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  • Tecnicas Moleculares para Identificacion de Patogenos

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    Andy Rashta Aguirre
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    Los primeros métodos de identificación molecular fueron la hibridación ADN-ADN, el análisis de secuencias del ADNr 16S, la hibridación con una sonda específica y el análisis RFLP o ribotipificación

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    Tecnicas Moleculares Para Identificacion de Patogenos

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    Articulo de Revision REV PERU MED EXP SALUD PUBLICA. TECNICAS MOLECULARES PARA LA DETECCION E IDENTIFICACION DE PATOGENOS EN ALIMENTOS: VENTAJAS Y LIMITACIONES Carolina Palomino-Camargo'”: Yuniesky Gonzalez-Murioz'** RESUMEN. Las enfermedades transmitias por alimentos, ocasionadas por mioroorganismos patégenos. constiuyen un grave ‘problema de salud pabica a nivel mundial. Los métodos microbio\gicos uflizados comnmente ena deteccion de estos. ‘paldgenos, de origen aimentario, son laboriosos y consume mucho tempo. Esta sitacién, aunada a la demmanda por Fesuttados inmediatos y alos avances tecnoldgices, ha conducido al desarrolo de una ampla gama de métodos répidos ‘on las itmas décadas. Enbase a esto, a presente revision describe las ventajasyimtaciones de les pancipales métodos :moleculares uiizados en la detecciine idenbicacion de meroorganismes paldgenos transmiidos por alimentos. Para ‘allo, so considor la actuaidad dela informacion consutada, ol andlsis objetivo de a tomdtca y su alcanco. Laiteratura fecionto porta un nimmoro signet de técnieas moleculares, altorativas,sonsibles y slactvas para la dotoccin, _’enumeracioneidentfeacion de microorganisms petégenos en alimentos, siendola eaccidn en cadena dela polmerasa (PCR) la piatafocma mas popula, mientras que la secuenciacién de alto rendiminto Se pertla como una téniea de gran _apicabiidad a futuro. Sin embargo, aun con todas las ventajas que ofrecen estas novedosas metodologias, no se deben 'pasar por alto sus limtaciones. As, por ejemplo, los métodos moleculares no constituyen protocols estandarzados, Io ‘que difcula su utitzacion en algunos casos. Por estarazén se debe trabaararduamente para superar tales lmitaciones ‘y mejorar la aplicaciin de estas téenicas en matrices tan complejas como los sistemas alimentos. Palabras clave: Técnicas de chagnéstico molecular, Inocuad de lbs alimentos; Enfermedades transmtidas por los ‘alimentos, Mierobologia de almontos, Epidemiologia molecular (luente: DeCS BIREME). MOLECULAR TECHNIQUES FOR DETECTION AND IDENTIFICATION OF PATHOGENS IN FOOD: ADVANTAGES AND LIMITATIONS ABSTRACT. Foodvome diseases, caused by pathogenic mecroorganisms, are a major public heath problem wordwide, Merobilogical ‘methods commonly used in the detocton of hese foodborne pathogens are laborious and tme consuming, This station, ‘oupled wa the demand for mmediato resus and with technological advances, hasied othe development ofa wide range ‘of raped methods in recent decades, On this bass, ths review deserbes the advantages andlimtations ofthe main molecular methods used in detection and identification of foodbome pathogens. To this end, we considered how recent te information was pubished, the objective analyss ofthe topic and its scope, Recent Heralure reports significant number of allernatve, ‘sonstve and solectvo molecuar techniques for dotocon, enumeration and idontficabon of pathogenic meroorganisms in food. Polymerase chain reaction (PCR) isthe most popular platform, whi high perfomance sequencing is emerging as ‘ fochnique of wide app¥eabilty forthe future. However, even with all the advantages ofthese now methodoioges, thor limtations should not be everooked, For example, molecular methods are not standardized protocos, whch hinders use in some cases, Forths reason, hard werk should be done to avercome these mations and improve the appcaion of these techniques n complex mates such as food systems. Key words: Molecutar dlagnostic techniques: Food safety. Foodborne diseases, Food microbiology; Molecular ‘epttemiobgy (tuente: DeCS BIREME) Instituto de Ciencia yTendogl de Alimentos, Facultad de Cencs, Universidad Central de Venema, Carcas evens “Minitrio dl Poder Popular para a Almentacion. Caracas, Veezucla ‘Magiteren Glenciay Tecnologie deloe Almentox*icncada en nog ‘Iceni en Ciena dos Alieton Rech: IL01-14” proba: 23-07-14 (Gtar comes Palomino. Crary (Gensler Mur Tecnica mleclaes paras deen edentiicacén de pies en alimentos: vent limita ‘Sones Rey ers Med Exp Salad able, 201431(3)535 46 ms a | s3s REV PERU MED EXP SALUD PUBLICA. 