Análisis de

Medicamentos
Módulo 1
 Propiedades físico-químicas
Correo profe: rgodoy@udec.cl
Modulo numero 1 corresponde principalmente a propiedades fisicoquímicas y ensayos de
solubilidad de compuestos orgánicos.
El capítulo de fisicoquímica es muy importante porque como profesionales químicos
farmacéuticos vamos a ser los expertos en medicamentos, y cuando hablamos de expertos
en medicamentos nos referimos a conocer absolutamente todo respecto a un
medicamento, comenzando con cómo se fabrica, como se analiza, como se administra,
cuáles son sus efectos adversos, sus regímenes de dosificación, sus interacciones con otros
medicamentos en terapias concomitantes, etc.
Ocurre mucho en la práctica clínica que por ejemplo en el hospital traumatológico se
acostumbra a que cada vez que lega un paciente fracturado se le administran antibióticos
de amplio espectro como profilaxis, es decir, por si acaso llegara a infectarse la persona o
por si acaso llegase a tener una infección con alguno de estos microorganismos agresivos y
la verdad es que esto es una mala práctica porque lo que debería hacerse es primero un
antibiograma, para así conocer cuál es la bacteria sensible que está produciendo
probablemente el cuadro y a partir de ahí indicar cual es el mejor antibiótico, Situaciones
como esa son las que han hecho que exista una alta resistencia a la acción de los antibióticos
por parte de las bacterias porque van mutando y generando esta resistencia
antimicrobiana, ahora es verdad que un antibiograma es un poco más lento y no es
instantáneo el resultado por lo que se requiere tener en observación a ese paciente. Lo
anterior son situaciones particulares que se nos presentan y que tienen que ver con el mal
uso de los medicamentos y por eso es importante la opinión especializada y profesional de
nosotros.
Dentro de este contexto de lo que significa el medicamento en sí, nosotros como químicos
farmacéuticos nos referimos siempre a estos como medicamentos, no como remedios, ya
que remedios podrían catalogarse un agua de hierbas y es una connotación un poco más
coloquial.
Para la industria farmacéutica la presencia de farmacéuticos dentro de la industria es
esencial para la fabricación, elaboración y el diseño de los medicamentos, particularmente
porque una de las etapas en la fabricación de uno de los medicamentos obviamente es la
parte del análisis o de la analítica porque nos va a permitir entonces el control tanto físico
como químico de ese medicamento que están elaborando en esa industria farmacéutica.
¿Qué es lo más importante a la hora de la fabricación de un medicamento? Dentro del
análisis es esencial la identidad, ustedes tienen que pensar que un error en cuanto a la
identificación de una materia prima puede ser muy grave para un paciente. Esto por
ejemplo lo podemos apreciar en la actualidad en una controversia por un anticonceptivo de
un laboratorio en el cual había un error en la formulación aparentemente probablemente
derivado de la identificación de los componentes o de las materias primas que se utilizaron
en la fabricación de ese anticonceptivo de manera que es esencial que podamos disponer
de métodos de identificación o de análisis cualitativos que sean selectivos y por tanto
respondan únicamente para ese compuesto que debería tener el medicamento y si no es
posible esto, que es lo más probable usar una combinación de al menos dos métodos
distintos, de esa manera nos aseguramos de poder comprobar la identidad de un
compuesto orgánico o de un principio activo que ha llegado a nuestro laboratorio de
análisis.
Una vez que el medicamento ha sido elaborado y conocemos medicamentos que poseen
más de un principio activo como por ejemplo un antigripal donde hay un analgésico o un
antipirético más un antihistamínico y en ese caso hablamos de una mezcla de compuestos
orgánicos de manera que para poder identificar la presencia de cada uno de ellos vamos a
tener que desarrollar un análisis cualitativo y también un análisis cuantitativo para saber
cuál es la proporción de esos principios activos en esta mezcla de compuestos. Obviamente
como hablamos de una mezcla primero tenemos que separar a estos compuestos, luego
identificarlos y finalmente determinar la cantidad de cada uno de ellos en esa mezcla. Para
esto nos ayudamos de diferentes métodos o técnicas instrumentales para determinar o
llevar a cabo esta separación, identificación y cuantificación.
En este análisis que nos habla de los aspectos cualitativos son muy importantes las
propiedades fisicoquímicas, primero con un objetivo de identificación como esta en el
diagrama, como un control de calidad y también como un control de pureza de los principios
activos.
¿Cuál es el esquema que uno debiera seguir normalmente cuando llega a su laboratorio un
principio activo o una materia prima para conocer su confirmación de identidad?
Lo primero que debemos hacer es un análisis preliminar tal como muestra el esquema, y un
análisis preliminar que consiste básicamente en una observación de las características
órgano eléctricas de ese principio activo o materia prima. Una característica órgano
eléctrica es el color o el olor, el sabor no porque es riesgoso que estemos probando un
principio activo que no sabemos de qué se trata. Normalmente un polvo que llega al
laboratorio coloreado generalmente se asocia a la presencia de aromaticidad en esa
molécula (Se trata de un compuesto aromático con mucho doble enlace, etc.) y eso va a
generar también un olor característico cuando son compuestos aromáticos, también se va
a observar la forma o estado físico como por ejemplo si es un sólido o un líquido la materia
prima, si es un sólido podemos observar que tipo de cristales tiene la materia prima, en
forma lenticular(forma de lentejas), acicular (forma de aguja) o bien estado cristalino
amorfo. En seguida luego del análisis preliminar se pasa a determinar las constantes
fisicoquímicas que es lo que nos convoca el día de hoy, luego de determinadas estas
primeras dos etapas nosotros podemos incluir un análisis elemental cuantitativo, es decir
cuánto es el porcentaje de halógenos que existe en mi muestra, el porcentaje de nitrógenos
que existe en la muestra, porcentaje de azufre, etc. Para luego orientar cual es la identidad
del compuesto y como seria su estructura. Vamos a hacer luego de esto ensayos de
solubilidad en distintos solventes (Agua, éter, soluciones acidificadas, soluciones
alcalinizadas) de manera entonces que en base a esa solubilidad ir orientando la estructura
química del compuesto. En base a esos datos entonces se podrá realizar una revisión
bibliográfica con todos los principales candidatos del compuesto que estamos analizando.
A partir entonces de esa revisión bibliográfica podremos practicar más análisis como análisis
funcional como si sabemos que la molécula contiene grupo oxigeno podemos tener a la
molécula como grupo cetónico, aldehído, carboxílico o hidroxilo de la molécula y haremos
la búsqueda de estos grupos funcionales mediante reacciones químicas; enseguida
utilizando métodos instrumentales podremos realizar un análisis espectral como a través
de espectroscopia infrarroja, espectrometría de masa o resonancia nuclear magnética
(RNM) de manera que con toda esa información y por ejemplo con masa podremos
determinar el peso molecular para finalmente llegar a la confirmación de la identidad a
partir de métodos espectrales.
PROPIEDADES FISICO- QUIMICAS
¿Por qué nos interesan las propiedades fisicoquímicas? Dijimos que nos interesan porque
poseen el objetivo de identificar, control de calidad y de pureza del compuesto. Entonces
acá encontramos por ejemplo la densidad y peso específico que nos van a dar la
determinación de estas propiedades fisicoquímicas una orientación de la composición y la
estructura de ese analito o materia prima o principio activo. En el caso de buscar la pureza
de líquidos podemos practicar un índice de refracción o la determinación de la densidad
también. Si sabemos que la molécula tiene centros quirales y por tanto es ópticamente
activa podremos determinar su pureza en base a la medición de rotación óptica. Finalmente
practicar reacciones de solubilidad para poder identificar los principales grupos funcionales
que tenga una molécula, conocer la orientación química, es decir, si es más acida, básica, si
es de carácter débil o fuerte y probablemente conocer su tamaño y composición molecular.
A modo de ejemplo podemos comentar que si un compuesto contiene 4 o 5 carbonos y un
grupo polar como el hidroxilo, por ejemplo, normalmente va a ser soluble en agua, mientras
que si posee más de 5 carbonos probablemente ya no sea soluble en agua.

Propiedades Físico-Químicas
1.- Puntos de Fusión (PF)
2.- Puntos de ebullición (PE)
3.- Índice de refracción
4.- Densidad (d) y peso específico.
5.- Rotación óptica (α)
6.- Solubilidad.
Todas estas propiedades tienen el objetivo de identidad y pureza de esa muestra de materia
prima o principio activo.

Análisis Cualitativo
Métodos térmicos de análisis:
1. Punto de fusión (PF)
2. Punto de ebullición (PE)
3. Termogravimetría
4. Análisis Térmico Diferencial (DTA)
5. Calorimetría Diferencial de Barrido
*Dentro de este análisis cualitativo, los más utilizados que podemos encontrar dentro de
las farmacopeas o la USP o la británica, vamos a encontrar que en la mayoría de las
monografías de los compuestos presentan métodos térmicos de análisis como los
mencionados anteriormente, aunque clásicamente los dos primeros son los que se
encuentran siempre en estas monografías.

Punto de fusión
El punto de fusión no es otra cosa que la determinación de la temperatura a la que un sólido
pasa al estado líquido por efecto de la aplicación de temperatura. Los métodos utilizados
para determinar el punto de fusión los tenemos a continuación:
1. Punto de Fusión Capilar (Más clásico)
2. Micropunto de Fusión
3. Punto de Fusión instantáneo

Punto de Fusión Capilar

En la imagen podemos observar en la fotografía los equipos para medir los puntos de fusión
capilar, los dos de la izquierda son los actuales que se utilizan y el de la derecha es el más
antiguo, el cual consistía en un baño de silicona o vaselina, un termómetro insertado en un
corcho y adosado a la punta del termómetro se colocaba un capilar donde estaba contenida
la muestra. Ese capilar quedaba fuertemente unido al termómetro y el agitador que estaba
insertado en el corcho se movía para homogenizar la muestra de vaselina o silicona en el
mechero y estar mirando a ojo desnudo (sin microscopio y sin lupa) cuando se fundiera el
sólido que estaba dentro del capilar y en ese momento mirar la temperatura en el
termómetro. Este procedimiento podía durar entre una a dos horas.
En el equipo de la izquierda que
parece un microscopio que posee
un visor con aumento, que posee
una abertura donde se inserta el
capilar con la muestra de manera
que si observamos vamos a ver la
forma amplificada del capilar con la
muestra en ese microscopio. Abajo
tendremos los ajustes de
temperatura, por lo cual si
sospechamos que el compuesto
funde a 180° lo que hacemos es
fijar una temperatura de calentamiento más rápida al inicio que llegue a los 170° con un
aumento de 5° por minuto y cuando llega a los 170° que disminuya esa velocidad de
calentamiento y por ejemplo que sea 1° por minuto de manera que podamos alcanzar a
visualizar cuando el compuesto se funde y cuando pase apretamos un botón en el
instrumento para ver a la temperatura a la cual se funde. Estos instrumentos funcionan a
través de un sistema de aire caliente, por lo que a través de un sistema de resistencia
produce el calentamiento del ambiente que es pasado a la muestra, por lo que es más
sencillo enfriar.
Ventajas:
- Poca Muestra
- Económico
- Poca instrumentación
Desventajas
- Lento
- No útil para compuestos termolábiles (Se descomponen por la aplicación de T°)

Micropunto de Fusión
Fundamento:
Es básicamente un microscopio cuya platina es
calentada eléctricamente y lo que podemos hacer
es observar a través del ocular cuando se va
produciendo la fusión del compuesto y
probablemente observar las distintas etapas del
estado cristalino a medida que va aumentando la
temperatura.
Ventajas:
- Observación de Cambios
- Poca Muestra
Desventajas:
- Lento y costoso
- No útil para Termolábiles

Punto de fusión Instantáneo

Fundamento:
Consiste en que tenemos una barra
metálica que es calentada
eléctricamente y en cada punto de esta
barra hay una temperatura asociada. De
modo que lo que se hace es esparcir el
polvo de la muestra sobre esta barra y en
la temperatura de fusión de este
compuesto se va a mover la aguja que se desplazara donde se produzca la fusión del
compuesto.
Ventajas:
- Rápido (Instantáneo)
- Útil termolábiles.

Punto de Fusión
¿Cuál es la utilidad entonces de la determinación del punto de fusión?
Principalmente lo que nos comentaba es verificar la pureza de los compuestos, confirmar
la identidad a través del punto de fusión mixto e identificar a través de la determinación
de la temperatura de fusión eutéctica.
¿Que nos va a permitir entonces la determinación del punto de fusión?
Conocer algunos aspectos respecto a la estructura química de los compuestos, ya sea
orientadas respecto al peso molecular, hacia el tipo de cristales o la presencia de isómeros.
Si vamos al modulo vamos a verificar que a mayor peso molecular es mayor el punto de
fusión de los analitos o de los compuestos, vamos a verificar que los sistemas cristalinos
mas ordenados tienen mayor punto de fusión que los sistemas cristalinos mas
desordenados, generalmente los cristales amorfos funden mas rápido. También podremos
encontrar en el módulo que los isómeros en general también poseen estructuras mas
rígidas, tienen puntos de fusión un poco más elevado.
1.- Verificar Pureza
¿Por qué es útil para verificar Pureza?
Básicamente porque si ustedes por ejemplo realizaran un análisis o ensayo por ejemplo en
el que en una modulan la temperatura y en el otro miden el tiempo y tienen un compuesto
puro, van a observar lo que ocurre a la izquierda, donde esta la zona de calentamiento que
es la primera pendiente hasta que funde el compuesto y eso dura algunos segundos, si esas
temperaturas donde se funde el compuesto son las mismas se dice que el compuesto es
puro, por el contrario si nuestra muestra tuviese contaminantes y por tanto estuviera
impuro, la temperatura inicial de fusión va a ser distinta a la temperatura final de fusión tal
como se muestra en el gráfico de la derecha, entonces así se puede asegurar que el
compuesto es impuro, es decir, hay algo mas que el analito o el principio activo.

PUNTO DE FUSION MIXTO

2.- Confirmar identidad
Procedimiento
- Determinar PF del analito
- Buscar posibles “candidatos” (Compuestos con PF similar)
- Mezclar analito y “candidato” en partes iguales.
- Determinar PF mixto.
- Si PF mixto es igual al PF de analito (±0,5°C) es muy probable que este corresponda
al “candidato”.
- Si PF mixto es diferente → NO es el candidato.
Lo que se hace es determinar el punto de fusión del analito, y en base a ese punto de fusión
determinado, se buscan los posibles candidatos, es decir, compuestos que tengan un punto
de fusión similar. Por ejemplo si hicimos la medición de una muestra y arrojo que tiene un
punto de fusión de 155 grados, vamos a bibliografía, puede ser en una USP o tablas de
puntos de fusión y vamos a encontrar que a 145 grados funden el paracetamol , diclofenaco
e hidroclorotiazida, pero no tenemos certeza de cual de esos tres posibles candidatos
corresponde a nuestra mezcla, por lo que mezclamos en partes iguales nuestra muestra
más una fracción igual de paracetamol, o su muestra más diclofenaco o hidroclorotiazida y
determinamos el punto de fusión de cada mezcla. Entonces si ese punto de fusión mixto
que obtenemos de esta mezcla en partes iguales es igual al punto de fusión del analito,
nosotros con una cierta certeza podemos confirmar que probablemente corresponda a ese
compuesto, si en cambio el punto de fusión mixto que obtuvimos de esa mezcla es de 130
grados entonces inequívocamente vamos a decir que no corresponde a este. Cuando
realizamos un punto de fusión mixto hay dos posibilidades, que el compuesto sea el
candidato probablemente o que descartemos esa posibilidad.

