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DIAGNÓSTICO DE LA HEMOFILIA Y OTROS

TRASTORNOS DE LA COAGULACIÓN

MANUAL DE LABORATORIO

Steve Kitchen, PhD


Especialista Docente de Laboratorio de la FMH
Centro de Hemofilia y Trombosis, Sheffield
Hospital Royal Hallamshire
Sheffield, UK

Angus McCraw
Especialista Docente de Laboratorio de la FMH
Centro de Hemofilia y
Unidad de Hemostasia Katharine Dormandy
Hospital Royal Free
Londres, UK

Preparado por

EL COMITÉ DE CIENCIAS DEL LABORATORIO DE LA


FEDERACIÓN MUNDIAL DE HEMOFILIA
Este manual fue revisado durante su escritura por los
siguientes miembros del Comité de Ciencias del Laboratorio:

Profesor Ian Peake


Profesor Eric Preston
Profesor Uri Seligsohn
Profesor Ernest Briet
Profesor Ampaiwan Chuansumrit
Profesor Mammen Chandy
Profesor Gil White

También por la Doctora Carol Kasper, Vicepresidente Médico de la Federación Mundial


de Hemofilia

La traducción al español de este manual fue revisada por Pura Lawler, científica biomédica
senior del Centro de Hemofilia y Unidad de Hemostasia Katharine Dormandy, del hospital Royal
Free, Londres, Reino Unido.

Agradecimientos

La técnica del recuento de plaquetas de este manual ha sido reproducida con pequeños cambios
del libro publicado en 1992 Fundamental Diagnostic Hematology: The Bleeding and Clotting
Disorders, con el permiso de sus autores: Evatt BL, Gibbs WB, Lewis SM, McArthur JR. El libro fue
publicado conjuntamente por la OMS y el Departamento de Salud y Servicios Humanos, el
Servicio de Salud Pública y el Centro para el Control de Enfermedades de Atlanta, Georgia,
USA.

La técnica de detección del antígeno del factor von Willebrand (FVW:Ag) mediante
inmunoelectroforesis ha sido reproducida con pequeños cambios de la publicación que se cita a
continuación: Laboratory Manual for the Diagnosis of Haemophiloid Disorders, Federación
India de Hemofilia. Dicha reproducción se ha hecho con la autorización de los Doctores
Bhargava y Jain.

Información de interés

Las empresas farmacéuticas que se mencionan en este Manual aceptaron colaborar cuando ya
había sido escrito. Dichas empresas son simples ejemplos de todas las que participaron. El hecho
de que aparezcan en el manual no significa que la WFH, sus autores o el Comité de Ciencias de
Laboratorio de la WFH apoyen el uso exclusivo de sus productos. También queremos constatar
que las empresas productoras pueden y suelen modificar sus productos, y por lo tanto las
sustancias que eran más adecuadas cuando se escribió este Manual podrían dejar de serlo
posteriormente.
Índice

1. Equipo del laboratorio 5


2. Seguridad del laboratorio 6
3. Recogida de muestras y variables preanalíticas 10
4. Control de calidad interna y valoración de calidad externa 13
5. Técnica manual de agitación del tubo de ensayo 18
6. Preparación y calibración del plasma normal recogido de donantes (PNP) 20
7. Determinación de un rango de referencia normal 22
8. Reactivos 25
9. Recuento de plaquetas 27
10. Tiempo de hemorragia 32
11. Tiempo de protrombina (PT) 34
12. Tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT) 37
13. Pruebas de mezcla para la ulterior investigación de PT y APTT anormales 40
14. Tiempo de coagulación de la trombina 43
15. Fibrinógeno (ensayo modificado de Clauss) 45
16. Rastreo del factor XIII 48
17. Ensayos basados en el PT (factores II, V, VII y X) 50
18. Ensayos de factor basados en el APTT (ensayo en un tiempo de los 53
factores VIII:C, IX, XI o XII)
19. Rastreo del inhibidor del factor de la coagulación basado en el APTT 57
20. Actividad del cofactor ristocetina, actividad del factor von Willebrand 59
21. Antígeno del factor von Willebrand mediante ELISA 63
22. Ensayo de inmunoelectroforesis (Laurell´s Rocket) para el antígeno del factor 66
von Willebrand
23. Medición cuantitativa de los inhibidores del factor VIII 72
24. Ensayo del inhibidor del factor IX 78
25. Anticoagulante lúpico y anticuerpos antifosfolípidos 80
25.1 Tiempo del veneno de víbora diluido de Russell 82
25.2 Prueba de rastreo de KCT de Exner 87
26. Pruebas de función plaquetaria 90
26.1 Retracción del coágulo 91
26.2 Medición de la agregación plaquetaria 93
27. Liofilización del plasma 103
28. Bibliografía general 105
1 EQUIPO DEL LABORATORIO

Para poder diagnosticar y tratar los trastornos de la coagulación, cualquier laboratorio que utilice
las técnicas descritas en este manual necesita como mínimo del siguiente equipo:

•= Un refrigerador que sirva para almacenar los reactivos a 4ºC; sin embargo, puede ser
suficiente una nevera doméstica de buena calidad.

•= Un congelador que mantenga al menos –35ºC de temperatura. Para un almacenaje más


prolongado sería mejor una temperatura aún menor, de unos –70ºC. Los congeladores de –
20ºC normalmente no son adecuados para almacenar los plasmas y reactivos de muchas
pruebas hemostáticas.

•= Baño (único o múltiple) de temperatura controlada (o control mediante termostato), o bloque


de calor seco capaz de mantener la temperatura a 37ºC+ 1ºC.

•= Un pH-metro (medidor de pH).

•= Una fuente de luz, por ejemplo una lámpara con brazo angulado.

•= Cronómetros.

•= Pipetas automáticas, que manejen volúmenes exactos y precisos de muestras o reactivos, en


un rango de 0-200 microlitros hasta de 1000 microlitros.

•= Una pipeta calibrada para manejar hasta 5 ml de volumen de líquido.

•= Una centrifugadora capaz de generar al menos 1700 g. En algunas técnicas se recomiendan


2500 g y una centrifugación a 4ºC.

•= Para algunos procedimientos se requieren otros medios adicionales, como son:

 Una placa lectora de microtítulos, para las técnicas inmunoabsorbentes ligadas a enzimas
(ELISA).

 Un agregómetro de plaquetas.

•= Otros equipamientos necesarios serán mencionados en las páginas referentes a cada método
en particular.

En los países de temperatura elevada es recomendable tener aire acondicionado en todas las
habitaciones.

Deberá haber un buen suministro de materiales desechables (que se utilicen una sola vez). No es
aconsejable reutilizar tubos de ensayo y puntas de pipetas lavadas. Sin embargo, en casos de
extrema escasez de medios, el tubo de ensayo puede ser reutilizado tras ser lavado y enjuagado
de forma meticulosa.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 5


2 SEGURIDAD DEL LABORATORIO

Los laboratorios que manejan sustancias químicas y biológicas son lugares potencialmente
peligrosos.

En los últimos años ha habido una creciente sensibilización de la industria con respecto a la
importancia de trabajar de forma segura, tanto por razones de salud como por razones
ambientales.

Dicha sensibilización ha conducido a dar mayor importancia a asuntos tales como la


documentación de seguridad y el aprendizaje del personal.

Los patronos tienen la responsabilidad de proporcionar la ropa protectora y el equipo necesarios,


con el fin de permitir un aprendizaje seguro.

Si se llevan a cabo métodos seguros de trabajo, la probabilidad de autolesionarse gravemente o


de lesionar a los compañeros o a los miembros del público, se verá reducida de forma drástica.

Encargados de Seguridad

Es importante nombrar uno o varios encargados de seguridad en el departamento que se


responsabilicen de enseñar y mantener unos métodos de trabajo seguros.

Manual de Seguridad

Debe haber un manual de seguridad completo, que cubra todos los aspectos relacionados con las
formas seguras de trabajar en el departamento.

Todos los miembros del personal deben leer dicho manual y firmar un formulario que confirme
que lo han entendido debidamente.

Debe haber copias del manual de seguridad en poder de los encargados de la seguridad, en un
lugar fácilmente accesible, y a disposición de todo el personal.

Medidas de Seguridad: Precauciones Generales

Un sistema Universal de precauciones, referente a las formas adecuadas de trabajo, reducirá el


peligro de cualquier tipo de infección.

Todas las muestras de sangre, los productos sanguíneos (incluido los reactivos basados en el
plasma y sus equipos correspondientes) y otros materiales del cuerpo humano, deben ser
consideradas como posibles fuentes de infección.

6 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Cuando se trabaja con cualquier tejido corporal, siempre deben utilizarse los mejores métodos
(los más completos) de autoprotección.
No debe hacerse ningún otro tipo de clasificación del riesgo. Todos los líquidos y materiales,
además de la sangre almacenada o traída a la Unidad para su estudio o cualquier otro fin, deben
ser manejados con el mismo cuidado que la sangre.

El Laboratorio
El laboratorio debe estar siempre limpio y ordenado.

Hay que mantener los libros lejos de las áreas donde se realizan las pruebas de laboratorio.

No se debe usar el laboratorio como almacén de bultos de gran tamaño.

Asegúrese que todo el mundo participa en mantener limpio el laboratorio.

Ropa de Protección
Toda persona que entre en el laboratorio, incluidos los visitantes, deberá llevar una bata de
laboratorio. Si esta se contamina, deberá sustituirse rápidamente por otra.

Guantes Desechables
Aunque a mucha gente no le guste usar guantes, cualquier muestra utilizada en el laboratorio
puede ser peligrosa; por ello, siempre deben utilizarse guantes cuando se manejen materiales
tóxicos y potencialmente peligrosos, como lo son todos los tejidos corporales.

Obviamente, los guantes y la bata no protegen contra los pinchazos (de una aguja o cualquier
otro objeto punzante). Sin embargo, sí evitan que los sueros HIV-positivos o las toxinas entren
en contacto con heridas o abrasiones que el personal pueda tener en la piel.

Si los guantes se rompen o se pinchan, hay que cambiarlos inmediatamente.

Lavado Ocular
Muchas infecciones se contagian fácilmente por el contacto del agente infectante con las
membranas mucosas de los ojos.

Si sus ojos se ponen en contacto con un material posiblemente infeccioso, láveselos


inmediatamente, con grandes cantidades de agua corriente fría, directamente del grifo.

Objetos Cortantes
Los objetos cortantes, como las agujas o los trozos de cristal, son un gran peligro. Utilice una
caja para guardar dichos objetos cortantes, con el fin de no tener riesgo de pinchazo.

Esto es muy importante, porque ha habido casos de trabajadores que se han infectado como
consecuencia de pinchazos.
Aerosoles
Evite cualquier tipo de práctica de laboratorio que produzca polvo o gotas en el aire.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 7


Todas aquellas operaciones que produzcan aerosoles, deben hacerse en un armario adecuado
para humos; además, deben utilizarse gafas de seguridad.

Todo lo que se vierta en la mesa de trabajo deberá ser limpiado inmediatamente, con lejía o
cualquier otro agente neutralizante.

Sustancias Tóxicas e Inflamables


Las sustancias tóxicas o inflamables (que atraen al fuego y arden fácilmente) deben ser siempre
guardadas en un armario de humos o en una caja de seguridad adecuada.

Equipo Eléctrico
Téngase especial cuidado con los equipos que utilicen líquidos, como son los tanques de
electroforesis y los baños.

Dejar siempre que la instalación, el mantenimiento y las reparaciones sean hechos por personal
cualificado.

Personal
Nunca lleve cosas personales en el laboratorio, como son bolígrafos, bolsos, peines, etc.

Mientras esté en el laboratorio, evite tocarse la cara o las mucosas (ojos, nariz y boca) con las
manos.

Lávese siempre las manos antes de tocarse la cara, etc.

No coma, ni beba, ni fume, ni se ponga maquillaje mientras esté en el laboratorio.

Nunca use una pipeta bucal.

Lávese siempre cuidadosamente las manos antes de salir del laboratorio.

Accidentes
El encargado de seguridad de la Unidad debe ser informado inmediatamente de todos los
accidentes; además, estos deberán ser registrados en el libro de accidentes, que debe estar bajo el
poder de dicho encargado.

8 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Legislación (Leyes) sobre el Control de Sustancias Peligrosas para la Salud

Esta legislación se utiliza en los laboratorios del Reino Unido, y es una forma útil de identificar
riesgos y peligros.

Definiciones

Peligro y Riesgo
Peligro es la posibilidad de que una sustancia cualquiera sea dañina.

El riesgo de dicha sustancia es la probabilidad que tiene de afectar a alguien bajo condiciones
reales de utilización.

Identificación de los Peligros

Antes de llevar a cabo una valoración del riesgo es necesaria la identificación de los peligros.

El tiempo necesario para la identificación de los peligros variará según cada sustancia en
particular.

Valoración del Riesgo

Considere los siguientes hechos:


•= Los peligros;
•= Las condiciones de uso;
•= Las cantidades que se van a utilizar;
•= Las vías o zonas de exposición – inhalación (respiratoria), ingestión (oral, comiendo), piel u ojos.

El resultado final de la valoración del riesgo determinará:


•= Las condiciones de almacenamiento – cómo se debe almacenar una sustancia.
•= Las formas de manejo – cómo el personal del laboratorio debe tratar la sustancia mientras la
utiliza (por ejemplo, llevar guantes, mascarilla, gafas de seguridad, etc);
•= Los procedimientos de eliminación – cómo se desechará o eliminará la sustancia;
•= La necesidad de supervisar y vigilar sus efectos – cómo se debe supervisar el efecto de la
sustancia sobre la salud del personal del laboratorio;
•= Los procedimientos urgentes (por ejemplo, qué hacer si alguien ingiere una sustancia o la
vierte sobre la mesa de trabajo, etc).

Si se tiene conocimiento de alguna circunstancia nueva o de que cambie algunas de las existentes
(por ejemplo, nueva información de peligros, cambio de uso, etc), la valoración deberá ser
actualizada.

Los Departamentos deben tener copias de las evaluaciones de riesgo y documentos de apoyo.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 9


3 RECOGIDA DE MUESTRAS Y VARIABLES PREANALÍTICAS

Recogida de Muestras

Siempre que sea posible, la sangre venosa debe ser sacada de las venas de la flexura del codo.
Justo antes de tomar la muestra debe ponerse un compresor. Para adultos, la aguja no debe ser
mayor del calibre 21. Para los niños pueden ser necesarias agujas del 22-23. La muestra debe ser
tomada mediante una jeringa o un sistema de recogida y evacuación, que permitan la recogida
rápida de la misma. El contenedor de muestras no debe provocar una activación por contacto (es
decir, utilizar plástico o cristal de silicona). La sangre debe ser conducida suavemente al interior
de la jeringa. Cualquier muestra que no sea obtenida rápidamente, es decir mediante una punción
venosa satisfactoria, deberá ser desechada (porque es posible que en tales circunstancias se active
el proceso de la coagulación). La sangre no debe ser pasada de nuevo a través de la aguja tras ser
recogida en la jeringa. La aguja ha de retirarse antes de que la sangre pase de la jeringa al
contenedor con el anticoagulante. No debe haber pérdida de tiempo entre la recogida y la mezcla
con el anticoagulante. Una vez que la sangre y el anticoagulante se unan, deberán ser sellados y
mezclados mediante cinco movimientos suaves de inversión. No haga movimientos bruscos, con
el fin de evitar la lisis de los hematíes o la activación del proceso de la coagulación.

Si se utiliza un sistema evacuado de recogida, conviene recordar que también es necesario hacer
la mezcla mediante cinco movimientos de inversión, después de que la sangre haya sido puesta
en contacto con el anticoagulante.

La sangre debe ser mezclada con citrato sódico anticoagulante en una proporción de 9 partes de
sangre y 1 de anticoagulante. El anticoagulante debe ser 0,109 M (3,2% de citrato sódico
dihidrato) o similar (por ejemplo, en algunos sistemas evacuados se utiliza de forma satisfactoria
citrato anticoagulante 0,105 M). La solución anticoagulante debe almacenarse a 4ºC hasta un
máximo de 3 meses, pero ha de ser inspeccionada antes de su uso y desechada si se encuentran
partículas en ella, cosa que ocurre cuando se contamina. Si el paciente tiene el hematocrito bajo o
si el hematocrito está elevado, los resultados pueden verse afectados; por ello, el volumen de
anticoagulante debe ser ajustado para tener en cuenta la disminución del volumen plasmático,
siguiendo las pautas de la tabla que se muestra a continuación.

Volumen de anticoagulante necesario para una muestra sanguínea de 5 ml

Hematocrito Volumen de Volumen de sangre


anticoagulante
25-55% 0,5 ml 4,5 ml
20% 0,7 ml 4,3 ml
60% 0,4 ml 4,6 ml
70% 0,25 ml 4,75 ml
80% 0,2 ml 4,8 ml

10 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


También se puede mantener el volumen de anticoagulante en 0,5 ml y ajustar el volumen de
sangre añadida según el hematocrito. El volumen de sangre que debe añadirse (para 0,5 ml de
citrato 0,109 M) se calcula mediante la siguiente fórmula:

60 x 4,5
100-hematocrito

Centrifugación

El plasma rico en plaquetas (PRP) que se utiliza para las pruebas de función plaquetaria se
prepara mediante centrifugación de la sangre a temperatura ambiente, a 150-200 g durante 10-15
minutos. El sobrenadante (el líquido que queda por encima de los sólidos que están al fondo del
tubo) se extrae y se mantiene a temperatura ambiente, pero nunca más de 2 horas. Durante dicho
tiempo, el plasma debe mantenerse en un contenedor cerrado.

El plasma pobre en plaquetas (PPP) se utiliza en la mayoría de las pruebas de coagulación. La


muestra de sangre debe ser centrifugada hasta un mínimo de 1700 g durante al menos 10
minutos, preferiblemente a 4ºC en una centrifugadora refrigerada. Si no es posible tenerla, abra
las muestras a temperatura ambiente y separe y almacene la muestra de plasma lo antes posible a
4ºC. Si la temperatura ambiente es mayor de 25ºC pueden afectarse las lábiles proteínas de la
coagulación. Si la temperatura ambiente supera los 25ºC, deberá utilizarse una centrifugadora
refrigerada (4ºC).

Algunas pruebas necesitan que el plasma sea centrifugado dos veces. Para ello, hay que transferir
el PPP de la primera centrifugación a un tubo taponado con un plástico, para después ser
centrifugado por segunda vez. Hay que tener cuidado de no utilizar el plasma de la parte del
fondo, puesto que puede contener plaquetas que hayan quedado allí tras la primera
centrifugación.

Muestras para Pruebas Inmediatas

Siempre que se pueda, las muestras deben ser analizadas en las primeras 4 horas tras su recogida.
Para las pruebas de rastreo (“screening”) o de ensayos de los factores de la coagulación debe
evitarse un almacenaje superior a dicho tiempo. Las muestras para ensayos de factores de la
coagulación deben almacenarse a 4ºC antes de realizar la prueba. Las muestras para las pruebas
de rastreo y de ensayo del factor VII deben mantenerse a temperatura ambiente, con el fin de
evitar el riesgo de una activación por frío.

Muestras de Alto Riesgo

Hay que tener cuidado al manejar cualquier tipo de muestra de plasma, por el riesgo que conlleva
de transmisión de hepatitis, HIV y otros virus.

Véase también la Sección 2, referente a la Seguridad en el Laboratorio.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 11


Congelado Intenso del Plasma

Las muestras pueden ser congeladas para su análisis posterior. Aunque lo deseable es su
almacenamiento a –70ºC o menos, para la mayoría de las pruebas un almacenamiento a –35ºC es
adecuado. Un almacenaje a –20ºC normalmente no es adecuado. Se debe utilizar la doble
centrifugación (véase el apartado correspondiente anteriormente mencionado) si las muestras son
congeladas intensamente antes de su análisis para el anticoagulante lúpico. Debe evitarse el
congelado y descongelado antes de las determinaciones de APTT, ya que los resultados
obtenidos para algunas técnicas podrían verse afectados.

12 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


4 CONTROL DE CALIDAD INTERNA Y VALORACIÓN DE CALIDAD
EXTERNA

La garantia de calidad (“Quality assurance”- QA) es un concepto genérico que incluye todas las
medidas que se toman para garantizar la fiabilidad de las pruebas realizadas y publicadas por un
laboratorio. Implica la elección de la prueba, la recogida de una muestra adecuada, el análisis de
la prueba y la obtención de resultados de forma precisa y a tiempo. También se refiere a la
interpretación de los resultados y su comunicación al médico que solicitó la prueba.

El control de la calidad interna (“Internal quality control” – IQC), y la valoración de la calidad


externa (“External quality assessment – EQA), son dos componentes distintos aunque
complementarios del programa de calidad segura del laboratorio. El IQC se utiliza para
determinar si una serie de técnicas y procedimientos se están realizando correctamente, durante
un determinado periodo de tiempo. Se emplea para asegurar el buen funcionamiento diario del
laboratorio. La EQA se usa para detectar el grado de acuerdo que hay entre los resultados de un
laboratorio y los resultados de otros centros. En los más importantes protocolos de la EQA el
análisis retrospectivo de los resultados obtenidos por los laboratorios participantes permite
detectar, no sólo el deficiente funcionamiento de un laboratorio concreto sino también aquellos
reactivos y métodos que producen resultados poco fiables o equívocos.

La función primaria de la EQA es probar la competencia de laboratorios concretos. Hay un


protocolo internacional de la EQA que incluye analíticas de importancia concreta para el
diagnóstico y tratamiento de los trastornos de la coagulación. Datos de este protocolo han sido
publicados en las siguientes referencias bibliográficas:

Jennings I, Kitchen S, Woods TAL, Preston FE. Development of a World Federation of


Hemophilia External Quality Assessment Scheme: results of a pilot study. Haemophilia 1996;
2:41-46.