2014: 31(3:535-46 Palomino-Camargo C & Gonzalez Mufloz ¥ INTRODUCCION Las enfermedades transmitidas por los alimentos (ETA) son un problema de salud piblica en todo el mundo y una ‘causa importante de morbiidad, lo cual supone una carga ‘econémica signifcativa para las naciones, perjicios para los consumidores y un impacto al comercio intemacional {de productos alimenticios '-*. Mas de 260 enfermedades conccidas se transmiten a través de alimentos. Su incidencia ha aumentado considerablemente durante las Uitimas décadas por la répida glabalizacién del mercado de alimentos y por los profundos cambios en los habitos alimenticios. Ademas, este problema se acrecienta con el ‘surgimiento de nuevas formas de transmisin, laaparicién de grupos poblacionales vulnerables, y el aumento de la resistencia a los compuestos antimicrobianos en los, ‘microorganismos patégenos “, Se sabe que alrededor de 40 diferentes patégenos de ‘origen alimentano causan enfermedades humanas ©. Mas del £0% de los casos confirmados y las muertes: causadas por dichos patégenos han sido atribuidos bactorias ©. Entre las bacterias mas comunes se ‘encuentran; Clostridium botulinum, Escherichia col Salmonella’ spp., Listeria. monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus, Shigella spp. Bacillus cereus, y Campylobacter jejuni. No obstante, ‘aproximadamente el 98% de los microorganismos fencontrados en los productos alimenticios no son patégenos ®, Por esta razén, se requiere desarrolar pruebas de diagnéstico que puedan detectar ‘especificamente el microorganismo de interés © LLainocuidad de los alimentos es un concepto inherente a la seguridad alimentaria, y esta relacionada con muchos ‘aspectos de las tecnologias de produccién agraria, ala manipulacién y elaboracién de alimentos, constituyendo tuna importante prioridad politica en todo el mundo °*. Porlo tanto, eldesarrolioyla optimizacién de alternativas novedosas para el seguimiento, caracterizacién ‘enumeracion de patégenas en alimentos es uno de los ‘aspectos clave en la microbiologia de alimentos, y se ‘vuelve cada vez mas importante para la agriculture, la industria alimentana y los consumidores, Los métodos microbiolégicos clésicos _implican, generalmente, el uso de un apropiado cultivo de Preenriquecimiento y enriquecimiento, oaistamiento en edios selectivos y la posterior confirmacién mediante pruebas bioquimicas morfolégicas ylo serolégicas. Todo ‘esto 8 laborioso, la obtencion de resultados puede tomar dias 0 semanas y, adicionalmente, presentan baja sensiblidad. Aunado a ello, se ha demostrado ‘que algunas células bacterianas pueden entrar en tun estado viable pero no cultivable (VPNC), debido 536 | al procesamiento al que se sujeta el alimento, lo que imposibiita el uso de los métodos de cultivo como herramionta de diagnéstico. Una serie de métodos moleculares alternatives, répidos y sensibles para la deteccién, identficacién y cuantificacién de patégenos transmitidos por alimentos han sido desarrollados para ‘superar estos inconvenientes °°, El objetivo de la revision es describ os distntos métodos ‘moleculares utiizados para la deteccién, e identficacién de ‘microorganismos patégenos transmitides por almentos, haciendo particular énfasis en sus ventajas ylintaciones. METODOLOG| Se reaizé una revisién de tipo narrative, no sisiemétca, referents alas técricas molecularesutizadas actualmente tenia deteccién eidentiicacion de patégencs en alimentos, destacando a la vez, sus aplicaciones, ventajas limtaciones. La recoleccién de la informacion se efectud durante noviembre y diciembre de 2013. La bisqueda se llevéa cabo enlas bases de datos Science Direct, Springer Journal y Medine. La estategia de busqueda estuvo caracterizada por los siguientes cris: actualidad de la informacién consultada, andlisis objetivo de la temétca y ‘lcance de la misma. Los timinos de bisqueda apicados fueron: Molecular diagnostc techniques, food safety, eodbome diseases, molecular epidemiology y advantages and litatons of molecular dlagnostc techniques. Se incluyeron articuos en inglés y espafiol METODOS MOLECULARES PARA LA. DETECCION E IDENTIFICACION DE. PATOGENOS TRANSMITIDOS POR ALIMENTOS. Los principales avances en los ensayos de deteccién de ppatégenos en alimentos, basados en dcidos nucleicos, se produjeron a partir de 1980 "2. Los primeros métodos de identificacién molecular fueron la hibridacién ADN-ADN, cel andlsis de secuencias del ADNr 165, la hibridacién con tuna sonda especifica y el andlisis RFLP o ribotipificacion En contraste con las caracteristicas fisiolégicas y bioquimicas, la identifeacién molecular se basa en la ‘composicién constitutiva de los cidos nucleioos més que en los productos de su expresién. Estos métodos ‘moleculares se utlizan a menudo en asociacién con la identiicacién microbiolégica convencional "=" EldescubrimientodelaPCR,laclonacién,lasecuenciacién y la tecnologia de deteccicn por fuorescencia, asi como la accesiblidad @ una gran cantidad de informacién fen la web ayudé al desarrollo de nuevas herramientas RV PERU MED ExP SALUD PUBLICA. 