PROYECTO

1. ANÁLISIS OFICIALES
A. INVESTIGACIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Se parte de la suspensión madre del producto que se va a utilizar, sembrando, por
duplicado, 1mL de dicha suspensión en tubos que contengan 19 mL de caldo de
enriquecimiento Giolitti Cantón. Cubrir la superficie con parafina estéril. Incubar a 37
ºC durante 18-24 horas.

Se consideran positivos los tubos que producen ennegrecimiento.

De los tubos positivos, se resiembra 0,1 mL por diseminación con asa de vidrio estéril,
sobre placas con medio sólido selectivo Baird-Parker. Incubar las placas en estufa a 37
ºC durante 48 horas.

El aspecto de las colonias típicas de Staphyloccocus aureus sobre agar Baird-Parker es

el siguiente: redondas, de bordes lisos, convexas, de 2-3 mm de diámetro, húmedas,
brillantes, negras, con un borde fino blanco, rodeadas de una zona opaca y de un halo
claro de 2-4 mm.

Prueba confirmativa:

1. A partir de las colonias típicas crecidas en el medio Baird-Parker, se siembra, en

estrías radicales, sobre la superficie de agar Dnsa. Incubar a 37ºC durante 18-24 horas.

2. Sobre el crecimiento se vierte HCl 1 N y se espera unos minutos a que se produzca la

reacción, que consiste en la aparición de una zona transparente a su alrededor, lo que
indica que el germen en estudio a liberado desoxirribonucleasa.

*Esta prueba se hizo sobre la parte interna y externa del huevo caducado de industria y
el huevo sin caducar de granja.

B. COLIFORMES
*Esta prueba se hizo sobre la parte externa del huevo caducado de industria y el huevo
sin caducar de granja.

B.1 RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES

1. Se prepara una gradilla con tres series de tres tubos cada una. Cada tubo contendrá 9
mL de lactosa bilis verde brillante (y una campana Durham).

2. En cada uno de los tubos de la primera serie, se vierte 1 mL de la dilución 10-1,

preparada anteriormente. En cada una de los tubos de la segunda serie, se vierte 1 mL de
la dilución 10-2 y en cada uno de los tubos de la tercera serie, 1 mL de la dilución 10-3.

3. Incubar los tubos a 37 ºC durante 24-48 horas. La reacción es positiva cuando se

observe turbidez y producción de gas en la campana. Contabilizar los tubos positivos y
determinar el número más probable de coliformes por mililitro usando la tabla NMP.
 B.2 RECUENTO DE COLIFORMES FECALES
Se parte de los resultados obtenidos en la investigación de los coliformes totales, de
acuerdo con los siguientes pasos:

1. Subcultivar con el asa de siembra todos los tubos positivos que se han detectado en la
investigación de los coliformes totales, a otros tubos que contengan 10 mL de un medio
apropiado como el medio EC (es un caldo lactosado con sales biliares), con campana
Durham.

2. Incubar a 44,5 ºC durante 24-48 horas. Se consideran positivos los tubos que
presenten gas después de la incubación. Como la temperatura es selectiva para E.coli, se
presupone que los tubos positivos se deben a esta bacteria, pero habrá que confirmarlo.

3. Contabilizar los tubos positivos y determinar el número más probable de coliformes

fecales por mililitro usando la tabla de NMP.

C. IDENTIFICACIÓN DE E.COLI
Para confirmar la presencia de E.coli, se hacen siembras a partir de los tubos positivos
sobre agar Levine, con el fin de obtener colonias aisladas fácilmente identificables. Se
incuban a 44,5 ºC, con lecturas a las 24-48 horas.

Las colonias de E.coli sobre agar Levine miden 2-3 mm de diámetro, son planas o
ligeramente cóncavas, con centro oscuros, casi negros. Con luz reflejada se suele
observar un brillo metálico.

Normalmente basta con lo dicho para la investigación de E.coli. No obstante, en

ocasiones es necesario realizar más pruebas de confirmación, como por ejemplo, las
IMViC.