Jennings I, Kitchen S, Woods TAL, Preston FE. Laboratory performance of haemophilia centers
in developing countries: 3 years´ experience of the World Federation of Hemophilia External
Quality Assessment Scheme. Haemophilia 1998; 4: 739-746.

La dirección del protocolo de la EQA es la siguiente:

Director de la EQA: Profesor FE Preston


Manager del protocolo: Señor TAL Woods
Científico del protocolo: Dr S Kitchen
Dirección: 305 Western Bank
Sheffield S10 2TJ
United Kingdom
Teléfono: 44-114-270 0862
Fax: 44-114-275 8989

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 13


Protocolos más completos de la EQA podrían mejorar la información sobre el funcionamiento
relativo de los procedimientos analíticos, como son el principio básico de cada método, sus
reactivos y su instrumentación. La utilización continua de los protocolos de la EQA por parte de
los laboratorios, ha contribuido a una mejoría de los laboratorios. Dicha mejoría ha ocurrido
tanto en la reducción de la variabilidad de los resultados entre diferentes laboratorios como en el
rendimiento de cada uno de ellos.

La valoración del rendimiento de un laboratorio determinado es un componente esencial de los


protocolos de la EQA. El protocolo de la EQA de la WFH compara los resultados de los
laboratorios participantes con los resultados de las mismas muestras obtenidas en los centros
internacionales de formación en hemofilia. Hay muchas razones por las que un laboratorio puede
dar resultados insatisfactorios. Estas pueden ser inmediatamente descubiertas o ser por el
contrario difícilmente detectables. Protocolos más completos pueden detectar problemas de
rendimiento, específicamente relacionados con diferencias en los reactivos o en la metodología.

Su total confidencialidad es una de las características más importantes de todos los protocolos de
la EQA; así la formación referente al rendimiento de un determinado laboratorio no se divulga ni
revela a nadie, excepto al jefe del departamento.

Control de Calidad Interna (“Internal Quality Control” – IQC)

El IQC se utiliza para determinar si una serie de técnicas y métodos funcionan adecuadamente,
durante un determinado periodo de tiempo. Control de calidad (“Quality Control”- QC) suele
referirse al conjunto de procedimientos utilizados para comprobar que los resultados de las
pruebas de laboratorio son suficientemente fiables. En el sentido de que dichas pruebas ayuden a
la toma de decisiones clínicas, al control del tratamiento y al diagnóstico de las alteraciones
hemostáticas. Los métodos de QC deben ser aplicados de tal forma, que aseguren el control
inmediato y constante del modo en que se realizan las pruebas y se obtienen los resultados.

En el entorno de un laboratorio hay muchos factores que influyen en la calidad de los resultados,
a saber: la recogida y la manipulación adecuadas de las muestras, la selección de técnicas
apropiadas, y el mantenimiento de un manual actualizado de los métodos operativos estándar, el
uso de reactivos fiables y de materiales de referencia, la selección de una automatización y
procedimientos adecuados y un sistema de registro y publicación de los resultados idóneos.
Además, la calidad de los resultados en la práctica cotidiana depende mucho de la selección,
formación y motivación de un número adecuado de personal.

El control de calidad interna es especialmente útil para identificar el grado de precisión de una
técnica determinada. La precisión se define como el grado de acuerdo entre mediciones repetidas
de una misma muestra. Es importante saber que una técnica precisa no es necesariamente exacta.
La exactitud hace referencia a la proximidad entre un valor estimado y el valor real.

14 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Materiales para el Control de Calidad

Para valorar la precisión de cualquier método es necesario realizar análisis repetidos de partes
alícuotas de la muestra. Para asegurar que un método está bajo control, a diferentes niveles de un
dato concreto, es importante incluir muestras de QC con valores normales y anormales. Y ello,
porque cambios relativamente pequeños en el proceso analítico pueden ser más evidentes cuando
se prueba un control anormal. Las propiedades del control deben ser similares a las de las
muestras de las pruebas, y ser analizadas al mismo tiempo. Los materiales de QC de origen
humano tienen las máximas probabilidades de parecerse a las muestras de pruebas humanas.
Todos los viales o partes alícuotas del material de control deben ser prácticamente idénticos, de
forma que cualquier variación en los resultados de las pruebas no se deba a una variación entre
viales. El material de QC debe también ser estable durante el periodo de tiempo en que se tenga
que usar. Con respecto a las pruebas y ensayos hemostáticos, las muestras de plasma deben estar
congeladas a –35ºC o menos, o liofilizadas (congeladas en seco), con el fin de asegurar la
estabilidad del material de QC. Para la reconstitución de muestras liofilizadas es importante usar
agua destilada, con un pH de 6,8 a 7,2 y dejarlas reposar durante 5 minutos antes de su uso. Si se
utiliza material liofilizado de tipo comercial, deberá ser reconstituido siguiendo las
recomendaciones del fabricante, utilizando pipetas precisas. Si se utiliza material para QC
congelado, debe ser descongelado rápidamente a 37ºC en 5 minutos. Cuando se seleccionen
materiales para el QC habrá de tenerse en cuenta el riesgo de transmisión de virus por vía
sanguínea, de forma que no deberán utilizarse materiales de alto riesgo.

En cada grupo de pruebas de rastreo o ensayo debe incluirse al menos un material para QC. Para
las pruebas de rastreo es conveniente incluir un QC normal y un QC anormal una vez al día o
una vez por turno, o cuando exista duda de si el método está bajo control. En las pruebas
utilizadas para diagnosticar y controlar los déficits congénitos asociados con hemorragias debe
incluirse un material de QC de bajo nivel.

En todos los casos y siempre que sea posible, el material de control debe ser tratado exactamente
como las muestras a probar. Teniendo en cuenta que ocurren ciertas variaciones como
consecuencia de diferencias biológicas, técnicas y analíticas, cada resultado de QC deberá ser
registrado y evaluado en comparación con el rango que se considere aceptable en cada caso,
como se describe a continuación.

Límites de Variación Aceptables

En las muestras comerciales para IQC, los fabricantes frecuentemente proporcionan un rango
idóneo de valores aceptables. En las pruebas de rastreo y de ensayo ocasionales los resultados
obtenidos dependerán de los reactivos y del sistema de detección final que hayan sido utilizados.
El rango idóneo debe tener en cuenta las variables mencionadas previamente. Cuando no exista
un rango idóneo para una determinada técnica, el laboratorio podrá establecerlo. El material de
IQC se debe probar de forma repetida, mínimo 10 veces, en días diferentes, tras saber que el
método está bajo control (lo que vienen indicado por unos resultados idóneos con un material de
QC alternativo). Después se calcula la media y la desviación estándar (“standard deviation” –
SD), de los resultados. La SD es la raíz cuadrada de la suma de d2 dividida por n-1, siendo d la

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 15


diferencia de los resultados individuales con respecto a la media y n el número de
determinaciones. La SD es una forma de medir la dispersión de los resultados, de forma que
cuanto mayor sea la SD, mayor es la dispersión de los mismos. Otro parámetro importante es el
coeficiente de variación, CV, que es la SD expresada como porcentaje de la media. CV es igual a
SD dividido por la media y multiplicado por 100%. El CV de los resultados durante días
diferentes del tiempo de protrombina y el tiempo de tromboplastina parcial activada de una
muestra de QC, siempre deberán ser iguales o menores del 8% (cuanto menor, mejor). Para
ensayos como los del factor VIII:C y IX debería ser posible obtener CVs menores del 10%, en
pruebas realizadas durante varios días.

En la mayoría de los casos, los resultados obtenidos de una muestra para IQC presentan una
distribución normal, curva de Gauss. Es habitual considerar como rango idóneo para los
resultados de IQC, la media +/- 2 SD, puesto que dicho rango incluye el 95% de los valores. Los
resultados individuales deben anotarse en un registro que indique el rango idóneo. La Figura 4.1
que viene a continuación muestra un ejemplo de ello. Cualquier valor futuro que caiga entre
dichos límites será considerado aceptable. Los resultados que estén fuera de dicho rango
indicarán que el material de QC se ha deteriorado, ha sido manipulado de forma incorrecta o que
el método no está siendo controlado adecuadamente. La repetición de las pruebas del material de
QC más adelante diferenciará entre las dos posibilidades mencionadas. Los resultados que estén
repetidamente fuera de los límites indicarán que el sistema de prueba está fuera de control. La
desviación de los resultados de las pruebas de QC a medio o largo plazo, por ejemplo secundaria
al cambio o deterioro de un instrumento o de un reactivo, podrá hacerse evidente mediante el
escrutinio de todos los registros previamente realizados.

16 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Figura 4.1

Resultados de los ensayos del factor VIII:C de una muestra de IQC ensayada en días diferentes.
Cada punto es un ensayo diferente del mismo material. Las líneas continuas representan la media
y 2 SD correspondientes a 20 ensayos del material. El hecho de que los 20 ensayos estén en el
área limitada por dichas líneas, indica que los resultados son aceptables.

Fecha de la prueba

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 17


5 TÉCNICA MANUAL DE AGITACIÓN DEL TUBO DE ENSAYO

Aunque se utilizan en el mundo una gran diversidad de instrumentos para las pruebas de
coagulación, muchos centros todavía usan con éxito la técnica de agitación manual del tubo de
ensayo. Hay que destacar que aunque se disponga de métodos automáticos, algunas pruebas
requieren el uso de la técnica manual, bien sea por incompatibilidad de la muestra o por la propia
instrumentación. Como ejemplo de ello mencionaremos las concentraciones muy elevadas de
lípidos en plasma, las muestras ictéricas, o aquellas en las que el patrón de formación del coágulo
de la muestra sea muy diferente al de las muestras normales, sobre todo cuando la concentración
de fibrinógeno esté muy reducida.

Las pruebas de coagulación manual se realizan mejor en tubos de ensayo de cristal. El tamaño
más adecuado es de 75 x 10 mm. Se pueden utilizar con éxito diferentes tipos de cristal, aunque
pueden influir en los tiempos de coagulación obtenidos, sobre todo en las pruebas de rastreo,
como la del tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT). Debe determinarse el efecto de
las diferencias en la composición o fabricación del tubo sobre los resultados de las pruebas.
Dicho efecto puede medirse mediante la realización de un pequeño número de pruebas en cada
tipo de tubo, para después comparar sus resultados. Si existieran diferencias mantenidas entre los
resultados de las pruebas realizadas manualmente o automáticamente, debería establecerse un
nuevo rango de normalidad. Siempre que sea posible debe evitarse el lavado y uso repetido de
los tubos de ensayo.

Las pruebas deben ser siempre realizadas por duplicado. Esto es necesario porque hay muchas
variables y posibles causas de contaminación de las técnicas manuales. Si el tiempo de
coagulación de las dos pruebas difiere en más del 10%, se debe hacer una nueva prueba.

Al realizar la técnica manual de agitación del tubo de ensayo, hay que tener en cuenta los
siguientes aspectos:

•= precalentar los reactivos a 37ºC durante al menos 5 minutos, antes de utilizarlos en las
pruebas de coagulación.

•= el plasma y el reactivo de la prueba deben ser mezclados inmediatamente, mediante la


agitación rápida y controlada del tubo de ensayo durante 1-2 segundos. Simultáneamente se debe
poner en marcha un cronómetro que registre el tiempo de coagulación.

•= después, la mezcla debe ser inclinada 90º, tres veces cada 5 segundos bajo observación.
Finalmente se registra el tiempo de coagulación. Este método es esquematizado en la Figura
5.1.

•= colocar el tubo en el baño a 37ºC (+/- 1ºC) entre las inclinaciones, de forma que la base del
tubo esté 3-4 cm por debajo de la superficie del agua. Esto ayudará a mantener la temperatura
de la mezcla de incubación lo más cerca posible de los 37ºC.

•= la mezcla coagulante debe ser inspeccionada visualmente (de forma cuidadosa) con ayuda de
una fuente de luz proveniente de una lámpara de brazo angulado. Después se registrará el
tiempo de coagulación.

18 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Figura 5.1

Técnica de agitación manual del tubo de ensayo para las pruebas de coagulación

MÉTODO DE REFERENCIA DE INCLINACIÓN DEL TUBO

segundos

INCLINAR 3 VECES CADA 5 SEGUNDOS

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 19


6 PREPARACIÓN Y CALIBRACIÓN DEL PLASMA NORMAL
RECOGIDO DE DONANTES (“Pooled Normal Plasma”- PNP)

Donantes Como mínimo 20 personas sanas que no tomen medicación que


pueda interferir con los factores y reacciones de la coagulación. Se
pueden incluir mujeres que estén tomando anticonceptivos orales.
Lo ideal es tener un número aproximadamente igual de hombres
que de mujeres. Su rango de edad debe estar entre 20 y 50 años.

Anticoagulante Dihidrato de citrato trisódico al 0,109 M (3,2%) tamponado con


N-2 hidroxietilpiperacina. 5 gramos de N-2 ácido etanolsulfónico
(HEPES) en 100 ml de citrato trisódico.

Recogida La sangre de donantes se debe obtener entre las 9 y las 11 de la


mañana, mediante jeringas desechables de plástico de 60 ml y
agujas de mariposa del calibre 21.

Equipo
•= contenedor de plástico

•= centrífugadora

•= baño de hielo

•= pipeta de plástico

•= viales de plástico de 1,5 ml

•= hielo seco/CO2 sólido

Método

1. Recoger 54 ml de sangre y mezclarlos con 6 ml de anticoagulante en los contenedores de


plástico.

2. Guardar las muestras en hielo granizado durante la preparación del plasma normal (“pool”).

3. Centrifugar a 4ºC durante 15 minutos a 2500 g.

20 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


4. Mezclar el plasma en un contenedor de plástico de no contacto.

5. Obtener las fracciones del plasma mezclado de 0,5 ml mediante una pipeta de plástico e
introducirlos en viales de plástico de 1,5 ml.

6. Congelar inmediatamente en hielo seco/CO2 sólido si se tiene. Alternativamente guardar en


un cogelador a –70ºC.

7. Guardar a –70ºC hasta 6 meses.

Realice el procedimiento mencionado en 4 horas.

Una mezcla de plasma normal (PNP) preparada de la forma mencionada tiene una concentración
de 100 u/dl ó 1 u/ml de la mayoría de los factores de la coagulación, considerando una unidad
como la cantidad de factor de la coagulación existente en un ml de PNP. Estas cifras son
aceptables para los factores II, V, VII, X, XI y XII. En la práctica también es así para el factor
IX. No podemos esperar que se alcance una concentración de 100 u/dl de factor VIII o de FVW
en el PNP, ya que se sabe que dichas muestras suelen tener cantidades variables de dichos
factores. La WHO (Organización Mundial de la Salud) dispone de preparaciones calibradas de
referencia para la mayoría de los factores de la coagulación, muchas de las cuales están en el
Instituto Nacional de Estándares y Control Biológico en South Mimms, Potrees Bar, Herts, UK.
Dichas preparaciones también pueden obtenerse de fuentes comerciales. Es fundamental que las
preparaciones de referencia mencionadas se utilicen para calibrar un PNP local con respecto al
factor VIII o FVW y si es posible también para el factor IX; y ello antes de ser utilizadas como
estándar de los ensayos de los factores de la coagulación. Se debe recordar que cada 5-6 meses la
mezcla de plasma debe ser sustituida.

A continuación se describe un protocolo de calibración de PNP local.

1. Hay que obtener un calibrado estándar, como por ejemplo el estándar internacional (IS) de la
WHO (mínimo 2 viales). Se deben realizar las pruebas en dos días diferentes. Cada día han
de utilizarse 1 vial de IS y 4 partes alícuotas del PNP local.

2. En el primer día se deben probar las muestras en el siguiente orden: IS, local, local, local,
local, IS; también hay que repetirlas mediante diluciones frescas de cada plasma.

3. En el segundo día se han de probar las muestras en este orden: local, local, IS, IS, local,
local; y repetirlas mediante diluciones frescas de cada plasma.

4. Hay que calcular la potencia de cada parte alícuota del estándar local, frente al promedio de
los resultados obtenidos con los IS.

5. El resultado medio de 4 partes alícuotas por 2 diluciones durante 2 días (n=16) será
considerado la potencia del estándar local.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 21


7 DETERMINACIÓN DE UN RANGO DE REFERENCIA NORMAL

Para interpretar adecuadamente el resultado de cualquier prueba de laboratorio es importante


tener datos relativos a los resultados de la prueba en personas normales (sanas). La salud no es
un concepto bien definido y a veces es incluso relativo. El grupo ideal puede a veces estar muy
cerca del grupo investigado, con respecto a su edad, sexo y grupo sanguíneo ABO (en casos de
FVIII/FVW). Sin embargo, en muchas pruebas de laboratorio no es esencial realizar una
selección tan cuidadosa. En realidad la selección de sujetos normales sanos para definir un rango
normal dependerá de aspectos prácticos. De hecho se pueden utilizar empleados sanos del
hospital que no estén tomando ninguna medicación y donantes de sangre sanos o cónyuges de
pacientes adultos en estudio. Con respecto a los rangos normales, hay que tener en cuenta las
siguientes consideraciones de interés:

Siempre ha de definirse un rango normal a nivel local; las informaciones provenientes de los
fabricantes y las extraídas de las publicaciones sólo deberán ser consideradas como guías.

Las muestras normales deben ser obtenidas, procesadas y analizadas mediante técnicas idénticas
(o lo más parecidas posible) a aquellas empleadas para las muestras de los pacientes.

En las pruebas de rastreo (“screening”), como las del tiempo de protrombina (PT) y el tiempo de
tromboplastina parcial activada (APTT), existe la posibilidad de que un lote de reactivos del
mismo fabricante tenga un rango normal diferente al de otro lote similar previamente utilizado.
Deberán estudiarse minuciosamente los datos internos del control de calidad que hagan
sospechar un cambio, de forma que cualquier cambio indicará la necesidad de definir un rango
normal diferente.

En los ensayos, la información proveniente de las publicaciones y de los fabricantes sólo se


utilizará como guía. Las técnicas de ensayo más adecuadas son aquellas en las que el rango
normal localmente definido es muy similar al de las publicaciones correspondientes.

Los rangos normales de algunas pruebas de coagulación son diferentes en los recién nacidos (a
término o pretérmino) y en niños que en adultos.

Los rangos normales, sobre todo de las pruebas de rastreo (“screening”), han de ayudar a la
información clínica. Algunos pacientes con antecedentes personales y familiares sospechosos
deberán ser investigados más a fondo ante la presencia de unos resultados normales en las
pruebas de rastreo. Otros pacientes con pruebas de rastreo anormales no deberán ser investigados
más a fondo cuando exista una causa clara de su anomalía. Los límites normales pueden por
tanto no ser iguales a los límites de decisión e intervención.

El número de sujetos normales que deben ser seleccionados para el análisis no debe ser menor a
30; dicho número es aceptado como el más adecuado para la mayoría de las pruebas de
hemostasia que investigan los trastornos de la coagulación.

22 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


En cada prueba, los resultados derivados de las muestras de sujetos sanos se utilizarán para
definir el rango de referencia normal. Los resultados de la mayoría de las pruebas que investigan
los trastornos de la coagulación muestran una distribución normal (curva de Gauss). Es útil
confirmar dicho extremo mediante la inspección visual de los datos, como se puede ver en la
Figura 7.1. Aquellos valores claramente alejados de los de referencia deberán ser excluidos de
los cálculos futuros.

Es comúnmente aceptado que el rango normal o de referencia debe incluir el 95% central de los
valores. Si la distribución difiere llamativamente de la que se ve en la Figura 7.1 (por ejemplo,
que esté desviada en una determinada dirección), será necesario obtener más muestras normales.
Siempre que una distribución esté desviada hacia cualquier dirección será conveniente excluir los
valores del 2,5% de los extremos, dejando los del 95% central.

Si la distribución es normal, deberán calcularse la media y la desviación estándar de los valores


normales (como se ha descrito en la Sección 4), y utilizar la media más 2 SD y la media menos 2
SD como sus límites superior e inferior, respectivamente.

En cualquier caso, el rango normal sólo debe ser utilizado como guía que ayude a la
interpretación clínica.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 23


Figura 7.1

Distribución de los resultados del APTT en sujetos sanos. Los datos que aquí se muestran
tienen una distribución normal, es decir están similarmente distribuidos a cada lado del valor
medio.

APTT medio (30 segundos)


Desviación estándar (2,9 segundos)
Rango normal (24-36 segundos)

APTT (segundos)

24 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


8 REACTIVOS

Cloruro cálcico

Por ejemplo el de la empresa “BDH Chemicals”. Solución molar.

Solución 25 mM: diluir 25 ml de solución 1M en 1 litro de agua destilada en un frasco


volumétrico.

Tampón Barbitúrico de Owren de pH 7,35

5,875 g de dietilbarbitúrico sódico (barbitone sodium)


7,335 g de cloruro sódico

1. Colocar las sustancias mencionadas en un frasco volumétrico y disolverlos en


aproximadamente 780 ml de agua destilada.
2. Añadir 215 ml de ácido hidroclórico 0,1 M
3. Ajustar el volumen a 1 litro con agua destilada.
4. Comprobar el pH y ajustarlo a 7,35 en caso necesario.

Suero Salino Tampón de Owren

200 ml de tampón barbitúrico de Owren


800 ml de suero salino normal (0,9 g % de cloruro sódico)

Tampón de Glioxalina

2,72 g de glioxalina (imidazol)


4,68 g de cloruro sódico

1. Colocar las sustancias en un frasco volumétrico y disolverlas en aproximadamente 650 ml de


agua destilada.
2. Añadir 148,8 ml de ácido clorhídrico 0,1 M y ajustar el pH a 7,3.
3. Ajustar el volumen a 1 litro con agua destilada en caso necesario.

