas con mucho contraste

Ejem: ala de mosca o escama

PROCESADO DE MUESTRAS
- Fijación:
 Su obj es preservar. Las cells mueren, xo se intenta q una vez muerto se parezca a la realidad
Imagen real
Imagen equivalente es la q se obtiene a el micro
Es muy variado, depende de lo q se busque, a tiempo, productos y modos. Depende del objetivo y el
material
Parámetros
• Velocidad de penetración (físico) como penetra a el mat
E = k t (tiempo)
K: velocidad de penetración
0,5 – 1,5 mm/h
1mm/s formol fijador universal
Sirve pa calcular el tiempo q tiene q estar fijando

• Velocidad de fijación
Como reaccionan las molec de la muestra y del fijador
OsO4: oxido de osmio.
↓vel penetración las piezas deben ser peq
↑ vel fijación y se tendrá pco tiempo
Si la vel fijación es ↑ la pieza puede ser + grande o peq tb
↑ vel fijación pco tiempo

- Coeficiente endurecimiento
Capacidad endurecimiento de un fijador
> a + densidad. Si la deshidrata mucho tendrá > endurecimiento
Al corte se astilla el mat y es imposible x su endurecimiento
Cuanto + alcoholes + endurecimiento

- Variaciones de volumen
Se puede provocar si no es isosmótico, retracción o hinchamiento
Se debe ajustar la p osmótica del fijador a la sangre del animal en cuestión
Varía entre 300-340 mOsm q es lo mismo q 9% NaCl

- Efecto mordiente
Efecto preparativo pa dar un paso post. Se prepara pa la tinción final normalmente

TIPOS FIJACIÓN
- Fin perseguido
- Agente fijador
- Procedimiento q se sigue en la fijación

- Fin perseguido
• Fijación histológica
• Fij histoquímica

• Fij. Histológica: pa estudios estructurales

• Fij. Histoquímica:
Pa deteción bioq: busca molec como ARN, almidón, glucógeno
Se buscan act enzimáticas y q se vea si son funcionales

- Ag fijador
• Químico
• Físico

• Químico
 Solución simple: soluciones acuosas o alcohólicas
la + universal formol 10% o etanol 70%

 Mezcla: 3-4 comp. Llevan el nombre del q lo descubrió como Bouin, Zenker, Altman
 • Físico
 Calor: se usan microondas pa acelerar la fijación química
 Frío
o Criofijación: + usado. Se fija x frío. Se para la act biológica
El hielo debe ser amorfo, no cristalino xq se formarían agujas y se rompe el mat. Se
hace rápidamente. Tb se trabaja con isopentano a -50ºC. El N liq es + rápido
o Criosustitución
o Criodesecación: el hielo lo pasamos a gas. Liofilización
o Criosustitución: se congela muy rápido
La mezcla se sustituye a las molec de agua q hace de fijador

- Procedimiento
• In Toto, in vivo: agitar los 1º min de la fijación. Se fija directamente. A vel suficiente
• Perfusión: sustituir sangre x liq fijador. Según sale sangre entra el fijador hasta cells peq x
capilares y en el momento justo
 Transcardial: pa esponer el corazón se rompe el diafragma y costillas, el pulmón se para y no
respira, los tej empieza a morirse. Alg canulan la tranquea con respiración artificial
Se pone una canula q va conectada a una bomba
Se empuja fijador x la aorta q empuja la sangre
Se corta la AD dnd sale la sangre de forma q se sustituye sangre x fijador. El fijador está a
42ºC pa q no se provoque constrición de vasos, se añade heparina pa evitar la formación de
trombos, se añaden colorantes pa ver si se ha fijado bien
Con La bomba peristáltica se simula el bombeo del corazón de forma q los vasos no hagan
espasmos. El animal se pone rígido
Se puede hacer solo con org individuales

- Inclusión:
Le da rigidez a al muestra pa poder hacer cortes muy finos
• Inclusión propiamente dicho
• Enclaustramiento: si el mat penetra dentro de muestra se le dice q es incluir (dura mucho tiempo)
Si el mat utilizados: ceras, plásticos y resinas
Pa MO cera y plástico. ME plástico y resina dan > rigidez
Paraplast: cera y plástico

 Congelación: inclusión y fijación son simultáneos

Tb se puede fijar con ag químico y luego crioproteción y congelar
La crioproteción es pa q no se formen cristales largos y no se rompa
Se introduce la pieza en un liq sacarosa glicerol (30%), DMSO, etilenglicol
La pieza se introduce, queda flotando y al hundirse ya está introducido, de forma q no se
forman cristales. No desecan