PF EUTÉCTICO
3.- Identificar.
Procedimiento:
- Determinar PF del analito
- Buscar compuestos probables en tablas eutécticas (estándares)
- Preparar mezcla del compuesto y estándares eutécticos.
- Contrastar valores de PF obtenidos con aquellos de tablas.
- Conclusión: ES o NO ES el analito.
Se hace el tercer tipo de punto de fusión que es el punto de fusión eutéctico, ya habíamos
determinado el punto de fusión del analito, entonces se busca en tablas eutécticas de
estándares eutécticos los probables compuestos. Por ejemplo, nosotros sabemos o
sospechábamos que era paracetamol y como estándares eutécticos existen la acetanilida,
la fenacetina y buscamos entonces en esa tabla cuales son los PF de una mezcla entre mi
compuesto mas la acetanilida y van a tener en esa tabla el PF que debería resultar de esa
mezcla y si mezclan el paracetamol con la fenacetina que es el otro estándar eutéctico
también esta especificado la temperatura del PF de esa mezcla. De manera que preparamos
esa mezcla en partes iguales y determinamos los valores de PF que obtenemos. De esta
manera llegamos a la conclusión de que si obtenemos el mismo PF que sale en la tabla
entonces es el analito, pero si no coincide con el valor de la tabla entonces descartamos el
paracetamol como el analito. Aquí entonces si permite identificar el analito.
Clase 2 18-03-2020
La clase anterior se vio el inicio de este capítulo de
propiedades fisicoquímicas y hablamos principalmente de
cuales eran las utilidades, las ventajas de las Propiedades
fisicoquímicas, ¿Por qué un farmacéutico debe conocer
respecto de las propiedades fisicoquímicas de un
compuesto?, sobre todo si les llega a su laboratorio un analito
que desconocemos. Entre esas múltiples propiedades que estábamos comenzando a
estudiar, hablábamos de que nos podían servir para fines de identificación y de control de
pureza en algunos casos, es así como primero vimos el punto de fusión, vimos los tres tipos
de métodos para la determinación del PF, el más corriente o clásico el PF capilar, luego el
Micropunto de fusión y finalmente el PF instantáneo. Enseguida hicimos un ejemplo
práctico de la determinación del punto de fusión mixto para confirmar la identidad del
analito o bien Punto de fusión eutéctico para identificar un analito a través de la medición
de la medición del PF de una mezcla eutéctica.

Punto de Ebullición
- Series Homólogas >n° átomos de C -> ↑PE
- Unión Puente de Hidrógeno >n° de puentes -H -> ↑PE
- Polaridad PE aromáticos > PE alifáticos
- Posición grupo funcional + central -> ↓PE
- Ramificación > Ramificación -> ↓PE
Tenemos en el esquema el mismo que utilizamos en el PF salvo que en este caso esta
destacado el cambio de estado liquido a gaseoso, porque en el fondo el punto de ebullición
corresponde a la temperatura a la cual coexisten un analito en el estado de equilibrio entre
el estado liquido y el estado gaseoso. Lo importante es que tal como otras propiedades
fisicoquímicas, la medida del punto de ebullición nos va a permitir obtener ciertas
estructuras de los compuestos y así por ejemplo si nosotros tomamos una serie homologa,
cuando dice serie homologa por ejemplo serian todos los hidrocarburos saturados y vamos
midiendo su punto de ebullición a medida que se van agregando átomos de carbono a la
molécula inicial, vamos a verificar entonces que existe un aumento en el PE mientras mayor
sea el número de átomos de carbono, también es posible que este aumento pueda
obedecer a la presencia de puentes de hidrogeno en la molécula, pueden ser puentes de
hidrogeno intramoleculares o extramoleculares. En definitiva, lo importante es que si existe
la posibilidad de formación de puentes de hidrogeno dentro de la molécula, vamos a tener
un PE mayor que si no existiese ese grupo que permite la unión Puente de hidrogeno. Si se
compara ahora entre los compuestos aromáticos con doble enlace insaturados y aquellos
que son alifáticos o saturados con igual numero de carbonos, vamos a verificar que hay un
aumento en la polaridad en aquellos que son aromáticos. También es indicador o nos puede
dar una orientación respecto al PE, la posición del grupo funcional dentro de una molécula,
si por ejemplo tenemos un alcohol de cuatro carbonos, uno lineal y otro ramificado o bien
que ese grupo funcional este en vez de terminal, en el carbono dos o en el carbono tres, en
ese caso vamos a verificar que el punto de ebullición de ese compuesto disminuye del
compuesto de estructura lineal. Del mismo modo pasa con la ramificación, mientras mas
ramificado sea el compuesto, menor será su PE.
Índice de Refracción
Influenciado por:
- Analito
- Temperatura (por cada °C el índice
de refracción disminuye 0,00045
unidades)
- Longitud de onda
Instrumentos:
- Refractómetro de Abbe (Directa)
- Refractómetro de Inmersión
(Indirecta)
Ya habíamos dicho la clase pasada que el índice de Refracción es para líquidos, si nos
acordamos de las clases de análisis instrumental, la definición del índice de refracción es la
relación que existe entre el anulo que toma este rayo de luz incidente al atravesar la cubeta
donde esta el analito que en este caso como dijimos es un líquido. Ese rayo de luz incidente
cambia su ángulo de incidencia, de manera que se produce un distinto ángulo cuando esta
fuera del medio a cuando esta dentro del medio que contiene este analito. Esa relación de
velocidad de este rayo incidente o esa relación del ángulo es lo que se conoce como índice
de refracción. Ese índice de refracción va a estar influenciado por supuesto por el analito,
por la temperatura y aquí hay que tener presente que por cada grado de aumento de la
temperatura, el índice de refracción disminuye en 0,00045 unidades. Ahora este rayo de luz
incidente generalmente utiliza la longitud de onda de la línea D del sodio.
Los instrumentos para medir el índice de refracción son el Refractómetro de Abbe donde
se hace una medición directa y el otro en un Refractómetro de inmersión donde se hace
una medición indirecta.

Utilidad
- Identificación de Líquidos (±0,0004)
- Control de pureza
- Análisis Cuantitativo
- Detector en cromatografía de líquidos (Industria Azucarera)
Esencialmente es para la identificación de líquidos con esa tolerancia, para control de
pureza de líquidos, para análisis cuantitativo sobre todo porque se utiliza como detector en
cromatografía de líquidos en la industria azucarera.

Ejemplos:
A. M-xileno: ƞ𝐷20 = 1.49722
Muestra ƞ𝐷25 = 1.49587
1,49722 − 5 · 0,00045 = 1,49497
B. Como influyen los siguientes factores sobre el RI:
a) ↑Temperatura -> ↓n?
¿Verdadero o falso? VERDADERO
b) ↑ Concentración de solutos -> ↓n?
¿Verdadero o falso? FALSO
Aquí un ejemplo, el m-xileno tiene un índice de refracción medido a 20° que es igual a
1,49722 y se esta realizando una muestra que fue medida a 25° y el valor entonces es
1,49589, esa diferencia en el índice de refracción con esta muestra que se cree que es m-
xileno, acuérdense que por cada grado de aumento, el índice debe disminuir en 0,00045
unidades y entonces sacar el calculo para ver si esta muestra corresponde al m-xileno o a
otro analito. Ahora como influyen los siguientes factores sobre el RI, ¿a mayor temperatura
disminuye el valor del índice de refracción?, esto seria verdadero, ya que al aumentar la
temperatura se disminuye en 0,00045 unidades por grado Celsius. Tenemos que pensar que
la temperatura se refiere en el liquido y estamos midiendo la velocidad en que este haz
incidente atraviesa el líquido, entonces cuando aumentamos la temperatura preparando
un huevo frito lo primero que hacemos es agregarle aceite y el aceite es viscoso, pero a
medida que aumentamos la temperatura se hace mas liquido y se distribuye mejor en el
sartén. Con el aumento de la temperatura entonces disminuye la viscosidad en el liquido o
del medio que contiene a nuestro analito y por lo tanto hay un aumento de la energía
cinética y la velocidad con que atraviesa este rayo de luz incidente va a ser mayor y por
tanto el índice va a disminuir por lo que sería Verdadero. Ahora en la pregunta b dice, ¿si
aumento la concentración del soluto disminuye el índice de refracción?, esto seria falso ya
que al aumentar la concentración de solutos el medio o la velocidad va a disminuir en el
liquido y por tanto el índice de refracción va a aumentar.

PODER ROTATORIO
Compuestos ópticamente activos:
- Enantiómeros
- Diasteroisómeros

Otra propiedad fisicoquímica y obviamente el poder rotatorio es

aplicable a compuestos que son ópticamente activos, esto significa que
presentan quiralidad, lo cual significa que estructuralmente la molécula
va a estar compuesta por un carbono quiral que va a estar unido a 4
sustituyentes diferentes, en ese caso vamos a tener enantiómeros y
diasteroisómeros. ¿Como se expresa el poder rotatorio?, se expresa
como la rotación especifica que esta denotada como la letra alfa a una
cierta temperatura y longitud de onda, en el caso de los sólidos o soluciones de solidos
corresponde al ángulo de rotación multiplicado por 100 y dividido a su vez por el largo del
tubo polarimétrico y la concentración en gramos por ciento. En el caso de líquidos la
rotación especifica se calcula por la división entre la rotación angular que es el ángulo de
rotación que uno mide en el polarímetro dividido por el largo del tubo polarimétrico
multiplicado por la densidad de ese líquido.
¿Qué elementos o parámetros pueden influenciar o modificar este poder rotatorio?
- Longitud de ondas (Curvas DOR)
- Temperatura (20°C)
- Concentración (0,0188°/g)
- Naturaleza del compuesto
- Solvente
En particular cuando hablamos de la longitud de
ondas y se habla de estas curvas de dispersión
óptica rotatoria, eso significa que un compuesto
que tiene una cierta rotación angular a una
longitud de onda, si se va variando una cierta
longitud de onda, va variando también el valor de
su ángulo de rotación, y acá va a depender si se
esta hablando de compuestos Dextrógiro o
Levógiro. Si nos fijamos en la molécula Levógira mantiene valores negativos pese al cambio
de longitud de onda, que pasa si a esta misma molécula Levógira le incluimos grupos
cromóforos, supongamos que generamos una reacción donde se incorporan dobles enlace,
lo que va a ocurrir es que si aumentamos la longitud de onda vamos a ver que esta molécula
que inicialmente era levógira va a ir aumentando el valor de su rotación angular hacia
valores positivos hasta atravesar el eje cero y se transforma ahora en una molécula
dextrógira a esa longitud de onda. Eso se le conoce entonces como efecto Cotton positivo
(cuando se va hacia valores de rotación angular positivos). En el caso contrario, si tenemos
una molécula que inicialmente era dextrógira y avanzamos en la longitud de onda
verificamos también un efecto hacia valores negativos de rotación angular. Se le llama
entonces efecto Cotton negativo. Esta interpretación de las curvas de dispersión óptica
rotatoria nos permite tener una aproximación respecto de la estructura de compuestos que
sean desconocidos. Por ejemplo, si nos llega a nuestro laboratorio la molécula y
sospechábamos que era dextrógira, practicamos una reacción química que incorpore
grupos cromóforos y vuelven a medir la dispersión óptica rotatoria, trazamos esta curva y
cambia la molécula de dextrógira a levógira, nos aseguramos de que nuestro compuesto
ópticamente activo es inicialmente dextrógiro.

Utilidad
- Identificación.
- Determinación de Pureza.
- Curvas DOR y estructura.
- Curvas de calibración con el poder rotatorio.
Nos sirve para realizar curvas de calibración con el poder rotatorio porque en el eje de las Y
tiene valor de poder rotatorio y en el eje de las X vamos a poder validar la concentración y
de esa manera generar curvas de calibración cuando queremos cuantificar un analito.

Densidad

Densidad absoluta => 1,0000000 g/mL (H2O a 3,98°C)

t´= temperatura ≠ 3,98°C
Nosotros sabemos que la densidad es la relación entre la masa y el volumen que utiliza esa
masa. Generalmente la expresamos en gramos por mililitros o en gramos por litro también
y debe ser medida a una cierta temperatura. A partir de la densidad también se puede hacer
la relación con la masa y el mismo volumen de agua de esa masa y en ese caso estaremos
hablando del peso especifico o densidad relativa. Esto ya que estamos comparando la
densidad del analito y la densidad del agua. Esto se mide a temperaturas distintas y es
distinta de 3,98°C que es la densidad absoluta del agua.
Utilidad:
 - Identificación.
- Verificación de Pureza.
- Análisis cuantitativo de soluciones hidroalcohólicas, ácidos y bases.

Relación Densidad y Estructura Química

- Peso Molecular (↑PM -> ↑d)
- Ramificación (↑Ramificación -> ↓d)
- Grado de insaturación (↑Insaturación -> ↑d)
- Posición Insaturación (+ central -> ↑d)
- Grupos funcionales Monofunc. -> d < 1
Polifunc. -> d > 1
- Halógenos F, Cl -> d < 1
Br, I -> d > 1
Todas estas verificaciones son empíricas es decir se hizo experimentalmente cuando se
clasificaban estos compuestos y se verifica que ocurra eso.
Todas estas orientaciones respecto a la estructura química, podemos obtener simplemente
midiendo la densidad de un compuesto, eso entonces nos va permitir orientar hacia la
identidad de los compuestos en el análisis farmacéutico que podemos complementar con
mas estudios de otras propiedades fisicoquímicas si disponemos en el laboratorio de
métodos instrumentales.
Solubilidad
Este capitulo es super importante porque de este capitulo en adelante vamos a ir utilizando
el concepto de solubilidad. Pero ¿Por que es tan importante esta solubilidad? Esto es
porque para cualquier análisis cuantitativo, para hacer alguna reacción química, para hacer
alguna extracción, es necesario conocer en que solvente es soluble un compuesto. La idea
de esta clase es que viendo una estructura química y siguiendo una marcha de solubilidad
vamos a poder determinar en que solvente son solubles los diferentes compuestos.