Reactivos para las Pruebas de Rastreo (“screening”)

En los estadios iniciales de la investigación y diagnóstico de los trastornos de la coagulación, la


adecuada selección y aplicación de los reactivos de las pruebas de rastreo son de gran
importancia; especialmente para las pruebas del tiempo de protrombina (PT) y del tiempo de

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 25


tromboplastina parcial activada (APTT). Existe un gran número de reactivos en el mundo.
Cuando se disponga de una gran diversidad de ellos, ha de tenerse en cuenta su diferente
sensibilidad.

Cuando se rastrea un trastorno de la coagulación mediante el PT y el APTT hay que considerar


las siguientes fuentes de información, relacionadas con el rendimiento más frecuente de cada
reactivo:

•= Datos comparativos en relación con otros reactivos de protocolos de EQA (valoración de


calidad externa), como por ejemplo el esquema de EQA internacional (véase la Sección 4);

•= Datos publicados;

•= Estudio local del plasma obtenido de pacientes con defectos conocidos;

•= Hojas de datos de los fabricantes.

La producción local de los reactivos de PT y de APTT puede resultar atractiva desde el punto de
vista economico, pero puede causar dificultades en la estandarización por lo que debe ser
evitada.

También debe mencionarse que algunos fabricantes disponen de diferentes reactivos y que
además la composición de reactivos con el mismo nombre puede ser alterada de vez en cuando.
Por eso no se puede recomendar la utilización de una fuente de material concreta

26 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


9 RECUENTO DE PLAQUETAS

Principio Básico

La sangre se mezcla con un disolvente que causa la hemolisis de los hematíes. El líquido diluido
obtenido se vierte en un hemocitómetro y se recuentan las plaquetas mediante un microscopio, a
ser posible de contraste de fase, si se dispone de él.

Equipo

•= Cámara de recuento fina de fondo plano (hemocitómetro de contraste de fase con reglas
Neubauer).

•= Preferiblemente, un microscopio de contraste de fase, equipado con un condensador de fase


que trabaje a larga distancia; si no se dispone de éste, usar un microscopio óptico corriente.

•= Pipeta de 20 microlitros.

•= Pipeta graduada de 2 ml.

•= Tubo de 12 x 75 mm.

•= Mezclador mecánico.

Reactivo

•= Líquido diluyente: oxalato de amonio al 1% en agua destilada. Guardarlo en el frigorífico y


siempre filtrarlo antes de ser usado.

Muestra

Si la muestra de sangre proviene de un pinchazo en el dedo, la punción debe ser limpia y dejar
salir la sangre libremente. Desechar la primera gota de sangre. Si la muestra proviene de
venopunción, debe ser recogida en una jeringa seca de plástico (o de cristal siliconado) , con una
pequeña aguja, como mínimo de calibre 21. Hay que retirar la aguja antes de que la sangre se
introduzca en un contenedor de plástico con EDTA. La sangre y el anticoagulante deben
mezclarse cuanto antes y suavemente, para evitar la formación de espuma.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 27


Método

1. Pipetear 0,38 ml de líquido diluyente en un tubo de ensayo.

2. Llenar una pipeta de 20 microlitros hasta la marca, eliminando lo que sobre.

3. Añadir el contenido de la pipeta al líquido diluyente e ir vaciándola en pocos minutos,


mediante el paso de la sangre al tubo de ensayo. Mezclar durante al menos 10 minutos,
manual o mecánicamente.

4. Rellenar el hemocitómetro como se describe más abajo.

5. Pipetear la muestra preparada en el hemocitómetro. Dejar un trozo de algodón húmedo o de


papel filtrante en la placa, con el fin de evitar su evaporación.

6. Cubrir la cámara con una placa de Petri durante 10-20 minutos, para que las plaquetas se
precipiten.

7. Mediante un microscopio, contar las plaquetas en grandes cuadrados de 1 mm (= 0,1


microlitros). Contar las plaquetas en todos los cuadrados que sean necesarios para llegar por
lo menos a 100 plaquetas. Éstas pueden ser redondas u ovaladas; su estructura granular
interna y su color púrpura nos permitirán distinguirlas de los artefactos. Se pueden ver en el
mismo campo restos de hematíes lisados por el oxalato de amonio. Si no se dispone de
microscopio de contraste de fase, se puede utilizar un microscopio óptico corriente, siempre
que su condensador proporcione una luz de baja intensidad.

8. Calcular el número de plaquetas por litro de sangre, según la fórmula que se describirá más
adelante.

El Hemocitómetro

La cámara de recuento del hemocitómetro, con reglas de Neubauer clásicas o mejoradas, está
construido de tal forma, que la distancia entre la parte inferior de su cubierta de cristal y su
superficie sea de 0,1 mm. La superficie de la cámara contiene dos áreas especialmente reguladas,
con unas dimensiones que se pueden ver en la Figura 9.1. El mm2 central tiene el doble o el triple
de líneas límite. En las áreas centrales hay 25 cuadrados en las reglas de Neubauer mejoradas y
16 en las clásicas. Cada cuadrado tiene un área de 0,04 mm2 (0,2 x 0,2 mm). Los cuadrados
están, a su vez, divididos en cuadrados más pequeños, cada uno de 0,0025 mm2 (0,05 x 0,05
mm). Los cuadrantes externos del área reglada son cada uno de 1 mm2, y están divididos, a su
vez, en 16 cuadrados.

28 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Cálculos

La fórmula para calcular el recuento plaquetario es la siguiente:

Recuento (células/L) = N x D/A x 10 x 106

Siendo: N = número total de células contadas


D = dilución
A = área total contada (en mm2)
10 = factor para calcular el volumen en microlitros, a partir del área (en mm2) de la
profundidad de la cámara (0,1 mm)
106 = factor de corrección de recuento/microl en microl de recuento

Causas de Error en el Recuento Celular

Cuando se utilice sangre capilar, obtendremos una gota que fluya libremente.

Cuando se utilice sangre anticoagulada se debe mezclar ésta cuidadosamente, invirtiendo el tubo
de sangre por lo menos 20 minutos antes de que sea obtenida la muestra. No agitar bruscamente
el tubo, porque se formará espuma e imposibilitará la utilización de la pipeta con precisión.
Incline el tubo, bien mezclado, hasta un ángulo de 45 grados o un poco más y eche el contenido
de la pipeta en el tubo desde su borde, de igual forma que se hace con la sangre capilar.

Las pipetas para muestras sanguíneas deben estar limpias y secas.

Se debe llenar la pipeta rápidamente, de forma que la sangre sea manejada con exactitud. Esto se
logra poniendo un dispositivo de succión en la pipeta, que permite que se llene hasta el nivel
deseado; si se sobrepasa ligeramente la línea, la sangre sobrante será expulsada tocando con el
borde de la pipeta en un papel de filtro o en una toallita de papel. Si se sobrepasa excesivamente
la línea, se deberá utilizar una pipeta nueva.

No debe haber burbujas de aire en la columna de sangre.

El exterior de la pipeta debe estar libre de sangre antes de ser introducida en el líquido
disolvente, para lo cual hay que tener cuidado de no meter sangre desde su punta.

Una vez que el contenido de la pipeta es descargado en el disolvente, se debe introducir la


mezcla en la pipeta, mediante varias succiones precisas; su finalidad es asegurar que toda la
sangre se ha descargado en el líquido.

El tubo con la sangre diluida debe ser agitado suavemente, durante al menos 2 minutos (a mano o
con un agitador mecánico). Una vez que el tubo ha sido agitado, hay que llenar inmediatamente
le cámara del hemocitómetro mediante una pipeta de Pasteur o un tubo capilar.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 29


La cámara se rellena por acción capilar, de forma que el flujo del líquido desde la pipeta o
capilar sea rápido y suave. Debe ser llenada completamente, de modo que el líquido no se
desborde. Hay que permitir que las células se depositen en el área de recuento durante 10-20
minutos, para después proceder al recuento.

La cámara del hemocitómetro y su cubierta de cristal deben estar limpias y secas antes de su uso.
Se pueden introducir errores importantes con las huellas dactilares o con una película aceitosa.

Se debe contar un número suficiente de células para reducir el error debido a la distribución al
azar de las células. En la práctica, se deben contar al menos 100 células. Otra prueba más,
referente a la correcta distribución de las células en la cámara, es que el número de células
contadas en cada área (por ejemplo, en los cuadrados grandes) no debe diferenciarse en más del
10%.

Controles

Deben hacerse dos diluciones, tomando como buena la media de ambos. Entre ellas debe haber
una similitud del 10%.

Causas de Error en el Recuento de Plaquetas

Es mejor usar sangre obtenida por venopunción que sangre capilar, puesto que las plaquetas se
adhieren a la herida; por ello diluciones sucesivas tomadas de un pinchazo en el dedo no siempre
son reproducibles.

Los grandes errores en el uso de las pipetas y en la hemocitometría se han descrito previamente.
La cámara de recuento debe estar totalmente limpia, ya que las suciedades y los artefactos
podrían ser contados como plaquetas. Hay que lavar la cámara con agua jabonosa y enjuagarla
con agua destilada, secándola mediante una toallita sin gasa. Asegurarse de que el cerrojo de su
cubierta está limpio antes de usarlo.

La presencia de grupos de plaquetas hace que los recuentos no sean fiables. Si la muestra tiene
grupos plaquetarios, debería obtenerse una muestra fresca.

El disolvente de oxalato de amonio debe permanecer frío, debiendo ser desechado si existiera
alguna evidencia de contaminación bacteriana.

El recuento de la muestra debe realizarse en las tres primeras horas tras su obtención.

30 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Figura 9.1

Cámara de recuento del hemocitómetro: (a) Neubauer; (b) Neubauer mejorado.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 31


10 TIEMPO DE HEMORRAGIA

Principio Básico

El tiempo de hemorragia es el tiempo que tarda en detenerse la hemorragia de un corte estándar


en profundidad y longitud, en la piel.

El tiempo de hemorragia está prolongado en pacientes con trombocitopenia, enfermedad de von


Willebrand, trombastenia de Glanzmann, síndrome de Bernard-Soulier, enfermedad de
almacenaje (“storage pool didease”) y otras alteraciones plaquetarias. El fibrinógeno es esencial
para un buen funcionamiento plaquetario y también parece tener un papel importante el factor V.
Por ello el tiempo de hemorragia puede estar también prolongado en pacientes con déficits de
dichos factores. Esta prolongación también se da en pacientes con enfermedad renal,
disproteinemias y alteraciones vasculares.

Determinados fármacos pueden también prolongar el tiempo de hemorragia. Por ejemplo los
fármacos que contienen aspirina pueden interferir con los procesos de la coagulación, y si es
posible, no deben ser tomados durante los 7 días previos a la prueba.

Materiales
•= Esfigmomanómetro (manguito de presión sanguínea)

•= Torundas de limpieza

•= Dispositivo patrón del tiempo de hemorragia1

•= Papel de filtro de 1 mm de grosor

•= Cronómetro

Método

1. El manguito del esfigmomanómetro se coloca alrededor de la parte superior del brazo y se


insufla a 40 mmHg. Dicha presión se mantiene durante toda la prueba.

2. Se limpia la cara dorsal del antebrazo y se coloca el dispositivo de tiempo de hemorragia,


firmemente contra la piel pero sin oprimir. Apretar el gatillo y poner el cronómetro en
marcha.

Se deben evitar las venas superficiales, las cicatrices y los hematomas.

1
El dispositivo comercialmente disponible Simplate R (Organon Teknika) proporciona una incisión de 5 mm de
longitud y 1 mm de profundidad.

32 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


La incisión hay que hacerla en dirección paralela a la longitud del brazo. Los cortes hechos
perpendicularmente sangran mucho más.

3. A intervalos de 30 segundos, extender la sangre que sale con un filtro de papel, acercándolo a
las incisiones, pero sin tocar el borde de la herida.

4. Registrar el tiempo desde la punción hasta la detención de la hemorragia.

Resultados/Interpretación

En adultos el rango normal es hasta 8 minutos, aunque puede variar dependiendo del método
utilizado. Los fármacos que interfieren con la función plaquetaria deben ser rechazados como
causa de resultados anormales.

Nota Importante:
Para cualquier dispositivo de tiempo de hemorragia que sea usado, debe existir un rango normal,
establecido localmente.

Un resultado anormal debe ser repetido.

Si la hemorragia continúa más de 20 minutos, registrar simplemente que el tiempo de hemorragia


es mayor a 20. No continuar la prueba hasta que la hemorragia se detenga.

Existe la posibilidad de que la zona donde se realizan las incisiones para el tiempo de hemorragia
cicatrice demasiado. Hay que informar a los pacientes de que puede producirse una cicatriz como
resultado de esta prueba, antes de que sea completada.

Cita Bibliográfica

Mielke CH. Measurement of the bleeding time. Thrombosis and Haemostasis 1984; 52: 210-211.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 33


11 TIEMPO DE PROTROMBINA (PT)

Principio Básico

Esta prueba refleja la eficacia global de la vía extrínseca. Es sensible a cambios en los factores
V, VII y X y menos para el factor II (protrombina). Es también poco apropiado para detectar
pequeños cambios en los niveles de fibrinógeno, pero además puede ser anormal si los niveles de
fibrinógeno son muy bajos o si está presente un inhibidor. La sensibilidad de la prueba se ve
influenciada por el reactivo y la técnica utilizada, por lo que es importante establecer un rango de
referencia local.

En la Figura 11.1 se muestra la vía medida por el tiempo de protrombina. El reactivo de PT, a
menudo llamado tromboplastina, contiene factor tisular y fosfolípidos.

Equipo

•= Tubos de ensayo

•= Cronómetro

•= Pipetas

•= Baño

•= Coagulómetro

Reactivos

Existen muchos reactivos apropiados comercialmente disponibles. En la Sección 8 se incluyen


notas referentes a la selección de reactivos.

•= Tromboplastina (que puede contener cloruro cálcico)

•= Cloruro cálcico 25 mM (sólo es necesario si el reactivo de tromboplastina no contiene calcio)

34 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Método – Manual

1. En los primeros dos tubos:


Colocar 0,1 ml de plasma normal y calentar a 37ºC durante 2 minutos.
Añadir 0,2 ml de reactivo de tromboplastina (si hay calcio en el reactivo) precalentado(a
37ºC), poner en marcha el cronómetro, mezclar agitando suavemente el tubo y registrar
los tiempos de coagulación.

2. Repetirlo por cada muestra de prueba.

3. Anotar el tiempo de coagulación del paciente, en segundos.

Resultados/Interpretación

Los tiempos de coagulación duplicados no deben diferir entre sí en más del 10 %.

Notas Importantes:
Si el reactivo de tromboplastina no contiene calcio, el procedimiento de la prueba se hará con 0,1
ml de plasma, 0,1 ml de tromboplastina y coagular con 0,1 ml de cloruro cálcico 25 mM
precalentado.

La activación del factor IX, mediante el factor tisular – factor VII se produce in vivo. Bajo las
condiciones de la mayoría de las pruebas de PT, el factor X es activado tan fuertemente, que el
ensayo es insensible al déficit del factor IX u VIII.

La tromboplastina/cloruro cálcico deben ser precalentados durante los 5-30 minutos previos a su
uso.

Los tiempos de coagulación están normalmente influenciados por el uso de diferentes


coagulómetros, dependiendo de cómo y cuándo se detecte el punto final. Esto subraya la
importancia de establecer rangos normales para los métodos habitualmente usados en el
laboratorio.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 35


Figura 11.1

Vía medida por la prueba del tiempo de protrombina

Factor Tisular/Ca++/PL + Factor VII

Factor X Factor Xa
con Factor V/Ca++/PL

Protrombina Trombina
(Factor II) (Factor IIa)

Fibrinógeno Fibrina

PL = Fosfolípido Activación
(“phospholipid”)

36 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


12 TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA (APTT)

Principio básico

Es una prueba no específica de la vía intrínseca. Medido junto con un PT normal, es la prueba de
rastreo más útil para detectar deficiencias en los factores VIII, IX, XI y XII.

El APTT estará prolongado en cualquier deficiencia que implique a las vías comunes
(deficiencias en factores V, X, II y en menor grado el fibrinógeno) y en presencia de inhibidores.
La presencia de algunos inhibidores terapéuticos de la coagulación, como la heparina,
prolongarán también el APTT. Esto es importante para rechazar estos tratamientos como causa
de la prolongación del APTT antes de continuar con otras pruebas.

El camino seguido por el APTT se muestra en la Figura 12.1.

Equipo

•= Pipetas

•= Cronómetros

•= Baño

•= Tubos de ensayo

Reactivos

•= Reactivo de APTT (hay muchos reactivos comerciales adecuados, que pueden diferir en su
sensibilidad).

•= Cloruro cálcico 25 mM.

Método

1. Colocar un tubo con cloruro cálcico a 37ºC, durante 5 minutos, antes de su utilización.

2. Pipetear 0,1 ml de reactivo de APTT en dos tubos de coagulación de cristal a 37ºC.

3. Pipetear 0,1 ml de plasma control en el primer tubo. Poner en marcha el cronómetro


principal. Mezclar. Añadir 0,1 ml de plasma control al segundo tubo. Mezclar.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 37


4. A los 5 minutos, añadir 0,1 ml de cloruro cálcico a cada tubo y seguidamente poner en
marcha un cronómetro para cada tubo. Mezclar. Anotar el tiempo de formación del coágulo.

5. Realizar todas las pruebas por duplicado.

Resultados/Interpretación

Debe establecerse localmente un rango normal.

Un APTT alargado con un PT normal, indica una posible deficiencia de factores VIII, IX, XI,
XII, quininógeno de alto peso molecular, precalicreina, o la presencia de un inhibidor. En casos
con APTT alargado, una mezcla igual, de plasma normal y plasma de prueba debe ser probada
(es decir, una mezcla de 1 parte de plasma de prueba y 1 parte de plasma normal, lo que se
conoce como una mezcla 50:50, ver más abajo). Si el APTT corrige en más del 50% la diferencia
existente entre los tiempos de coagulación del plasma normal y el plasma de prueba, indica la
deficiencia de un factor. Una mala corrección sugiere la presencia de un inhibidor, posiblemente
en uno de los factores de la coagulación del sistema, o de tipo no específico, como el
anticoagulante lúpico (ver Sección 25).

Ejemplo:
APTT control: 35 segundos
APTT de prueba: 60 segundos

Si la mezcla 50:50: 42 segundos - ésta es una buena corrección, es decir existe


deficiencia de un factor, 60 – 42 = 18, 60 – 35 =
25, 25/2 = 12,5; 18 > 12,5

Si la mezcla 50:50: 52 segundos - ésta es una mala corrección, es decir,


probablemente exista un inhibidor, 60 – 52 = 8, 8 <
12,5

Nota Importante:
Como el PT, los tiempos de coagulación también pueden verse influenciados por el uso del
coagulómetro.

En los plasmas de prueba, niveles altos de un factor de la coagulación, pueden compensar los
niveles bajos de otros factores. Por ejemplo, un nivel muy alto del factor VIII durante la reacción
de fase aguda, puede llevar a un APTT normal en presencia de reducciones del factor IX u XI
que pueden ser clínicamente importantes. Si un paciente tiene una historia personal o familiar
sospechosa de alteraciones en la coagulación, investigaciones más complejas, como los ensayos
de factor específicos, pueden estar justificadas aunque el APTT sea normal.

38 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Figura 12.1

Vía medida por el APTT

La activación de contacto implicando a la


precalicreína, al fibrinógeno de alto peso
molecular y a la superficie cargada negativamente

Factor XIII Factor XIIa

Factor XI Factor XIa


con Ca++/PL

Factor IX Factor IXa


con Ca++/PL/Factor VIII

Factor X Factor Xa
con Ca++/PL/Factor V

Factor II Factor IIa

Fibrinógeno Fibrina

Activación PL = Fosfolípido
(“phospholipid”)

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 39


13 PRUEBAS DE MEZCLA PARA LA ULTERIOR INVESTIGACIÓN DE
PT Y APTT ANORMALES

Principio Básico

Las muestras de plasma que resulten tener pruebas de rastreo anormales, es decir PT y APTT,
pueden ser investigadas exhaustivamente para determinar la causa de la anormalidad.
Frecuentemente, podemos obtener información de la naturaleza del defecto mediante
experimentos de mezcla. Se mezcla el plasma de la prueba con plasma normal, o con plasma con
un defecto conocido de la coagulación. Se repite la prueba anotando el grado de corrección. Lo
primero, es importante demostrar que el defecto del plasma de un paciente se corrige con plasma
normal, con el fin de descartar la presencia de un inhibidor. La corrección de la anormalidad
mediante la adición de uno de los reactivos descritos abajo, indica que el reactivo añadido debe
contener la sustancia deficitaria de la muestra de prueba.

Las pruebas de rastreo anormales se repiten en mezclas de igual volumen (llamadas 50:50, ver
más abajo) de plasma aditivo y de plasma de prueba.

Las sustancias que pueden ser utilizadas para las pruebas de mezcla son las siguientes:
•= Plasma normal
•= Plasma viejo
•= Plasma adsorbido
•= Plasma deficitario en factor VIII
•= Plasma deficitario en factor IX

Plasma Viejo

1. Mezclar sangre venosa normal y oxalato sódico 0,1 M en una proporción 1:9

2. Centrifugar la sangre para obtener plasma pobre en plaquetas (ver Sección 3), separado en
condiciones de esterilidad e incubar a 37ºC durante 2-3 días. El PT al final de este periodo
debe ser mayor a 90 segundos con tromboplastinas sensibles.

3. Repartir el plasma en contenedores de plástico y almacenarlos a −35ºC (o menos)

El plasma viejo es deficitario en factores V y VIII.

40 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Plasma Adsorbido

1. Preparar gel de hidróxido de aluminio (alumina)1 en una suspensión uniforme, mediante la


mezcla de un gramo de gel húmedo con 4 ml de agua destilada.