 Otros procedimientos
Inclusión en celoidina y gelatina
Se pone una gota de gelatina, se incorporan pa q no se pierdan pa muestras peq
Celoidina pa piezas de celoidina + alcohol eter. Se deja penetrar y evaporar
Queda una esp de plástico

- Corte
Pa obtener secciones delgadas q puede atravesar la luz
MO: 30-5 μm. Los típicos de 8-10 μm
Se llaman microtomos los ap q lo cortan
• Rotación (Minot)
• Deslizamiento
• Congelación
• Vibratomo
• Desgaste

• Rotación: se rota una manivela

• Deslizamiento: se desliza de delante a atrás. Pa grandes piezas
• Congelación: pa piezas congeladas
 Clásicas: se descongela la muestra
 Criotomos: se mete una rotación en una manera en el q se controla la Tª
Se cortan lonchas peq

• Vibratomo
La cuchilla va vibrando pa cortar mat blando. No se utiliza la inclusión
Se corta mojado en un tampón. El mat puede ir fijado o no
No permite hacer cortes demasiado finos 25 μm

• Desgaste
Se utiliza pa biomat: plásticos, cerámica, titanio textil. Mat q está en contacto con el org
Se lija con un disco hasta dejar una sección fina
Se ve el tornillo y el tej
2 MICROSCOPIA ELECTRONICA
Pa mejorar la resolución se ↓ λ. Si se trabaja con e se ↓ λ.
0,61 .λ
r =
AN
Hay pantallas q son sulfuro de zinc q al incidir los e se una fluorescencia ya q los e no los veo
Un e con + vel lleva – λ asociada
150
λ=
v
Pa arrancar un e se necesitan 60000 v y se consigue v=0,1 A teoricamente. La vel es una 3-5 A. No se ven
at xo si molec de cierto tamaño
Inciden e 1º en la mat, el e puede arrancar e de la mat q son 2º. Se utilizan pa formar imagen
Se utiliza el M de barrido o SEM, MEB
Si La muestra es delgada puede atravesar y lo transmite la muestra es la q se llama MET de transmision
Si los e 1º revotan son e retrodispersados o q se genera una emisión de rayos X q se utilizan pa análisis
cuanti o cualitativos
Se utilizan M microanalítico, siempre va formando parte de MET o SEM

TEM (M electrónico de transmisión)

Los e se transmiten a través de la muestra
Se hizo en el 36
Pa estudiar ultraestruc tisular y cellar
Ultraestruc pa tec de ME
Tiene una columna cilíndrica hueca
Es la parte sup tiene un filamento q conectada a una fuente de alto voltaje de e. Tendra bomba bomba de
vacio 10-6 y sist de transformación de alta tensión
Se utiliza bomba de vacío pa q los e no choquen con el aire y no se desvien
Tiene placa o pantalla fosforescente q llega imagen al llegar el e
Si no llega no forma imagen
La columna tiene un inyector de muestras. Alrededor del cilíndro hay lentes electromagnéticas q son
análogos de lentes de MO
El inyector de muestra, de forma q hay solo una parte del cilindro q se descomprime pa q no se pierda el
vacío de todo, se introduce y se vuelve a hacer el vacío
ME no tiene cristal de bombilla solo filamento xq los e no atraviesan el cristal
Tengo una sección delgada de muestra de 60 nm. Pa colorear una estruc
La mb tiene 2 capas oscuras y una clara. Pa teñir se utilizan molec pesadas. Al impactar no van a poder
pasar. Si se utiliza osmio solo se pone en las zonas polares
Los e rebotan
Dnd se ve oscuro no pegan los e en claro si
Siempre la imagen está en blanco y negro. Si se pone color es coloreado

ALTO VOLTAJE (HVTEM)

Si acelero un e con dif voltaje no le da tiempo pa acelerarse y q se meta xq no le deja q alcance ↑ vel pa
atravesar muestras + gruesas
Este M si deja el espacio. Trabaja pa secciones gruesos. Tienen 6 nm

SEM/MEB
1965
- perdida de PR q el M de tranmisión
Puede trabajar desde muy pocos amplificaciones a altas
Se utilizan e 2º: e arrancados a la muestra. X esto a las muestras se las recubre de una fina capa de metal
(pa arrancar los e)
Obtengo una replica perfecta de la muestra x barrido con haz de e
X la rugosidad de la muestra. Relación directa entre pantalla y muestra
El pto + luminoso es dnd + e pegan
↑ versatilidad. Insecto-virus
↓ PR r= 30 A