Introducción
Compuesto:
- Iónico: RCOO- Na+
- NO Polar: CH3-CH3
- Polar: CH3-CH2-OH
Solvente:
- Capacidad de formar Puentes Hidrogeno
- Magnitud de la cte. Dieléctrica.
*La solubilidad obviamente va a depender del compuesto y del solvente. En los compuestos
tenemos diferentes uniones químicas, primero tenemos las uniones de tipo iónicas donde
hay una transferencia de electrones, luego tenemos las uniones de tipo covalentes donde
hay una compartición de electrones, aquí pueden ser no polares cuando los átomos son
iguales o pueden ser polares cuando los átomos son distintos dependiendo de su
electronegatividad. Ahora el solvente puede tener distintas características, por ejemplo,
como el agua que puede formar puentes de hidrogeno es importante la magnitud de su
constante dieléctrica del compuesto y también es importante su carácter ácido-básico.
Todas estas características del solvente y del compuesto van a influir en la solubilidad de un
compuesto en un determinado solvente.

SOLVENTES
Clasificación:
- Solubilizan por Miscibilidad: - Agua - Éter
- Solubilizan por una reacción: -HCl -NaOH - NaHCO3 -H2SO4
Los solventes se pueden clasificar por dos tipos, los que solubilizan por miscibilidad y los
que solubilizan por una reacción química. Los que solubilizan por miscibilidad en la marcha
que vamos a ver es el agua y es el éter, mientras que los que solubilizan por una reacción
química tenemos el ácido clorhídrico (HCl), el hidróxido de Sodio (NaOH), el bicarbonato de
sodio (NaHCO3) y el ácido sulfúrico (H2SO4).
Miscibilidad: Lo similar disuelve lo similar
- Magnitud polaridad
- Ramificaciones en alifáticos
- Sustituciones en aromáticos
Dentro de los solventes que solubilizan por miscibilidad hay que tener siempre presente
que lo similar disuelve lo similar, de esta manera un compuesto polar se va a disolver en un
solvente polar. Hay que tener en cuenta la magnitud de la polaridad, ya que no es lo mismo
disolver etanol en agua que decanol en agua, esto porque el decanol tiene 10 átomos de
carbono y solamente un grupo polar y eso va a ser que no sea soluble en agua, por lo tanto,
siempre hay que ver el balance entre la cadena hidrocarbonada y la cantidad de compuestos
polares que tenga el compuesto. La ramificación en los compuestos alifáticos también
afecta fuertemente, mientras mas ramificado este un compuesto va a ser mas soluble ya
que ese compuesto va a ser menos simétrico. La sustitución es muy importante en los
compuestos aromáticos dependiendo si tenemos un dador o un atractor de electrones
generara un efecto en el compuesto.

Solvente clasificación Solvente subclasificación

Agua Éter
Hcl 5% -
NaOH 5% NaHCO 5%
3

H SO (c) -
2 4

Acá tenemos los solventes que se dividen en clasificación y subclasificación. Los de

subclasificación es solamente porque un compuesto se prueba en el solamente después de
haber salido soluble en el solvente de clasificación. Así tenemos que por ejemplo si un
compuesto es soluble en agua, después se prueba en éter y ahí se clasifica, si es soluble en
acido clorhídrico se clasifica ahí, si es soluble en hidróxido de sodio se subclasifica en
bicarbonato de sodio y si es soluble en ácido sulfúrico se clasifica ahí.
Esta es la marcha de solubilidad que hay que hacer y hay que ir siguiéndola en orden para
poder clasificar algún compuesto en alguno de estos solventes. Primero tenemos que el
compuesto se prueba en agua, si es soluble en agua, se va a probar en éter que es un
solvente de subclasificación y ahí se va a clasificar como soluble o insoluble. Si es soluble en
éter se hace una medición de pH para clasificar más (Obviamente esta medición se hace en
la solución acuosa y no en la solución etérea). Si el compuesto es insoluble en agua se va a
probar en acido clorhídrico, si es soluble se clasifica ahí y si es insoluble se pasa al tercer
solvente que seria al hidróxido de sodio, si el compuesto es soluble en hidróxido de sodio
se hace una subclasificación y se prueba en bicarbonato de sodio donde se va a informar si
es soluble o insoluble y ahí se clasifica. Después si es insoluble en hidróxido de sodio se va
a probar en el ultimo solvente que es el ácido clorhídrico, aquí solamente se prueba en los
compuestos que no tienen nitrógeno ni azufre en su estructura, los compuestos que tienen
nitrógeno o azufre en su estructura son compuestos neutros que no reaccionan con el ácido
sulfúrico. Aquí entonces el ácido sulfúrico se va a clasificar como soluble o insoluble.
CRITERIOS SOLUBILIDAD
- Solubles: ≥3 g%
- Insolubles: ≤ 3 g%
*Ahora cuales son los criterios de solubilidad porque obviamente yo puedo tener un granito
de un compuesto y ponerle 10 litros de solvente y puedo decir que es soluble. Estos criterios
serian que los son solubles si es mayor o igual a 3 gramos por ciento eso quiere decir 3
gramos de compuesto en 100 mL de solvente y son insolubles si son menores o iguales a 3
gramos por ciento.
AGUA
Características
- Alta Constante dieléctrica
- Alta polaridad
- Carácter Anfótero
- Puede formar puentes Hidrogeno
- Ionizables
- Alcoholes
- Ác. Carboxílicos
- Aminas
Compuestos polares - Aldehídos
- Cetonas
- Amidas
- Ésteres
- Éteres

*Vamos a comenzar con el primer solvente que es el agua que tiene como característica
que posee una alta constante dieléctrica, una alta polaridad, posee un carácter anfótero,
esto quiere decir que puede se puede comportar como acido o como base y puede formar
puentes de hidrogeno. Esto la hace un solvente útil para compuestos tipo polares
(recuerden que el agua solubiliza por miscibilidad). En su modulo se encuentran una serie
de compuestos que son solubles en agua.
Lo similar disuelve lo similar

Sol Agua

Insol Agua

*Acá tenemos un ejemplo de lo que habíamos dicho que lo similar disuelve lo similar, el
compuesto de arriba que es un compuesto iónico se va a solubilizar en agua, en cambio los
compuestos de abajo que no tienen ningún grupo polar van a ser insolubles en agua.
Soluble ≤ 5C
*Aquí se ve un ejemplo en donde se ve la magnitud de la polaridad, los compuestos van a
ser solubles si tienen 5 o menos átomos de carbono por cada grupo polar. Así los
compuestos de arriba, el etanol tiene menos de 5 carbonos y un grupo polar y va a ser
soluble en agua. En cambio, el octanol tiene 8 átomos de carbono y un grupo polar y va a
ser insoluble en agua. Al igual que el aldehído de abajo también va a ser insoluble porque
presenta un grupo funcional para la cantidad de átomos de carbono que posee. En cambio,
el carbohidrato tiene muchos grupos polares por tanto el si va a ser soluble en agua.
Los carbonos con 1 grupo polar son solubles:
4 carbonos: Cadena normal

O O
CH3 C C2H5 CH3 C C4H9

Soluble Insoluble
*Hay ciertas reglas que es muy importante que se la aprendan para la solubilidad en agua
porque siguiendo estas reglas van a poder hacer una fácil clasificación del compuesto, si es
soluble o es insoluble en agua. La primera regla es que los compuestos que tienen solo un
grupo polar son solubles con 4 carbonos cuando la cadena es normal, con cadena normal
se refiere a cuando no es ramificada. Así por ejemplo el compuesto de la izquierda va a ser
soluble porque tiene 4 carbonos mientras que el de la derecha será insoluble porque
presenta 6 carbonos.
Más de un grupo funcional:
Cada grupo puede solubilizar entre 3-4 C

O
CH3 C CH CH2 CH CH3

CH3 OH

Soluble
*Obviamente si hay mas de un grupo funcional que le aporte polaridad a la molécula va a
aumentar la solubilidad de ese compuesto. Se dice que cada grupo funcional puede
solubilizar entre 3 o 4 átomos de carbonos. Por lo tanto, el compuesto que esta ahí que
tiene 2 grupos polares va a ser soluble en agua, aunque tenga más de 5 carbonos.
Aromático sustituyente (fenilo) se comporta como si tuviera 4 carbonos.

≈ CH3CH2CH2CH2CH2OH
Insoluble
5 C / 1 GP
*El grupo aromático cuando se comporta como un sustituyente fenilo equivale a como que
tuviera 4 Carbonos, así, los dos compuestos que están abajo que tendrían los dos 5 carbonos
tienen una similar solubilidad y como no están ramificados se van a clasificar como
insolubles en agua.
Los halógenos y grupos NO2 inducen insolubilidad en agua (Aumento PM)
OH-CH2-CH2-CH2-CH2-Cl

Insoluble
*Los halógenos y el grupo nitro cuando entran a una cadena hidrocarbonada inducen
insolubilidad en agua por su alto peso molecular, así el compuesto de ahí que tiene 4
Carbonos y un grupo polar que uno diría es soluble en agua, como entra un grupo cloro va
a hacer que se convierta en insoluble en agua por el gran peso que aporta el Cloro.
- Mayor PF: Menor solubilidad.
- Posición grupo funcional: III>II>I

*También influencia el punto de fusión, a mayor punto de fusión va a ser menor la

solubilidad, para disolver un compuesto se debe romper la estructura cristalina y la fuerza
del cristal lo demuestra el punto de fusión. Además, es importante la posición del grupo
funcional, van a ser mas solubles los grupos que sean terciarios, luego secundarios y
finalmente primarios.
- Mayor ramificación: Mayor Solubilidad
- Ácidos carboxílicos: pares < sol, >PF
- Amidas: Disust> Monosust > No sust
*La ramificación mientras sea mayor, mayor será la solubilidad. Hay un caso especial de los
ácidos carboxílicos y es que los ácidos carboxílicos pares tienen menor solubilidad por su
mayor punto de fusión. Mientras que las amidas disustituidas son mas solubles que las
monosustituidas y esta a su vez es más soluble que la no sustituida. Esto es porque las no
sustituidas pueden formar polímeros, las monosustituidas pueden formar dímeros, en
cambio las disustituidas no se asocian.

ETER
Los compuestos solubles en agua se prueban en éter.
Características

- Baja constante dieléctrica

- Baja polaridad
- No pueden formar Puentes de Hidrogeno
*Luego pasamos al segundo compuesto, si un compuesto es soluble en agua se va a probar
en éter. Obviamente el éter tiene características muy distintas al agua, por lo tanto,
clasificar un compuesto como soluble en agua y soluble en éter va a dar harta información
acerca de que grupo de compuestos puedo tener. El éter tiene una baja constante
dieléctrica, baja polaridad y no puede formar puentes de Hidrogeno.
Compuestos solubles en éter
- No iónicos
- Un grupo polar
- Con 5 o menos átomos de Carbono.
 CH3 O
+ -
C2H5 NH Cl CH3 C CH3
H

Soluble agua Soluble agua

Insoluble éter Soluble éter

*Los compuestos solubles en éter son los no iónicos, los con un grupo polar y con 5 o menos
átomos de carbono. Así tenemos dos ejemplos, el primero es una sal, la cual es soluble en
agua y por esta misma característica de ser iónica va a ser insoluble en éter, luego la otra
estructura de la derecha que por la cantidad de carbonos por el grupo polar va a ser soluble
en éter y por esto mismo que tiene un grupo polar y tres átomos de carbono también va a
ser soluble en éter. Al clasificar un compuesto como soluble en agua y soluble en éter uno
ya restringe a un estrecho numero de compuesto porque para que se cumplan estas
características son pocos compuestos las que las cumplen.

ÁCIDO CLORHÍDRICO
Los compuestos insolubles en agua y con N en su estructura se prueban en HCl.
A > Basicidad > solubilidad en HCl

CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 NH2

Insoluble agua Soluble HCl

*Luego pasamos al tercer solvente de clasificación que corresponde al acido clorhídrico,
este es un solvente de reacción, solubiliza produciendo una reacción química. Como es un
acido va a reaccionar con una base, se va a formar una sal y esa sal va a ser soluble. Este
acido clorhídrico esta diluido por lo tanto esta preparado en agua. Por tanto, forma la sal y
esa sal que se forma va a ser soluble en el acido clorhídrico que esta en un medio acuoso.
Ahora los compuestos que son insolubles en agua y que tengan basicidad van a ser solubles
en acido clorhídrico que generalmente son los compuestos nitrogenados, ahora no todos
los compuestos nitrogenados van a ser solubles en ácido clorhídrico ya que va a depender
de su basicidad. Así la amina que tiene 5 átomos de Carbono y un grupo polar que seria la
amina es insoluble en agua ¿Por qué? Porque tiene 5 átomos de Carbono, sin embargo,
pasamos a probarlo en acido clorhídrico y como es una amina va a ser soluble en acido
clorhídrico.
Solubilidad en Ácido Clorhídrico
- Alquilaminas, cicloalquilaminas, heterociclos nitrogenados saturados.

Soluble HCl
- Aminas monoaromáticas, heterociclos N, amidas dialquilsustituidas.

Soluble HCl
- Aminas Aromáticas policíclicas, heterociclos N policíclicos, amidas mono y
no sustituidas.

Insoluble HCl
*¿Quiénes se solubilizan en Ácido Clorhídrico? Los mas solubles son las aminas alifáticas,
las cicloalquilaminas y los heterociclos nitrogenados saturados, luego vienen las aminas
monoaromaticas (un solo grupo), heterociclos nitrogenados y las amidas dialquilsustituidas.
Solamente las amidas dialquilsustituidas son solubles en acido clorhídrico, las mono y las no
sustituidas no tienen basicidad para disolverse en acido clorhídrico. Luego, finalmente las
aminas aromáticas policíclicas y los heterociclos nitrogenados policíclicos y las amidas
anteriormente mencionadas van a ser insolubles en acido clorhídrico, aunque tengan
nitrógeno en su estructura química.
*Aquí tenemos algunos ejemplos, en el modulo hay varios ejemplos más que podemos
encontrar. Acá tenemos primero la anilina, la cual tiene solo un grupo aromático por lo que
va a ser soluble en ácido clorhídrico. Luego tenemos el carbazol, el cual es un heterociclo
nitrogenado policíclico, por lo tanto, va a ser insoluble en ácido clorhídrico. Finalmente
tenemos una amina con dos grupos aromáticos que también va a ser insoluble en ácido
clorhídrico.