2. Preparar plasma citratado pobre en plaquetas, obtenido de 5 donantes normales, y después, se


mezcla.

3. Mezclar hidróxido de aluminio y plasma precalentado en una proporción 1:9 (1 parte de


hidróxido de aluminio y 9 de plasma) y se incuba la mezcla a 37ºC durante 3 minutos.

4. Centrifugar la mezcla inmediatamente (1700 g durante 3 minutos, a temperatura ambiente)


hasta sedimentar el gel.

5. Poner el plasma sobrenadante en contenedores de plástico, y puede ser almacenado durante


muchas semanas a −35ºC.

El plasma adsorbido es deficitario en factor II, VII, IX y X (factores vitamina K- dependientes).


Debería tener un PT > 60 segundos con un reactivo sensible.

Nota importante. El tiempo de adsorción debe medirse cuidadosamente, ya que una


sobreadsorción dará lugar a la pérdida de otros factores de la coagulación.

Plasma Deficitario en Factor VIII/IX

Los plasmas obtenidos de pacientes con déficits graves aislados (<2 U/dl) de factores VIII o IX
son muy útiles para los estudios de mezcla. Cuando sea posible, estos serán usados con
preferencia sobre el plasma viejo o plasma adsorbido. El plasma seleccionado con este propósito
debe tener un PT normal; un PT normal indica que los factores de la coagulación sintetizados
(producidos) en el hígado están en niveles normales.

Estos plasmas pueden ser liofilizados (congelados en seco) para su almacenamiento a largo plazo
o guardados como plasma a –35ºC (o menos) para ser utilizados en 3 meses.

Se puede descubrir una anomalía cuando se usan mezclas 50:50 de aditivo y plasma de paciente.

En caso de que haya una prolongación aislada del APTT, el plasma deficiente en factor VIII es
preferible al plasma viejo, y del mismo modo, el plasma deficiente en factor IX es preferible al
plasma adsorbido.

Las tablas que van a continuación muestran cómo deben ser interpretados los resultados de las
pruebas de mezcla.

1
El hidróxido de aluminio está disponible en BDH, Poole, BH15 ITD, England.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 41


Defecto en el APTT Viejo o Adsorbido o Plasma
plasma de prueba Deficitario en VIII Deficitario en IX Normal
VIII Abn No corr Corr Corr
IX Abn Corr No corr Corr
XI/XII Abn Corr Corr Corr
Inhibidor Abn No corr No corr No corr

Abn = anormal; No corr = Falta de corrección; Corr = Corrección; Norm = Normal

Defecto en el PT APTT Plasma viejo Plasma Plasma


plasma de prueba Adsorbido Normal
II Abn Abn Corr No corr Corr
V Abn Abn No corr Corr Corr
VII Abn Norm Corr No corr Corr
X Abn Abn Corr No corr Corr

Notas Importantes:
Los inhibidores no específicos que afectan al APTT (como el anticoagulante lúpico) muestran
típicamente una falta de corrección, en cambio, el plasma que contiene inhibidores más débiles o
de bajo título pueden ser corregidos parcialmente con plasma normal.

Los inhibidores específicos contra el factor VIII se pueden asociar a una falta de corrección
inmediata de APTT, al añadirle plasma normal. En otros casos hay una corrección inmediata con
plasma normal, seguida de un alargamiento en la mezcla del APTT. Una mezcla de plasma de
prueba y plasma normal puede ser probada tras una hora y a 37ºC. También se pueden hacer
determinaciones del APTT sobre el plasma normal y el plasma de prueba que han sido incubados
de forma separada pero al mismo tiempo.

Inhibidores específicos contra otros factores de la coagulación son muy raros, pero pueden
aparecer. No podemos generalizar acerca de su comportamiento en experimentos de mezcla,
excepto los inhibidores del factor IX que son típicamente de acción rápida.

42 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


14 TIEMPO DE COAGULACIÓN DE LA TROMBINA

Principio Básico

El tiempo de trombina refleja la reacción entre la trombina y el fibrinógeno.

Trombina

Fibrinógeno Fibrina

Se prolonga cuando los niveles de fibrinógeno son muy bajos, en presencia de heparina y de
sustancias heparina- like, en presencia de otros inhibidores, por ejemplo productos de
degradación de fibrina (fibrinógeno) (FDPs) y cuando el fibrinógeno es cualitativamente1
anormal (disfibrinogenemia).

Equipo

•= Tubos de ensayo

•= Cronómetros

•= Pipetas

•= Baño

Reactivos

•= Solución de trombina que induce la coagulación del plasma normal en unos 15 segundos.

•= Plasma control.

Método- Manual

1. Pipetear 0.2 ml de plasma de prueba y plasma control en tubos separados de coagulación de


cristal.

2. Calentar a 37ºC.

1
La cantidad de la proteína del fibrinógeno presente puede ser normal, pero su estructura está alterada, de modo que
no actúa correctamente.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 43


3. Añadir 0,2 ml de trombina en cada tubo. Poner en marcha un cronómetro para cada tubo.
Anotar el tiempo de coagulación.

Debe establecerse localmente un rango normal.

4. Hacer la prueba por duplicado.

Resultados/Interpretación

Notas Importantes:
La concentración de trombina usada debe ser la que dé un tiempo de coagulación de unos 15
segundos con el plasma normal mezclado (“pooled”) de control. Si se usa trombina concentrada,
diluirla en suero salino a aproximadamente 10-15 u/ml, y posteriormente diluir hasta que se
obtenga un tiempo control apropiado.

La trombina reconstituida puede ser almacenada a –35ºC o menos, y diluida previo uso.

La trombina diluida a temperatura ambiente se deteriora, por lo que debe incluirse en cada grupo
de prueba un plasma normal mezclado (“pooled”) de control.

44 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


15 FIBRINÓGENO (ENSAYO MODIFICADO DE CLAUSS)

Principio Básico

Se preparan diluciones de un plasma normal estándar con una cantidad de fibrinógeno conocida,
en tampón de glioxalina. Se mide el tiempo de coagulación tras añadir la trombina. Se construye
un gráfico de los tiempos de coagulación frente a la concentración de fibrinógeno.

El tiempo de coagulación es proporcional a la concentración de fibrinógeno, y se toma la


concentración a 1/10 para representar el valor de la preparación estándar. El plasma de prueba se
diluye a 1/10 y el resultado se lee de la línea estándar.

Equipo

•= Tubos de coagulación de cristal

•= Pipeta

•= Cronómetro

Reactivos

•= Plasma estándar o de referencia con una concentración conocida de fibrinógeno

•= Trombina > 30 u/ml (la concentración puede variar según su procedencia)

•= Tampón de Imidazol (glioxalina) a pH 7,35

Método

1. Preparar diluciones a 1/5, 1/10, y 1/20 de plasma estándar en tampón de imidazol.

2. Pipetear por duplicado 0,2 ml de cada dilución en tubos de coagulación de cristal.

3. Calentar a 37ºC durante 2 minutos.

4. Añadir 0,2 ml de trombina (30 u/ml) y medir el tiempo de coagulación con el cronómetro.

5. Hacer la prueba por duplicado.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 45


6. Representar en un papel gráfico logaritmico, la media del tiempo de coagulación frente a la
concentración de fibrinógeno. Considerar la dilución a 1/10 como el valor estándar.

7. Diluir el plasma de prueba a 1/10, determinar el tiempo de coagulación y leer el valor de


fibrinógeno correspondiente en el gráfico.

Resultados/Interpretación

Se debe establecer localmente un rango normal, aunque normalmente es de 1,5-3,5 g/l.


Para la mayoría de las técnicas de Clauss, la relación entre el tiempo de coagulación y la
concentración de fibrinógeno es lineal por encima del rango limitado de los tiempos de
coagulación, típicamente de 10-25 segundos. Para un plasma de prueba normal se puede usar una
dilución a 1/10. Para concentraciones menores, por ejemplo 0,75-1,5 g/l debe diluirse el plasma 1
en 5 (y el valor leído del gráfico multiplicarse por 5/10). Para niveles <0,75 g/l el plasma de
prueba se diluye en 1/2 (y el valor leído en el gráfico multiplicarse por 2/10). Para niveles
mayores (>4 g/l) el plasma de prueba debe diluirse a 1/20 (y el valor leído del gráfico
multiplicarse por 20/10). Estos cálculos corrigen la diferencia existente en las diluciones de las
muestras de prueba y las muestras de plasma estándar.

Datos de Calibración Típicos

(Recordar que la curva de calibración debe establecerse con los reactivos de uso local).
Plasma estándar – 2,1 g/l de fibrinógeno

Dilución del estándar Concentración de Tiempo de coagulación


fibrinógeno (g/l) (segundos)

1/5 4,2 g/l 8,5 segundos

1/10 2,1 g/l 14 segundos

1/15 1,4 g/l 19,5 segundos

1/20 1,05 g/l 24,5 segundos

46 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Ejemplos:

Plasma de prueba 1 – diluida 1 en 10, tiempo de coagulación de 15 segundos.


Fibrinógeno = 1,9 g/l (según el gráfico de calibración)

Plasma de prueba 2 – diluida 1 en 5, tiempo de coagulación de 16 segundos.


Fibrinógeno = 1,8 g/l según los gráficos de calibración
x 5/10 (ya que dilución a 1/5 es mejor que a 1/10)
= 0,9 g/l

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 47


16 RASTREO DEL FACTOR XIII

Principio Básico

La trombina y el calcio (Ca) son necesarios para la activación del factor XIII que estabiliza el
entrecruzamiento de la fibrina. En este método, a pesar de usar plasma citratado, hay suficientes
iones de Ca disponibles para activar el factor XIII. Para control se utiliza plasma anticoagulado
con ácido etilendiaminotetracético (EDTA). En este plasma, el EDTA se liga completamente a
los iones de Ca, lo que significa que el factor XIII no puede unirse a la fibrina. La adición de
ácido acético 2% o de urea 5 M termina lisando los coágulos no ligados. El plasma citratado que
contenga más de 10 u/dl de actividad de factor XIII tiene un coágulo insoluble. La prueba es
generalmente más sensible si se emplea ácido acético en vez de urea, es decir el coágulo se
disolverá a niveles más altos de factor XIII en presencia de ácido acético.

Equipo

•= Tubos de cristal de 75 x 10 mm

•= Tapones

Reactivos

•= Suero salino al 0,9%

•= Trombina 30 u/ml

•= Plasma EDTA normal

•= Ácido acético 2%

Método

1. Añadir 0,2 ml de plasma citratado de prueba a 0,2 ml de suero salino 0,9% en un tubo de
cristal. Para un control positivo, repetir con plasma EDTA (0,2 ml). Para un control negativo,
repetirlo con 0,2 ml de plasma citratado normal.

2. Añadir 0,1 ml de trombina 30 u/ml. Mezclar.

3. Dejar durante 30 minutos a 37ºC.

4. Sacudir suavemente los tubos para separar el coágulo de la pared del tubo.

48 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


5. Añadir 5 ml de ácido acético 2% y tapar el tubo. Dejar a temperatura ambiente durante 12
horas.

Resultados/Interpretación

El plasma EDTA no debe tener un coágulo visible.

El plasma citratado normal debe tener un coágulo íntegro visible.

Si un coágulo no es visible en el plasma de prueba, el sujeto presenta una deficiencia de factor


XIII.

Nota Importante:
Se puede usar urea 5 M en lugar de ácido acético 2%. Con urea, hay que incrementar a 18 horas
el tiempo de incubación para la disolución del coágulo. Este método es menos sensible que el
realizado con ácido acético.

Rango Normal
Los sujetos sanos tienen un coágulo visible tras 12 horas en ácido acético, al 2%.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 49


17 ENSAYOS BASADOS EN EL TIEMPO DE PROTROMBINA
(Factores II, V, VII y X)

Principio Básico

Los ensayos de factores II, V, VII y X pueden ser realizados usando un ensayo en un tiempo
basado en el tiempo de protrombina. El ensayo compara la capacidad que tienen diluciones de un
plasma estándar o de referencia y de un plasma de prueba, para corregir el tiempo de
protrombina, de un plasma que se conoce que es totalmente deficiente en el factor de la
coagulación que se está midiendo. Por ejemplo, en un ensayo de factor V, que será descrito más
adelante, el plasma es deficiente en factor V pero contiene cantidades normales de factores II,
VII, X y fibrinógeno. Los factores de la coagulación II, VII y X se pueden ensayar de forma
similar, mediante la sustitución del plasma deficiente apropiado por el plasma deficiente en
factor V, como en el ejemplo que se cita más adelante. El plasma de referencia apropiado
contiene una concentración conocida del factor para el que se está probando.

Equipo

•= Pipetas

•= Tubos de coagulación

•= Cronómetros

•= Baño de hielo

•= Baño

Reactivos

•= Plasma deficiente en factor V (puede ser una deficiencia congénita o una deficiencia artificial
(plasma viejo) del factor V).

•= Tampón de suero salino de Owren (OBS) o tampón de glioxalina (ver Sección 8).

•= Plasma citratado pobre en plaquetas – de prueba y estándar.

Para el estándar, usar una mezcla (pool) de plasma normal de 20 donantes (mantenido a –
70ºC o menos) o un plasma de referencia o estándar comercial. En el plasma de referencia, se
debe conocer la concentración del factor V.

•= Tromboplastina/calcio (como se usa en las pruebas de PT).

50 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Método

1. Tanto para los plasmas de prueba como para los estándar, preparar diluciones en tubos de
plástico, de la forma siguiente:

Dilución Plasma (ml) OBS (ml)


1/5 0,1 0,4
1/10 0,1 0,9
1/20 0,5 de dilución 1/10 0,5
1/40 0,5 de dilución 1/20 0,5

Nota Importante:
Mezclar bien la dilución a 1/10 antes de usarla para preparar una dilución a 1/20. Mezclar
bien la dilución a 1/20 antes de usarla para preparar una dilución a 1/40. Mantener todas las
diluciones en hielo (sólo es necesario hacerlo cuando las diluciones no son probadas
inmediatamente después de su preparación, o si la temperatura ambiente excede los 25ºC).

2. Probar cada dilución de plasma de referencia o estándar, de la forma siguiente:


i) Pipetear 0,1 ml de cada dilución en un tubo de cristal de 75 x 10 mm.
ii) Añadir 0,1 ml de plasma deficiente en factor V.
iii) Calentar a 37ºC durante 2 minutos.
iv) Añadir 0,2 ml de reactivo de tromboplastina/calcio precalentado. Poner en marcha
el cronómetro y mezclar.

Nota Importante:
Si el reactivo de tromboplastina no contiene calcio, se añaden 0,1 ml de tromboplastina a la
mezcla de la dilución y al plasma deficiente, y tras esperar 1-2 minutos para calentarlo a
37ºC, se coagula la mezcla con 0,1 ml de calcio precalentado (a 37ºC).

3. Anotar el tiempo de coagulación.

4. Repetir para las diluciones del plasma de prueba. Para los plasmas de prueba que se prevén
que son normales, probar diluciones a 1/10, 1/20 y 1/40. Para los plasmas de prueba que se
prevén que tienen niveles reducidos, probar diluciones a 1/5, 1/10 y 1/20.

Una prueba en blanco debe ser también estudiada, de la forma siguiente:


1 ml de OBS
0,1 ml de plasma deficiente en factor V
0,2 ml de reactivo de tromboplastina/calcio

El tiempo de coagulación de la prueba en blanco, refleja le calidad del plasma deficiente y debe
ser equivalente a menos del 1% del plasma de referencia.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 51


Resultados/Interpretación

Representar el tiempo de coagulación del plasma control frente a la concentración del factor V,
sobre papel logarítmico de 3 x 2 ciclos. Un ejemplo de tal gráfico (para un ensayo de factor VIII)
se muestra en la Sección 18. A la dilución 1/10 se le asigna arbitrariamente un valor del 100%,
así la dilución 1/5 es equivalente a 200%, etc.
Alternativamente, representar la concentración sobre una escala logarítmica y el tiempo de
coagulación sobre una escala lineal.

La cantidad relativa de factor V en el plasma del paciente comparado con el plasma normal o
material de referencia estándar se extrapola de los gráficos. Un ejemplo de esto se muestra más
adelante, en la Sección sobre los ensayos basados en el APTT (Figura 18.1). El tiempo de
coagulación equivalente al 100% de la prueba (el punto donde la linea de la prueba cruza el
100% de actividad) se lee de la linea standar (es decir la concentración del standar que da ese
determinado tiempo de coagulación). Así se obtiene la concentración de la prueba en % del
estándar. Este % se multiplica por la concentración del factor de la coagulación del estándar (en
u/dl), con lo que se obtiene la concentración de la prueba (en u/dl).

Rango Normal
El rango normal para cada uno de estos factores de la coagulación, debe determinarse
localmente, pero a menudo tiene un límite inferior de 50-60 u/dl.

52 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


18 ENSAYOS DE FACTOR BASADOS EN EL APTT
(ENSAYO EN UN TIEMPO DE FVIII:C, FIX, FXI O FXII)

Principio Básico

Se describirá aquí el ensayo en un tiempo del factor VIII. El ensayo compara la capacidad de
diluciones de plasmas estándar y de plasmas de prueba, para corregir el APTT de un plasma que
se conoce totalmente deficitario en factor VIII, pero que contiene todos los demás factores
necesarios para una coagulación normal. Para los factores IX, XI y XII el ensayo es básicamente
el mismo y se realiza mediante la sustitución del plasma deficiente apropiado por plasma
deficiente en factor VIII, y tras la selección del plasma de referencia adecuado.

Equipo

•= Tubos de plástico

•= Pipeta

•= Tubos de cristal de 75 x 10 mm

•= Baño de hielo

•= Baño

Reactivos

•= Prueba del plasma citratado pobre en plaquetas (ver Sección 3) y del plasma estándar.

El plasma estándar usado debe ser una mezcla (“pool”) de plasma localmente preparada y
mantenida a –70ºC o menos, o un plasma estándar comercial. En cualquiera de los casos, este
plasma de referencia debe ser calibrado frente a un estándar internacional para el factor VIII.
No es aceptable suponer que un plasma normal mezclado (“pooled”) tenga 100 u/dl de factor
VIII:C, ya que normalmente no es así.

•= Plasma deficiente en factor VIII.

Está disponible comercialmente o puede ser recogido de un donante cuyo nivel de factor VIII
sea menor de 1 u/dl, que no tenga anticuerpos antiVIII, que no haya recibido tratamiento
durante 2 semanas y que tenga pruebas de función hepática normales. Una función hepática
anormal puede causar un descenso en otros factores de la coagulación. Dicho descenso puede
provocar un ensayo no específico. Este plasma puede almacenarse en partes alícuotas a –
35ºC. Es preferible usar plasma deficiente en factor VIII, producido por inmunodepleción del
factor VIII desde un plasma normal, usando un anticuerpo monoclonal. Este tipo de material

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 53


está comercialmente disponible. La preparación comercial tiene la ventaja de la seguridad
viral en comparación con el plasma de gente con hemofilia que ha sido tratada con productos
plasmáticos. Sin embargo, no todo el plasma inmunodeplecionado tiene <1 u/dl, lo que debe
ser comprobado.

•= Reactivo de APTT

•= Suero salino tampón de Owren (OBS) o tampón de glioxalina (ver Sección 8).

•= CaCl2 25 mM.

Método

1. Hacer diluciones a 1/10 de plasma estándar y plasma de prueba en suero salino tampon, en
tubos de plástico. (Si se espera que el plasma de prueba tenga un nivel muy bajo de factor
VIII, empezar con una dilución a 1/5).

2. Usando volúmenes de 0,2 ml, hacer dobles diluciones en OBS de plasma estándar y plasma
de prueba desde 1/10 a 1/40,en tubos de plástico. (Mezclar bien cada dilución antes de
transferirlas al siguiente tubo). Mantener todas las diluciones en hielo ya que el factor VIII es
lábil (fácilmente destruible). (Esto sólo es necesario si las diluciones no se prueban
inmediatamente tras su preparación o si la temperatura ambiente excede los 25ºC).

3. Pipetear 0,1 ml de cada dilución estándar en un tubo de cristal de 75 x 10 mm.

4. Añadir 0,1 ml de plasma deficiente en factor VIII y transferirlo a un baño a 37ºC.

5. Añadir 0,1 ml de reactivo de APTT e incubarlo durante 5 minutos.

6. A los 5 minutos, añadir 0,1 ml de CaCl2 y registrar el tiempo de coagulación.

Una prueba en blanco también puede establecerse de la siguiente forma:


0,1 ml de OBS
0,1 ml de plasma deficiente en factor VIII
0,1ml de reactivo de APTT
Incubar 5 minutos
0,1 ml de CaCl2

El tiempo de coagulación de la prueba en blanco debe ser mayor que el tiempo de la actividad
del factor VIII al 1% del estándar según el gráfico de calibración. Si el tiempo es menor, indica
que el plasma no es totalmente deficiente en factor VIII y de este modo no es adecuado para la
prueba.

54 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Resultados/Interpretación

Representar los resultados como se describe en la Sección 17, sobre un papel gráfico logarítmico
o log/lineal.

A la dilución 1/10 se le asigna arbitrariamente un valor de 100%, a la 1/20 un valor de 50% y a la


1/40 un valor de 25%.

Se deben obtener líneas rectas y paralelas entre sí.

Leer la concentración de la muestra de prueba como se muestra en el gráfico de la Figura 18.1 y


como se describió en la Sección 17. En este ejemplo la prueba tiene una concentración de factor
VIII que es el 7% de la estándar. Si la estándar tiene una concentración de 85 u/dl, la prueba
tiene una concentración de 85 u/dl x 7% = 6 u/dl.

Si las líneas no son paralelas se debe repetir el ensayo.