*Esta prueba se hizo a partir de las coliformes fecales.

D. MOHOS
Para realizar esta prueba se prepara agar Sabouraud, el cual se repartirá en 2 placas por
cada muestra a analizada.

Se prepara también diluciones de 10-1 a 10-4 ambas inclusive de la muestra.

Sembrar en superficie, alícuotas tomadas de 0,1 mL de las diluciones preparadas.

Las placas son incubadas a 22 ºC durante 5 días.

Realizar una observación a las 48 h. Si se observa un crecimiento rápido de las colonias,

realizar el recuento antes de que la placa sea totalmente invadida.

*Esta prueba se hizo sobre la parte interna y externa del huevo caducado de industria y
el huevo sin caducar de granja.
 E. DETERMINACIÓN DE SALMONELLA
Se realiza un preenriquecimiento que consiste en introducir la muestra a analizar en una
bolsa de plástico estéril y se añade agua de peptona tamponada (BPW). Se homogeneiza
la muestra en el triturador. Se incuba la bolsa 24 horas a 37 ºC.

Hacer un enriquecimiento en medio líquido selectivo que consiste en preparar caldo

Selenito Cistinal (S-C) y añadir 10 mL de la muestra anterior. Se homogeniza. Se
incuba durante 24 horas a 37 ºC.

A continuación, se produce un aislamiento diferencial en medio sólido selectivo.

Se agita el caldo de enriquecimiento y en una placa Petri con medio de cultivo
Salmonella-Shigella (S-S) realizar un agotamiento por estría continua. Se incuban las
placas a 37 ºC durante 24 horas.

Pasadas estas horas se hace el recuento, donde se diferenciará entre colonias de Shigella
y/o Salmonella. Las colonias de Salmonella son incoloras ó incoloras con el centro
negro si son productoras de sulfuro de hidrógeno y las de Shigella son incoloras.

*Esta prueba se hizo sobre la parte interna del huevo caducado de industria y el huevo
sin caducar de granja.

F. GALERÍA API

INTRODUCCIÓN
API STAPH es un sistema de identificación de los géneros Sthaphylococcus y
Micrococcus. La incubación se hace a 35-37 ºC durante 18-24 horas. La lectura e
interpretación se hacen a partir de la información contenida en las instrucciones. Esta
interpretación también se puede realizar con programa informático.

CONSERVACIÓN DE GALERÍAS Y MEDIOS:

Se conservan a 2-8 ºC hasta la fecha de caducidad indicada en el envase.

CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS NECESARIOS:

Deben conservarse en la oscuridad a 2-8 ºC hasta la fecha de caducidad indicada en el
envase. Antes de utilizar los reactivos deben dejarse a temperatura ambiente.

PROCEDIMIENTO:
1. Preparación de la galería:

1.1 Unir el fondo y la tapa de una cámara de incubación y repartir en los alvéolos
aproximadamente 5 mL de agua destilada o desmineralizada, con el fin de crear una
atmósfera húmeda.
1.2 Inscribir la referencia de la cepa en la lengüeta lateral de la cámara.
1.3 Sacar la galería de su bolsa hermética y depositarla en la cámara.

2. Preparación del inóculo:

2.1 Realizar un precultivo de la bacteria.

2.2 Abrir una ampolla de API STAPH Médium.
2.3 Preparar una suspensión bacteriana homogénea de turbidez equivalente al 0,5 de
McFarland.
3. Inoculación de la galería:

3.1 Rellenar los tubos de la galería con la suspensión preparada con API STAPH
Médium, utilizando una pipeta. Llenar solo los tubos, no las cúpulas sin sobrepasar el
nivel del tubo.
Evitar la formación de burbujas apoyando la punta de la pipeta en la parte interior de la
cúpula.
3.2 Crear anaerobiosis en los test ADH y URE rellenando la cúpula con aceite de
parafina para formar un menisco convexo.
3.3 Cerrar la cámara de incubación.
3.4 Incubar a 35-37 ºC durante 18-24 horas.