Efecto de los sustituyentes sobre la basicidad

- Grupos Activantes lo aumentan
Aminas alifáticas (R)
Aminas Aromáticas (Aminas, R, OR, OH)
Aromático: Posición p
Cualquier dador en posición o afecta las moléculas impredeciblemente
- Grupos desactivantes la disminuyen
Aminas Alifáticas (halógenos, NO2)
Aminas Aromáticas (NO2, halógenos, COOH)
Aromático: Posición o-p
*Es importante también el efecto de los sustituyentes que entran en la molécula sobre la
basicidad que tengan, así van a haber sustituyentes que van a aumentar la basicidad del
compuesto y van a hacer que sea mas soluble en ácido clorhídrico y hay compuestos que
las van a disminuir y por tanto la van a volver menos soluble al ácido clorhídrico. Así
tenemos que los grupos activantes van a aumentar la basicidad y los desactivantes la van a
disminuir. Así por ejemplo si tenemos aminas alifáticas dentro de nuestro sustituyente R,
ese va a aumentar la densidad electrónica de los electrones del nitrógeno y así aumentar la
basicidad. Tenemos grupos desactivantes en aminas alifáticas y en aminas aromáticas
donde va a importar la posición del grupo funcional para ver el efecto que produce.

HIDROXIDO DE SODIO
Los compuestos insolubles en HCl se prueban en NaOH.
A > Acidez > Solubilidad en NaOH
CH3-(CH2)5-COOH

Insoluble agua Insoluble HCl Soluble NaOH

*Luego pasamos al hidróxido de sodio, obviamente si un compuesto resulta insoluble en
ácido clorhídrico se va a probar en hidróxido de sodio. Aquí los compuestos que van a ser
solubles van a ser los compuestos ácidos, el hidróxido de sodio también es un solvente de
reacción que presenta un mecanismo igual que el HCl, acá los compuestos con mayor acidez
van a ser más solubles en hidróxido de sodio. Ahí tenemos el compuesto que corresponde
a un ácido carboxílico que contiene 7 carbonos por lo tanto va a ser insoluble en agua, como
es un acido va a ser insoluble en ácido clorhídrico y finalmente va a ser soluble en hidróxido
de sodio
Compuestos solubles en NaOH
- Ácidos carboxílicos y sulfónicos

Ácido Fuerte
- Fenoles, tiofenoles (Ar-SH)
imidas (RCO-NH-OCR)
Ácidos hidroxámicos (RCO-NHOH)
Nitrocompuestos (RCH2NO2, R2CHNO2)
Sulfonamidas monoalquilsust (SO2-NHR)
Ácido Débil

*¿Quienes son solubles en hidróxido de sodio? Son los Ácidos fuertes y los Ácidos débiles
que están enlistados previamente, los nitrocompuestos solo primarios y secundarios ya que
deben tener un hidrogeno al lado para cumplir su carácter acido.
Efectos de los sustituyentes sobre la acidez
- Grupos activantes la disminuyen
Ácidos alifáticos (R)
Ácidos Aromaticos (Aminas, R, OR, OH)
Aromático: posición p-m
Cualquier R en o aumenta la acidez.
- Grupos desactivantes la aumentan
Ácidos Alifaticos (halogenos, NO2)
Ácidos Aromaticos (NO2, halogenos, COOH)
Aromático: posición o-m-p
Por lo general un mismo sustituyente en o tiene mayor grado de acidez.
*Acá vemos el mismo efecto de los sustituyentes, pero es al revés, ya que los grupos
activantes van a disminuir la acidez y los desactivantes la van a aumentar. También hay que
tener en cuenta la posición del grupo funcional en los aromáticos.
Clasificación de Sustituyentes

Activantes Desactivantes

Fuerte OH - NH2 – NHR – NR2 NO2

Moderado OCH3-OR CN-SO3H-COOH-COOR-CHO-COR

Débil R- Fenilo Halógenos

*Para recordar un poco la clasificación de los sustituyentes, tenemos grupos que ejercen un
efecto fuerte, otros moderados y otros débiles y ahí tenemos clasificados los activantes y
los desactivantes.

BICARBONATO DE SODIO
Los compuestos solubles en NaOH se prueban en NaHCO3.

Ácidos carboxílicos
Ácidos fuertes Ácidos sulfónicos
Fenoles sustituidos
OH
Insoluble agua
Cl
Insoluble HCl

Soluble NaOH
Cl
Soluble NaHCO3

*Luego pasamos al bicarbonato de sodio, se prueban en el los compuestos que son solubles
en NaOH, esta subclasificacion se hace porque en bicarbonato de sodio solamente son
solubles los acidos fuertes. Como acidos fuertes podemos catalogar a los acidos
carboxilicos, acidos sulfonicos y algunos fenoles sustituidos. Esta sustitucion en el fenol para
que lo hagan soluble en bicarbonato de sodio tienen que ser con dos o mas sustituyentes
electronegativos que hagan que aumente fuertemente su acidez. Asi tenemos el fenol,
tenemos un compuesto con un grupo polar pero con dos cloro por lo tanto sera insoluble
en agua, luego como es insoluble en agua, lo probamos en acido clorhidrico, va a ser
insoluble en acido clorhidrico porque no es basico, luego lo probamos en hidroxido de sodio
va a ser soluble porque es un fenol fuertemente desactivado porque tiene dos cloro,
tambien va a ser soluble en bicarbonato de sodio y ahi se va a clasificar.
*Acá tenemos algunos
ejemplos, el fenol que vemos en
la imagen va a ser insoluble en
bicarbonato de sodio porque no
tiene ciertos sustituyentes
electronegativos, pero es
soluble en hidróxido de sodio,
ósea es un acido débil. Luego
tenemos el fenol que esta al
medio que tiene dos
sustituyentes electronegativos
por lo tanto va a ser soluble en
hidróxido y en bicarbonato de
sodio. Finalmente, el ultimo
también va a ser soluble en
bicarbonato de sodio porque
tiene 3 sustituyentes
electronegativos.

ÁCIDO SULFÚRICO
Los compuestos insolubles en NaOH y sin N y/o S se prueban en H2SO4

Soluble H2SO4 O Insoluble agua

CH3 CH C CH2 CH3 Insoluble HCl

CH3 Insoluble NaOH

*El ultimo solvente de clasificación es el ácido sulfúrico, como ya habíamos mencionado

antes los compuestos insolubles en NaOH y sin N y/o S se prueban en H2SO4. Si tienen
azufre o nitrógeno y ya se llega a esta etapa se clasifica como misceláneo y si no tienen se
prueban. Acá por ejemplo ese compuesto será insoluble en agua por la cantidad de
carbonos, es insoluble en acido clorhídrico porque no es una base, es insoluble en hidróxido
de sodio porque no es un acido y llegamos al acido sulfúrico y como vemos que es un
compuesto oxigenado será soluble en ácido sulfúrico.
Compuestos solubles en H2SO4
- Alquenos
- HC aromático activado
- Alcoholes bajo PM
- Compuestos oxigenados: Cetonas, aldehídos, éteres, esteres.
*Los compuestos solubles en acido sulfúrico son los alquenos reaccionan con el ácido
sulfúrico, se produce una sulfonación y así se disuelven, los hidrocarburos aromáticos con
sustituyentes activantes, los alcoholes con bajo peso molecular (generalmente hasta 10
carbonos) y los compuestos oxigenados generalmente las cetonas, aldehídos, éteres y
esteres.
Separación de mezclas en base a solubilidad

Fase acuosa Fase orgánica

Agua Éter
HCl
NaOH Cloroformo
NaHCO3

*Ahora la solubilidad también es super importante para separar mezclas, yo hago una
separación liquido-liquido en que tengo un compuesto en dos fases y así puedo hacer una
separación. Esta parte es super importante para la clase que viene a continuación de este
modulo que es el tratamiento de muestra, entonces es super importante que tengamos
clara la solubilidad para saber cómo hacer una separación liquido-liquido en base a la
solubilidad. Aqui como es una separación liquido-liquido tengo dos fases que son la fase
acuosa y la fase orgánica en que mi compuesto se va a repartir según sus características de
solubilidad. En la fase acuosa se puede ocupar agua, acido clorhídrico, hidróxido de sodio o
bicarbonato de sodio, mientras que en la fase orgánica se puede usar éter o cloroformo.
*Acá nos muestra un ejemplo de una separación entre una fase acuosa y una fase orgánica.
Esto va a depender netamente del compuesto que tengamos, no es una marcha como la
anterior, sino que yo según los compuestos que tengan voy a seleccionar la fase acuosa que
yo requiera, por ejemplo, si tengo una base voy a utilizar una fase acuosa de ácido
clorhídrico, pero si es una base voy a utilizar una fase acuosa como hidróxido o como
bicarbonato. Por lo tanto, esta separación va a depender netamente de la mezcla de
compuestos que tenga.
Supongamos que tengo una muestra, vamos a utilizar agua acida (fase acuosa) pero a eso
se refiere con acido clorhídrico, entonces la fase acuosa va a ser acido clorhídrico y la fase
orgánica va a ser éter. Si yo utilizo acido clorhídrico y hago esta separación liquido-liquido
en el embudo de decantación a la fase acuosa se nos van a ir los compuestos básicos y a la
fase orgánica se nos van a ir todos los compuestos ácidos y neutros, y supongamos que
tenemos un compuesto acido, si tengo un acido fuerte lo voy a tratar con bicarbonato de
sodio, pero si tengo un ácido débil lo voy a tratar con hidróxido de sodio. Entonces esta
marcha no es estática, sino que va a depender de la mezcla de compuestos que uno tenga.
Tratamiento de Muestras
El objetivo principal del tratamiento de muestra es separar el analito que interesa analizar
del resto de los componentes de la matriz para realizar un análisis cualitativo y/o
cuantitativo de este.
El tratamiento de muestra tal como dice esta diapositiva tiene como objetivo obtener
nuestro analito separado de la matriz en la cual se encuentra, de manera que ese analito se
encuentre separado y disponible para ser analizado ya sea en temas cualitativos o
cuantitativos, es decir, conocer su identidad y una vez conocida su identidad también poder
conocer cual es la cantidad que existe de ese analito en esa muestra que se tomo
inicialmente.
Generalidades
Proceso de medida => Información de objeto/ substancia
*Algunas generalidades respecto al tratamiento de muestra, obviamente como lo que
queremos obtener es información del objeto, la sustancia, principio activo o materia prima,
vamos a tener que realizar un proceso de medida y en cada medida necesitamos poder de
alguna manera aislar nuestro analito o separarlo del resto de los componentes de la matriz
que pueden ser tanto los excipientes como por ejemplo si estamos hablando de
medicamentos u otros principios activos que estén presentes en esa matriz. Ahí siempre
pone como ejemplo un medicamento antigripal donde pueden tener una combinación de
antihistamínicos, antipiréticos y analgésicos dentro de la misma formulación farmacéutica
y la idea es que podamos realizar un proceso de tratamiento de muestra que nos permite
entonces, por ejemplo, determinar ese analgésico inequívocamente, cuantificarlo
inequívocamente aun en presencia de las otras sustancias que están en esa matriz.
La substancia...
- Solido
- Liquido
- Gas
- Material Biológico

*La substancia entonces a estudiar puede ser un sólido, un líquido, un gas (con menor
frecuencia) o también puede estar dentro de un material biológico, por ejemplo, si
queremos extraer o cuantificar un analito por su medición en sangre y pienso
inmediatamente en fármacos anticonvulsivantes por ejemplo la fenitoína (Determinar
fenitoína en plasma de pacientes). Obviamente vamos a tener que separar esa fenitoína de
todos los otros componentes plasma de la sangre y de esa manera entonces poder
identificar y cuantificar esa fenitoína.
La información obtenida...
Composición Química o Física => Propiedades Estructurales=>Medida
*La medida que hagamos o ese proceso de medición va a estar determinado por las
propiedades estructurales del fármaco por que dependiendo de esas propiedades del
fármaco o compuesto vamos a determinar el mejor procedimiento de extracción como por
ejemplo una extracción liquido-liquido, extracción solido-liquido, extracción en fase solida
si la cantidad de muestra es muy pequeña y también podemos entonces tener en
consideración la composición química o física del compuesto, por ejemplo si es un sólido,
un líquido. Todo eso va a determinar como va a ser este proceso de medición o análisis de
ese compuesto.
Etapas del proceso de Medida...
Muestreo=>Preservación de la muestra=>Preparación de la muestra=>Análisis
*¿Cuáles son entonces las etapas de este proceso de medición o análisis? Bueno primero
tenemos que tomar una muestra de manera aleatoria con lo cual hay parámetros
estadísticos que permiten por ejemplo si estamos trabajando en industria farmacéutica y
tenemos un mezclador en V. En eso esta la mezcla de excipientes y principios activos y son
volúmenes grandes (Industriales) de polvo para compresión, y de ese mezclador entonces
tenemos que tomar una cantidad de muestra de puntos específicos dentro de ese
contenedor. De manera que no solo tomemos muestras superficiales, sino que tomemos
muestra de puntos intermedios y de puntos mucho mas abajo en el mezclador. Eso se puede
hacer en base a una planificación estadística, es decir, 5 puntos de la parte superior, 5 de la
intermedia y 5 de la inferior, para así tener una muestra representativa de ese polvo de
medicamento que se esta formulando. Luego tenemos que considerar la preservación de
esa muestra, es posible que ese principio activo o ese compuesto contenido en esa matriz
sea inestable a temperatura ambiente o sea sensible a la luz solar. Por lo tanto, hay que
protegerlo de la temperatura, de la humedad ambiental o también de la luz a través de la
utilización de un envase ámbar (con vidrio ámbar) para que pueda filtrar esa radiación. En
seguida entonces viene la etapa de preparación de la muestra donde ocurre propiamente
tal el proceso de tratamiento de esa muestra, es decir, de aislación de ese analito de su
matriz. Finalmente, ya con el analito disponible separado vamos a realizar el
correspondiente análisis cuali o cuantitativo.
Etapas de preparación de la Muestra...
Homogenización/Reducción de tamaño=>Extracción=>Concentración=>Clean Up=>Análisis
*Primero, en las etapas de preparación de la muestra, se necesita sin duda en el caso de
solidos particularmente homogenizar y reducir el tamaño. Para reducir el tamaño de un
polvo granulado se puede proceder al proceso de molienda donde en la industria
farmacéutica existen esos dispositivos que permiten la reducción de tamaño a través del
proceso de molienda que puede ser a veces por simple agitación por una cantidad de
tiempo especifico o puede ser a través de molinos que tienen dentro una especie de
cuchillos que van de alguna manera desmenuzando o descompactando los aglomerados de
polvo que pueden haber o también a través de dispositivos que se llaman de martillos
donde hay una suerte de golpeteos de estos aglomerados. Otra forma diferente de la
molienda puede ser el tamizado, es decir, pasarlo por distintos tamices con distintos
tamaños de poros de ese tamiz o de la rejilla del tamiz de manera de ir gradualmente
disminuyendo el tamaño o mas que disminuirlo o bien mas que disminuirlo dejar todos los
gránulos del mismo tamaño. Una vez que se ha logrado esa homogenización se procede al
procedimiento de extracción propiamente tal, ahí podemos usar lo que se menciono
anteriormente como por ejemplo extracción liquido-liquido que es la mas frecuente que
encontremos, la extracción solido-liquido o la extracción en fase sólida. Ese mismo
procedimiento de extracción lo que nos va a permitir en algunos casos es poder concentrar
la muestra, de manera de poder determinarla cuantitativamente con mucha más precisión,
puede haber involucrado también un proceso de Clean up o de lavado, de eliminación de
alguno de los excipientes que aun acompañan la muestra para dejar el analito aislado.
Finalmente, entonces ya disponible el analito aislado podemos recurrir a practicar los
análisis cualitativos y cuantitativos.

