8.

NORMAS

Los estándares de referencia primarios son materiales homogéneos con propiedades tales como
identidad, pureza y potencia que han sido medidas y certificadas por el Instituto Nacional de
Estándares y Tecnología, la Convención de la Farmacopea de EE. UU., la Sociedad Estadounidense
de Pruebas y Materiales u otra organización equivalente. Los químicos usan estos estándares para
preparar estándares de trabajo para análisis químicos y de drogas.

Aunque la microbiología es una ciencia relativamente menos exigente que la química, en el

laboratorio de microbiología de alimentos se utilizan patrones de referencia. Los microbiólogos
utilizan cultivos de referencia para determinar cualitativamente que los medios funcionan
correctamente.

Con mucho, la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) es la mayor fuente de estos cultivos.
Difco Laboratories y BBL Microbiology Systems son esencialmente distribuidores que obtienen sus
cultivos principalmente de ATCC. Los cultivos normalmente se liofilizan o se liofilizan, y cada cepa
de cultivo ATCC tiene su propia identificación o número de código de referencia. Los cultivos se
liofilizan comúnmente en ampollas de vidrio y se almacenan en refrigeración (4-8°) antes de su
uso.

Además de los polvos liofilizados, los distribuidores comerciales pueden suministrar cultivos ATCC
impregnados en discos de filtro. Tanto los cultivos liofilizados ATCC como los cultivos en disco ATCC
cuentan con una fecha de caducidad más allá de la cual no deben utilizarse. Al ordenar estos
cultivos, el analista debe rotar las existencias. Además, se debe realizar un inventario de estos
cultivos de referencia disponibles comercialmente cada 3 meses. Los cultivos que hayan pasado su
fecha de caducidad deben esterilizarse en autoclave y desecharse.

8.2 Preparación y uso

Los cultivos liofilizados se rehidratan rompiendo asépticamente el cuello de la ampolla, agregando

el polvo a un medio no selectivo apropiado para el crecimiento del organismo e incubando el
cultivo rehidratado en las condiciones recomendadas para ese organismo. Un asa llena del cultivo
se vierte en un agar para obtener colonias aisladas. La placa se incuba en las condiciones
prescritas. El analista entonces procede como desea con las colonias aisladas.

Para rehidratar cultivos de disco, se utilizan fórceps estériles para extraer asépticamente un disco
del vial y colocarlo en un tubo que contiene infusión de cerebro y corazón o caldo de soja
Trypticase. El caldo se agita hasta que el disco se disuelve por completo. Una asa llena del cultivo
disuelto se vierte en un agar apropiado para obtener colonias aisladas y la placa se incuba en las
condiciones prescritas por el método. El analista entonces procede como desea con las colonias
aisladas.

8.3 Período de validez y condiciones de almacenamiento

Después de rehidratar los cultivos liofilizados o en disco, el analista debe mantener estos cultivos
madre. Las condiciones de mantenimiento varían según el microorganismo; Los procedimientos de
mantenimiento para aquellos organismos de mayor interés para el microbiólogo de alimentos se
dan en el Anexo 12.

Para

El analista también debe mantener un registro que contenga la siguiente información: nombre del
cultivo (género y especie), designación de la cepa, fuente del cultivo (tanto comercial como
original, por ejemplo, tipo de alimento o muestra clínica de la que se aisló originalmente el cultivo),
fecha de recepción, fecha de rehidratación, todas las fechas de subcultivo en serie del cultivo
madre rehidratado, todos los medios utilizados (crecimiento, purificación y almacenamiento),
período de incubación y temperatura utilizada para el crecimiento y la purificación, temperatura
utilizada para el almacenamiento, ubicación del cultivo, e iniciales del analista que realiza cualquier
segmento particular del procedimiento de mantenimiento.

8.4 Especificaciones de rendimiento

Los cultivos bacterianos de referencia deben cumplir con los criterios de pureza, morfología,
reacciones bioquímicas y reacciones serológicas.

Pureza

La pureza de los cultivos microbiológicos se determina sembrando un caldo de cultivo en un agar

en placas selectivo, no selectivo y/o diferencial adecuado. El agar selectivo contiene uno o más
ingredientes para inhibir el crecimiento de organismos no analitos o competidores; el agar no
selectivo no. El agar diferencial simplemente indica cierta información bioquímica sobre el cultivo
inoculado por un cambio de color en el agar. Para asegurar la pureza de un organismo, es preferible
utilizar agar tanto selectivo como diferencial. Si no se dispone de un agar diferencial para un
organismo en particular, se puede sustituir por un agar no selectivo.
La aparición de más de un tipo morfológico de colonia indica que el cultivo puede estar
contaminado. Sin embargo, los diferentes tipos morfológicos pueden deberse a mutantes,
organismos estresados o dañados o medios defectuosos. En este caso, se deben purificar una o
más colonias de morfología típica. Hay dos enfoques:

En el primer enfoque, las colonias seleccionadas se inoculan en un caldo apropiado, se incuban en

las condiciones prescritas y se vuelven a sembrar en placas de agar. La ventaja de usar un caldo,
especialmente uno no selectivo, es que le da al organismo la oportunidad de resucitar o revivir y
alcanzar una alta densidad de población. Sin embargo, una desventaja es que puede dar a los
organismos competidores la oportunidad de crecer demasiado en el analito objetivo. En cualquier
caso, si todas las colonias del agar de siembra son morfológicamente similares, se puede suponer
razonablemente que el cultivo ha sido purificado.