M MICROANALITICO
Se forma um dispositivo q permite hacer microanalisis. Hace análisis cuanti y cualitativos
Nos dice at q tengo y q cont. Se acopla a M de barrido y transmisión
Detecta el patrón de rayos X q se utiliza cuando se bombardea la muestra
EDS (E dispersa X-ray spectroscopy)
Funciona bien com nº cuantico de 5 o >
Bombardeo com e

MÉTODOS DE PROCESAMIENTO DEL MAT PA SU ESTÚDIO AL ME

- Tec rutina TEM
- Tec rutina SEM
- Sombreado
- Criofractura
- Tinción negativa
- Criomicroscopia e
- Estereomicroscopia

- Tec rutina TEM

• Fijación: de alta calidad. Se perfunde normalmente y se fija 2 veces, fijación y postfijación. El
glutaraldehido fija prot, es + estable y + rápido al 3%. Se lava y se postfija con OsO4 pa lip y tb
contraste la muestra
• Inclusión: se utiliza un mat duro como resina sintética comp x resina, acelerador y endurecedor.
La resina es la q polimeriza, acelerador y endurecedor ↑ rapidez y rigidez. Se utiliza
ARALDITA, lovicril y EPON. Se puede utilizar calor pa acelerar
• Corte: han de ser muy delgadas pa q puedan ser atravesador x e. Se hace x ultramicrotomo. De
600 A. El sist de corte son cuchillas de vidrio o diámetro
• Montaje: se monta en una rejilla, son discos con 3 nm de diámetro de niquel o Cu. Su int es una
rejilla de ≈ 150 agujeros. Se coje un corte y se pone sobre la rejilla
• Tinción: se tiñe con metales pesados como citrato de Pb y acetato de uranilo

- Tec rutina SEM

Pega una capa de metal x encima de una muestra
La capa de metal tiene q ser muy fina
A este se le llama metalizado
El 1º prob es la contaminación x sales o restos de cualq otro metal
Si queremos observar estruc int hay q romper la muestra de forma q se artefacta (se rompe)
El procesamiento de secado puede dar lugar a grandes alteraciones, pa evitarlo se hace el
procedimiento de secado al pto crítico pa no causar distorsión. X la variación de densidad causa las
alteraciones x lo q hay q evitar la dif de densidad
Si pongo una muestra en liq, si el liq lo paso a gas no habrá variación de densidad
El liq es especial, es CO2 o liq refrigerantes
Se pone en CO2 liq y una vez empapado se ↑ Tª y p. 39ºC y 80 bares
En un pto deter la p es 0 (se mide contra la pared). Si hay una peq burbuja al presionar sobre ella se
encoge hasta q se cierra. Se puede cerrar la muestra arrugándose
Una vez está la muestra seca, se metaliza x metalizador. Tengo una peana dnd pongo la muestra y
arriba un filamento de Au o oropaladio q se somete a alto voltaje. La peana es giratoria pa q el Au
impacte x toda la muestra. Los e rebotan. Se realiza el vacío

- Sombreado: metalización parcial con MET con muestras de peq tamaño, virus, prot
 Tenemos una superficie de mica dnd pongo prot
El filamento no está encima, está a un lado, los haces de Au van de lado pa generar sitios de sombra
x lo q obtengo metalización parcial. Le pego una fina capa de C contínua. Si quiero eliminar la parte
orgánica se desorganiza x ser discont. Con el C actúa de estabilizador de forma q mantiene la
continuidad y cohesión
Se disuelve el mat biológico q tiene replica metalica, le pongo sobre rejilla de Cu dnd la observación
es con MET
Los e dnd no hay Au se ve blanco, dnd hay Au rebotan e y se ve oscuro. Se ve una parte con luz y
otra con sombra

- Criofractura: pa observar mb biológicas

Al fracturar se golpea la estruc, si está congelado se produce fractura con el plano de fractura dnd se
limitan las 2 capas lipídicas de la mb
Se utiliza pa análisis de mb
IMPs: son prot intramb. Estas part se asocian y forman agregados. Se emplea pa deter prot de mb.
Una variante, el mat biológico se degrada
Se hace una peq digestión
Se emplea una técnica inmunocitoquímica