27%

6% 61%

6%

*Si pudiésemos agrupar el tiempo que utilizamos en el proceso de preparación de la

muestra y ustedes realizan ese procedimiento, en general mas del 50% casi el 61%
corresponde al tratamiento de la muestra, después otros porcentajes están asignados al
tratamiento de los datos o al procesamiento de los datos y al procedimiento de medición
del analito de interés, pero para los efectos de esta clase se enfoca en ese 61% que tiene
que ver con el tratamiento propiamente tal de la muestran entonces mas adelante cuando
tengamos laboratorios de esta área, principalmente de industria farmacéutica se van a dar
cuenta que cuando tengamos que analizar la potencia de un compuesto o la materia prima
que nos llegue al laboratorio de producción, la mayor parte del tiempo se nos va a ir
precisamente en tratar de aislar el analito por el procedimiento oficial que tengamos
establecido en ese laboratorio de producción, después la medida propiamente tal, el
proceso de redacción de ese informe final y los tratamientos de datos también ocupan
menos tiempo.
Análisis Cuali y Cuantitativo
Muestreo =============➔ Separación==============➔Análisis

No instrumental
Filtración, destilación, evaporación, Análisis Cualitativo
extracción con solventes, precipitación, Ej: IR, RMN, MS, etc
etc.
Análisis Cuantitativo
Instrumental Ej: UV, MS, etc
Cromatografía (GC, HPLC)

*Veíamos en la introducción del modulo cuando nos hablaba de análisis cuali y cuantitativo,
en el fondo esto se refería a que en esta etapa del tratamiento de muestra, lo primero que
corresponde es el muestreo y en seguida a partir de esa muestra ya homogenizada plantear
entonces algún mecanismo que permita separar los analitos presentes para después llevar
a cabo el análisis. Ahora esa separación se puede realizar por métodos no instrumentales,
es decir, que no requieren de mayor sofisticación para poder aislar el analito, de ahí
hablamos por ejemplo de una filtración simple, de la destilación de analitos que sean
principalmente volátiles, de evaporación, extracción con solventes, precipitación u otros.
Mientras que también podríamos usar métodos instrumentales para producir esta
separación y en este caso lo mas utilizado y lo más rápido también con mayor precisión y
reproducibilidad es el uso de la cromatografía ya sea en cromatografía de gas o
cromatografía de líquidos. En seguida entonces en la etapa de análisis tenemos esta
diferenciación respecto al objetivo que buscamos lograr con la separación de este analito,
si nosotros queremos verificar de que se trata este analito entonces haremos un análisis
cualitativo por métodos en su mayoría espectroscópicos (IR, MS, RMN, etc), mientras si el
interés es cuantitativo podremos practicar Ultravioleta, espectrometría de masas acoplado
a cromatografía y la cromatografía propiamente tal.
ANÁLISIS CUALITATIVO:
- Analito puro
- Método especifico y selectivo
ANÁLISIS CUANTITATIVO:
- Analito puro
- Método validado
- Muestra inicial exactamente medida
*Para el análisis cualitativo necesitamos que el analito este puro, y mas que puro
necesitamos que este aislado de la matriz y por supuesto vamos a necesitar una alta
especificidad y selectividad del método. ¿Que significa que un método sea especifico? Esto
significa que esta diseñado para reconocer una sustancia en particular aun en presencia de
otras, y al agregarle esta frase “aun en presencia de otros”, significa que además este
método es selectivo, es decir puede reconocer nuestro analito de interés e identificarlo aun
si en la muestra que se esta analizando existen otros compuestos. Ahora para el análisis
cuantitativo también se requiere que el analito este puro o aislado, necesitamos un método
de cuantificación validado y una muestra inicial exactamente medida y esto es porque como
tiene fines de cuantificación necesitamos saber cual fue el volumen o la cantidad inicial que
se tomo de esa muestra. ¿Que significa que este método este validado? Significa que se
hace bajo estándares de calidad, teniendo en cuenta la precisión y exactitud de estos
métodos además del Límite de Cuantificación (LIC) siguiendo las normas internacionales
como las que aparecen en las farmacopeas norteamericanas o UPS o también en las guías
ICH, de la conferencia internacional de armonización. Los análisis cuantitativos SIEMPRE
tienen que ser con métodos adecuadamente validados.
Objetivos de la separación...
- Obtener analito puro (RECUPERACIÓN)
- Obtener analito en la mayor cantidad posible (RENDIMIENTO)
- Obtener recuperación reproducible (PRECISION Y EXACTITUD)
Objetivos del análisis...
1. Identificar analito (ANÁLISIS CUALITATIVO)
2. Cuantificar analito (ANÁLISIS CUANTITATIVO)
*Los objetivos de la parte de la separación eran los que veníamos recién, empezando por
obtener el analito puro y aislado y por lo tanto poder recuperarlo, obtener el analito en la
mayor cantidad posible y ahí vamos a estar hablando del rendimiento de la extracción de
un procedimiento y bien por supuesto obtener una recuperación reproducible, es decir, con
precisión y exactitud.
Análisis Farmacéutico...
En las formas farmacéuticas existen excipientes y coadyuvantes que constituyen una
matriz: para el análisis del principio activo se requiere que esté puro, por lo tanto, se
debe realizar una separación previa de la matriz.
*En el análisis farmacéutico que es donde vamos a aplicar principalmente el tratamiento de
muestras, bien lo dice el mensaje anterior, en las formas farmacéuticas existen tanto
excipientes como adyuvantes que van a constituir esta matriz del producto farmacéutico y
entonces para el análisis del principio activo se requiere que este lo encontremos
completamente puro y por lo tanto se tiene que realizar esta separación previa de la matriz.
Procesos de separación...

*Si podemos ejemplificar o esquematizar los distintos procesos de separación, tenemos dos
casos, un analito que se encuentra solo dentro de su matriz representado a la izquierda con
la letra A y otro que esta presente junto a otros componentes A+B+C en la derecha, de tal
manera que probablemente con una técnica de separación podamos aislar en el primer
caso el analito A desde la matriz y tener ese analito inmediatamente separado, mientras
que en el segundo caso es probable que no sea suficiente una sola técnica de separación o
la separación sea parcial y en ese caso tendremos que implementar o probar con otra
técnica de separación secundaria o paralela que permita ahora si extraer cada componente,
el A, el B y el C, y dejarlo separado de la matriz.
Procedimientos o tratamientos de muestra...
MEDIR MUESTRA
SEPARACIÓN
AISLAR ANALITO INTERÉS
ANALIZAR MUESTRA ANALÍTICA
*Los procedimientos o - Extracción con solventes - Procesos de membrana
tratamientos de muestra liquido-liquido* - Trampas de adsorción
principalmente se basan en - Extracción en columnas - Extracción con fluidos
procesos de separación, y en solido-liquido* supercríticos
esta separación, la extracción - Separación de proteínas * - Espacio de cabeza
con solventes (liquido- - Destilación simple, - Columnas conectadas
liquido), extracción en fraccionada y por arrastre
- Sublimación
columnas (solido-liquido),
- Liofilización
separación de proteínas,
- Congelación
destilación simple,
fraccionada y por arrastre,
sublimación, liofilización, congelación, procesos de membrana, trampas de adsorción,
extracción con fluidos supercríticos, espacios de cabeza y columnas conectadas.
Generalmente las dos primeras son las más utilizadas.
EXTRACCIÓN LÍQUIDO-LÍQUIDO
La extracción líquido-líquido se basa en la transferencia de un analito desde
una fase liquida a otra según su solubilidad.
Generalmente una de las fases es agua o solución acuosa y la otra es un
solvente orgánico inmiscible con la fase acuosa.
La selección del solvente de extracción es fundamental.
Se puede utilizar para separar analitos en mezcla de forma selectiva o para
eliminar interferentes e impurezas de una solución.
*Se basa en la transferencia de un analito desde una fase liquida a otra y para ello se utiliza
de fundamento el principio de solubilidad de ese analito. En esta separación líquido-líquido
normalmente una fase es acuosa, una solución acuosa o agua propiamente tal y la otra es
un solvente inmiscible con la fase acuosa. ¿Que significa que el solvente sea inmiscible?
Significa que no se pueden mezclar, como por ejemplo el agua con un solvente apolar como
el hexano. Ahí tenemos el dibujo de un matraz por ejemplo si estamos mezclando agua y
cloroformo, en esta representación del esquema una de las fases va a ser acuosa y la otra
va a ser la orgánica. Ahora ¿Como podemos reconocer cual es la fase orgánica y cual es la
fase acuosa? Esto se puede reconocer en base a una propiedad fisicoquímica que
estudiamos hace poco que es la densidad precisamente. Conociendo la densidad de ambos
solventes, el agua podemos asumir que es la unidad y el cloroformo que es 1,38 g/mL, en
base a eso podemos predecir donde va a estar una fase u otra. En este caso del ejemplo
que nos está dando evidentemente el cloroformo por ser mas denso que el agua va a estar
en la fase inferior del matraz, en cambio en la fase acuosa en la fase superior. En cambio, si
estamos combinando agua y éter como solvente se invierte ya que el éter es menos denso
que el agua, algo como 0,8 g/mL y por lo tanto quedara en la fase superior y el agua en la
fase inferior. ¿Por que es importante esto? Porque dependiendo de la extracción que
estemos haciendo, del pH de las soluciones, vamos a tener a nuestro analito totalmente
ionizado y si esta totalmente ionizado va a volverse polar, y al ser polar va a ser soluble en
la fase acuosa. Entonces cuando un analito esta totalmente ionizado va a ser polar y se va
a mezclar en la fase acuosa. Eso nos va a permitir que cuando estemos realizando un
tratamiento de extracción de muestra nunca perdamos de vista donde esta el analito
porque si no vamos a tener errores en la cuantificación. En caso contrario si el analito se
encuentra debido a su pH y pka totalmente desionizado va a ser mas apolar y por tanto
soluble en la fase orgánica. De tal manera que es super relevante el solvente de extracción
que se seleccione. Tal como dice al final de la diapositiva nos va a permitir separar analitos
en mezcla o para eliminar simplemente los interferentes o los excipientes de una muestra.
EXTRACCIÓN SÓLIDO-LÍQUIDO
Se usa un solvente (Agua u orgánico)
Puede ser continua (SOXHLET) o de un solo
paso (café)
El uso de la TEMPERATURA aumenta el
rendimiento

*En la extracción sólido-líquido donde se utiliza un solo solvente (agua u orgánico) puede
ser una extracción continua o de un solo paso. En continua tenemos el ejemplo clásico del
SOXHLET que utiliza un refrigerante y la extracción a través de la evaporación y
condensación del analito que nos interesa, también tenemos la extracción sólido-líquido de
un solo paso cuando una prepara un café en que con la aplicación de la temperatura
podemos ir aumentando el rendimiento de la extracción . Tenemos el solvente abajo, en la
interfase el café y con el aumento de la temperatura va siendo extraída la cafeína o el café
desde los granos.
EXTRACCIÓN EN FASE SOLIDA

1. Se usan pequeños volúmenes de solventes.

2. Fácilmente automatizable
3. No se forma emulsiones
4. Permite Concentrar analito
*La extracción en fase solida es super interesante y tenemos una foto de como se realiza,
consiste en estas pequeñas columnas que tienen un relleno. Ese relleno puede ser tal como
en cromatografía polar o apolar. Es una serie de columnas todas homogéneas en cuanto a
la cantidad de relleno, lo que se hace es que se acondiciona estas columnas con un solvente
adecuado inicialmente y luego se agrega la muestra y posteriormente nuevos solventes. Por
ejemplo, en una primera pasada de solventes podría ser solamente a aquellos que
solubilizan a los excipientes mientras que el analito queda retenido en la columna en el
relleno de esas columnas y enseguida agregar un nuevo solvente que va a permitir ahora la
extracción del analito que estaba retenido ahí en esa columna. Si nos fijamos en la parte de
abajo existen pequeños tubos en donde se van recibiendo ya sea primero la solución de
lavado con los principales excipientes e interferentes, eso se reemplaza y además se ponen
tubos nuevos donde se recuperará el analito propiamente tal. La ventaja de todo este
dispositivo es que se puede conectar a una bomba de vacío, y al generar vacío se acelera el
proceso, se produce un efecto de succión desde la parte inferior hacia las columnas de
extracción y por lo tanto eso acelera el proceso y nos permite tener mucho más rápido el
analito separado. Aquí vemos nosotros que tenemos 16 columnas por tanto podemos
analizar simultáneamente muchas mas muestras, esa es la ventaja, es un poco mas
automatizable. Otro es que se utilizan pequeños volúmenes de muestra, si comparamos
esto con un matraz o con un embudo de decantación como el que se utiliza en extracción
liquido-liquido, el volumen es mucho más pequeño en este caso. Tampoco se forman
emulsiones a diferencia de la extracción líquido-líquido. Ya que cuando llenamos el embudo
de decantación en la extracción liquido-liquido, agitamos una vez que se han agregado las
dos fases y en la interfase si agitamos excesivamente se genera una emulsión y por lo tanto
va a haber perdida de muestra que va a quedar atrapada en esa emulsión, en este caso no
va a haber perdida de muestra porque no hay agitación mecánica vigorosa. Por otra parte,
nos permite concentrar el analito, cuando sabemos que la cantidad de muestra es
pequeñita, entonces podemos de alguna manera llevar estos tubitos de abajo aislados,
proceder a una evaporación bajo corriente de nitrógeno y de esa manera vamos a
concentrar nuestro analito y poder determinarlo cuantitativamente a posterior.
SELECCIÓN DEL PROCEDIMIENTO.
1. Niveles de concentración
2. Naturaleza química del analito
3. Naturaleza química de los interferentes
4. Complejidad de la muestra
*La selección de procedimiento de extracción va a depender del nivel de concentración del
analito en nuestra muestra, de la naturaleza química del analito, de la naturaleza química
de los interferentes y en general depende de cuan compleja sea nuestra muestra.

