RESUMEN LABORATORIO BIOQUÍMICA

ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS SDS-PAGE

ELECTROFORESIS : ES UNA TÉCNICA QUE CONSISTE EN LA MOVILIDAD DE LAS

PROTEÍNAS CARGADAS EN UN CAMPO ELÉCTRICO Y PERMITE ADEMÁS,
DETERMINAR EL PUNTO ISOELÉCTRICO Y PESO MOLECULAR DE ESTAS.

LA TECNICA DE ELECTROFORESIS ES UN MÉTODO UTIL PARA LA IDENTIFICACIÓN Y

SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS DE FORMA RÁPIDA , DE MANERA TAL QUE PODAMOS
DETERMINAR LA CANTIDAD DE ESTAS PROTEINAS EN UNA MEZCLA O BIEN SU
GRADO DE PUREZA.

● LA ELECTROFORESIS SE LLEVA A CABO EN GELES QUE SE PREPARAN CON

POLIACRILAMIDA QUE ES UN POLIMERO ENTRECRUZADO.
● LA POLIACRILAMIDA , PERMITE QUE LA MIGRACIÓN DE LAS PROTEÍNAS SEA
MAS LENTA , AL ACTUAR COMO TAMIZADOR , Y PERMITE QUE ESTA
MOVILIDAD DE LAS PROTEÍNAS, SEA PROPORCIONAL A SU CARGA Y MASA, Y
ESTO DEPENDERÁ DE LA FORMA Y TAMAÑO QUE TENGAN ESTAS .

SDS : DODECIL - SULFATO DE SODIO.

● SE USA SDS EN ELECTROFORESIS PARA ESTIMAR EL PESO MOLECULAR Y
PUREZA DE UNA PROTEÍNA .

SDS : ES UN DETERGENTE QUE SE UNE A PROTEÍNAS POR MEDIO E INTERACCIONES

HIDROFÓBICAS EN PROPORCION CON EL PESO MOLECULAR DE ESTAS PROTEINAS.
ESTE DETERGENTE OTORGA CARGA NEGATIVA A LAS PROTEINAS , LO CUAL A LA
CARGA INTRINSECA LA DEJA INSIGNIFICANTE.

SE USA UN SDS CADA DOS RESIDUOS DE AMINOACIDOS.

CON SDS , EN ELECTROFORESIS SE SEPARA A LAS PROTEINAS POR SU PESO

MOLECULAR , DONDE AQUELLAS MOLECULAS QUE CORRESPONDEN A LOS
POLIPEPTIDOS QUE SON MAS GRANDES , MIGRARAN DE MANERA MAS LENTA Y
AQUELLOS POLIPEPTIDOS QUE SON MAS PEQUEÑOS, MIGRARAN MAS RAPIDO.

UNA VEZ QUE SE REALIZA ELECTROFORESIS , LAS PROTEINAS ANALIZADAS

PUEDEN SER VISIBLES CUANDO SE INCUBA EL GEL EN PRESENCIA DE UN
COLORANTE , EN ESTE CASO, AZUL DE COOMASSIE R-250 , EL CUAL ES UN
COLORANTE QUE SE UNE A LAS PROTEÍNAS, NO ASÍ, AL GEL.

CUANDO SE ESTABLECE UNA COMPARACIÓN EN LA MIGRACIÓN DE LAS PROTEÍNAS

QUE SON DESCONOCIDAS EN RELACION A LA MIGRACION DE AQUELLAS QUE
TIENEN PESO MOLECULAR CONOCIDO Y ESTAN PRESENTES EN UN ESTANDAR,
PODEMOS DETERMINAR EL PESO MOLECULAR DE LAS PRIMERAS ( LAS
DESCONOCIDAS)

CUANDO HAY PROTEINAS QUE CONSTAN DE DOS O MAS SUBUNIDADES , SE UTILIZA

EL SDS PARA SEPARARLAS Y ESTAS , APARECERÁN COMO BANDAS
INDEPENDIENTES EN EL GEL.

LOS GELES DE POLIACRILAMIDA CONSTAN DE VARIOS QUÍMICOS EN SU

COMPOSICIÓN , DONDE CADA UNO TIENE UNA FUNCIÓN ESPECÍFICA :

● ACRILAMIDA FORMA EL POLIMERO DEL GEL

● BISACRILAMIDA : CORRESPONDE A UN AGENTE ENTRECRUZADOR
● TEMED Y PERSULFATO DE AMONIO ( APS ) : INICIAN LA POLIMERIZACIÓN

LOS GELES CONSTAN DE UN GEL CONCENTRADOR Y UNO SEPARADOR.