- Criograbado (freeze-etching)
Se quiere generar relieve. Pa estudiar frag de cells tridimensional
La parte de mat congelado. Se hace sublimación pa evaporar hielo de sólido a gas. Expongo al aire.
Se sublima en cond de – 115ºc a 10-7 bares. 1 mm/seg
Hay dos tipos: normal – exponemos a 100 nm
Profundo (deep)- µm
Se hace grabado y sombreado y estabilización

- Tinción negativa
Negativo se deja la muestra sin teñir, y el fondo es oscuro
Si tengo una prot apoyada en sustrato, se le cubre con mat. Se deja evaporar, si tiene sales metálicas
(acetato de uranilo, o ac fosfotungstico) a ↓ agua los metales se depositan en las recovecos
Si se observan en MET. Se pone peq capa de plástico en la rejilla pa pegar la prot
> resolución q el sombreado

- Criomicroscopio electrónico
Se trabaja con 2 tipos de muestras
• Cortes/secciones
• Solución: estruc subcellar o cells peq

• Cortes/secciones
Se congela el mat y se corta en un crioultramicrotomo. Se pega a rejillas q van tb a bajo cero, se
mete a criotransfer a microscopia cuya columna tb está congelado

• Soluciones
Rejilla con solución. Se elimina la gota tan grande. Se pone en vertical con papel de filtro y dejar
escurrir pa q quede capa + peq y se congela.
Se mete a criotransfer y se observa al microscopio
Hay bastante ruido de fondo, se hace mucha fotografía y se decunvoluciona la imagen con un
programa
Es rápido
CEMOVIS (microscopio crioelectrónico)

- Estereomicroscopio electrónico
Recomponer 2 imágenes pa tener tridimensionalidad
Se hace mov de la rejilla y se obtienen imágenes. Al recomponer se tiene sensación de 3D
No se usa mucho
3 MICROSCOPIOS DE BARRIDO X SONDA (SPM)
La resolución depende de:
Delgadez de la sonda y barrido (desplazamiento)
Los mov de nm depende de:
Plazoelectricidad: cambiar e mec en eléctrica o al revés
Son muy sensibles
Se acoplan a sondas o dnd está la muestra
Permiten desplazamientos de nm. Se cambia e electrica en distancias
No hay lentes

- STM (microscopio de efecto tunel)

Se utiliza pa muestras q pueden ser cargadas. La sonda y muestra tiene q estar cargada
Ajusta la sonda a la muestra a una dist deter. Empiezan a saltar e y detecta un potencial
La ext tiene relación directa con potencial
d=v
Se empieza a mover sonda o muestra, la dist varía, o cae el pot o sube
Se mueve y se vuelve a ajustar el pot pa q sea cte. Los empujones de carga se transforman en dist. De
esta forma se dibuja una imagen
Efecto tunel xq hay saltos

- Microscopia de fuerza atómica

La interación es la fuerza de interación atómica. Se trata de acercar la muestra tanto pa atracción
(Van der Waalls) o repulsión (Lehnard Jones)
Se pone la muestra en un cantilever o fleje. Permite el desplazamiento de la sonda
Mediante laser ilumino el cantilever e ilumino la muestra. El detector impacta en la sonda. El rayo
pega en el mismo sitio x lo q sube y baja el piazoelectrico
Se calcula el impacto pa ver imagen
Hay varios modos:
Intermitente: la frec la detecta el laser. En func de la variación de la frec dibuja la muestra

- Microscopia de fuerza magnética

La sonda funciona como ion. Se acerca a la superficie q quiera analizar
Si hay magnetismo en la muestra se atrae o repele
Se ven variaciones en el cuerpo magnético
Variante SP-STM spin polarizad
La sonda va cargada
Cuando el campo y la sonda son coincidentes el salto de e es >
Se detectan las variaciones y tendremos una placa magnética de la muestra

- SNOM (Microscopio óptico de campo cercano de scaning)

Dist de la muestra y obj
Se separan entre muestra y estruc q capta la luz es + peq q el rango de la luz visible
X fenómenos de difracción los 2 ptos actuan de fuente de emisión de ondas, hacen interferencias
Se hizo una estruc q esta x debajo de la dist, elimna la fuerza de difracción q afectan a la resolución
La dist de grosor de la sonda tienen q ser < q la λ q estamos utilizando pa evitar intervenir y generar
resolución
Se hace barrido
La sonda lleva una fibra de vidrio en el int y envuelta de aluminio
Si la muestra tiene rugosidad puede llevar un cantilever
- Microscopio acústico de barrido
Se utilizan ondas acústicas
Se trabaja 106 c/s  MHz. Funciona mejor en sólido q en aire
Se trabaja en 107-109 Hz
En MO