*En el capitulo de solubilidad algo vimos relacionado con esto, es decir, la utilidad de la
solubilidad en la extracción o en la separación del compuesto. En este caso corresponde a
un esquema general de extracción donde vamos a tener nuestro compuesto representado
por la letra X y vamos a agregarle una mezcla de dos clases, una fase acuosa y una fase
orgánica, de tal manera que en la separación de ambas fases vamos a verificar que aquellos
compuestos o analitos que sean de carácter básico van inmediatamente a separarse en la
fase acuosa acida, mientras que el resto de los compuestos, es decir, los compuestos ácidos
y neutros van a quedar en la fase orgánica (Cloroformo). A partir de esta fase orgánica
podemos volver a agregar una mezcla ahora con bicarbonato que esta en fase acuosa más
cloroformo en fase orgánica y vamos de esta manera a poder solubilizar a los ácidos fuertes
que van a quedar en esta fase acuosa bicarbonato, mientras que en la fase orgánica
cloroformo se van a mantener los compuestos ácidos débiles y neutros. Ahora para separar
a los ácidos débiles de los neutros se agrega una base fuerte como el hidróxido de sodio
que nos va a permitir solubilizar a los ácidos débiles que van a quedar en la fase acuosa,
mientras que aquellos compuestos neutros van a quedar aislados en la fase del cloroformo.
Así entonces vamos a separar a aquellos compuestos que sean básicos, ácidos fuertes,
ácidos débiles y neutros. Es importante esto porque toda molécula tiene un valor de pKa y
dependiendo del medio del pH de la reacción esa molécula se va a encontrar o no ionizada.
Por ejemplo, si tenemos una molécula que es un ácido débil y la tenemos en un pH ácido,
esta se va a encontrar no ionizada, ya que por ejemplo imaginémonos una molécula que
tenga un ácido carboxílico (COOH), tiene un protón que es ionizable y si se encuentra en pH
acido, es decir, donde hay abundancia de protones en el medio, ese protón va a permanecer
pegado al átomo de oxigeno y no se va a ceder al medio. Si ahora hablamos de una molécula
que tiene un pKa más básico por ejemplo una molécula amino y la ponemos en el ambiente
de pH ácido, entonces la molécula va a encontrarse ionizada. Esto porque como tiene ese
grupo amino NH2, en nitrógeno tiene ese par de electrones desapareados o no enlazantes,
esa base nitrogenada entonces va a poder tomar un protón del medio y así va a quedar la
molécula ionizada. Esto es super importante cuando tengamos que verificar en una
extracción líquido-líquido, en que fase va a quedar, si en la fase liquida o en la orgánica.
OPTIMIZACIÓN DE LA EXTRACCIÓN
- Modificación del pH
- Modificación de solvente
Densidad
Absorción al UV
Presión de Vapor
-Adición de sales
- Numero de extracciones
*Precisamente con lo que nos estaba hablando recién se podría optimizar la extracción con
la modificación del pH, podemos también modificar el tipo de solvente que estamos
utilizando, basándonos en la densidad, en la absorción que tenga al UV el solvente, en la
presión de vapor porque dependiendo de esa presión de vapor vamos a poder aplicar o no
temperatura para mejorar la extracción. La adición de sales que pueden ser orgánicas e
inorgánicas y a través también del numero de reacciones. El rendimiento de reacción y la
cantidad de analito que se extrae es diferente por ejemplo si uso un volumen total por única
vez de 50 mL para hacer la extracción de un analito o si en vez de esos 50 mL, utilizo
fracciones de 10 mL con un total de 5 fracciones. Evidentemente el rendimiento de reacción
es mayor cuando utilizo fracciones que en el otro caso donde se utiliza solo una vez.
 Cálculos para preparar disoluciones
- Si el origen es un sólido:
Peso o masa de comprimidos o polvo y volumen del contenedor
- Si el origen es una solución:
Volumen medido y volumen del contenedor
IMPORTANTE
Criterios, lógica, cifras significativas.
*Si el compuesto es solido vamos a tener que pesar una masa o una cantidad de
comprimidos o mas bien el polvo de esos comprimidos (comprimidos triturados) y
considerar el volumen del contenedor o matraz aforado en el cual van a preparar esa
disolución. Mientras que si es una solución entonces tendremos que medir un volumen
preciso y exacto de esa disolución y también considerar el volumen del matraz en el cual
van a depositar esa solución. Lo importante entonces es aplicar criterio, y criterio basado
en estas consideraciones que ha explicado, sobretodo en esas consideraciones de pH y de
densidad de solventes, lógicas por cierto y cifras significativas cuando se haga la
cuantificación que es bastante importante que se haga en términos cuantitativos.
Tarea: Buscar en la base de datos de las farmacopeas o en algún papel la cuantificación de
algún medicamento y enviar cual es el tratamiento de muestra que se realiza que se hizo
en ese paper. Por ejemplo, en la monografía del paracetamol aparece la estructura de la
molécula, las condiciones de almacenamiento, los criterios de identidad de pureza y al
final aparece algo que se llama ensayo, que corresponde a la cuantificación de ese
paracetamol y ahí entonces aparece definido como se tiene que realizar ese ensayo, por lo
tanto, está definido ahí cual es el tratamiento de la muestra para poder cuantificar ese
paracetamol.
Módulo 2
 ÁCIDOS CARBOXÍLICOS Y AMIDAS
Ácidos Carboxílicos
Reacciones Generales de Identificación
Carácter Ácido
En primer lugar, están los ácidos
carboxílicos que como su nombre
lo indica son compuestos que
tienen un carácter ácido y por lo
tanto es precisamente esa
característica la que se utiliza para
las reacciones generales de
identificación de ácidos
carboxílicos. Esta la reacción con
papel pH donde podemos
evidenciar el cambio de color hacia coloraciones ácidas del ácido carboxílico en solución
acuosa. En seguida esta la reacción con carbonato, que fue practicada en química orgánica
donde mezclan el ácido carboxílico con una solución de carbonato, se va a generar entonces
o se va a liberar dióxido de carbono y agua a la forma de vapor. Ese vapor del dióxido de
carbono se recibe en otro tubo de ensayo donde existe hidróxido de bario formándose
entonces un precipitado de carbonato de bario que es un precipitado de color blanco. Esta
reacción es la que se conoce como la reacción de agua de barita por la adición del bario
precisamente. Otra forma de evidenciar el carácter ácido del ácido carboxílico es con pasta
de almidón, en este caso lo que ocurre es que en presencia del ácido carboxílico o como
esta representado en la diapositiva, este protón que aporta el ácido carboxílico va a generar
la oxidación del yoduro presente en el reactivo (Pasa de -1 a 0). El yodo elemental entonces
puede ser reconocido con pasta de almidón obteniéndose entonces un color característico
azul-violeta.
Formación Hidroxamato
*También hay reacciones especificas
aunque se les llame generales y son
principalmente la reacción de formación
del Hidroxamato, para ello lo primero que
tenemos que hacer es transformar el ácido
carboxílico en un haluro de ácido, es decir,
introducir un átomo de halógeno en el
ácido carboxílico y mas bien reemplazar
entonces ese grupo hidroxilo por el átomo del cloruro. Una vez que tenemos este haluro de
ácido, agregamos la hidroxilamina a 80° y en medio etanol, se va a formar entonces el
Hidroxamato, el cual a su vez necesitamos reconocer de alguna manera su formación y para
eso se adiciona cloruro férrico, al adicionar este cloruro férrico lo que va a ocurrir es que se
va a generar un precipitado abundante de color rojo violeta que corresponde al
Hidroxamato. La coloración es mas bien como la vemos en el titulo de la diapositiva
“Formación del Hidroxamato”. Esas entonces serían las reacciones que nos permiten
evidenciar la presencia de ácidos carboxílicos en un compuesto o una muestra problema.
Amidas
Reacciones Generales de Identificación
Formación Hidroxamato
*Este ácido carboxílico puede dar paso a
la formación de una amida, son muy
cercanos estructuralmente y por eso se
pasa a continuación. Como bien
conocemos tenemos en este caso la
amida formada por el grupo carbonilo más el grupo amino unido a un radical que puede ser
alquílico o aromático. Entonces para poder reconocer al igual que en la reacción que los
ácidos carboxílicos lo vamos a reconocer a través de la formación del Hidroxamato. Se
agrega de forma directa la hidroxilamina, evitamos el paso previo de la formación del haluro
de ácido anterior, pero lo que cambia acá es el medio de reacción, aumentamos la
temperatura de reacción desde 180° a 188° en el caso de las amidas y cambiamos de etanol
a propilenglicol, se va a formar entonces el Hidroxamato que vamos a reconocer en
presencia del ion Fierro+3 formándose este precipitado de color rojo violeta abundante.
Hidrolisis de la Amida
*Ahora otra forma en que podríamos
evidenciar la presencia de una amida es a
través de la hidrolisis de esta, en este caso
podemos tener 3 tipos de amidas como
aquellas que no están sustituidas, es decir,
que tiene íntegramente sus dos protones,
aquellas monosustituidas donde uno de los
protones ha sido reemplazado ya sea por un grupo alquílico o por un grupo aromático y
finalmente las amidas disustituidas donde ambos protones han sido reemplazados. En
aquella amida no sustituida al dejarla en contacto con agua en medio alcalino y calor, se va
a producir la hidrolisis de la amida y por una parte vamos a obtener el anión del ácido
carboxílico y por otro lado la formación de amoniaco. Ese amoniaco se hace reaccionar con
reactivo Nessler y se va a producir un precipitado de color naranja. Así reconocemos la
presencia de una amida no sustituida.
*Para reconocer una amida
monosustituidas tenemos la hidrolisis de
la amida en medio básico con aplicación
de temperatura se genera el anión del
ácido carboxílico y lo que vamos a
obtener es una amina primaria como
producto de hidrolisis que puede ser
alifática o aromática. Si es alifática la
mejor forma de reconocerla es a través de la reacción de Rimini con la formación del
precipitado color violeta. Si la amina producto de la hidrolisis es aromática, practicaremos
la diazocopulacion donde se van a obtener coloraciones o precipitados de color rojo
característico.
*Para el reconocimiento de la
amida disustituida hidrolizamos
esta amida en medio acuoso,
alcalino aplicando temperatura
obteniendo el anión del ácido
carboxílico y la amina secundaria.
Esta amina secundaria la hacemos
reaccionar con una reacción especifica de reconocimiento de aminas sea aromática o
alifática y vamos a obtener entonces el precipitado blanco verdoso porque estamos
practicando una reacción de ditiocarbamato de níquel. De esta manera reconocemos las
amidas disustituidas.
RESUMEN
*Si hacemos un
pequeño resumen
respecto a las
reacciones
características como podemos evidenciar son bastante pocas para los ácidos carboxílicos y
amidas, tenemos que para evaluar el carácter acido en el caso del Hidroxamato primero
requiere una reacción previa para liberar el ácido. En el caso de la amida también es una
reacción positiva, pero a mayor temperatura y la reacción de un haluro también es positiva
de manera directa. Esto es un poco una tabla resumen respecto a esta reacción del
Hidroxamato, por supuesto solamente el ácido y el haluro van a tener carácter ácido y lo
vamos a poder encontrar positivo en las reacciones, pero para la amida y para el Ester lo
vamos a encontrar negativo. Lo que quiere de esta tabla es dejar claro que la reacción del
Hidroxamato es positiva para los cuatro tipos de derivados, pero en algunos casos es una
reacción directa, en otros requiere mayor temperatura y en otros requiere una reacción
previa.
 AMINAS
✓ Toxicas
✓ Básicas (➔Sales). Alifáticas>Aromáticas
✓ I y II forman puentes-H entre sí y con H2O. Aminas III solo con H2O
✓ Moderadamente Polares
✓ Punto de Ebullición: >Alcanos
<Alcoholes
*Como sabemos las aminas son compuestos que tienen en su estructura un grupo amino
caracterizado por la presencia de un nitrógeno sustituido por protones o bien por cadenas
alquílicas. En general son compuestos bastantes tóxicos de manera que en los laboratorios
frente al derrame en las manos o al derrame sobre los mesones de laboratorio es siempre
necesario lavar con abundante agua destilada y enseguida con agua potable de manera de
limpiar la zona donde cayo todo este compuesto.
*Respecto a su carácter, en general las aminas básicas pueden formar sales y así por
ejemplo tenemos el caso de la Procaína Clorhidrato, la cual vimos en la clase de tratamiento
de muestra, donde observamos que el grupo amino, el nitrógeno en particular ganaba un
protón del acido clorhídrico y formaba entonces una sal clorhidrato. También tenemos decir
que las aminas alifáticas son por lo general mucho mas polares que las aminas aromáticas.
Pueden formar tanto las aminas primarias como secundarias puentes hidrogeno entre
moléculas de la propia amina y también moléculas de agua. Mientras que las aminas
terciarias solo van a formar puentes de hidrogeno con moléculas de agua. La polaridad en
general es medianamente polar y presentan puntos de ebullición que son superiores al
punto de ebullición de los alcanos del mismo número de átomos de carbono y son inferiores
respecto a alcoholes con mismo número de átomos de carbono.
Reacciones Generales de Identificación
1. Reacción con sales de Cobre II
2. Reacción con 2,4-dinitroclorobenceno
3. Formación de dansilderivados (Cloruro de Dansilo)
4. Reacción con reactivos carbonílicos
Reacción con sales de Cobre II
*Las reacciones con sales de
cobre secundario, en la cual
tenemos graficado el compuesto
aminado al cual agregamos esta
solución de sulfato de cobre (ac)
formándose un complejo de la
amina con el catión metálico
cobre. De manera que cuando se trata de aminas alifáticas el producto de la reacción es un
precipitado de color azul. Mientras que cuando se trata de aminas aromáticas, el producto
es un precipitado de color azul verdoso. Eso va a servirnos entonces como primer criterio
para distinguir entre una amina alifática y una amina aromática.
Reacción con 2,4-dinitroclorobenceno
*En esta reacción el reactivo es
precisamente 2,4-
dinitroclorobenceno y lo que
ocurre es que para aquellas
aminas primarias y secundarias lo
que se produce es un precipitado
amarillo mientras que en las
aminas terciarias no hay reacción
(NHR).
Reacción con Cloruro de Dansilo
En tercer lugar tenemos la
reacción con Cloruro de
Dansilo que consiste en su
reactivo el cloruro de dansilo
con un compuesto amino. Lo
que vamos a poder obtener
como resultado en esta
reacción es que para aminas
primarias y secundarias se obtiene un producto fluorescente generalmente de color verde
correspondiente a la sulfonamida que esta representada en la reacción. En el caso de las
aminas terciarias, lo que se forma es una sal de amonio cuaternario, entonces ya no se
forman los productos fluorescentes y desde ese punto de vista podríamos decir que la
reacción es negativa con cloruro de dansilo para aminas terciarias.
Reacción con reactivos carbonílicos (Aminas I)
*Como cuarto lugar esta la
reacción con reactivos
carbonílicos, acá lo vamos a
ver caso a caso. Para las
aminas primarias es una
reacción característica de
aminas primarias y consiste
entonces de hacer reaccionar
la amina con el furfural que es
el primer reactivo, en medio acido, y lo que se obtiene es un precipitado de color rojo. En
el caso de las aminas secundarias también pueden reaccionar con el reactivo carbonílico en
medio acido, pero en este caso no se forma una coloración roja, sino que se forman las
enaminas que son compuestos coloreados naranjos. Entonces esta reacción nos permite
diferenciar aminas alifáticas secundarias de primarias, puesto que es positivo solo para
aquellas primarias. Podemos variar el reactivo a utilizar como furfural, p-
dimetilaminobenzaldehido o aldehído ftálico.
Reacción con Ácido Nitroso (HNO2)
*Para poder llevar a
cabo esta reacción lo
primero que
debemos hacer es la
formación de la
especie reactiva en
medio acido con bajas temperaturas. Para ello lo que se mezcla son cristales de nitrito de
sodio con un ácido fuerte donde va a producirse entonces la formación del acido nitroso, el
cual debido a que esta en presencia del medio acido, va a generarnos la descomposición en
agua y el ion nitrozonio (NO+), el cual va a ser nuestra especie reactiva que va a reaccionar
con nuestras aminas.
*Si sospechamos que
se trata de una amina
primaria alifática
vamos a tener la
reacción en medio
acido de esta amina
primaria alifática, ion
nitrozonio y lo que se
va a formar entonces
es una nitrosamina, sin embargo, como esta nitrosamina como posee un hidrogeno en su
estructura, lo que va a ocurrir es que se va a reordenar esta estructura y se va transformar
en ácido diazotico. El hidrogeno que estaba sobre este nitrógeno pasa al grupo oxigeno y se
forma entonces el acido Diazótico, este proceso se conoce como tautomerizacion. Como el
medio continúa siendo un medio acido lo que vamos a observar entonces es la perdida del
grupo hidroxilo del acido diazotico y por lo tanto la formación de una sal de diazonio que
tiene una característica como tal que es muy inestable por lo tanto se descompone con
rapidez y se descompone rápidamente en un radical alquilo, en agua y en nitrógeno en
forma de gas. De esa manera entonces es como evidenciamos la reacción positiva debido a
nitrógeno gaseoso.
*Para las aminas secundarias
alifáticas con el ion nitrozonio, vemos
la formación de un intermediario y
finalmente llegamos a la formación
del compuesto denominado
nitrosamina que tiene la
particularidad de ser un aceite o
precipitado de color amarillo que da positivo a la reacción de Lieberman. Si nos fijamos
como no hay un hidrogeno disponible, esta nitrosamina no tautomeriza a diferencia de lo
que ocurre con las primarias alifáticas, por lo que la reacción culmina con la formación de
las nitrosaminas.
*Para las terciarias alifáticas
tenemos el ion nitrozonio en
medio acido y se forma
inmediatamente la nitrosamina
Lieberman con coloración a
precipitado amarillo. Da reacción
Lieberman positiva.