EL GEL CONCENTRADOR ES MENOS CONCENTRADO QUE EL SEPARADOR. ESTE

GEL CONCENTRADOR SE ARMA SOBRE EL SEPARADOR Y EN EL , SE APLICA LA
MUESTRA. CUANDO TRANSCURRE UN LAPSO CORTO DE TIEMPO, LAS PROTEÍNAS
DE LA MUESTRA SE CONCENTRAN PREVIAMENTE AL ENTRAR AL GEL SEPARADOR.

EN EL GEL SEPARADOR ES DONDE SE PRODUCE LA MIGRACIÓN DE LAS PROTEÍNAS

EN RELACIÓN A SU TAMAÑO.

● Las precauciones que se deben tener al hacer uso de la acrilamida es trabajar con
guantes , lentes de protección y mascarilla, debido a que en forma sólida y asi
como también en solución , esta se absorbe a traves de la piel y es tóxica.

● Cuando la acrilamida está polimerizada , los efectos tóxicos desaparecen.

● La acrilamida puede causar algunos de estos efectos :

- posible efecto carcinogeno

- posible efecto teratogeno
- puede ocasionar daños genéticos hereditarios
- también es neurotóxico
- irrita la piel
ACTIVIDADES QUE SE REALIZARAN EN EL PRACTICO :

EN PRIMER LUGAR SE PREPARARAN AMBOS GELES, EL CONCENTRADOR Y EL

SEPARADOR.

EN PRIMERA INSTANCIA, SE PREPARARÁ EL GEL SEPARADOR DE LA SIGUIENTE

FORMA :
● SE USARÁ ACRILAMIDA Y BISACRILAMIDA AL 40% 3ML
● 1,5 M Tris-HCl pH 8,8
● APS 10%
● SDS 10%
● H20
● TEMED
TODOS EN DISTINTAS CANTIDADES INDICADAS POR EL PROFESOR

EN SEGUNDO LUGAR, SE PREPARARÁ EL GEL CONCENTRADOR CON LOS MISMOS

COMPUESTOS QUE EN EL SEPARADOR, PERO ESTA VEZ EL 1,5 M Tris-HCl , SERÁ EN
PH 6,8 . Y LAS CANTIDADES DE LOS DEMÁS COMPUESTOS SERÁN diferentes que en el
gel separador.

LUEGO SE PROCEDERA A REALIZAR EL ARMADO DE GELES , DONDE SE LLEVARAN A

CABO UNA SERIE DE PROCEDIMIENTOS, ENTRE ESTOS :

● Limpiar las placas de vidrio con etanol y secar , luego Armar las placas y fijarlas
en los soportes que estan destinados para eso. Despues, se debe agregar el
volumen correspondiente del gel separador que se preparó.
● Posteriormente, se agregará isopropanol por las paredes y se dejará gelificar por
alrededor de 20 minutos.
● Para seguir en el procedimiento, se va a eliminar el isopropanol y se secará la
superficie del gel. Luego, se preparará el gel concentrador.
● Luego de la actividad anteriormente mencionada, se agregará volumen sobre el
gel separador y se colocará peineta de 10 bolsillos, para evitar que queden
burbujas de aire.
● Se dejará gelificar por 20 minutos, luego se envolverá en toallas de papel
humedas y papel alusa el gel espaciador y se guardará a 4° hasta la actividad
siguiente del práctico.
Actividad 2: Corrida electroforética, tinción y desteñido de los geles

En la segunda parte del práctico, los procedimientos que se llevaran a cabo son los
siguientes :
● en primer lugar, se preparará y aplicará la muestra de la siguiente manera :
- con una micropipeta se mezclaran 20 uL de una muestra con proteinas , en donde
hay 20 uL de buffer y se dejará hervir durante 5 minutos.
- Posterior a lo anterior, se cargarán 20 uL por carril y se incluirá un carril en el que
se arguen 3,5 uL de estándar de peso molecular .

En el siguiente paso, se procederá a realizar la CORRIDA ELECTROFORÉTICA :

● en esta parte del práctico, se hará conexión de los electrodos y se aplicarán 130 V
durante una hora y media hasta que el indicador del frente alcance el final del gel.
● Luego de esto se detendrá la corrida y se sacaŕa el gel del tanque de
electroforesis.
● FInalmente, se separarán las placas de vidrio para hacer obtención del gel.

En los pasos posteriores a la corrida electroforetica, se hará una tinción , donde se

sumerjirá el gel en una solución teñidora y se incubará a temperatura ambiente hasta
que el gel se tiña . Una vez, de incubar y esperar a que el fondo aclare, se procederá a
medir las distancias de migración y se graficará el logaritmo del peso molecular de los
estandares en función de la migracion.
Por medio de interpolación , será posible determinar el peso molecular de cada proteína
en la muestra.