2014; 31(3)S35-46. Deteccion @ kentiicacon de patogenos en almentos rmoleculares, cuyo uso ha aumentado enormemente la habildad para detectar y cuantificar bacterias patégenas, fen agua y alimentos, entre estas, muchas bacterias emergentes, como por ejemplo; Escherichia coli 0167, Helicobacter pylor, Campylobacter spp., las cuales han representado una seria amenaza para la salud publica ‘mundial, La segunda generacién de métodos moleculares para la deteccién e identficacién de géneros y especies ‘son la reaccién en cadena de la polimerasa (PCR), la PCR multiple, la secuenciacién de genes especficos, cl andlisis de restriccién del ADN ribosomal amplfcado, entre otros Recientemente, se ha dado un pasohacialas plataformas moleculares mas sofisticadas para la identificacién de microrganismos patégenos, incluyendo sistemas de amplficacién in vitro en tiempo real, biosensores y rmicroarrogios ®, los cuales han sido desarrallados 0 se estan desarrollando para su uso como métodos rapidos fen a deteccién de patégenos en alimentos. Algunos de los actuales métodos de deteccién molecular pueden ser empleados, ademas, en laboratorios o establecimientos clinicos, en sitios de observacién, tales como la granja 0 cel campo, en forma de kit todo en uno. APLICACION DETECNICAS MOLECULARES EN LA DETECCION E IDENTIFICACION DE PATOGENOS. TRANSMITIDOS POR ALIMENTOS REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA La enumeracién de patégenos transmitides por alimentos fes un aspecto principal del diagndstico molecular rmicrobiolégico, especialmente si quiere utlizarse para la cevaluacién cuantitativa del riesgo. La reaccin en cadena de la poimerasa (PCR) es fa técnica de diagnéstico molecular mas ampliamente utilzada debido a su protocolo répido y de fécil uso (Figura 1). Por lo general, 23h son necesarias para completar una PCR, pero hoy fen dia se estén desarrollando sistemas de PCR mas avanzados para generar un resultado en cuestion de minutos. A contiuacién se presentan varios ejemplos de las aplicaciones de los distintostipos de PCR en alimentos, Existen muchas pruebas de PCR que se han deserito para patégenos relacionados a alimentos (Selmore E coli O167, L. monocytogenes, Campylobacter varios, ctros). Estas se encuentran disponibles comercialmente (certficado por la FDA y AOAC), Para Campylobacter spp. se han desarrollado distintas investigaciones en alimentos, utiizando la técnica PCR dirigida a los genes flaA, CadF, ceuE y cdt y la regién 165 del ARNr‘”. De festa manera, una nica célula de Campylobacter jejuni ‘Molde de ADN seo ds + ‘Desnaturalizacién del ADN molde + org) . SALLE Anillamiento de los cebadores } (primers) (Goo) 3 5 DoscopisdelADNmotse ' Repetiin de proceso (25-35 veces) Figura 1. Etapas de la PCR" “La icica de POR se basa en ol principio de complemented de tases delADN y en a parcipacn de la encima pamerasa que perme la exensin del fragmento 2 arpifear, agregande nuclsios en secvenesaconplemertata a ADN made par medio de un proces ko {ue comprende ves pasos: desratralzaion, Nbadaciny extension fen leche yen muestras de agua (utlizada para el lavado del pollo) fue identiicade a través de la PCR, en conjunto con una técnica de separacién inmunomagnética (IMS). El tiempo de ensayo fue de & h, sin el enriquecimiento| de la muestra. Una PCR-ELISA fue empleada para la deteccién de C. jejuni en muestras de aves de corral. Este ensayo, dirigido al gen ceu, fue aplicado directamente sin el paso de enriquecimiento previ, reporténdose un limite de deteceién de 40 ufelml. Asimismo, se han utiizado pruebas basadas en la PCR para la dentfcacién de Listeria spp y L. monocytogenes fn distintas muestras de alimentos, leche y productos Idcteos. Por ejemplo, Gouws y Liedemann (2005) ulilizaron un ensayo de PCR especifico para la deteccién dol gen hlyde L. monocytogenes y los métedos de cultivo | 937 REV PERU MED EXP SALUD PUBLICA. 2014: 31(3:535-46 Palomino-Camargo C & Gonzalez Mufloz ¥ cconvencionales para la identificacién de Listeria spp. De los 27 productos analizados, 74% fueron presuntamente posiivos para Listeria en agar Oxford (Oxoid) y 44% identificados como L. monocytogenes en agar RAPID’ L. mono agar (Bio-rad). La PCR se utiiz6 como prueba de cconfirmacién ¢ identificé a L. monocytogenes en el 37% de la muestras analizadas. Los autores concluyeron ‘que la PCR fue capaz de eliminar los resultados falsos Posttivos que se observaron por los métodos de cultvo. Para la deteccién e identificacién de Salmonella spp. en alimentos también se han desarrolado varios ensayos PCR. Un ensayo especifico para la especie Salmonella typhimurium, basado en la amplificacién del gen OgaH, ‘se ha descrito con un limite de deteccién de 100 UFC «partir de cultivos puros y de 200 UFC a partir de las muestras positivas de came de pall *. Para los serogupes 0174 y O177 de E. cof se han

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