El poder de resolución de una y otra son parecidos

El acústico se utiliza en vivo y en directo
Tiene 4 partes:
• Pulsador
• Transductor
• Focalizador
• Acoplante

• Pulsador
Genera descargas de pca intensidad, con pulsos peq se reciben sobre el
• Traductor xq transfiere E eléctrica en mec q es una lámina de Zn. Se envia al
• Focalizador q es un cristal de zafiro con una concavidad. Las ondas q se generan se focalizan en
un pto deter dnd está la muestra
Hay 2 tipos de sist:
 Eco: el sist q produce el ultrasonido tb la recibe
 Directo: se pone otro sist debajo y se cogen las ondas q llegan
• Acoplante: facilita la transmisión de ondas, es un hidromel

RESUMEN (los + importantes) (tipico de)

- AFM: la preparación de muestras es peculiar. Se utilizaba pa estruc sueltas. Si se utiliza pa secciones
se incluyen en resinas o plásticos cortados (MET) en ultramicrotomos (MET)
Una vez quitada la resina hay q secar a pto crítico (MEB) y el montaje es en un porta (MO)

- SNOM
- Acústico
4 INMUNOTECNICAS
Tec dnd pa levarlo a cabo se utilizan Ac
Permiten:
- Hacer estudios de deteción: si hay o no hay
- Distribución. Dnd está
- Cuantificacion: cuanto tengo
Normal o semicuantitativa (tratado contra control, sin unidades) Ejem: 2 veces mas

Ag: molec q interacciona con un Ac

A cada sitio de una molec dnd se puede interaccionar Ag/Ac con ella se le llama determinante
antigénico o epitopos
Deter Ag iguales: polivalente
Deter Ag dist: multivalente
Si son molec peq no responde al sist inmune, se acopla a otra molec pa q sea visible
Se pueden obtener Ac pa cualq molec Ag

Ac: molec q se une a Ag

γglobulina: con electroforesis posición γ. La >ria son inmunoglobulinas xo alg no lo son
IgG: tipo especial de Ig
Ig

CARACTERISTICAS
- Afinidad
- Avidez
- Especificidad

- Afinidad:
Vel de interación entre Ag y Ac. Afinidad si Ac enseguida interacciona con Ag
Nos dice el tipo de incubación y la cant de Ac
Ac de ↑ afinidad – dosis y – tiempo incubando
Ac de ↓ afinidad + dosis y + tiempo incubando
[ Ab / Ag ]
Ka =
[ Ab ][ Ag ]

- Avidez: nos dice la estabilidad de la unión. El Ac tiene q ser la + avida posible ya q se hacen muchos
lavados
Hay 3 parámetros q lo deter:
• Afinidad: ↑ afinidad > ↑ Avidez
• Valencia de unión: alg Ac tiene 2 regiones de unión, a + valencia + unión
• Ordenación geométrica del deter Ag: si los deter están juntos pueden interaccionar los 2
Si están lejanos los 2 tienen – posibilidades de interaccionar

- Especificidad (IMP)
El Ac es específico si interacciona solo con un Ag. + de 1 es reactividad cruzada
Si tengo una muestra hay una señal q tengo q saber si es la q busco. Se desarrollan controles de
especificidad
AC MONOCLONALES Y POLICLONALES
Cada linf es dif y cada uno produce un tipo dif de Ac
Al poner un linf con un Ag, hay un linfocito q segrega el Ac perfecto para ese Ag
El Ac es policlonal xq reconoce el Ag
Si se ponen en tubo Ag y linf se segregan Ac perfectos pa ese Ag
Si los linf son = y producen el mismo Ac. Producen Ac monoclonales

TEC PA OBTENER AC MONOCLONALES

Se inmuniza a la rata pa q ↑ la cant de Ac pa responder contra el Ag
Cogia un linfoma (tumoral) estos linfocitos los une pa q sean inmortales. Las cells solo crecen en medio
selectivo. Las mb se fusionan
Los linf normales mueren, solo sobreviven hibridomas
Se seleccionan las cells pa garantizar su soledad q es clonación x dilución límite garantiza q en un pocillo
solo hay una célula. Le garantiza q todas las cells son derivados de un mismo progenitor