Las líneas no paralelas pueden deberse a un error técnico. Si se descarta un error técnico, las
líneas no paralelas pueden deberse a la presencia de un inhibidor, el cual mostraría un patrón
convergente.

Nota Importante:
Si la concentración del factor VIII está próxima a 0 en el plasma de prueba (es decir. Los
tiempos de coagulación de todas las diluciones son similares a la prueba en blanco) pueden
aparecer líneas no paralelas.

Rango normal
El rango normal debe establecerse localmente, pero frecuentemente tiene un límite inferior de
50-60 u/dl.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 55


Figura 18.1

Gráfico del ensayo del factor VIII

Tiempo de
Coagulación (segundos)
Prueba
Estándar

% Actividad del factor VIII

56 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


19 RASTREO DEL INHIBIDOR DEL FACTOR DE LA COAGULACIÓN
BASADO EN EL APTT

Principio Básico

Los inhibidores de la coagulación que afectan al APTT pueden actuar inmediatamente o ser
dependientes del tiempo. La prueba de un plasma que contenga un inhibidor de acción inmediata,
mostrará poca o ninguna corrección del tiempo de coagulación cuando se mezcle con plasma
normal. Por el contrario, el plasma con inhibidores dependientes del tiempo requieren un periodo
de incubación con plasma normal antes de que los inhibidores puedan ser detectados (ver
Sección 13).

El plasma normal y el de prueba se incuban a 37ºC durante 120 minutos, ambos por separado y
como una mezcla 50:50. Entonces se determina el APTT en el plasma normal, el plasma de
prueba, la mezcla incubada y una mezcla preparada con volúmenes iguales de plasma de prueba
y plasma normal, tras su incubación por separado (mezcla inmediata). Se comparan los grados de
corrección del APTT de cada mezcla.

Una mala corrección en:


(a) la mezcla preparada tras incubación separada sugiere que existe un inhibidor de acción
inmediata.
(b) la mezcla incubada sugiere la presencia de un inhibidor dependiente del tiempo.

Equipo

•= Pipetas

•= Tubos de ensayo

•= Baño de hielo

•= Baño

Reactivos

•= Plasma normal (mezcla, “pool”, de 20 donantes).

•= Plasma de prueba.

•= Reactivos para el APTT.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 57


Método

1. Se preparan 3 tubos de plástico – A, B y C. Poner 0,5 ml de plasma normal en el tubo A, 0,5


ml de plasma de prueba en el tubo B y 0,2 ml de plasma normal y 0,2 ml de plasma de
prueba en el tubo C.

2. Incubar durante 120 minutos a 37ºC.

3. Poner en hielo todos los tubos.

4. Hacer una mezcla 50:50 de los tubos A y B – este es el tubo D, que sirve como una mezcla
inmediata.

5. Realizar un APTT por duplicado en A, C, D y B (en este orden).

Resultados/Interpretación

Ejemplo:

Muestra 1 2 3

A – plasma normal 40 40 40
B – plasma de prueba 90 90 90
C – plasma de prueba + plasma normal (incubado) 45 70 70
D – plasma de prueba + plasma normal (no incubado) 45 48 70

Por ejemplo
1 = un plasma con un defecto intrínseco pero sin inhibidor.
2 = un plasma que contiene un inhibidor dependiente del tiempo.
3 = un plasma que contiene un inhibidor de acción inmediata.

58 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


20 ACTIVIDAD DEL COFACTOR RISTOCETINA / ACTIVIDAD DEL
FACTOR VON WILLEMBRAND (FVW:RiCof o FVW:Act)

Principio Básico

La medición del cofactor de ristocetina es esencial para el diagnóstico de una posible enfermedad
de von Willebrand. Mientras que la agregación plaquetaria inducida por ristocetina (en el plasma
rico en plaquetas) puede producirse cuando se realizan los estudios de agregación plaquetaria, la
prueba no es suficientemente sensible, de forma que se puede encontrar una alteración de la
agregación plaquetaria diferente a la de von Willebrand. El ensayo FVW:RicoF es especialmente
útil para la detección de la enfermedad de VW de tipo 2A, en la que el antígeno del FVW puede
ser normal o casi normal pero en la que el FVW:RicoF está muy disminuido.

Ensayo de Cofactor de Ristocetina

El método combina un método de ensayo macroscópico (visible a simple vista) y la técnica de


fijación de plaquetas de Evans y Austen (ver más adelante).

Equipo

•= Tubos de ensayo

•= Pipetas

•= Baños

Reactivos

•= Plasma de referencia

•= Plaquetas lavadas y fijadas

Las plaquetas normales humanas fijadas con formaldehído se preparan de concentrados


plaquetarios, como los usados para el tratamiento de pacientes con alteraciones plaquetarias,
mediante el método de Evans y Austen (Brit. J. Haematol. 1977; 37:280). Para este método
ver página 61.

•= Ristocetina1

Preparación de solución básica (“stock”): se diluyen 100 mg de polvo en 3.3 ml de suero salino y
se coloca en cantidades de 0,1 ml en tubos de plástico tapados, que se guardan a –70ºC. La

1
SO4 A Ristocetina Macrofarm Ltd, Third Floor, 27 Cockspur Street, Trafalgar Square, London SW1Y 5BN.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 59


concentración final en el tubo de ensayo es de 1,0 mg/ml. Puesto que hay una dilución de 1 en 4
en el ensayo, éste requiere una solución de 4,0 mg/ml. Para obtener 4,0 mg/ml, añadir 0,65 ml de
suero salino a 0,1 ml de solución “stock”. (Esto debe dar un tiempo en blanco, es decir 0,2 de
plaquetas + 0,1 ml de ristocetina + 0,1 de tampón de >60 segundos).

•= 6g% de tampón de suero salino-citratado con albúmina.

Usar suero salino-citratado (1 parte de citrato trisódico 0,11 M: 5 partes de suero salino normal)
con 1,2g de suero bovino al que se ha añadido albúmina.

Método
1. Usando el tampón de suero salino-citratado con albúmina, diluir el plasma normal y el
plasma de prueba de la siguiente forma:
Plasma estándar 1/2, 1/4, 1/8
Plasma de prueba 1/2, 1/4, 1/8

2. Cada dilución se prueba a temperatura ambiente, de la forma siguiente:

En un tubo de coagulación de cristal colocar:


0,2 ml de plaquetas lavadas y fijadas (en una solución en la que hay plaquetas
suspendidas en una cantidad de 800 x 109/l).
0,1 ml de plasma diluido.

Mezclar todo lo posible, evitando las burbujas. Añadir 0,1 ml de ristocetina (4,0 mg/ml,
dando una concentración final de 1,0 mg/ml).

Poner en marcha el cronómetro e inclinar el tubo rápidamente de un lado a otro sobre un


fondo oscuro con una lámpara.

Anotar el tiempo que tarda en formarse un agregado grande y visible. Probar cada dilución
por duplicado, y por triplicado si la diferencia entre las dos primeras pruebas es >10%.

Resultados/Interpretación

Cálculo
Representar el tiempo que tardan en aglutinarse las diluciones de plasma normal frente a
dilución/concentración, en un papel logarítmico de 2 ciclos, como se describe en la Sección 17.
Representar los tiempos obtenidos con las diluciones del plasma de prueba. Los gráficos deben
mostrar líneas rectas y paralelas.

Se lee la concentración del cofactor de ristocetina del plasma de prueba a partir de la curva
estándar y corregida por dilución y el valor del estándar, de forma similar a la descrita en la
Sección17.

Rango Normal
El rango normal debe establecerse localmente, pero normalmente es de unos 50-150 iu/dl.

60 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Preparación de Plaquetas Fijadas

Equipo

•= Contenedor de plástico tapado

•= Centrifugadora

Reactivos

•= Solución EDTA al 0,2%.

2 g de EDTA disódico, 8,5 g de NaCl, agua destilada hasta 1 litro, pH 6,4

•= Solución fijadora

Solución de formaldehído 20 ml x 40% (o formaldehído 22,2 ml al 36%). 0,2 g de EDTA


disódico, 8,5 g de NaCl, 0,4 de fosfato de hidrógeno disódico, 1,1 g de dihidrato de fosfato
dihidrogenado de sodio, agua destilada hasta 1 litro, pH 6,4.

•= Solución de lavado

1 parte de solución de citrato trisódico (3,8%), 5 partes de solución salina, pH 6,4.

•= Solución de suspensión

Como la solución de lavado, pero con un pH de 7,4.

•= Solución de almacenaje

0,2 g de EDTA disódico, 8,5 g de NaCl, 0,10 g de azida sódica, agua destilada hasta 1 litro,
pH 6,4.

Método

1. Obtener plaquetas lo más frescas posibles en dextrosa de fosfato citrato (como el usado para
la recogida de productos sanguíneos) o coger sangre y ponerla en citrato 0.109 M y preparar
plasma rico en plaquetas (PRP).

2. Dejar el PRP en un contenedor de plástico tapado a temperatura ambiente durante 1 hora.


Después a 37ºC durante otra hora. Mezclar 9 partes de PRP con 1 parte de solución de
EDTA. Dejarlo a temperatura ambiente durante 2 minutos.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 61


3. Añadir un volumen igual de solución fijadora a 4ºC; durante toda la noche mantenerlo a 4ºC.

4. Centrifugar a 280 g durante 20 minutos. Retirar el sobrenadante y dejar escurrir el grumo


plaquetario.

5. Resuspender las plaquetas en una solución de lavado. Usar un volumen de solución de lavado
igual al 2% del volumen del PRP inicial.

6. Diluir la suspensión al 25% del volumen del PRP inicial. Dejar a 4ºC durante 1 hora.

7. Centrifugar a 280 g durante 20 minutos y dejar escurrir.

8. Re-suspender el grumo en una solución suspensora. Usar un volumen de solución suspensora


que dé una concentración final de aproximadamente 800 x 109/L.

Las plaquetas reposarán almacenadas en un recipiente amplio. Las plaquetas mantendrán sus
propiedades durante al menos 2 meses. Antes de que las plaquetas almacenadas se utilicen para
un ensayo, extraer las soluciones de almacenamiento y sustituir la solución por una solución de
suspensión fresca de igual volumen.

62 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


21 ANTÍGENO DEL FACTOR VON WILLEBRAND
(FVW:Ag) MEDIANTE ELISA

Principio Básico

Un anticuerpo policlonal humano contra el factor von Willebrand está ligado a la superficie de
plástico de las cisternas de una placa de microtítulo. Se añaden e incuban diluciones del plasma
de prueba y del plasma estándar, momento en el que el FVW se une al anticuerpo. Se añade un
segundo anticuerpo marcado con enzimas, el cual también se une al FVW. La cantidad de
anticuerpo unido, y por tanto del FVW existente, se cuantifica añadiendo un sustrato enzimático,
hecho que va seguido de la aparición de un determinado color.

Equipo

•= Una cámara húmeda

•= Papel absorbente

•= Papel de aluminio

•= Pipeta o pipeta de múltiples canales

•= Placas desechables de microtítulo y lector de placa

Tampones (“buffers”)

•= Tampón de carbonato al 0,05 M y con un pH de 9,6

Para 1 litro:
1,59 g de carbonato sódico
2,93 g de carbonato de hidrógeno sódico
0,20 de azida sódica

•= Tampón de fosfato salino al 0,01 M y con un pH de 7,2

Para 1 litro:
0,345 g de fosfato dihidrógeno sódico
2,680 g de fosfato hidrógeno disódico 12H2O
8,474 g de cloruro sódico
Tween PBS 20, 1 ml/L
Tween PBS 20, 0,5 ml/L

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 63


•= Tampón de fosfato citrato al 0,1 M y con pH de 5,0

Para 1 litro:
7,30 g de ácido cítrico
23,87 g de fosfato disódico de hidrógeno 12H2O

Solución Sustrato (Tintura)

80 mg de 1,2 dicloruro de ortofenilenediamina, disueltos en 15 ml de fosfato citrato tampon y 10


microlitros de 20 volúmenes. Añadir peróxido de hidrógeno (NOTA: CADA VEZ DEBE
REALIZARSE EN FRESCO)

Otros Materiales

•= Anticuerpo contra el factor von Willebrand1

•= Anticuerpo contra el factor von Willebrand, conjugado con la enzima peroxidasa2

Se pueden utilizar otras fuentes de anticuerpos con igual éxito. La dilución del anticuerpo
sugerido más abajo puede variar, dependiendo de la fuente y del número de lote del anticuerpo
utilizado.

•= Solución de ácido sulfúrico al 10%

Método

1. En cada pocillo a utilizar se añaden 100 microlitros de anticuerpo diluidos en 1/1000 de


tampón de carbonato. Después se incuba la placa durante 1 hora, en una caja húmeda y a
temperatura ambiente.

2. Lavar los pocillos, llenándolos de 0,5 ml/L de Tween PBS. Dar la vuelta a las placas
poniéndolas hacia abajo, y dándoles un ligero toque en papel absorbente. Repítase lo mismo
4 veces.

3. Dilúyase el plasma estándar de la siguiente forma: 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, 1/80, 1/160, 1/320
en 1 ml/l de Tween PBS.

Diluir las muestras del plasma de prueba de la siguiente forma: 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 para casos
normales. 1/5---- > para los casos en los que se esperen resultados bajos, debe hacerse en 1 ml/L
de Tween PBS.

1
Por ejemplo, FVW antihumano de conejo de DAKO a/s. Producción Svej, DK-2600 Glastrup, Dinamarca.
2
También de DAKO

64 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Añadir a los pocillos 100 microlitros de cada dilución, incubar durante 1 hora y lavar la placa
como se mencionó previamente.

4. Diluir el anticuerpo, conjugado con la peroxidasa al 1/1000, en 1 ml/L de Tween PBS.


Añadir 100 microlitros de esta solución a cada pocillo, e incubarla en una cámara húmeda
durante 1 hora y a temperatura ambiente.

5. Preparar ahora el sustrato, y protegerlo de la luz con papel de aluminio colocado alrededor de
todo el contenedor. También hay que mantenerlo mezclándose, hasta que los cristales o la
tableta se disuelvan (añadir peróxido de hidrógeno inmediatamente antes de usar).

6. Encender el lector de la placa.

7. Lavar los pocillos dos veces en 0,5 ml ml/L de Tween PBS, y una vez en 0,5 ml de tampón
de citrato fosfato al 0,1 M.

8. Añadir a cada pocillo 100 microlitros de solución fresca de sustrato, e incubar la placa en una
caja húmeda a temperatura ambiente, durante aproximadamente 6 minutos (hasta que el color
sea visible en la dilución estándar más baja).

9. Parar la reacción añadiendo 100 microlitros de solución al 10% de ácido sulfúrico a cada
pocillo, al mismo ritmo con el que se añadió al sustrato. Si se utiliza una pipeta de múltiples
canales, es conveniente añadir sustrato a cada fila de pocillos por turnos a intervalos de 10
segundos. Después, añadir ácido sulfúrico con la misma secuencia, a intervalos de 10
segundos.

10. Leer la densidad óptica (OD) a 492 nm.

Resultados /Interpretación

Los resultados se obtienen trazando en un papel grafico logaritmico la OD y la dilución.


Comparar la OD del plasma de referencia con las diluciones. Comparar la OD de los plasmas de
prueba con las diluciones. Localizar la OD de la muestra de la prueba de la curva estándar, y lea
la dilución correspondiente del plasma de referencia. La concentración del antígeno del FVW
puede calcularse mediante la multiplicación de la concentración del estándar por el cociente entre
la dilución de prueba y la dilución estándar. Para cálculos de la muestra véase la Sección 17.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 65


ENSAYO DE INMUNOELECTROFORESIS
22
(“LAURELL´S ROCKET”) PARA EL ANTÍGENO
DEL FACTOR VON WILLEBRAND (FVW:Ag)

Principio Básico

Se permite la emigración de una cantidad conocida de la muestra por un campo eléctrico en un


gel de agarosa, el cual contiene anticuerpos específicos contra la proteína medida. Puesto que la
mayoría de las proteínas plasmáticas (antígenos) están cargadas negativamente a un pH de 8,6,
dichas proteínas emigran hacia el ánodo (extremo del gel cargado positivamente). Al comienzo
de la electroforesis se construye un complejo (combinación) soluble entre el antígeno de la
muestra y los anticuerpos del gel. Cuando haya más antígeno que anticuerpo, el complejo
mencionado es soluble en el gel. La mayor precipitación aparece cuando estén presentes
cantidades equivalentes de antígeno y anticuerpo. Cuando la concentración del antígeno sea más
alta en el centro de su camino de emigración, la precipitación comenzará en los lados y se
evidenciará un arco de precipitación con forma de cohete (“rocket”). La altura del cohete
(“rocket”), que está en relación con el área existente bajo el arco de la precipitación es
proporcional a la concentración del antígeno de la muestra.

Equipo

•= Corriente eléctrica de al menos 100 mA y 200 v, con capacidad para proporcionar un flujo y
voltaje constantes.

•= Aparato de electroforesis de agua, con bandejas tampon y cubierta.

•= Papel de filtro- Whatman número 3 (la fibra debe estar orientada en dirección a su anchura y
no en dirección a la longitud del papel).

•= Placa de vidrio de 110 x 205 x 1,0 mm, para moldear el gel.

•= Marcos en U de plástico o metálicos, de 110 x 205 x 1,0 mm (1 cm de anchura por todos sus
lados) o de 110 x 100 x 1,0 mm.

•= Clips de presa (“bull dog clips”).

•= Cortador de pocillo, de 4 mm de diámetro.

•= Pipeta de Pasteur conectada al vacío (conexión lateral a una bomba de Venturi).

•= Cajas de plástico con cubierta de 120 x 240 x 70 mm, para enjuagar, teñir y desteñir las
placas.

66 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Reactivos

•= Tampón veronal “a” (para muestras de cámara y diluyentes).

20 g de 5,5 dietil barbiturato de sodio (barbital sódico)


2,8 g de ácido dietil barbitúrico
0,2 g de azida sódica

Disolver en 800-900 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 8,6 y completar hasta 1 litro.


Guardar en un frigorífico.

Solución de trabajo: diluir la solución básica (“stock”) a 1:4, en agua destilada.

•= Tampón veronal “b” (para preparar el gel de agarosa).

Solución de trabajo: diluir la solución básica (tampón veronal “a”) al 1:2,5 en agua destilada.

•= Gel de Agarosa al 1% (agarosa con una electroendosmosis; debe usarse una mezcla de < 0,10
y sulfato < 0,20%)1

Poner 1 g de agarosa en un frasco cónico. Añadir 100 ml de tampón de veronal “b” (ver más
arriba). Mezclar el frasco cónico mediante batido y después cubrir la boca del frasco con
papel de aluminio. Colocarlo en un vaso de precipitación que contenga agua y ponerlo a
hervir. Dejarlo durante 20 minutos, para que la agarosa se disuelva. Dividir en partes iguales,
en tubos de cristal, en volúmenes adecuados para preparar una placa de gel cada vez (por
ejemplo, 20 ml de volumen para un gel de 110 x 205 x 1 mm). Dejar que se enfríe y
guardarlo a 4ºC hasta 6 semanas.

•= Antisuero de conejo contra el antígeno del FVW (disponible comercialmente).

•= Tinción “Coomassie” azul brillante R250.

Añadir 0,25 g de tinción “Coomassie” azul brillante a 100 ml de solución decolorante.


Dejarla toda la noche para que se disuelva y filtrarla cada vez que se vaya a usar. Guardar a
temperatura ambiente.

•= Solución decolorante

450 ml de metanol absoluto


100 ml de ácido glacial acético
450 ml de agua destilada

Añadir el ácido a la solución de metanol y de agua destilada. Trabajar en un lugar bien


ventilado o con extractor de humos. Guardar a temperatura ambiente.

1
Por ejemplo, Agarosa de Seakem ME, FMC Bio Products, 191 Thomaston Street, Rockland, ME 04841, USA.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 67


•= Suero salino normal

Método

Preparación del Aparato


Las bandejas de los electrodos se rellenan con tampón veronal “a”, de forma que los electrodos
estén justo bajo la superficie del tampón. Poner igual cantidad de tampón en cada bandeja.

Endurecimiento del Gel de Agarosa


1. Usar dos placas de cristal previamente limpiadas, primero mediante etanol y después
mediante agua destilada. Después, secarlas perfectamente en un horno caliente. Colocar las
placas, una encima de otra, con un marco en U entre ellas. Las placas se colocan de tal forma
que la superior esté 1 cm por debajo del borde superior de la que está debajo (para facilitar el
vertido de la agarosa entre ellas). Juntar las placas mediante 4 clips de presa (“bull dog
clips”), 2 a lo largo de su parte baja y 1 a cada lado, de forma que su presión sea uniforme.
Las juntas (“clamps”) deben colocarse sobre el marco de plástico y no dentro de él.

2. Dejar la mezcla sobre los “clamps” inferiores.

3. Preparar una solución de agarosa al 1%. Colocar la cubeta que contiene dicha solución en un
recipiente con agua. Calentar dicho recipiente. Dejarlo sobre la llama hasta que la solución de
agarosa esté clara (máximo 20 minutos). Coger una cantidad conocida de solución de agarosa
del tubo (por ejemplo, 20 ml) y ponerla en un frasco cónico. Poner el frasco al baño María, a
56ºC durante 15 minutos, para así disminuir la temperatura de la agarosa. Añadir antisuero, a
una concentración final de 0,1% (V/V). Por ejemplo, 20 microlitros de antisuero en 20 ml de
agarosa, a no ser que el fabricante del anticuerpo indique una concentración diferente. Cubrir
la parte superior del frasco con una chapita de aluminio y mezclar cuidadosamente mediante
batido. Poner la agarosa en una pipeta y verter rápidamente la agarosa que haya entre las dos
placas. Dejar que la agarosa se enfríe y solidifique durante 15 minutos, a temperatura
ambiente. Después, ponerla en un frigorífico durante algunas horas. Retirar los “clips” de
papel. Quitar cuidadosamente el cristal superior de la mezcla. Retirar con cuidado el marco
en U. También se puede verter el gel directamente en la placa de cristal, sobre una superficie
bien equilibrada.