4. Lectura de la galería.

4.1 Leer todas las reacciones conforme a la Tabla de Lectura añadiendo una gota de
cada uno de los reactivos siguientes:

- Test VP: VP1 y VP2. Esperar 10 minutos. Un color rosa fuerte o violeta indica una
reacción positiva. Un color rosa pálido o rosa claro debe ser considerado negativo.
- Test NIT: NIT 1 y NIT 2. Esperar 10 minutos. Una coloración roja indica una reacción
positiva.
- Test PAL: ZYM A y ZYM B. Esperar 10 minutos. Una coloración violeta indica una
reacción positiva.

4.2 Anotar los resultados en la hoja de resultados.

5. Identificación:

Obtener el perfil numérico. Los tests están separados por grupos de tres y un valor de 1,
2 ó 4 indicado en cada uno. Hay que sumar en cada grupo los correspondientes a las
reacciones positivas para obtener 7 cifras que constituyen el perfil numérico. La
resistencia a la lisostafina característica de los Micrococos constituye el test 21 y se le
adjudica el valor 4 cuando es positiva.

6. Eliminación del material utilizado:

Después de su uso, ampollas, pipetas, cámaras y galerías deben ser incineradas o

descontaminadas, por autoclavado o desinfección en un desinfectante, antes de ser
tiradas.

*Este procedimiento se realizó a partir de una placa de determinación de Salmonella.

 2. VALORES PERMITIDOS

Criterios de seguridad Criterios de higiene de los

Parámetro
Método de referencia
Criterio microbiológico
Fase en la que se aplica el
criterio
Interpretación del resultado
Acción en caso de resultados
insatisfactorios
alimentaria
Salmonella
EN/ISO 6579
n=5, c=0, m=Ausencia en 25
g, M=Ausencia en 25 g
Productos comercializados
durante su vida útil
Satisfactorio, si todos los
valores observados indican
ausencia de la bacteria.
Insatisfactorio, si se detecta la
presencia de la bacteria en
cualquiera de las muestras
procesos
Enterobacteriáceas
ISO 21528-2
n=5, c=2, m=10 ufc/g o ml,
M=100 ufc/g o ml
Final del proceso de
fabricación
Satisfactorio, si todos los
valores observados son ≤ m.
Aceptable, si un máximos de
c/n valores se encuentran
entre m y M y el resto de los
valores observados son ≤ m.
Insatisfactorio, si uno o varios
valores son > M o más de c/n
valores se encuentran entre m
y M.
Comprobaciones de la eficacia
del tratamiento térmico y
prevención de la
recontaminación

Siendo:
• n = número de unidades de la muestra.
• m = valor umbral del número de bacterias. El resultado se considerará satisfactorio si
todas las unidades que componen la muestra tienen un número de bacterias igual o
menor que m.
• M = valor límite del número de bacterias. El resultado se considerará no satisfactorio
si una o varias unidades que componen la muestra tienen un número de bacterias igual o
mayor que M.
• c = número de unidades de la muestra, cuyo número de bacterias podrá situarse entre
m y M. La muestra seguirá considerándose aceptable si las demás unidades tienen un
número de bacterias menor o igual a m.

Reglamento CE 2073/05, DOUE L338/1 22.12.2005, modificado por Rgto. CE

1441/2007, DOUE L322/12 7.12.2007)
3. ANÁLISIS QUE SE REALIZAN

Los análisis que se realizan realmente son los anteriores debido a su facilidad,
posibilidad de realización y su bajo coste.

FUENTES CONSULTADAS:

Apuntes profesora
http://cvu.rediris.es/pub/bscw.cgi/d311175/Normicro/Recopila/normictb.htm
http://www.asemac.es/docus/Criterios_Microbiologicos.pdf
http://www.mcd.com.mx/pdfs/AGAR%20SALMONELLA%20SHIGELLA.pdf