TEC POLICLONAL
Se trabaja con conejo o cabra pa sacar > vol de sangre
Se inmuniza en 3 dosis pa generar un gran nº de cells q responden contra el Ag
A los 3-4 meses tendrá un vol generado de Ac. Se obtiene pl se purifica en columna y tendremos los Ig q
interaccionan con el Ag
A veces funciona el pl sin purificar, el Ig de 97% de Ac están dirigidos contra el Ag

HERRAMIENTAS Y MODOS DE PROCEDIMIENTO

Tenemos Ac y una señal q tenemos q poner en contacto con el Ag, han se acoplarse específicamente
- Ac 1º: se une al Ag. Es un método directo y no es usual
Tenemos actina humana sint en cabra q es el Ag y tenemos Ac de cabra anti actina (se distingue en la
cola)
Ac 1º de cabra anti actina humana

- Ac 2º
Reconoce el 1º. Reconoce a la región cte. Ac 2º de rata anti IgG cabra

- Ac 3º
Reconoce el Ac 2º. Si el 2º es de cabra el 3º tb
Normalmente se vende 2º y 3º unido como 2º

- Marcaje
Tipo de señal q se incorpora al Ac
• Enzimático
Si a la enz le pongo un prod inicial se transforma en prod final q lo hace visible
La enz q + se usa es la peroxidada. Tb fosfatasa alcalina y B galactosidasa q rompe azúcares
La sust es DAB (diaminobenzidina) al añadir peroxidada se produce un precipitado marrón
insoluble de forma q sabré q está mi Ag
ABTs de color verde
AEC de color rojo
CN de color azul

 Ventajas e inconvenientes
Fácil de hacer y barato
Dobles y triples marcajes
Se añade un colorante q podría alterar 2 señales una la del Ac y la otra x act enzimática
endógena. Se inactiva la act enzimática endógena pa q no se mezclen los marcajes y nos
equivoquen. Con H2O2 3% se elimina y solo obtendré marcaje
Variante enzimática

• Variante enzimática: quimioluminiscencia

El prod inicial se transforma en prod final q emite luz
Sensibilidad 100 veces >
+ tediosa xq se trabaja con papel fotográfico
  PAP (peroxidada anti peroxidada)
La enz es peroxidada. Se utiliza Ac q lo reconoce. Lo lleva el Ac 3º

 ABC
El Ac 2º va biotinado. La avidita se une a biotina. Pa interaccionar con peroxidada lo uno a
avidita. De esta forma se marca la enz del Ac. Este sist se suele utilizar pa amplificar la señal
ya q se unen muchas peroxidasas a un solo Ac

• Marcaje x fluorescencia
Se ilumina el fluorescente con luz y emite luz al excitarse. Se pone el fluorescente en Ac 2º
↑ sensibilidad
Posibilidad de marcar con varios fluorescentes
Se utiliza microscopio de fluorescencia
Se emplean molec pa fluorescencia (fluorescentes) como fluoresceina (verde), rodamina (rojo),
DAPI (azul)

• Radiactivo
+ sensible de todos
Caro y peligroso
Se puede utilizar marcando Ag o Ac
Marcando Ag se hace RIA
Marcando Ac: se utilizan marcadores. Se añade leucina tritiada q se unen a Ac

• Marcaje con Au coloidal

Pa microscopio electrónico
Se acopla una esfera de oro al Ac 2º
Los e no atraviesan la esfera x lo q si veo ptos negros q me dicen dnd está el Ag q busco
La esfera q se puede acoplar puede ser dist entre 5-40 nm

• Sonda enzimática
Se quiere detectar la presencia de Ac en caso de alergias
Se pone el Ag y se le pega una enz. Dnd hay señal está el Ag
Se prepara una placa ELISA y con suero en la placa del paciente. Se incuba con Ag y E. si tiene
alergia el Ac retiene Ac y E y habrá señal
Tiene riesgo xq le produce inmunidad con posible reación alergica

SIST PROCEDIMIENTO
- Ensayo captura de Ac
Se pegan los Ag y se incuba con Acs. Se capturan el Ac mediante el Ag q está fijado

- Ensayo captura de Ag
En fase solida está el Ac y en la liq Ag. Obtengo señal

- Ensayo con doble Ac

Se pega un Ac, incuba con Ag y ahora incuba con Ac q es = o dif
Tengo Ac y señal
Se añade Ac 2º de dist especie pa q se una específicamente el Ag

ESPECIFICIDAD Y CONTROL DE LA ESPECIFICIDAD (Imp)

Mec pa asegurarnos q la tec está hecha correctamente
Hay q hacer pruebas q demuestren q:
- Nuestro mat emite señal endógena
- No especificidad de los Ac