Punzamiento de los Pocillos


1. Colocar el gel de agarosa en el patrón de punzado y punzar los pocillos . Dichos pocillos
deben estar por lo menos a 2 cm del borde largo del interior del gel (borde que toca el marco
en U), alejados 5 mm y aproximadamente a 15 mm del borde de ambos lados. La Figura 22.1
muestra un ejemplo de ello.

2. Limpiar los pocillos mediante succión, con una pipeta de Pasteur conectada a un aspirador de
agua.

Preparación de las Muestras


1. Diluir el plasma de referencia a 1:1, 1:2, 1:4. 1:8 y 1:16 con tampón veronal “a”.

2. Diluir las muestras del paciente al 1:2 (es decir, 1 en un total de 3, a una dilución 1/3), 1:4 y
1:8 (al menos 3 diluciones) con tampón veronal “a”.

68 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Aplicación de las Muestras y Electroforesis
1. Colocar la placa de cristal con el gel de agarosa sobre la placa de enfriamiento. Conectar con
cuidado la placa del gel y el tampón con tiras de papel de filtro (preparado con papel
Whatman del tamaño número 3-longitud de la agarosa x 12 cm). Lo primero es mojar
abundantemente unas tiras de papel en el tampón, para después aplicarlo de forma que 1 cm
cubra el gel sobre los bordes largos de la placa del mismo.

2. Aplicar 10 microlitros de las muestras en los pocillos circulares en un orden determinado, de


forma que las muestras del paciente se añadan entre la serie de las curvas estándar.

3. Conectar al cátodo la bandeja de los electrodos. Asegurar que los orificios del gel estén cerca
de la bandeja de los electrodos. Comenzar la electroforesis con un voltaje constante de 10
v/cm (por ejemplo, 110 v) durante 18-20 horas. Cerrar la tapa. Constatar que el agua
refrigerante corre lo suficientemente rápida como para asegurar el adecuado enfriamiento.

Teñido y Secado
Tras completar la emigración durante 18-24 horas, se deben extraer las proteínas no precipitadas.

Para eliminar dichas proteínas hay que:


1. Embeber la placa durante toda la noche en suero salino normal.

2. Colocar sobre el gel, por la mañana, un filtro de papel humedecido con agua destilada. Poner
un rollo de papeles de filtro seco (5-6) sobre la placa de agar y sobre la parte superior de ésta
una placa gruesa de cristal, y después un peso de 2 kg. Dejarlo reposar durante 15 minutos.
Retirar el papel de filtro y secar la placa caliente mediante un secador de aire caliente.
Colocar la placa en solución azul brillante “Coomassie” durante 15 minutos. Lavar por
arrastre el exceso de tinte con una solución decolorante, hasta que su entorno quede
desteñido (limpio) y sea claramente visible la parte superior del cohete (“rocket”).

Cálculo
1. Marcar la parte superior de los cohetes con un bolígrafo de tinta. Colocar la placa sobre papel
milimetrado y medir la longitud del cohete, desde su parte superior hasta el centro del pocillo
de aplicación.

2. Preparar la curva estándar en un papel semilogarítmico, representando la longitud de los


cohetes de las diluciones estándar sobre el eje lineal y la concentración sobre el eje
logarítmico. También se puede usar papel logarítmico doble, que puede estar asociado a un
trazo de calibración más lineal.

3. Leer en la curva el FVW:Ag de la muestra del paciente, como un % del plasma de referencia.
Multiplicar por el factor de dilución y calcular su media. Multiplicar por la concentración de
FVW en el plasma de referencia (ejemplo de referencia = 90 u/dl del FVW:Ag de prueba =
90% de la prueba de referencia = 0,9 x 90 = 80 u/dl).

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 69


Resultados/Interpretación

El FVW:Ag es un parámetro útil para diferenciar la hemofilia A de la enfermedad de von


Willebrand. En la hemofilia el FVW:Ag es normal, mientras que el factor VIII:C está
disminuido. En la mayoría de los casos de enfermedad de von Willebrand, el FVW está
disminuido de forma proporcional a la reducción del FVIII:C. Sin embargo, un FVW:Ag normal
no excluye el diagnóstico de enfermedad de von Willebrand. Es más, el FVW:Ag sirve para
detectar las portadoras de hemofilia A, las cuales tienen una proporción de FVIII:C/FVW:Ag de
aproximadamente 0,5, mientras que en las mujeres normales dicha proporción es de
aproximadamente 1. Un cociente inferior a 0,7 indica un estado de portadora. Sin embargo, a
causa de la fluctuación de la molécula del factor VIII, es recomendable hacer más de una
estimación. De hecho, es aconsejable realizar tres estimaciones de tres muestras diferentes.
También hay que destacar que en la enfermedad de von Willebrand del tipo 2A, el nivel del
FVW:Ag puede ser mucho más alto que la actividad del FVW:RicoF.

Rango Normal
Hay que establecerlo localmente. Aunque su límite inferior habitualmente es de unas 50 ui/dl, su
límite superior suele estar entre 150 y 200 iu/dl, dependiendo de la técnica usada y de cómo se
lleve a cabo la selección de los sujetos normales.

La Figura 22.1 muestra un ejemplo de una placa de FVW:Ag.

70 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Figura 22.1

Ejemplo de una placa de FVW:Ag

1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/1 1/2

Referencia/estándar Paciente

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 71


23 MEDICIÓN CUANTITATIVA DE LOS INHIBIDORES DEL
FACTOR VIII

Los inhibidores contra el factor VIII resultantes del tratamiento con factor VIII de personas
hemofílicas son dependientes del tiempo.

Si se añade factor VIII al plasma con un inhibidor y se incuba la mezcla, el factor VIII será
neutralizado progresivamente.

Si se estandarizan la cantidad de factor VIII y el periodo de incubación, se puede definir la fuerza


del inhibidor mediante unidades, de acuerdo a la cantidad del factor VIII añadido que es
neutralizado.

El ensayo puede ser realizado usando factor VIII humano o porcino.

La presencia de un inhibidor podría ser sospechada ante una disminución de la vida media y de
la recuperación del factor VIII.

Ensayo de Bethesda

El origen del factor VIII es una mezcla (“pool”) normal de plasma para los títulos anti-humanos
y concentrado porcino diluido en un plasma deficiente en factor VIII para los títulos anti-porcinos.

Principio Básico

Una unidad Bethesda viene definida como la cantidad de inhibidor que neutralizará el 50% de
una unidad del factor VIII añadido durante 2 horas y a 37ºC.

En los pacientes en los que no es previsible la presencia de un inhibidor:


1. Hay que añadir partes iguales (0,2 ml) del plasma del paciente a una mezcla (“pool”) de
plasma normal.
2. Como control, hay que añadir 0,2 ml al 0% de FVIII:C a 0,2 ml de una mezcla (“pool”) de
plasma normal.
3. Hay que incubar durante 2 horas a 37ºC. Después, llevar a cabo el ensayo de factor VIII:C.

En los pacientes en que es previsible la existencia de un inhibidor:


1. Hay que preparar diluciones utilizando tampón para ensayo de FVIII del plasma del paciente.
Es preferible preparar demasiadas diluciones que demasiado pocas. Dichas diluciones pueden
ser conservadas en hielo después de pasadas 2 horas de la incubación para una segunda tanda
de ensayos. Si se dispone de información previa relacionada con el título previsto del
inhibidor, las diluciones para las pruebas deben cubrir ambos lados de ésta.

72 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


2. Hay que añadir a cada dilución del plasma estudiado una cantidad estándar de factor VIII en
forma de una mezcla (“pool”) normal de plasma, con lo que dicho plasma tendrá unas 100
u/dl. Así pues, cada mezcla de incubación tiene una concentración inicial de unas 50 u/dl. La
concentración exacta no es importante, puesto que la misma fuente se añade a todas las
mezclas de incubación.

3. En el ensayo de factor VIII llevado a cabo tras 2 horas de incubación, la mezcla de control
del plasma normal y del tampón (“buffer”) es usada como la referencia estándar, y la
concentración en factor VIII de otras mezclas es calculada frente a ella. Este material se
utiliza como la referencia del 100% en el ensayo.

Es importante tamponar el plasma normal, bien añadiéndole imidazol 0,1 M a pH 7,4 según
la recientemente descrita modificación de Nijmegen o bien usando la mezcla (“pool”)
tamponada del plasma normal descrita en la Sección 6. Esto mejora la sensibilidad y
especificidad del ensayo.

4. Al final del periodo de incubación, se mide el nivel de factor VIII residual y se calcula el
inhibidor a partir de la gráfica del factor VIII residual frente a las unidades del inhibidor (ver
Figura 23.1 más adelante).

Equipo

•= Tubos de plástico (75 x 12 mm)

•= Pipeta

•= Baño de hielo

Reactivos

•= Tampón de glioxalina (ver Sección 8)

•= Tampón de suero salino de Owren (OBS = “Owren´s buffered saline”) (ver Sección 8)

•= Mezcla (“pool”) de plasma normal (ver Sección 6) (para el ensayo Bethesda humano)

•= Concentrado porcino (para el ensayo Bethesda porcino)

•= Plasma deficiente en factor VIII

•= Reactivo de APTT

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 73


Método

Anti-VIII Humano
1. Preparar diluciones dobles (1/2,1/4, 1/8, 1/16, etc.) del plasma estudiado en tubos de plástico,
en volúmenes de 0,2 ml usando tampón de glioxalina como disolvente.

Las diluciones requeridas para cada paciente pueden variar; se sugiere un punto de inicio no
diluido,1/2,1/4, etc.

Nota de Interés: Si al paciente se le ha realizado previamente un ensayo de inhibidor, el nivel


de inhibidor que tenga nos puede indicar de forma aproximada qué diluciones deben
utilizarse. También es importante detectar si el paciente recientemente ha recibido cualquier
tratamiento con factor VIII, puesto que esto puede aumentar o disminuir el nivel del
inhibidor.

2. Pipetear 0,2 ml de plasma deficiente en factor VIII en otro tubo de plástico, que servirá como
el estándar.

3. Añadir 0,2 ml de una mezcla (“pool”) de plasma normal tanto al tubo estándar como a las
diluciones del plasma estudiado. De esa forma, el nivel de factor VIII de todos los tubos será
de aproximadamente 50 u/ml. En el ensayo del FVIII se considera que el estándar es del
100% al final de la incubación.

4. Tapar, mezclar mediante inversión e incubar todos los tubos a 37ºC durante 2 horas.

5. Tras dos horas, transferir todos los tubos a un baño de hielo a no ser que el ensayo del factor
VIII sea realizado inmediatamente.

6. Realizar un ensayo de factor VIII en todas las mezclas de incubación mediante el método
habitual de ensayo del factor VIII, utilizando el tubo considerado estándar como el 100% de
la actividad.

Las diluciones apropiadas de las muestras incubadas para usar en los ensayos de factor VIII
deben ser 1/5, 1/10, 1/20.

Resultados/Interpretación

Representar gráficamente los resultados como se indica en la Sección 17. Leer el factor VIII
residual de cada mezcla utilizando el control como el 100%.

Cálculo del Nivel del Inhibidor


La dilución del plasma estudiado que proporcione un factor VIII residual cercano al 50%, pero
en el rango del 30-60%, es elegida para el cálculo del inhibidor. También se puede calcular el
resultado de cada dilución y obtener su media. Cualquier factor VIII residual <25% o >75% no
debe ser usado para los cálculos del nivel del inhibidor.

74 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Debe realizarse un gráfico del % de factor VIII residual frente a las unidades de inhibidor en un
papel logarítmico desde la definición de la unidad de inhibidor (ver Figura 23.1).

Leer el nivel de inhibidor correspondiente al factor VIII residual para cada mezcla de prueba y
corregir la dilución.

Por ejemplo: Dilución a 1/4 + mezcla (“pool”) normal


Factor VIII residual = 50%
Unidad de inhibidor (del gráfico) = 1 UB (unidades Bethesda)
Multiplicar por el factor de dilución (1/4) = 4 UB

Nota Importante:
Los ensayos cuantitativos de inhibidor suelen ser realizados en plasmas de prueba de pacientes
con hemofilia grave. Dichas muestras tienen poco o inmedible factor VIII:C. Si el plasma de
prueba tienen más de 5 u/dl de factor VIII, debe ser tenido en cuenta durante el cálculo del título
del inhibidor.

Esto se puede realizar de dos formas:

•= Añadiendo más factor a la mezcla control que a la mezcla de prueba, para compensar el
factor VIII en la mezcla de prueba. Por ejemplo, si el plasma de prueba tiene 20 u/dl de factor
VIII, entonces la mezcla control se hace con 120 ul de plasma normal y 80 microlitros al 0%
de FVIII (ambas mezclas, la de prueba y la de control, tendrán entonces unas 60 u/dl de
factor VIII al comienzo de la fase de incubación). Este método sólo puede usarse en el
plasma no diluido del paciente. La dilución de las muestras cambia las concentraciónes
iniciales de factor VIII.

•= Teniendo en cuenta durante el cálculo el nivel inicial de factor VIII en el plasma estudiado.
En tal caso, las mezclas de ensayo son construidas de la forma normal.

Ejemplo 1:
Paciente con 20 u/dl de factor VIII
Control de mezcla (“pool”) de plasma normal + 0% FVIII

a. Plasma normal de mezcla (“pool”) + plasma de prueba sin diluir – FVIII inicial =
120%.
b. Plasma normal de mezcla + plasma de prueba diluido 1 en 2 – FVIII inicial = 110%.

Tras dos horas de incubación se realizan los ensayos del factor

a. Plasma normal de mezcla más plasma de prueba sin diluir – FVIII = 120% del control.
FVIII residual = 120/120 = 100%, resultado del inhibidor - negativo
b. Plasma normal de mezcla + plasma de prueba diluido 1 en 2 – FVIII = 110% del control
FVIII residual = 110/110 = 100%, resultado del inhibidor – negativo

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 75


Ejemplo 2:
Paciente con 20 u/dl FVIII (e inhibidor presente)
Paciente estudiado sin diluir

Plasma normal de mezcla (“pool”) + plasma de prueba sin diluir – FVIII inicial = 120%
del control

Tras dos horas de incubación se realizan los ensayos del FVIII

Plasma normal de mezcla + plasma de prueba sin diluir – FVIII = 90% del control
FVIII residual = 90/120 = 75%

Anti-VIII Porcino

El método para los inhibidores porcinos del factor VIII es básicamente el mismo que para los
inhibidores humanos, excepto en el origen del factor VIII.

Para los títulos anti-porcinos, el plasma porcino no está realmente disponible; sin embargo, es
aceptable utilizar concentrado porcino diluido a 1u/ml en plasma humano deficiente en factor
VIII.

Nota de Interés:
Si el factor VIII residual está entre el 80-100% de la muestra sin diluir que fue incubada con el
concentrado porcino, no es probable que esté presente un inhibidor.

Referencias Bibliográficas

Kasper C, Aledort L, Counts R, Edron J, Fratantoni J, Green D, Hampton J, Hilgartner M,


Laserson J, Levine P, MacMillan C, Pool J, Shapiro S, Shulman N, Eys J. A more uniform
measurement of factor VIII inhibitors. Thrombosis at Diathesis Haemorrhagica 1975;
34: 869-872.

Verbruggen B, Novakova I, Wessels H, Boezeman J, van den Berg M, Mauser-Bunschoten E.


The Nijmegen modification of the Bethesda Assay for factor VIII:C Inhibitors: improved
specificity and reliability. Thrombosis & Haemostasis 1995; 73: 247-251. (Para la modificación
de Nijmegen)

76 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Figura 23.1

Relación entre el factor VIII residual y el título del inhibidor

100% Residual = No Inhibidor

50% de FVIII Residual = 1,0 uB/ml

Unidades Bethesda /ml

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 77


24 ENSAYO DEL INHIBIDOR DEL FACTOR IX

Principio Básico

El principio básico es similar al descrito para los inhibidores del factor VIII. Sin embargo los
inhibidores del factor IX, muestran cinéticas diferentes a las de los inhibidores del factor VIII:C,
y la reacción antígeno-anticuerpo se alcanza por completo más rápidamente. El ensayo se basa
en la incubación del plasma del paciente con partes iguales de una fuente de factor IX, durante
10 minutos y a 37ºC, seguido por un ensayo del factor IX.

Definición de 1 Unidad de Inhibidor


Se define una unidad como la cantidad que destruye el 50% de la actividad del factor IX, durante
10 minutos y a 37ºC.

Equipo

•= Tubos de plástico de 75 x 12 mm.

Reactivos

•= Igual que para el ensayo del factor IX (ver Sección18).

•= Plasma normal mezclado (“pooled”) como fuente de factor IX (el mismo plasma mezclado
que para el ensayo del inhibidor del factor VIII).

Método

Si se sospecha la presencia de un inhibidor, usar diluciones de plasma del paciente. Las pruebas
de rastreo para los inhibidores deben hacerse con plasma no diluido.

1. Usando tubos de plástico de 75 x 12 mm:

Prueba: añadir 0,2 ml de plasma del paciente (o dilución) a 0,2 ml de plasma normal
mezclado (“pooled”).
Control (estándar): añadir 0,2 ml de plasma con 0% de factor IX a 0,2 ml de plasma
normal mezclado (“pooled”).

2. Control: después de 10 minutos, realizar el ensayo del factor IX, usando una mezcla control
como referencia (como en el ensayo del inhibidor del factor VIII).

78 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Resultados/Interpretación

Cálculos
Representar los resultados del ensayo de coagulación como se describe en la Sección 17. Leer el
factor IX residual de cada mezcla de prueba, usando el control como 100%.

Calcular el Nivel deI Inhibidor


Para calcular el inhibidor se escoge la dilución del plasma de prueba que de un factor IX residual
cercano al 50%, que este entre el 30%-60%. Se puede calcular también el resultado para cada
dilución y hacer la media. Cualquier factor IX residual <25% o >75% no se debe usar para
calcular el nivel del inhibidor.

Utilizando papel logaritmico, representar el % del factor IX residual frente a las unidades del
inhibidor en la grafica que define la unidad del inhibidor (ver Figura 23.1).

Leer el nivel del inhibidor correspondiente al factor IX residual para cada mezcla de prueba y
corregir para la dilución

Ejemplo: Dilución a 1/4 + mezcla normal (“pool”)


Factor IX residual = 50%
Unidad del inhibidor (del gráfico) = 1 UB (unidades Bethesda)
Multiplicarlo por el factor de dilución (1/4) = 4 UB

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 79


25 ANTICOAGULANTE LÚPICO Y ANTICUERPOS
ANTIFOSFOLÍPIDOS

Introducción

Para los laboratorios que investigan pacientes con posibles alteraciones hemorrágicas, es
importante poder identificar la presencia de anticuerpos que prolongan pruebas de laboratorio
como el APTT. Uno de los grupos de anticuerpos que pueden causar una prolongación
importante del APTT es el grupo heterogéneo (compuesto por diferentes tipos de anticuerpos)
conocido como anticuerpos antifosfolípidos (APA), o como los anticoagulantes lúpicos (LAC).
Es bien sabido actualmente que los APA reaccionan con epítopos (región de una proteína que se
une al anticuerpo) de proteínas que están compuestas de (o ligadas a) fosfolípidos cargados
negativamente. Muchos de estos anticuerpos necesitan la beta-2 glicoproteína 1, que es una
proteína que se une a los fosfolípidos. Otros pueden estar dirigidos contra la protrombina. Es
importante recordar que estos anticuerpos, en el laboratorio, pueden interferir con las reacciones
de la coagulación, prolongando las pruebas fosfolípido-dependientes como el APTT y a veces el
PT, pero no están asociados con la hemorragia. Por otro lado, estos anticuerpos están claramente
asociados con trombosis venosas y arteriales, aunque sus mecanismos no son bien conocidos.

Los Centros que diagnostican alteraciones hemorrágicas deben poder determinar si un APTT
prolongado se debe a estos anticuerpos. Esto se hace utilizando pruebas que son específicas para
estos anticuerpos.

Es importante conocer que no todas las técnicas de APTT son sensibles a la presencia de dichos
anticuerpos. Como están implicados varios anticuerpos, se recomienda usar más de una prueba
para detectar la presencia de anticoagulantes de tipo lúpico.

Los criterios para la presencia de anticoagulantes lúpicos son los siguientes:

1. Prolongación de una prueba de coagulación fosfolípido-dependiente.


2. Evidencia de un inhibidor, demostrado por estudios de mezcla.
3. Confirmación de la naturaleza fosfolípido-dependiente del inhibidor.
4. Falta de una inhibición específica de un factor de la coagulación (como los factores VIII:C,
IX:C u XI).

Se han publicado varios documentos de recomendaciones y revisiones de resultados mediante


diferentes técnicas, los cuales revisan la detección en el laboratorio de los anticoagulantes
lúpicos (LAC), entre los que se incluyen los siguientes:

•= Lupus Anticoagulant Working Party. Guidelines on testing for the Lupus anticoagulant.
Journal of Clinical Pathology, 1991; 44: 885-889.

•= Brandt JT, Triplett DA, Alung B, Scharrer I. Criteria for the diagnosis of lupus
anticoagulants: an update. On behalf of the Subcommittee on lupus
anticoagulant/antiphospholipid antibody of the SSC of ISTH. Thrombosis and Haemostasis
1995; 74: 1184-1190.