En el segundo enfoque, las colonias seleccionadas se vuelven a sembrar directamente en agares de

placa apropiados. La ventaja de volver a sembrar los medios de siembra directamente, en lugar de
inocular un caldo y luego volver a sembrar los medios de siembra, es el ahorro de tiempo. Sin
embargo, a veces es más difícil obtener colonias aisladas con este segundo enfoque. Además,
puede ser muy estresante para los organismos recogidos de una placa de agar selectivo pasarlos
directamente a otra placa de agar selectivo sin ninguna reanimación. En cualquier caso, si todas las
colonias del agar de siembra son morfológicamente similares, se puede suponer razonablemente
que el cultivo ha sido purificado.

Además de observar la morfología colonial para determinar la pureza del cultivo, la morfología
también puede garantizar que los medios funcionen correctamente. Los organismos producen
colonias que tienen una apariencia característica o típica en varios agares. Una apariencia que no
es típica puede indicar un medio defectuoso o un defecto en la preparación del medio. El analista
debe estar atento a la aparición de colonias surcadas de un cultivo puro que puede haber sufrido
una o más mutaciones. Este tipo de cultivo puede contener organismos que producen colonias
bastante diferentes. Los organismos gravemente estresados o dañados en un cultivo puro también
pueden producir colonias morfológicamente diferentes.

Reacciones bioquímicas

Se puede utilizar una serie de reacciones bioquímicas para confirmar la identidad de un organismo.
Se deben incluir varios cultivos de referencia conocidos en el procedimiento de identificación para
garantizar que las pruebas bioquímicas se realicen correctamente. Se han documentado reacciones
de prueba individuales de estos cultivos de referencia (1-3).

Las reacciones bioquímicas típicas de los cultivos de referencia (ya sean convencionales o rápidos)
indican que los cultivos de referencia son puros y que las pruebas bioquímicas reaccionan
correctamente. Una o más reacciones bioquímicas atípicas para un cultivo de referencia en
particular indica que el cultivo de referencia está contaminado o ha mutado, la prueba bioquímica
es defectuosa o cualquier combinación de las anteriores.

puede estar contaminado. Sin embargo, los diferentes tipos morfológicos pueden deberse a
mutantes, organismos estresados o dañados o medios defectuosos. En este caso, se deben
purificar una o más colonias de morfología típica. Hay dos enfoques:

En el primer enfoque, las colonias seleccionadas se inoculan en un caldo apropiado, se incuban en

las condiciones prescritas y se vuelven a sembrar en placas de agar. La ventaja de usar un caldo,
especialmente uno no selectivo, es que le da al organismo la oportunidad de resucitar o revivir y
alcanzar una alta densidad de población. Sin embargo, una desventaja es que puede dar a los
organismos competidores la oportunidad de crecer demasiado en el analito objetivo. En cualquier
caso, si todas las colonias del agar de siembra son morfológicamente similares, se puede suponer
razonablemente que el cultivo ha sido purificado.

En el segundo enfoque, las colonias seleccionadas se vuelven a sembrar directamente en agares de

placa apropiados. La ventaja de volver a sembrar los medios de siembra directamente, en lugar de
inocular un caldo y luego volver a sembrar los medios de siembra, es el ahorro de tiempo. Sin
embargo, a veces es más difícil obtener colonias aisladas con este segundo enfoque. Además,
puede ser muy estresante para los organismos recogidos de una placa de agar selectivo pasarlos
directamente a otra placa de agar selectivo sin ninguna reanimación. En cualquier caso, si todas las
colonias del agar de siembra son morfológicamente similares, se puede suponer razonablemente
que el cultivo ha sido purificado.

y analizando diferentes copias de las mismas cepas de cultivo de referencia (p. ej., otro subcultivo
de P. vulgaris ATCC 13315); cultivos de referencia completamente diferentes (por ejemplo,
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 o Enterobacter cloacae ATCC 13047 en lugar de Proteus
vulgaris ATCC 13315); diferentes lotes de sustratos de prueba bioquímicos convencionales; y
diferentes lotes o números de código del fabricante de kits de diagnóstico rápido.

Reacciones serológicas

Las reacciones serológicas son un complemento útil e indispensable de las reacciones bioquímicas
para identificar organismos. Cuando se utiliza para la serotipificación definitiva, tanto los antígenos
somáticos (pared corporal) como flagelares, si corresponde, se identifican serológicamente. En
ambos casos se incluyen cultivos de referencia para determinar la intensidad y especificidad de la
reacción inmunológica.
Si se utiliza una escala de 0 a ++++ (ver sección 7.4) para cuantificar la intensidad de la reacción de
aglutinación entre un cultivo de referencia conocido (antígeno) y su antisuero homólogo
(anticuerpo), las reacciones de menos de ++ indican que el cultivo está contaminado, el cultivo es
puro pero puede contener antígenos flagelares y/o somáticos dañados, o los antisueros tienen
títulos insuficientes o son defectuosos.

Además de la intensidad de la reacción entre un cultivo de referencia conocido y un antisuero

homólogo (p. ej., antígeno de Salmonella y antisuero de Salmonella), se debe determinar la
especificidad de la reacción. La reactividad de un cultivo de referencia conocido se determina con
antisuero no homólogo (p. ej., antígeno de Escherichia coli y antisuero de Salmonella). Las
reacciones de cualquier grado de actividad, es decir, + o mayor, indican que el cultivo de referencia
está contaminado, o es puro pero contiene antígenos "ásperos" o autoaglutinables, o que el
antisuero es defectuoso.

Para asegurarse de que no se utilicen cultivos de referencia conocidos aproximados, así como
cultivos de prueba desconocidos, un control de cultivo salino debe acompañar cada determinación
serológica. Para este control, el propio cultivo se mezcla con una pequeña cantidad de solución
salina en un portaobjetos de vidrio o en un tubo de ensayo, según el tipo de determinación
serológica que se realice. Una reacción positiva de cualquier grado indica que el cultivo es tosco y
no tipificable sin un tratamiento especial adicional.