BLOQUEO
- Pa act endógena
- Pa sitios de unión inespecífica

- Pa act endógena
Pa fluorescencia
 Tengo 2 enz endógena y exógena. Tiene una molec de fluorescencia
En el marcaje enz se bloquea la enz q se utiliza después. En fluorescencia

- Pa sitios de unión inespecífica

En Western blot
Se emplean Ac (prot) si se pegan bien los Ac tb se van a pegar, se evita q los Ac se unan en las zonas
intermedias. El prod q tapo es gelatina, albúmina, blotto buffer (leche en polvo desnatada), sueros
preinmune (se coje sangre del animal y con suero se bloquea, al animal no se le ha inmunizado)
Se puede utilizar suero preinmune en el q se sint Ac 1º. Si se hace en cobre bloqueo los sitios de
unión inespecífica. El 1º tb es de cabra. El preinmune tb. La señal aparece en todas partes. No
funciona. El 2º reconoce el 1º
Si se utiliza bloqueo de suero de conejo con Ac 2º marcado
Siempre el suero de bloqueo tiene q ser la misma esp dnd se obtiene el Ac 2º
Si el Ac 2º es un conejo el suero tiene q estar obtenido de conejo. No reconoce
Funciona

ESPECIFICIDAD
De Ac y de señal
- De Ac 1º
Western
• En una pongo muestra y en otra Ag. Si quiero ver la prot P53 tengo la prot
Pongo los Ac. Si el Ac es específico veo solo una banda. Si aparecen varias bandas hay
reactividad cruzada

• Si hechamos Ac en una solución. Meto Ag q se une al Ac. El AC no vale pa nada, saturo sus
centros de unión. Se utilizan como Ac 1º y no dará señal. Si da señal se une de forma inespecífica

- De Ac 2º
Elimina el Ac 1º. Tengo la muestra, añado bloqueante y añado el Ac 2º x lo q no se une y no habrá
señal ya q no hay Ac 1º al q se une

- De la señal
Quito Ac 1º o Ac 2º o los 2
Pa saber si la act es específica
Si hay señal le genera la muestra

CURVAS DOSIS RESPUESTA

A dif [] de prot obtengo la misma señal. Tratado y control no han variado. Aunq tratado tiene +. Es un
error
Se tiene q trabajar en las zonas lineales xq en esa zona está saturado
Se hacen varias tiras pa ver como varía la señal con la []
A las mismas variaciones de muestra son ≈ variaciones de señal
Se puede diluir la muestra pa tener un rango de trabajo adecuado en el q sea peq variaciones en [] muestra
de gran variación de señal
Lo ideal es pendiente de 45º

CONTROLES NEGATIVOS
Llegan a cabo la tec pa q no salga
Se elimina el Ac 1º, 2º o eliminan la muestra x ejem
Pa control de especificidad
CONTROL POSITIVO
Se intenta ver una prot en muestra. Si es -, se debe a q la tec está mal hecha o la prot no está
Se pone una muestra dnd se sabe q la muestra está. Se pone como control +
Si no aparece señal la tec está mal hecha

Si se hacen todas entre controles se sabe q la tec está hecha correctamnte

El Ag se une a Ac 1º y este a Ac 2º

DESCRIPCIÓN INMUNOTECNICAS
- Inmunohistoquímica: MO
- Inmunocitoquímica: ME
- Inmunoprecipitacion
- Inmunohistoquimica (IHQ)
La herramienta de detección es el Ac
Se hace al MO
Pa detectar y distribuir el Ag. Pa ver en q cells o en q zona está (mb, citopl o núcleo)
Se puede identificar aunq no es muy útil
Antigenicidad
Un Ac es el q reconoce un Ag x tener antigenicidad
Si tengo un Ag en sangre y a el se le une un Ac. El fijador puede cambiar el Ag y perder la
antigenicidad
Se tienen q hacer muchos lavados pa retirar el fijador
Si el tej está fijado de hace años, se realiza un desenmascaramiento del Ag pa recuperar la
antigenicidad. Se incuba en tampones básicos 9-10 pH a 50-60ºC pa romper puentes entre fijador y
Ag pa recuperar su estruc
En alg procedimientos conviene fijar poco 2´
La inmunohistoquímica se pone Ag con Ac 1º, 2º