80 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Preparación de la Muestra

Es importante asegurarse de que el número de plaquetas residuales en el plasma de prueba se


mantiene al mínimo, especialmente si el plasma es congelado y descongelado antes del análisis.
La mejor forma de retirar el mayor número de plaquetas, es filtrar el plasma centrifugado
(preparado como para otras pruebas de la coagulación) por medio de un filtro de 0,22 micras.
Alternativamente, el plasma puede ser centrifugado dos veces, como se describe en la Sección 3
de este manual. Se pretende reducir el número de plaquetas a <10 x 109/l en el plasma que se está
analizando. Ya que la filtración puede afectar a otros ensayos de la coagulación y puede ser cara,
frecuentemente la elección más acertada es la doble centrifugación. Estas observaciones se
aplican tanto a la preparación de los plasmas control como a la del plasma de prueba.

Estudios de Mezcla

Los detalles de los estudios de mezcla usados para indicar la posible presencia de un inhibidor,
se han citado anteriormente en la Sección 13 de este manual.

Pruebas Específicas para Detectar LAC y APA

Existe un número creciente de pruebas específicas para la presencia de anticoagulantes lúpicos.


Estos incluyen el tiempo del veneno de víbora diluido de Russell (DRVVT) y el tiempo de
coagulación de kaolín (KCT) (también llamado prueba de Exner). Otras pruebas específicas
basadas en veneno de serpiente, como el tiempo de Textarin o el tiempo de veneno de serpiente
de Taipan han sido usados, así como el tiempo de tromboplastina diluida. Se incluyen más
detalles de estas pruebas en las pautas referidas previamente.

Incluso cuando se emplean pruebas relativamente específicas como el DRVVT u otras, es


importante confirmar la naturaleza fosfolípido-dependiente del inhibidor usando pruebas
confirmativas.

En la Sección 25.1 y 25.2 se describen métodos para dos pruebas (DRVVT y KCT/prueba de
Exner). Unos resultados anormales de estas pruebas son más específicos que un APTT
prolongado de la presencia de anticuerpos antifosfolípidos.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 81


25.1 TIEMPO DEL VENENO DE VÍBORA DILUIDO DE RUSSELL (DRVVT)

Principio Básico

El veneno de víbora de Russell (RVV) contiene un enzima que activa directamente el factor X.
El factor X activado posteriormente activa la protrombina en presencia de fosfolípido, iones de
calcio y factor V. La dilución del veneno y el fosfolípido hacen que la prueba sea especialmente
sensible a la presencia de LAC/APA. Un DRVVT prolongado puede ser causado por inhibidores
de fosfolípidos, pero también puede producirse por deficiencia o anomalía de los factores II, V,
X o fibrinógeno. Si está prolongado en comparación con un rango normal localmente
determinado, el DRVVT se repite con plaquetas lavadas y fragmentadas (congelación –
descongelación) sustituyendo los fosfolípidos. Si las plaquetas corrigen la anomalía, sugiere la
presencia de anticuerpos antifosfolípidos.

Equipo

•= Tubos de ensayo de cristal

•= Cronómetro

•= Baño

Reactivos

•= Imidazol (tampón de glioxalina) – 0,05 m; pH 7,3

3,4 g de imidazol
5,85 g de cloruro sódico

1. Disolverlo en 800 ml de agua destilada.


2. Ajustar el pH a 7,3 usando M HCl.
3. Completar hasta 1 litro con agua destilada.

•= Veneno de víbora de Russell1

1. Añadir 2 ml de agua destilada a 0,2 ml de veneno para dar 0,1 mg/ml.


2. Congelar a –35ºC o menos en cantidades de 20 microlitros.
3. Para usarlo, descongelar y diluir aproximadamente 1 en 500 en tampón de imidazol (10
microlitros en 5 ml) para dar RVV diluido (DRVV).

1
Disponible en Diagnostic Reagents, Chinnor Road, Thame, UK

82 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


•= Fosfolípido (PL)1

Reconstituir con agua destilada, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

•= Cloruro cálcico – solución de cloruro cálcico 25 mM.

•= Plaquetas lavadas y fragmentadas (congelación- descongelación).

Las plaquetas humanas normales se lavan y lisan por congelación/descongelación para


exponerlas al fosfolípido procoagulante. El método completo se describe en la página 86.

•= Plasma normal mezclado (“pooled”).

Se debe preparar cuidadosamente para reducir al mínimo el número de plaquetas residuales,


como se ha descrito previamente como Preparación de la Muestra. Puede ser conveniente
usar el plasma normal mezclado (“pooled”) descrito en la Sección 6 de este manual, siempre
que sea centrifugado dos veces antes de la congelación intensa (como se describe en la
Sección 3, Preparación del Plasma Pobre en Plaquetas).

Método

1. Añadir 0,1 ml de fosfolípido (PL) y 0,1 ml de plasma normal mezclado (“pooled”) a un tubo
de ensayo de cristal a 37ºC.

2. Calentar a 37ºC durante 1-2 minutos.

3. Añadir 0,1 ml de RVV diluido (el RVV a temperatura ambiente). Mezclar y dejar durante
exactamente 30 segundos a 37ºC.

4. Añadir 0,1 ml de cloruro cálcico 25 mM precalentado. Mezclar. Poner en marcha el


cronómetro.

5. Anotar el tiempo de formación del coágulo. Realizar todas las pruebas por duplicado.

El plasma normal mezclado (“pooled”) debe dar un tiempo de coagulación de 30-35


segundos. Si es < 30 segundos, diluir posteriormente la solución RVV mediante la adición de
más tampón de imidazol. Si es > 35 segundos, añadir más solución RVV del “stock”. Repetir
la prueba en el plasma normal mezclado (“pooled”) hasta obtener un tiempo de 30-35
segundos.

6. Preparar una dilución a 1/8 de PL en suero salino, por ejemplo mediante la adición de 0,1 ml de
PL a 0,7 ml de suero salino.

1
Diagen Bell and Alton Platelet substitute, Diagnostic Reagents, Chinnor Road, Thame, UK

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 83


7. Repetir los pasos 1-5 con sustituto plaquetario 1/8, sustituyendo el PL no diluido.

Si el tiempo de coagulación (previamente de 30-35 segundos), ahora está prolongado a 35-40


segundos, indica que la concentración de PL está suficientemente diluida para hacer que la
prueba sea sensible a los anticuerpos de este fosfolípido.

Si el tiempo de coagulación excede los 40 segundos, repetir los pasos 1-5 usando PL diluido
1 en 4. Si el tiempo es de 35-40 segundos, proseguir. Si el tiempo de coagulación permanece
entre 30-35 segundos, repetir los pasos 1-5 usando PL diluido 1 en 16. Si el tiempo es de 35-
40 segundos, proseguir.

8. Repetir los pasos 1-5, sustituyendo el plasma del paciente por plasma normal mezclado
(“pooled”). En estas pruebas, usar la solución RVV que dio un tiempo de coagulación de 30-
35 segundos en presencia de PL no diluido y plasma normal mezclado (“pooled”). Usar la
dilución de PL que dio un tiempo de coagulación de 35-40 segundos.

9. Calcular la relación del tiempo de DRVV (DRVVT) del plasma del paciente dividido por el
DRVVT del plasma normal mezclado (“pooled”), para obtener el cociente DRVVT.

10. Repetir los pasos 1-5 usando plasma normal mezclado (“pooled”), y otra vez usando plasma
de prueba, pero utilizar plaquetas lavadas y lisadas (congelación-descongelación) en lugar de
PL. Este es el proceso de neutralización plaquetaria (PNP). En el paso 2, la mezcla se incuba
durante 10 minutos. La relación entre el plasma de prueba y el plasma normal mezclado
(“pooled”), se calcula para el PNP.

Resultados/Interpretación

El rango normal para el cociente DRVVT debe establecerse localmente usando plasma de sujetos
sanos, como se describió en la Sección 7. El rango normal (media + 2 desviaciones estándar) del
cociente del DRVVT con PL normalmente es de 0,90-1,10.

Un cociente DRVVT prolongado indica cualquier deficiencia de los factores II, V, X o


fibrinógeno, o la presencia de un anticuerpo antifosfolípido.

Un cociente DRVVT que se prolonga con fosfolípido pero que se reduce o normaliza con el PNP
es sugestivo de anticuerpo antifosfolípido.

Destacar que la deficiencia de los factores de la coagulación mencionada previamente está


asociada con cocientes prolongados, tanto del DRVVT con los fosfolípidos como del PNP.

La presencia de heparina en la muestra puede conducir a resultados similares a los que se


obtienen cuando el anticuerpo antifosfolípido está presente.

84 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Correcciones del DRVVT en la Prueba del PNP

Correcciones o disminuciones de la relación prolongada del DRVVT dentro del rango normal
evidencian claramente la presencia de LAC. También, un resultado por encima del rango normal
que se corrige más del 10% en el PNP se considera indicativo de LAC.

A menudo, la relación PNP no se corrige dentro del rango normal. No se sabe con certeza qué
grado de corrección indica la posible presencia de LAC. Una aproximación, es calcular el
porcentaje de corrección, así:

Cociente entre DRVVT y los PL – Cociente PNP x 100


Cociente entre DRVVT y los PL

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 85


Preparación de Plaquetas Lavadas para DRVVT

Método

1. Preparar plasma rico en plaquetas (PRP) de sangre citratada fresca, por centrifugación a 170
g (1200 rpm) durante 10 minutos a temperatura ambiente o usar concentrados de plaquetas
como para el tratamiento de pacientes.

2. Diluir PRP 1 en 2 con tampón de Tyrode (ver más adelante).

3. Las plaquetas diluidas se colocan en un tubo de centrifugado de plástico y de fondo cónico, y


se centrífuga durante 10 minutos a 850 g y a temperatura ambiente.

4. Retirar el sobrenadante mediante una pipeta de Pasteur de plástico y re-suspender el grumo


de plaquetas en tampón de Tyrode (añadir la misma cantidad de tampón que el volumen
original de PRP). Centrifugar a 850 g como antes. Este proceso se repite dos veces.

5. Retirar el sobrenadante y resuspender en tampón de Tyrode usando un volumen de tampón


igual al 25% del volumen original de PRP.

6. Dividir las plaquetas lavadas finales en cantidades alícuotas de 1,0 ml en tubos de plástico y
congelar y descongelar dos veces a –20ºC antes de ser usadas.

Tampón de Tyrode de pH 6,5

8,0 g de NaCl
0,2 g de KCl
0,065 g de NaH2PO42H2O
0,415 g de MgCl2 6H2O
1,0 g de NaHCO3

Disolver en 900 ml de agua destilada y ajustar el pH a 6,5. Completar hasta 1 litro con agua
destilada.

86 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


25.2 PRUEBA DE RASTREO DE KCT DE EXNER

Principio Básico

Se piensa que las plaquetas disminuyen el efecto anticoagulante de un anticoagulante lúpico


típico, por lo que las plaquetas o el sustituto lipídico de plaquetas se suprimen de esta prueba
para incrementar su sensibilidad. Mediante la realización de mezclas de plasma normal y plasma
de prueba y la realización de un KCT se obtienen cuatro patrones diferentes; tres de ellos se
clasifican como tipos diferentes del anticoagulante lúpico (ver más adelante).

En esta prueba no se añaden fosfolipidos, y así tiene una sensibilidad antifosfolípido muy alta.
Por esta razón es esencial que los plasmas de control y paciente no contengan plaquetas. El
plasma control sólo se considera aceptable para la prueba si tiene un KCT > 60 segundos.

La prueba se lleva a cabo en mezcla (“pool”) de plasma normal, plasma del paciente y una
mezcla de plasma normal: plasma del paciente de 4:1. Los resultados se expresan como una
relación de:

KCT de mezcla 4:1 x 100


KCT de plasma normal

Una relación mayor o igual a 1,2 se considera positiva para LAC, aunque se debe establecer
localmente un rango normal.

Se recomienda una prueba de Exner completa (KCT en 6 mezclas diferentes de plasma normal y
plasma del paciente) si el rastreo de KCT es positivo.

Equipo

•= Tubos de ensayo

•= Pipeta

•= Baño

Reactivos

•= Kaolín – 20 mg/ml en OBS

•= PPP normal – usar mezcla (“pool”) de 20 donantes

•= PPP de prueba

•= CaCl2 25 mM

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 87


Método

1. Hacer mezclas de plasma normal (NP) y plasma de prueba (TP) de la forma siguiente: NP:TP
– 10:0, 9:1, 8:2, 5:5, 2:8, 0:10.

2. Pipetear 0,2 ml de cada mezcla en un tubo a 37ºC.

3. Añadir 0,1 ml de kaolín.

4. Incubar a 37ºC durante 3 minutos.

5. Añadir 0,2 ml de CaCl2 y anotar el tiempo de coagulación.

Resultados/Interpretación

Representar el tiempo de coagulación frente a la proporción NP:TP sobre un papel gráfico lineal
y comparar con los tres tipos de resultados positivos ilustrados abajo.

TIPO I: Anticoagulante lúpico clásico

TIPO II: Anticoagulante lúpico clásico + deficiencia de factor

TIPO III: Presencia en el plasma del anticoagulante lúpico pero no del cofactor lúpico: necesario
para que el anticoagulante sea efectivo

200

150 TIPO I

100

50

0 20 50 80 100 TP%
100 80 50 20 0 NP%

88 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


200

150 TIPO II

100

50

0 20 50 80 100 TP%
100 80 50 20 0 NP%

200

150 TIPO III

100

50

0 20 50 80 100 TP%
100 80 50 20 0 NP%

Referencia Bibliográfica

Exner T, Rickard KA, Kronenberg H. A sensitive test demonstrating Lupus anticoagulant and its
behavioural pattern. British Journal of Haematology, 1978; 40: 143-151.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 89


26 PRUEBAS DE FUNCIÓN PLAQUETARIA

Principio Básico

Las plaquetas contribuyen a la hemostasia, de dos formas fundamentales:

•= Se adhieren a las microfibrillas subendoteliales y a las fibras de colágeno de la pared de los


vasos sanguíneos, después cambian de forma, sufren una reacción específica de liberación y
se agregan (unen) conjuntamente para formar el tapón hemostático primario.

•= Como resultado de estos procesos, se generan actividades procoagulantes sobre todo durante
la liberación y la agregación. Estas actividades implican principalmente a los fosfolípidos de
la membrana plaquetaria, de modo que la coagulación sanguínea se inicia en zonas donde se
ha producido la agregación plaquetaria.

Los defectos plaquetarios cuantitativos o cualitativos pueden terminar en una tendencia


significativa a la hemorragia, sobre todo debida al fallo en la formación del tapón plaquetario,
aunque también en menor grado, a la inadecuada activación de la coagulación sanguínea.

Los pacientes con defectos de la función plaquetaria o trombocitopenia, pueden manifestar una
variedad de síntomas muy sugestivos de fallo hemostático primario, por ejemplo hematomas o
equimosis, epistaxis, hemorragia gastrointestinal o menorragia.

Los defectos plaquetarios, frecuentemente dan lugar a alteraciones hemorrágicas leves de forma
que los pacientes pueden manifestar únicamente hemorragias graves tras una intervención
quirúrgica o tras una extracción dentaria.

Los defectos plaquetarios incluyen la enfermedad de almacenaje (“storage pool disease”), la


trombastenia de Glanzmann y el síndrome de Bernard-Soulier.

En la investigación de pacientes sospechosos de padecer una alteración hemorrágica, es


importante obtener una historia clínica detallada. Son pruebas iniciales importantes, el examen
de un frotis de sangre, la determinación del recuento plaquetario en sangre y la determinación del
tiempo de hemorragia en la piel (descrita en la Sección 10). Si estas pruebas están dentro de los
límites normales, es poco probable que un defecto plaquetario químicamente importante sea la
causa de la hemorragia que se está investigando.

La historia farmacológica es importante, debiéndose recordar que ciertos fármacos pueden influir
en los resultados de las pruebas de función plaquetaria, incluyendo el tiempo de hemorragia. Por
ejemplo, la ingestión reciente de aspirina puede ejercer su efecto durante más de 10 días.

Una lista de fármacos que pueden interferir con la función plaquetaria se detalla en el Journal of
Clinical Pathology 1988; 41:1322-1330.

Otra prueba simple, el método de retracción del coágulo puede indicar la presencia de una
anomalía. El método se describirá más adelante.

90 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


26.1 RETRACCIÓN DEL COÁGULO

Principio Básico

La retracción del coágulo en sangre totalmente coagulada puede dar información sobre el
número y la función plaquetaria. Cuando el coágulo se retrae, el suero es liberado y se puede
medir el grado de retracción del coágulo.

Equipo

•= Tubos de ensayo de cristal con diámetro de 75 x 10 mm

•= Varilla de madera

•= Baño

Método

1. Recoger 1 ml de sangre en un tubo de ensayo de cristal de 75x10 mm de diámetro, y


colocarlo a 37ºC.

2. Examinar visualmente el tubo hasta que aparezca un coágulo firme, dejándolo quieto a 37ºC
durante 1 hora.

3. Medir la distancia desde la base del tubo al menisco de la muestra. Retirar cuidadosamente el
coágulo con una varilla fina de madera, por ejemplo una varilla de “cocktail”, dejando el
suero liberado (expresado) del coágulo en el tubo.

4. Medir la distancia entre la base del tubo y el menisco del suero.

Resultados/Interpretación

Cálculos
Se divide la distancia del suero entre la distancia total y se multiplica por 100 para obtener un
porcentaje.

Normalmente se libera más del 40% del suero. Una liberación decreciente se presenta en algunos
defectos plaquetarios como en la trombastenia de Glanzmann.

Notas de Interés:
Los tubos y las varillas de madera deben estar totalmente limpios con el fin de evitar la adhesión
del coágulo al tubo.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 91


Se debe retirar el coágulo cuidadosa y suavemente, para evitar que se comprima con la posterior
liberación del suero.

Referencia Bibliográfica

Laboratory Haematology: An Account of Laboratory Techniques. Chanarin I (Ed.). Churchill


Livingstone, Edinburgh, 1989.

92 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


26.2 MEDICIÓN DE LA AGREGACIÓN PLAQUETARIA

Principio Básico

La densidad óptica del plasma rico en plaquetas disminuye cuando las plaquetas presentes
forman agregados. La cantidad, y en cierta medida la tasa de disminución, depende mucho de la
reactividad plaquetaria cuando el resto de variables están controladas (por ejemplo, el recuento
de plaquetas, la velocidad de la mezcla y la temperatura).

El efecto de diversas sustancias sobre la agregación plaquetaria en el plasma rico en plaquetas


puede ser controlado mediante la monitorización de los cambios de la densidad óptica del plasma
rico en plaquetas.

La densidad óptica se monitoriza usando un agregómetro que se conecta a una impresora de


forma que los resultados pueden ser recogidos en un gráfico.

Precauciones Previas al Estudio de la Agregación Plaquetaria

Las sustancias que contienen aspirina deben excluirse (evitarse) durante al menos 10 días antes
de la prueba, a no ser que su efecto sobre la agregación plaquetaria esté siendo específicamente
investigado, ya que la aspirina interfiere con la reacción de liberación.

También deben evitarse las investigaciones de otros fármacos, que se saben que influyen en la
función plaquetaria, durante al menos el tiempo que tardan en ser eliminados del organismo. Esto
incluye ciertos antihistamínicos, antibióticos y antidepresivos. Antes de realizar la prueba de
función plaquetaria, se debe investigar cualquier fármaco que el paciente pueda estar tomando.

No se deben realizar estudios poco tiempo después de una comida de alto contenido en grasas, ya
que los quilomicrones pueden interferir en la medición de la agregación plaquetaria.

Muchos otros componentes “normales” de la dieta, incluyendo el alcohol, cebollas, ajo,


pimientos y jengibre pueden también inhibir la agregación plaquetaria. Se debe preguntar a los
pacientes acerca del consumo de estos alimentos y especias, debiéndo tener en cuenta sus efectos
cuando se evalúen los resultados.

Preparación de Plasma Rico en Plaquetas y Plasma Pobre en Plaquetas

Se recoge sangre venosa con una oclusión venosa mínima, en un volumen 1/10 de citrato
trisódico (0,11 M) en un tubo de cristal de polipropileno o siliconado. Se necesitan
aproximadamente 20 ml de sangre para un estudio de agregación completo.

El enfriamiento activa las plaquetas, de modo que la sangre es procesada a 20-25ºC. El plasma
rico en plaquetas se prepara por centrifugación durante 10-15 minutos a 200 g.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 93


Se retira cuidadosamente el plasma rico en plaquetas, evitando su contaminación con hematíes o
globulos blancos (la agregación disminuirá si alguno está presente), en un tubo de polipropileno
y mantener a 20-25ºC hasta que se pruebe. La temperatura precisa de almacenaje no es
fundamental, pero puede influir en los resultados y por tanto la misma temperatura debe usarse
para todas las muestras de PRP.

La sangre remanente se centrifuga a 2000 g durante 20 minutos y el plasma pobre en plaquetas


se retira y almacena a 4ºC.

Se realiza un recuento plaquetario del PRP. El número de plaquetas influirá en las respuestas de
agregación obtenidas; los efectos son mínimos en el rango en el que la mayoría de los recuentos
de PRP caen (200-600 x 109/l).

La respuesta de agregación puede verse afectada para los recuentos de PRP excesivamente altos
(>1000 x 109/l); así puede ser beneficioso ajustar el recuento plaquetario a un nivel más
adecuado.

Esto puede hacerse diluyendo el PRP en el PPP del paciente. De modo similar, recuentos bajos
de plaquetas (menores a 200 x 109/l) pueden mostrar una disminución de la respuesta de
agregación. La concentración de plaquetas, prácticamente siempre induce un cambio funcional,
por lo que no es recomendado. Sin embargo, para que sirva de comparación debe estudiarse un
plasma control normal diluido (en plasma pobre en plaquetas) para el mismo recuento de PRP.