- Inmunocitoquímica (ICQ)
Pa observar a MET
• Preinclución: el mejor
• Postinclusión
Tenemos una rejilla con los cortes. Eliminamos el plástico q es dnd está el prob xq dañan los
prod al tej. Se hace la inmunotéc: Ac 1º, 2º con oro coloidal y observación
Se emplean Ac 2º marcados con oro coloidal, se emplea la prot A pa q una la part al Ac q sirve
de puente. El receptor Fc sujeta los Ac x la región cte

• Preinclusión
El tej está fijado y en tampón. Se hace la inmunotéc. Antes de incluir en resina
El Ac penetra con dificultad, pa q penetre mejor se utilizan detergentes pa solubilizar mb y
permite > entrada de Ac pa tener + zona en la q se lleva a cabo la inmunotécnica. Después se
realiza el mismo procedimiento q en muestras de MET

• Tec de marcaje de la fractura tras digestión con detergente

El sombreado es de lado y criofractura
En vez de eliminar todo el mat biológico se hace digestión suave, disuelvo las mb xo no del todo.
Se unen molec y mantiene las prot unidas al metal
Es útil pa poder hacer ICQ
Se hace ICQ. El Ac 2º lleva oro y une enz histoquímica
Se ve al microscopio el precipitado en la mb o esfera de oro y se distinte la prot x la forma en la
replica metálica. Lo distingue x el marcador

- Inmunoprecipitación
La muestra tiene prot y lo q quiero precipitar. Se añade Ac 1º y 2º con lastre
La muestra tiene q ser soluble
 Se pone plástico de lastre de agaraosa o sefarosa o mat ferromagnético
Se utiliza o centrifufa o con iman. Se elimina el sobrenadante y se recoge el precipitado
resuspendiendo las bolas y tendré molec puras
Se añade mucho Ac 1º xq tengo q tener la certeza de q no quede ningún Ag sin precipitar

5 CHIPS PROTEICOS
MICROMATRIZ PROTEICA
Micromatriz (microarray): un porta en el q distribuimos una matriz de ptos de modo q cada pto es
independiente de otro, ordenados y en cada pto hay un único tipo de molec
Las molec q se pueden poner son ac nucleicos o prot
Se utilizan 35000 ptos
- Proteica: o bien se pega una prot al porta o una estruc pa q se pegue la prot o los 2 son prot
Se emplea un Ac con Ag (perfil de expresión), añadir un receptor y una prot, con drogas

- Con Ac
El modelo, se ordena en columnas y filas. Hay 32 micromatrices, en cada una 16 ptos. Se ponen 7 Ac
x duplicado. Los 2 últimos ptos son 2 controles.
En las q no hay Ac, hay albúmina de suero bovino sin señal fluorescente q es control negativo. La
otra es control positivo, es albúmina marcada con fluorescencia

- Método de aguja
Pa poner las prot se utiliza una aguja q se acerca al porta, al contactar se deposita una gota y se
puntea con una máquina + o – son 1 nl y de Ø 20 -100 μm
Colocar la molec es fundamental pa q funcione bien
Al tener colocados los controles en la esquina inf derecha es un criterio posicional pa saber siempre
dnd está
• Procedimiento de 2 colores:
Empleo 3 colorantes
 Experimento
 Solubilización de prot, marcaje
 Eliminar exceso de marcaje
 Mezcla 1:1
 Incubación mezcla/ micromatriz
 Escanear /validar datos

 Experimento
Control y tratado

 Solubilizar prot
Se utiliza tampón pa dejar las prot solubles. Si no es buena podemos tener mb
Se utiliza RIPA o cellytic
Pa marcar, los marco de forma dif. Al control con Cy3 y tratado con Cy5
Debe haber una relación estequiométrica exacta pa ver la cant de marcaje específico

 Eliminar exceso de marcaje

Es un sist de filtros

 Mezcla 1:1
La misma cant de prot total de control y tratado (el mismo peso de prot)
Aunq el vol sea dif

 Incubar la muestra
En el porta escojo un pto. Ejem: Ac con actina
Cubierta x mezcla de prot entre ellas actina x lo q se unen
Tengo 2 actinas marcadas de forma dist (control y tratado). Es un ensayo de competencia. Si
es la misma C y T la competencia es el 50%
Si hay sobreexposición de actina hay + acina en T q en C
La unión final es el reflejo de la proporción relativa de cada prot
T Cy 5
r ( prop relativa ) = = = 1 no ha habido variación
C Cy 3
r > 1 hay sobreexposición de tratado sobre control
r<1 hay > control sobre tratado
cy5 y Cy3 tiene q tener ma misma cant de señal