La agregación plaquetaria es pH-dependiente y por tanto el PRP debe mantenerse en el rango


7,7-8,0. Un control satisfactorio puede llevarse a cabo almacenando PRP en tubos llenos y bien
tapados y completando las pruebas en las 2 primeras horas tras la recogida de la sangre.

Agentes Agregantes

Los reactivos como al ADP o el colágeno se unen a receptores específicos de la membrana


plaquetaria, activando la plaqueta y desencadenando una serie de reacciones, Esto produce un
cambio en la forma de la plaqueta, en su contracción, movilización y liberación de constituyentes
granulares y finalmente produce la agregación plaquetaria.

Existen varias vías diferentes pero encadenadas de la activación plaquetaria, que conducen a la
agregación plaquetaria. La vía que se activa depende del tipo y la concentración del agonista
empleado (compuesto que puede comenzar o desencadenar una reacción). En el tubo de
reacción, el cambio de una suspensión de plaquetas uniforme a agregados, conduce a una
reducción en la absorción de la luz y un incremento en la luz transmitida a través de las
suspensiones plaquetarias. Esto es detectado por un registrador en combinación con un
agregómetro plaquetario.

Los cinco agentes agregantes enumerados a continuación, deben ser suficientes para permitir que
varias alteraciones de la función plaquetaria sean identificadas.

94 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Adenosina 5-difosfato (ADP)
Se prepara una solución stock de 1mmol/l de sal disódica en suero salino tamponado de Owren
(OBS) y se almacena en pequeñas cantidades a –40ºC. Esto es estable durante al menos 3 meses.
Una vez descongelada, la solución debe ser usada en 3 horas o en caso contrario desecharla
(tirarla).

Para su utilización, se preparan varias diluciones de OBS. El patrón de respuesta del ADP,
depende de su concentración final.

A 2 umol/l, se pueden ver ondas de agregación primaria y secundaria, claramente definidas. La


primera representa el efecto directo agonista inducido; la segunda onda se debe a la liberación de
ADP endógeno y a la generación de tromboxano A2 (TXA2). El tromboxano A2 también puede
agregar plaquetas.

Por debajo de 2 umol/l, cada vez menos los sujetos sanos muestran una respuesta secundaria y la
onda primaria frecuentemente se invierte cuando el ADP se degrada enzimáticamente.

Por enzima de 3 umol/l la fase primaria suele ser tan intensa que la distinción entre ésta y la fase
secundaria queda enmascarada.

El ADP induce un cambio en la forma de las plaquetas, pasando de forma de disco a la de esfera
erizada. Al principio, esto induce un pequeño incremento en la densidad óptica de la suspensión
plaquetaria que sólo puede verse si la agregación primaria está afectada.

Adrenalina (también conocida como epinefrina)


Se prepara una solución stock de 1mmol/l de sal bitartrato en OBS. Esta se debe almacenar y
usar como para el ADP. Con la adrenalina, las concentraciones usadas y los patrones de
respuesta son similares a los del ADP. De cualquier modo, en ausencia de una onda secundaria la
onda primaria no se invierte, incluso cuando es tan intensa que la onda secundaria queda
enmascarada.

Colágeno
Una suspensión muy estable de fibrillas colágenas de tendón equino (1 mg/ml) está disponible en
Hormon-Chemie, Munich, Germany, y es muy usada.

Se almacena a 4ºC y debe ser mezclado inmediatamente antes de su dilución en el tampón


empaquetado que viene con el. Se debe usar a una concentración final de 0,5-2,0 ug/ml en PRP,
las suspensiones diluidas son estables durante 1 semana a 4ºC.

Con colágeno no se produce la onda primaria. Frecuentemente la respuesta se define por la


duración de una fase inicial de retraso (“lag phase”), antes del comienzo de la agregación y por la
intensidad de la agregación. Antes de la agregación se produce un pequeño aumento de la
densidad óptica, causado por el cambio de forma.

Ristocetina
A una concentración final de ristocetina de 1 mg/ml en PRP, las diferentes ondas primarias y
secundarias son normalmente detectables, pero a concentraciones mayores el efecto directo es
tan intenso que las dos fases se fusionan.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 95


La onda primaria se mide por la cantidad de factor von Willebrand presente en el plasma,
mientras que la onda secundaria se debe a la liberación de sustancias endógenas (normalmente
presentes en el organismo).

Ácido Araquidónico
Se disuelve araquidonato sódico (99% puro) en OBS hasta una concentración de 10 mmoles/l. Se
colocan partes alícuotas en viales oscurecidos de cristal que son tratados con nitrógeno para
prevenir su oxidación, luego se tapan bien y se almacenan congelados por debajo de los –20ºC.

Generalmente la agregación es monofásica (onda única) y se precede de una fase inicial (“lag
phase”) corta.

Equipo

•= Agregómetro

•= Cubeta de cristal desechable

•= Varilla agitadora

Reactivos

•= ADP

1. Hacer una dilución 1 en 10 = 100 uM (es decir 0,1 ml de solución 10000 uM + 0,9 ml de
OBS)

2. De ella hacer otras dos:


20 uM (es decir, 0,2 ml de 100 uM + 0,8 ml de OBS)
30 uM (es decir, 0,3 ml de 100 uM + 0,7 ml de OBS)

3. En casos en los que se está estudiando una hiperagregabilidad pueden ser necesarias
concentraciones más bajas (por ejemplo: 10 uM, 5 uM).

•= Adrenalina (epinefrina)

Diluir como para el ADP.

•= Colágeno

Mezclar bien y diluir en OBS:


1 en 500 (es decir 0,1 ml de stock + 4,9 ml de OBS) = 20 ug/ml
1 en 100 (es decir 0,5 ml de dilución 1,50 + 0,5 ml de OBS) = 10 ug/ml

96 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


•= Ristocetina

Se usa a tres concentraciones 15 mg/ml, 12,5 mg/ml y 5 mg/ml.

•= Ácido araquidónico – 10 mmol/l

Nota importante: Las concentraciones de estos cinco compuestos son adecuadas cuando se añade
1 parte a 9 partes de PRP, como se describirá más adelante para el agregómetro Payton.

Método

La centrifugación puede ocasionar una inhibición temporal de la agregación plaquetaria. Por eso,
los estudios de agregación no deben comenzarse dentro de los 30 minutos de preparación del
PRP. De cualquier forma, las pruebas deben ser completadas dentro de dos horas.

1. Encender el agregómetro para calentar a 37ºC y fijar la velocidad de agitación a 900 rpm.

El agregómetro de Payton tiene dos canales, así que es conveniente usar la mitad de la
anchura del papel para cada canal.

Con una desviación de 10-mv, los PRP utilizados son de 0,5 y 5,5 milivoltios para los
canales 1 y 2 respectivamente (representa el 0% de la agregación) y los correspondientes
valores en blanco (que aparecen cuando se usa PPP) sería de 4,5 y 9,5 milivoltios para los
canales 1 y 2 respectivamente (representa el 100% de la agregación).

2. Colocar 0,45 ml de PRP en una cubeta (cristal – desechable tras su uso) que contenga una
varilla agitadora de silicona para mezclar.

3. Colocar la cubeta en el recipiente para el canal 1 y poner la transmisión al 0% (0,5 mv).


Reponer con una cubeta que contenga 0,5 ml de PPP y poner la transmisión al 100% (4,5
mv). Repetir este procedimiento hasta que no sean necesarios más ajustes.

4. Repetir para el canal 2 usando 5,5 y 9,5 mv.

5. También se realiza una agregación espontánea – colocar 0,5 ml de PRP en una cubeta,
colocar en el agregómetro y monitorizar cualquier cambio de la densidad óptica durante 15
minutos. Esto debe realizarse antes de que sean probados el resto de los agonistas.

6. Dejar que el PRP se caliente a 37ºC durante 2 minutos y añadir 0,05 ml de agonista al fondo
de la cubeta y monitorizar si cambia la densidad óptica durante 3 minutos.

Repetir este procedimiento para cada agonista.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 97


•= Para el ADP y la adrenalina, comenzar con una concentración de 20 uM. Esta será la
concentración final en PRP de 2uM.

•= Para el colágeno, usar la concentración de 10 ug/ml. Esta será la concentración final de 1


ug/ml.

•= Para la ristocetina, usar la concentración de 12,5 mg/ml. Cuando se rastrea para von
Willebrand de tipo 2B, probar también la concentración 5 mg/ml. Esto dará una
concentración final en PRP de 1,25 y 0,5 mg/ml respectivamente. Usar 15 mg/ml si no hay
respuesta a 12,5 mg/ml.

Si las plaquetas del paciente se hiperagregan con 0,5 mg/ml de ristocetina (LO QUE
INDICARÍA UNA POSIBLE ENFERMEDAD DE VON WILLEBRAND TIPO 2B O UNA
PSEUDO ENFERMEDAD DE VON WILLEBRAND) y queda suficiente PRP cuando otros
agonistas han sido probados, ha de hacerse lo siguiente:

1. Comprobar la agregación espontánea.

2. Lavar tres veces un volumen medido de PRP, por ejemplo 1 ml tanto para el plasma del
paciente como para el plasma normal, en tampón lavado de suero salino citratado con EDTA.
Resuspender cuidadosamente las plaquetas del paciente en plasma normal y las plaquetas
normales en plasma del paciente. Probar otra vez con 0,5 mg/ml de ristocetina.

Nota importante: Si el volumen de PRP es insuficiente, los volúmenes mínimos que pueden
usarse en las cubetas estándar son de 0,36 ml de PRP + 40 ul de agonista.

Las reacciones deben acontecer dentro de uno de los siguientes patrones:

PRP del paciente PLT del paciente PLT normal


PPP del paciente PPP normal PPP del paciente
AGREGACIÓN Falta de respuesta Agregación = Enfermedad de von
Willebrand tipo 2B
AGREGACIÓN Agregación espontánea Falta de respuesta = Pseudoenfermedad
de von Willebrand

Interpretación de los Patrones de Agregación

Si las plaquetas que están siendo estudiadas no dan una respuesta normal, es decir, dos fases de
las agregaciones que cubren más del 50% de la escala con las concentraciones de los reactivos
descritos previamente, aumentar la concentración del agonista (dentro de lo razonable) hasta
obtener una respuesta satisfactoria.

En casos donde hay un defecto evidente de liberación, monitorizar la respuesta al ácido


araquidónico.

98 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Si no se obtiene respuesta con el ácido araquidónico, probar con tromboxano A2 y/o ionóforo de
calcio.

Cuando se estudia la agregación plaquetaria como parte de una valoración de la


HIPERAGREGABILIDAD, se usa ADP y adrenalina a concentraciones más bajas, para obtener
una curva dosis-respuesta.

Las concentraciones de ADP y adrenalina que se usan son: 2uM, 1uM, 0,5 uM, (0,1 uM),
concentración final en PRP.

Se debe procesar un control normal como verificación de los reactivos.

Resultados/Interpretación

Cálculo de los Resultados


Los resultados se expresan normalmente de tres formas:

•= Disminución del porcentaje de la densidad óptica medida 3 minutos tras la adición del
agonista. Esta es la forma más adecuada, aunque no proporciona información sobre la
morfología de las curvas de agregación.

•= Desnivel inicial del trazado de agregación. Esto indica el grado de agregación, pero no indica
si se ha producido la agregación secundaria.

•= Determinación de la concentración umbral del agonista, es decir la cantidad de reactivos de


agregación necesarios para inducir solamente una respuesta de segunda fase (suele ser un
desperdicio de PRP).

Interpretación de los Resultados


Se requiere una gran minuciosidad para interpretar los patrones de agregación plaquetaria.
Diversos factores técnicos pueden influir en los resultados y debe tenerse en cuenta que hay
diversas diferencias importantes entre la agregación determinada por nefelometría y las que
ocurren en el organismo.

Sin embargo, puede obtenerse información diagnóstica útil y algunos ejemplos de patrones de
agregación se muestran en la tabla siguiente.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 99


Resultados de la Agregación Plaquetaria en Diversas Enfermedades

Enfermedad ADP Colágeno Ristocetina Ristocetina Ácido Adrenalina


1,25 mg/ml 0,5 mg/ml Araquidónico
Von Willebrand N N A/R** A N N
Tipos 1 y 2A
Von Willebrand N N N H N N
Tipo 2B
Bernard-Soulier N N A A N N
Trombastenia de A A N A A A
Glanzmann
Enfermedad de P/N R/N P/N A R/N P/N
almacenaje
Defecto de la R/N R N A R R/N
ciclo-oxigenasa*

* o Efecto de la Aspirina
** Puede ser normal en Enfermedad de von Willebrand tipo 1 moderada

N = Normal A = Ausente R= Reducida H= Respuesta Exagerada P = Sólo Onda Primaria

Más Investigación de la Función Plaquetaria

Si se observa un patrón de agregación anormal en un individuo, repetir la valoración al menos


una vez más, para asegurar el diagnóstico de la enfermedad.

En presencia de una agregación anormal, puede ser útil una investigación ulterior. Esta incluye la
medición del contenido en nucleótidos de las plaquetas y la liberación de nucleótidos
plaquetarios durante la agregación.

Para el diagnóstico inequívoco del síndrome de Bernard-Soulier y de la trombastenia, puede


realizarse la cuantificación de las glicoproteínas de membrana.

El mecanismo de liberación plaquetaria se puede valorar midiendo el contenido total plaquetario


de ADP y adenosina trifosfato (ATP) y la liberación de ATP o 5-hidroxitriptamina (o ambos) de
los gránulos densos. Para más información sobre métodos de investigación de defectos
plaquetarios, ver las siguientes citas bibliográficas.

•= Guidelines on Platelet Function Testing: British Society for Haematology BCSH


Haemostasis and Thrombosis Task Force. Journal of Clinical Pathology 1988; 41:
1322-1330.

•= Greaves M & Preston FE (1985) The laboratory investigation of acquired and congenital
platelet disorders. In Thomson JM (Ed), Churchill Livingstone, Edinburgh - Blood
Coagulation and Haemostasis: A practical guide, 3rd edition: 56-134.

100 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


Algunos Factores Técnicos que Influyen en la Función Plaquetaria

Anticoagulante – volumen 1/10 de citrato sódico.

Tiempo – Comenzar las pruebas 30 minutos después de la preparación del PRP.


Completar los estudios en las 2 horas siguientes a la toma de sangre.

Centrifugación – Debe ser suficiente para eliminar los hematíes y leucocitos pero no
las plaquetas grandes.
Debe hacerse a temperatura ambiente, no a 4ºC.

Recuento de plaquetas – Recuentos bajos < 100 x 109/l causan respuestas lentas y débiles.
Recuentos altos > 1000 x 109/l pueden mostrar respuestas reducidas.

pH – pH < 7,7 inhibe la agregación.


pH > 8,0 aumenta la agregación.

Velocidad de mezclado – < 800 rpm muestra agregación reducida.


> 12000 rpm rompe los grumos plaquetarios.

Hematocrito – > 55% muestra progresivamente menos agregación, sobre todo la


inhibición de segunda fase, debido a la concentración elevada de
citrato.

Temperatura – < 35ºC muestra una agregación disminuida con dosis regulares de
todos los agonistas, pero una respuesta aumentada a dosis bajas de
ADP.

Lipemia – Un aumento de los quilomicrones reduce la agregación.

Cubeta sucia – Puede causar una notable agregación espontánea.

Falta de varilla agitadora – Falta de respuesta al añadir el agente agregante.

Burbujas de aire – Oscilaciones rápidas y grandes de la pluma registradora antes de la


agregación. También producidas por recuento bajo de plaquetas.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 101


Diferencias entre las Condiciones in Vivo e in Vitro de la Agregación Plaquetaria

Con pruebas de sangre in vitro:

•= La sangre está anticoagulada.

•= Se retiran hematíes y leucocitos de la sangre.

•= No están implicados los componentes vasculares.

•= La coagulación no está implicada.

•= Se selecciona la población plaquetaria.

•= Se mantienen productos de activación y de liberación plaquetarios.

•= Los reactivos usados no son fisiológicos en su composición y dosis.

•= Las plaquetas son inestables fuera del cuerpo.

•= Los fármacos pueden mostrar más o menos efectos marcados que in vivo.

102 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


27 LIOFILIZACIÓN DEL PLASMA

Trasfondo

La liofilización, o congelación en seco, se usa para preparar plasma que sea estable durante
periodos de tiempo prolongados. Por ejemplo, es útil para la preparación de plasma liofilizado
deficiente en factor VIII, que es normalmente estable hasta 2 años, cuando se almacena a –20ºC
o menos, y que es suficientemente estable para sobrevivir cortos periodos de tiempo (hasta 7
días) a temperatura de 20-25ºC.

Plasma Adecuado

Sangre venosa mezclada con citrato sódico 0,105 M (Vacutainer) o con citrato trisódico 0,109 M
(código 30128 del catálogo BDH) en la proporción de 9 partes de sangre y 1 parte de
anticoagulante; centrifugar a 2500 g durante 10 minutos; mezclar de la forma apropiada;
almacenar a –55ºC pendiente de los resultados de la prueba viral.

Confirmar los resultados normales para anti-VIH 1+2, anti-HCV y AgS de Hepatitis B

Equipo

•= Viales de 2 ml – cristal claro neutral, cuello de 13 mm internamente siliconado1

•= Tapón gris de 13 mm de congelado en seco1

•= Sellos metalicos de 13 mm completamente arrancables1

•= Unidad prototipo de congelados en seco2

•= N-2-hidroxietilpiperacina-N´-2-etanosulfónico (HEPES)3

1
Disponible en Laboratory Sales (UK) Limited, Unit 20-21 Gorrels Way, Transpennine Trading Estate, Rochdale,
UK, OL 11 2PX.
2
La unidad de tapones y de supermodulyo están disponibles en Life Sciences International, Unit 5, Ringway Centre,
Edison Road, Baringstoke, Hampshire, RG21 6YH.
3
Disponible en BDH Laboratory Suppliers, Poole, BD15 1TD, UK.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 103


Método

1. Descongelar rápidamente el plasma a 37ºC.

2. Mezclar bien.

3. Añadir 0,8 g de HEPES por 100 ml de plasma.

4. Mezclar y dejar que el HEPES se disuelva (15-20 minutos).

5. Llenar bandejas de liofilización de acero inoxidable con viales vacíos.

6. Poner partes alícuotas exactas de 0,5 ml en cada vial.

7. Colocar un tapón de goma a cada vial lo más profundamente posible para que no pueda
entrar aire.

8. Congelar a –70ºC durante un mínimo de 3 horas.

9. Encender la unidad del congelador en seco. Activar la unidad frigorífica.

10. Colocar las bandejas en la unidad de estantería (como máximo 8).

11. Colocar la unidad de estantería en una cámara de plástico claro, por encima del área de la
salida de aire en lo más alto del congelador secador.

12. Activar la bomba. Asegurarse de que los pasos anteriores y este paso se completan en 3-4
minutos, para evitar que comience la descongelación del plasma. Si se produce una
descongelación parcial, el material hará espuma, congelará en seco pobremente y tendrá que
desecharse.

13. Confirmar que el vacío se está produciendo por el movimiento del indicador de presión
(movimiento visible en pocos minutos) y por la inmovilidad de la cámara de plasma bajo
leve presión manual lateral.

14. Dejar al vacío durante 5 días.

15. Sellar los viales al vacío mediante el atornillado hacia debajo de los mangos de la unidad de
estantería.

16. Dejar que entre aire a través de la puerta de entrada del congelador secador.

17. Descongelar y secar el congelador secador.

18. Almacenar el plasma liofilizado a –20ºC y tapar lo antes posible.

19. Para confirmar la adecuada liofilización del plasma, probar 4-6 viales seleccionados de
lugares diferentes de las bandejas de acero. Determinar PT y APTT, de forma que no deben
variar más del 6-8%.

104 Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación


28 BIBLIOGRAFÍA GENERAL

Bloom AL, Forbes CD, Thomas DP, Tuddenham EGD (eds) Haemostasis and Thrombosis, 3rd
edn. Churchill Livingstone, Edinburgh, 1994.

Brozovic M, Mackie IH. Investigation of a bleeding tendency. Practical Haematology, 7th edn
(eds Dacie JV, Lewis Sm). Churchill Livingstone, Edinburgh, 1991: 293-318.

Federici AD. Diagnosis of von Willebrand disease. Haemophilia, 1998; 4: 654-660.

Hall R, Malia RG. General methods for the investigation of haemorrhagic disorders. Medical
Laboratory Haematology, 2nd edn. Butterworths, London, 1991: 530-664.

Machin SJ, Mackie IJ. Investigation of prolonged activated partial thromboplastin time.
Laboratory Haematology: An Account of Laboratory Techniques (ed. Chanarin I). Churchill
Livingstone, Edinburgh, 1989: 293-306.

Machin SJ, Mackie IJ. Investigation of prolonged prothrombin time. Laboratory Haematology:
An Account of Laboratory Techniques (ed. Chanarin I). Churchill Livingstone, Edinburgh, 1989:
285-291.

Mannucci PM. Diagnosis and therapy of haemophilia A. Practical Laboratory Haematolgoy (ed.
Koepke JA). Churchill Livingstone, New York, 1991: 347-371.

Peake IR, Lillicrap DP, Boulyjenkov V, et al. Report of a joint WHO/WFH meeting on the
control on haemophilia: carrier detection and prenatal diagnosis. Blood Coagulation and
Fibrinolysis, 1993; 4: 313-344.

Peake IR, Seligsohn U, Gitel S, Kitchen S, Zivelin A. The Laboratory diagnosis of haemophilia:
recommendations of the laboratory activities committee of the World Federation of Haemophilia.
Haemophilia, 1995; 1: 159-164.

Thomson JM (ed.) Blood Coagulation and Haemostasis: a Practical Guide, 3rd edn. Churchill
Livingstone, Edinburgh, 1991.

Diagnóstico de la Hemofilia y Otros Trastornos de la Coagulación 105

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