*Con respecto a las aminas

aromáticas tenemos la
representación de la Anilina con el
ion nitrozonio en medio acido y lo
que se forma es una sal de diazonio.
Recordamos que para las primarias
alifáticas también forman sal de
diazonio, pero la diferencia esta en
que en este caso la sal de diazonio está sobre un anillo aromático por lo tanto estos
electrones desapareados de los grupos aminos entran en resonancia con el anillo y por lo
tanto es mucho mas estable como estructura. La sal puede precipitar o puede evidenciar la
presencia de esta sal con otras dos reacciones posteriores.
*La primera es la copulación
con beta naftol en medio
alcalino, acá tenemos la beta
naftol en medio alcalino y lo
que se forma entonces es un
compuesto coloreado rojo.
*Otra alternativa es que en lugar de
usar el beta naftol en medio alcalino
cambiemos el medio de la reacción
en medio acido y cambiar el reactivo
que corresponde a la alfa
naftiletilendiamina, en ambos casos
lo que se obtiene son un precipitado
de color rojo que va a reflejar la
presencia de la amina primaria
aromatica.
*Tenemos ahí nuevamente la
esquematización de la reacción,
el ion nitrozonio en medio ácido
que nos dará una nitrosamina
que nos va a dar el test de
Lieberman positivo. Esta
reacción en general ocurre en
exceso de acido nitroso en calor
y cuando ocurre en esas
condiciones entonces la molécula se reordena y se obtiene el p-nitroso derivada. Por esto
hay que regular la cantidad de acido nitroso que se agrega y de temperatura que se aplica
al medio de reacción.
*Finalmente respecto a las aminas terciarias
aromáticas, se forma el p-nitroso derivado
que nos dará la reacción de Lieberman
negativo. Hay que decir que también se trata
de un compuesto de color amarillo insoluble
en agua, pero la diferencia va a estar
entonces en que si practicamos una prueba
de Lieberman su resultado va a ser negativo.
Test de Liberman para nitrosaminas
*El test de Lieberman es
especifico para identificar
nitrosamina. Vimos recién que
la nitrosamina es el producto
de la reacción con el ácido
nitroso tanto como para
aminas secundarias
aromáticas y alifáticas y terciarias alifáticas. Esta reacción consiste en hacer reaccionar la
nitrosamina que se formó con la reacción del ion nitrozonio con fenol en medio ácido, se
forma el intermediario y luego se obtiene un producto con coloración amarilla. Sí
mantenemos el medio de reacción constante con adición de fenol en medio ácido, lo que
ocurre es que está coloración amarilla finalmente pasa al complejo de color azul.
*Sí al complejo de color azul le
agregamos agua, lo que va a ocurrir
es que va a cambiar de color y
tornara a una coloración roja,
mientras que volvemos a alcalinizar y
regresamos a la coloración azul.
*Todos esos pasos tienen que
cumplirse para poder llegar al Test
de Lieberman Positivo o negativo.

Reacciones de Diferenciación
*También existen
reacciones de
diferenciación, por
ejemplo, para las aminas
primarias, ya sea alifáticas
o aromáticas. En el caso de
las aminas alifáticas la
reacción característica de
diferenciación es la
reacción de Rimini, la cual
consiste en agregar el reactivo que es nitroprusiato de sodio en medio acetona y lo que
vamos a obtener como producto positivo es el desarrollo de una coloración violeta a los 2
min aproximadamente. En el caso de querer diferenciar entre alifáticas y aromáticas, lo que
se puede practicar es la reacción de diazotación, con esta formación de la sal de diazonio
que se hace copular con fenoles en medio alcalino o con aminas en medio ácido, lo que
vamos a obtener en este caso son precipitados de color rojo.
*Para diferenciar secundarias
alifáticas y aromáticas podemos
practicar la reacción del
ditiocarbamato de Niquel que es
una reacción especificas para
aminas secundarias que utiliza
como reactivo cloruro de níquel
en disulfuro de carbono, el
medio es amoniaco
concentrado y el producto que
se obtiene es por la formación
de un precipitado blanco verdoso o simplemente una coloración blanco verdosa. De esta
manera estaremos identificando la presencia de aminas secundarias.
*Ahora si queremos especificar
un poco mas podemos practicar
la reacción de Simon que es
especifica para aminas
secundarias alifáticas. En esta
reacción se utiliza exactamente
el mismo reactivo que para la
reacción de Rimini, es decir, el nitroprusiato de sodio, la diferencia está en el medio de
reacción, en la reacción de Rimini es con acetona, en cambio en la reacción de Simon es con
acetaldehído. Lo que ocurre es que inicialmente se forma una coloración azul que
posteriormente a la adición de una base alcalina en OH va a cambiar la coloración desde
azul a verdes, esto nos va a indicar reacción positiva para aminas secundarias alifáticas.
*Las terciarias en general,
sea alifática y aromatica, se
pueden reconocer con la
precipitación del yoduro de
metilo y lo que se obtiene
entonces es generalmente
un precipitado de color
amarillo que es soluble en
agua, por eso es muy
importante que realicemos
esta reacción en un tubo de ensayo seco o en medio anhidro.
 *También podemos practicar
la reacción con ácido pícrico
(fenol trisustituido con grupos
nitro), el medio de la reacción
es metanol y lo que se obtiene
es un precipitado abundante
de color amarilla intenso que
si uno lo aísla desde los
reactivos puede obtener un
solido del punto de fusión característico. Es una reacción positiva para aminas terciarias,
para sales de aminas y también para amonios cuaternarios. La desventaja es que, si uno se
excede en la cantidad de metanol, el precipitado es soluble por lo tanto hay que agregarlo
gota a gota hasta que se produzca el precipitado y luego terminar la reacción.
*Otra reacción menos utilizada
en el laboratorio es aquella con
tetrafenil boruro de sodio, se
agrega este reactivo y se
obtiene la formación de un
precipitado de color blanco.

*Son bastantes reacciones como todo este módulo, pero son importantes a la hora de
poder ir identificando o aportar información de los grupos funcionales que puede tener un
compuesto o un analito que pueda llegar a nuestro laboratorio cuando estemos ejerciendo
la profesión farmacéutica.
 ANÁLISIS ELEMENTAL CUANTITATIVO
*Vamos a revisar todo lo que tenga que ver con el análisis elemental cuantitativo, como su
nombre lo indica lo que nos permite este análisis es determinar la cantidad de algún
elemento dentro de alguna muestra.
Introducción
1. Elementos más frecuentes cuantificados:
C-H-O-X-N-S
2. Fundamento:
✓ Mineralización: Destrucción de la materia orgánica
✓ Cuantificación: de los iones o compuestos formados
*El fundamento de esta determinación consiste en la destrucción de la materia orgánica, es
decir, el compuesto lo sometemos a un proceso de mineralización con ayuda de
temperatura, catalizadores, etc. De manera de destruir o mineralizar toda esta materia
orgánica, formándose entonces iones o compuestos a partir de esta destrucción de la
materia orgánica que se genera. Esos iones son los que finalmente se van a cuantificar a
partir de un método volumétrico que nos permita evidenciar la presencia de alguno de estos
elementos dentro de las moléculas que estamos analizando.
Escala de Análisis
- Macro escala: >100 mg
- Semimicroescala: 10-100 mg
- Microescala: 1-10 mg
- Ultramicroescala: <1 mg
- Trazas: 100 ppm (µg)
- Ultratrazas: <1 ppm
*En general para estos métodos de análisis elemental cuantitativo, la escala esta entre la
micro y la semiescala. Esto quiere decir que en general se trabaja entre 1-100 mg.
Usos (UTILIDADES)
1) Verificar pureza (P.E. tenemos una muestra de paracetamol que tiene un 20% de
elemento oxigeno y si encontramos una mayor cantidad de oxigeno en la muestra
de paracetamol probablemente pueda deberse a que haya una contaminación que
esta aportando a ese exceso de oxígeno elemental)
2) Determinar el contenido porcentual de un elemento
-Identificar compuestos descritos
-Como caracterización de compuestos desconocidos (A partir de una muestra que
no sabemos de que se trata podemos determinar cual es su contenido en cada uno
de los elementos que allí encontremos)
3) Determinar identidad de compuesto en mezclas solidas
Determinación de Azufre y Halógenos
MÉTODO DEL MATRAZ DE OXIGENO (METODO DE SCHÓNIGER)
Características:
- Corto
- Sencillo
- Limpio
*Se utiliza el método del matraz de Oxigeno o método de Schoninger, el cual es un método
bastante corto, sensible y bastante limpio también ya que no requiere mucha manipulación
del analista.
Requerimientos:
- Matraz adecuado
- Liquido Absorbente (H2O2, NaOH, H2O)
- Alambre o malla de platino (Catalizador)
- Papel Filtro Negro (Capsula de Acetato de Celulosa)
- Oxigeno
*Se van a necesitar un matraz, un líquido absorbente que puede ser peróxido de hidrogeno,
hidróxido de sodio o agua, sobre este liquido se van a absorber los iones que se forman
producto de la combustión de la muestra. También se requiere un alambre o malla de
platina que además de soporte hace las pesas de catalizador. Además, un papel filtro negro,
que podría ser también una capsula de acetato de celulosa cuya función es contener a la
muestra, es decir, uno pesa la muestra y la coloca en papel filtro negro y la empaqueta, de
manera que la muestra queda contenida en el papel filtro negro. Un requerimiento esencial
de este método es la presencia del Oxigeno gaseoso.
*Lo que ocurre en la imagen, en donde
tenemos el esquema del matraz de
oxígeno, en el cual podemos observar el
matraz que posee un tapón con una
extensión que corresponde a esa malla de
platino que hace las veces de soporte,
luego se deposita el papel filtro que
contiene a su vez la muestra y luego se
llena el liquido absorbente. Una vez que se
deposito la muestra, se agrego liquido
absorbente, se agrega oxigeno de manera
que ocupe todo el espacio disponible del matraz y favorezca la combustión de la muestra.
Enseguida se invierte el matraz, se coloca en la posición en diagonal, luego lo que se hace
es colocar este matraz invertido en una cámara de seguridad. La idea de invertir el matras
es para producir la mayor hermeticidad donde está el tapón colocado, ya que al invertir el
matraz el liquido absorbente va donde está el tapón e impide la salida del oxigeno que está
dentro del tubo. Lugo que se tiene el matraz listo, con muestra, oxigeno, bien sellado en la
cámara de seguridad, se procede a encender la cámara de seguridad que tiene un laser
infrarrojo, el cual va a apuntar directamente a la malla que contiene nuestro papel filtro
negro con la muestra. Ese laser va a producir el aumento de la temperatura hasta que
produzca la ignición, es decir, se empieza a combustionar toda la muestra, a eso se le llama
la mineralización de la materia orgánica. Al producirse entonces la ignición o combustión
de la materia orgánica se generan los iones que son absorbidos por el líquido absorbente
que corresponda y que posteriormente van a ser cuantificado a través de métodos
volumétricos.
Procedimiento:
- Pese exactamente la muestra
- Empaquetar en papel filtro y colocar en malla de Platino (Catalizador)
- Agregar absorbente
- Llenar matraz con Oxigeno
- Tapar, colocar en cámara de seguridad
- Encender papel
- Combustión de la sustancia, los gases se absorben en el liquido
- Cuantificación de los iones formados
Cuantificación de Azufre:
Pt−Q
C. O.(𝑆) + O2 → SO2 + SO3 + H2 O2(DIL) → H2 SO4
1. Titulación Directa
Torin
H2 SO4 + Ba(ClO4 )2 → BaSO4 (S)
*C.O quiere decir compuesto orgánico que contiene azufre en presencia de oxigeno, platino
y temperatura y se generan los gases de dióxido y trióxido de azufre. Estos gases son
diluidos en peróxido de hidrogeno y lo que se nos va a formar es ácido Súlfurico, es decir,
el azufre que estaba contenido en la muestra lo vamos a cuantificar a la forma de ácido
sulfúrico.
*Podemos evidenciar la presencia de ácido sulfúrico a través de una titulación directa, la
cual se realiza formando un complejo de sulfato de bario, para lo cual se utiliza como
titulante perclorato de bario en presencia de indicador Torin y se va a formar entonces el
sulfato de bario que es un solido precipitado, de tal manera que el titulante de perclorato
de bario posee una concentración conocida, además vamos a saber que por cada mL de
perclorato se titula X mg de azufre. Así finalmente llegamos a la equivalencia entre la
cantidad de azufre que encontremos acá y la cantidad inicial de muestra que se tomo o que
se peso cuando se inicio el procedimiento.
2. Titulación Indirecta
H2 SO4 + Ba(ClO4 )2 𝑒𝑥𝑐𝑒𝑠𝑜 → BaSO4 (S) + 𝐵𝑎2+ 𝑠/𝑟𝑒𝑎𝑐𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑟

𝐵𝑎2+ 𝑠/𝑟𝑒𝑎𝑐𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑟 + 𝐸𝐷𝑇𝐴

*Tambien está la posibilidad de una titulación indirecta, como el nombre lo indica a nuestro
azufre que está a la forma de acido sulfúrico le agregamos ahora perclorato de bario
nuevamente pero en exceso, en un volumen definido (Por ejemplo 20 mL de perclorato de
Bario 0,03M), de manera que vamos a saber que de ese exceso que se agrego una cantidad
de él o una fracción de el va a reaccionar con el azufre que este presente en la muestra,
mientras que otra cantidad de ese titulante va a quedar sin reaccionar. Para evidenciar que
existe el bario sin reaccionar, entonces agregamos otro agente que va a permitir determinar
ese bario en exceso que quedo sin reaccionar. Para esto se utiliza el Acido
etilendiaminotetraacético (EDTA), después entonces por diferencia entre la cantidad del
perclorato de bario agregada en exceso menos la cantidad que quedo en exceso de bario,
se obtiene por diferencia la cantidad de azufre que contenía nuestra muestra.
Cuantificación de Halógenos
*Si representamos el proceso
orgánico con el compuesto C.O. que
contiene el átomo de halogeno o
elemento Halogeno, en presencia
de oxigeno con platino como
catalizador y aplicación de
temperatura se van a formar los
siguientes iones (Cloruro, bromuro, bromato , yodato y peryodato). Acá podemos apreciar
que el Bromo tiene distintos estados de oxidación al igual que el yodo.
Reducción:

*Para poder cuantificar los halógenos que se encuentran en estado oxidado, lo que se hace
es producir una reducción primero, es decir, se realiza una reacción con el reactivo hidrazina
y lo que se hace entonces es producir el traspaso de electrones para que pasen los iones
oxidados, todos pasan a menos 1. Así la etapa previa antes de cuantificar hay que producir
la reducción de los iones formados una vez se sacan del matraz.
a) VOLUMETRÍA INDIRECTA (MÉTODO DE VOLHARD):
-AgNO3 exceso
-NH4SCN (Titulante)
-Sulfato Férrico Amoniacal (indicador)
*Luego entonces vienen las volumetrías que pueden ser indirectas o directas, en la
volumetría indirecta lo que se utiliza es un exceso de nitrato de plata, por lo que, si se utiliza
el cloruro, la reacción del cloro y la plata produce este precipitado abundante de cloruro de
plata. Se agrega un exceso de nitrato de plata de tal manera que cierta fracción del titulante
va a reaccionar con la muestra y nos va a quedar un exceso del ion plata. ¿Como
cuantificamos ese exceso del Ion plata? A través de un segundo agente titulante que es el
tiocianato de amonio en presencia de sulfato férrico amoniacal como indicador, entonces
podemos cuantificar de manera indirecta por diferencia entre la cantidad total de plata que
se agrego al inicio menos la cantidad de plata encontrada al re titular con tiocianato de
amonio, por lo que esa diferencia va a corresponder a la cantidad de halógeno presente en
la muestra.

b) VOLUMETRÍA DIRECTA
-Hg(ClO4)2
-Difenilcarbazida (Indicador)
*Tenemos la posibilidad de una volumetría directa, en este caso se utiliza otro agente
titulante que es el perclorato de mercurio de titulo conocido, es decir ya sabemos su
concentración y gota a gota se agrega al matraz de titulación en presencia del indicador
difenilcarbazida para así de esta manera poder llegar al punto final de titulación y establecer
cuanto fue el gasto del titulante para luego hacer la relación de 1 mL de titulante equivalen
a X de cloruro y enseguida referenciamos la cantidad de mg de cloruro encontrados con la
cantidad inicial que se pesó del compuesto orgánico.
Oxidación (Para determinación de Iodo)

*En el caso de la determinación de yodo también se puede proceder realizando una

oxidación, es decir, todo lo contrario a lo que habíamos visto. Así acá lo que se realiza es
agregar bromo en acido acético en exceso y lo que se obtiene es la oxidación de todo el
yodo a la forma de peryodato, nos queda siempre bromo en exceso sin reaccionar que se
re titula con ácido fórmico.

*La idea es tener al peryodato o al yodo en su estado de oxidación (+5) y para titularlo o
determinarlo entonces lo que se hace es agregar un exceso de yoduro de potasio en medio
ácido. Aquí va a ocurrir que mientras exista peryodato en el medio de reacción se va a
producir la oxidación del yoduro (yoduro de potasio). Lo que ocurre entonces es que en
presencia del peryodato que proviene de la muestra lo que ocurre es que se oxida y va a
quedar como yodo elemental oxidándose, así cuando se acaba la muestra nos va a quedar
yoduro de potasio sin reaccionar y ese yodo elemental formado una vez que se filtra se va
a hacer reaccionar con tiosulfito de sodio en presencia de almidón para producir entonces
la determinación de este yodo elemental a la forma de yoduro de sodio.
Determinación de Nitrógeno
*Existen dos métodos para la determinación de nitrógeno, conocidos como el método de
vía seca y método de vía humeda.
MÉTODO DE DUMAS (VÍA SECA)
Características:
- Micrométodo
- Combustión a alta temperatura (700°C)
- Catalizadores
- Gas de Arrastre (CO2)
- Se cuantifico el nitrógeno en estado gas
*Todo el nitrógeno presente en la muestra a través de la combustión se transforma en
nitrógeno gas que es arrastrado por la corriente de CO2.
Etapas:

*Si lo graficamos nuevamente en reacciones químicas tenemos al inicio nuestro compuesto

orgánico que contiene nitrógeno en presencia de catalizador de oxido de cobre nos da con
esta corriente de CO2 que arrastra los vapores generados y por supuesto la aplicación de
calor se forma nitrógeno gas y N óxidos. Sin embargo, nosotros lo que necesitamos es que
todo el nitrógeno pase a la forma de nitrógeno gas y como esto es un circuito, en una
siguiente etapa del circuito, el catalizador ahora es cobre metálico, el cual produce la
transformación de todos estos N óxidos en nitrógeno gaseoso. Ese nitrógeno gas es
transportada a otra etapa del circuito a través del CO2 que lo transporta y va a ser medido
en un nitrometro, pero antes se necesita separar del CO2 por lo tanto en esta última etapa
del circuito se agrega hidróxido de potasio que nos permite precipitar el CO2 a la forma de
bicarbonato de potasio, de manera que nos queda solo disponible en la fase gaseosa el
nitrógeno, el cual es medido en un instrumento especial llamado nitrometro. Se le llama vía
seca porque no hay adición de más reactivos.
MÉTODO DE KJELDAHL (VÍA HUMEDA)
Características:
- Macro, semimicro, o micrométodo
- Transformación del nitrógeno en amoniaco
- Cuantificación
Etapas:
- Digestión
- Destilación
- Valoración
*Son cantidades bastante amplias que se pueden determinar de nitrógeno y el fundamento
consiste en que todo el nitrógeno presente en la muestra es transformado a amoniaco y
una vez transformado en amoniaco puede realizarse la cuantificación.
*Posee tres etapas este método, una etapa previa de digestión de la muestra donde se
produce toda esta mineralización y transformación de la muestra en Iones, en este caso en
amoniaco, luego viene la etapa de destilación del amoniaco generado en la primera etapa
de combustión o digestión y finalmente la etapa de valoración o de cuantificación de este
amoniaco destilado.
Esquema:

*Acá tenemos un esquema de la via humeda, donde tenemos separadamente a la izquierda

el matraz de Kjeldahl, donde se le ha agregado el compuesto orgánico, acido sulfurico
concentrado, sulfato de cobre y sulfato de potasio, los cuales son catalizadores de la
reacción para que esto se produzca a altas temperaturas, de hecho el sulfato de potasio lo
que hace es aumentar el punto de ebullición del acido sulfurico, lo que hace mucho mas
energética la reacción. Todo esto se combina y se deja un tiempo considerable dependiendo
del tipo de muestra y a su vez dependiendo del tipo de uniones que tenga el nitrógeno
dentro de la molécula. Se refiere a que por ejemplo si tiene una amida o una amina y si esta
mono o disustituido o si hay nitrógenos intraciclicos en la molécula, el tiempo de digestion
va a ser distinto. Asi los grupos aminos son mucho más fácilmente combustionables. En el
lado derecho tenemos el matraz de Kjeldahl, la trampa de Kjeldahl, los cuales una vez que
se dejan calentar la muestra se agregan los reactivos, es decir la mezcla alcalina que
contiene hidróxido de sodio. Al agregar la mezcla alcalina de hidróxido de sodio lo que va a
ocurrir es la destilación del amoniaco, y ese amoniaco entonces va a pasar a través del tubo
al refrigerante, el cual hace las veces de condensador que permite que el amoniaco que
estaba a la forma de gas condense a la forma de hidróxido de amonio, y en ese matraz
donde se estaba consiguiendo el amoniaco nosotros vamos a tener directamente el agente
titulante de acido clorhídrico o podemos tener una solución de acido bórico que después se
re titula para tener la cantidad de nitrógeno presente en la muestra.
Digestión:
Mineralización del compuesto orgánico nitrogenado
- H2SO4 concentrado
- K2SO4 (Aumenta el punto de ebullición del ácido sulfúrico)
- Catalizadores: Selenio, Cobre, Oxido de Mercurio, Sulfito de Mercurio (Casi siempre
se utilizan sales de mercurio porque permiten volver más energética la reacción)

*Lo que se forma en esta reacción es el sulfato acido de amonio, pero puede ocurrir que
debido al uso de catalizadores de mercurio, cierta parte del amoniaco que se forma
producto de la reacción quede secuestrado en el complejo sulfato mercúrico amoniacal de
tal manera que si lo tenemos en ese complejo vamos a tener un defecto en la cuantificación
del nitrógeno.
Destilación

*En la destilación se destila el amoniaco, pero si el catalizador posee mercurio, además de

agregar hidróxido de sodio agregamos tiosulfito de sodio, el cual se sacrifica y forma un
complejo con el mercurio, lo cual nos permite liberar el amoniaco, lo cual nos da como
precipitado negro del sulfuro de mercurio y nos queda el amoniaco a la forma de sulfato
acido de amonio que a lo mas como existe en el medio de reacción va a producirse
exactamente la misma reacción que esta arriba con la liberación de amoniaco gaseoso.
Valoración:
a) Titulación Indirecta:

*Enseguida viene la etapa de titulación, la cual puede ser indirecta, es decir, recibimos el
amoniaco gaseoso que condensa en el refrigerante en ácido clorhidrico, lo que nos va a
quedar ácido clorhidrico en exceso que vamos a retitular con hidróxido de sodio de titulo
conocido, lo cual por diferencia se obtienen los mg de amoniaco o nitrógeno de la muestra
obtenida inicialmente
b) Titulación Directa:

*Tenemos la opción de una titulación directa, en ese caso recibimos el amoniaco en una
solución ácido bórico e indicador de Kjeldahl, se forma el complejo de una coloración violeta
llamado borato acido de amonio, y este se titula con una solución de ácido clorhídrico de
concentración conocida hasta llegar al punto final de titulación que es cuando se decolora
este color violeta inicial del borato acido de amonio.
c) Calorimetría:
-Baja cantidad de Amoníaco destilado
-Reacción con Reactivo de Nessler (HgCl2+KCl en NaOH)
-Compuesto Anaranjado, absorbe a 410 nm
*Acá se necesita un espectrofotómetro y se realiza cuando la muestra contiene poco
nitrógeno y por tanto se va a formar poco amoniaco, en este caso la solución se hace
reaccionar con reactivo de Nessler, se forma un precipitado naranja intenso, se filtra esto,
se redisuelve y se mide su absorbancia a 410 nm.
Comportamiento de Compuestos Nitrogenados en digestión:
1. Cuantificación Directa (2-3 hrs)
-Aminas I, II, III.
-Amidas
-Mayores Heterociclos Nitrogenados
2. Reducción previa con HI:
-Nitroderivados
-Nitrosoderivados
3. Reducción drástica con Sn/HCl o Zn/HCl (15 a 20 hrs):
-Azo: -N=N-
-Hidrazo: -NH-NH-
-Uniones -N-N- intricíclicas

Usos:
- Determinación de Proteínas
- Determinación de Nitrógeno en Alimentos
- Determinación de Nitrógeno en compuestos Orgánicos
 ANÁLISIS FUNCIONAL
*Iniciaremos el segundo modulo que corresponde al análisis funcional, análisis elemental y
a la determinación del agua
Identificación de un compuesto consta de varios pasos
*Aquí lo que se hace es identificar un grupo funcional que
tiene el compuesto que estamos analizando, por ejemplo,
podemos tener una función aldehído o una función amida
que con ciertos reactivos va a producir una reacción con un
producto característico por ejemplo una coloración. Así con
el grupo funcional podemos orientarnos a saber que
compuestos podemos tener, esto complementa el análisis
de propiedades fisicoquímicas que
habíamos visto. Supongamos que tenemos
un compuesto desconocido, a partir de esto
nos iremos orientando hacia que tipo de
compuestos tiene. También esta parte de
análisis funcional es super importante en los
análisis de pureza que se realizan según las
normas de la farmacopea. Acuérdense que
nos explico al principio que la USP salen las
monografías donde salen los distintos análisis que se les hacen a los compuestos, uno de
estos análisis son las reacciones de identificación que se basan en las reacciones de grupo
funcional que tenga la molécula. Cuando
estamos analizando un compuesto a
través de los métodos que salen en la
farmacopea yo sé lo que tengo, pero debo
confirmar mediante diferentes reacciones
para demostrar la calidad, cantidad de un
principio activo o forma farmacéutica para
certificar la calidad de los medicamentos.
Por lo tanto, estas pruebas de análisis
funcional son muy importantes en la etapa
de la identificación. Nosotros vamos a
realizar diferentes reacciones químicas y no
vamos a ver mecanismos de reacción ya que
se vio en química orgánica, entonces aquí
vamos a utilizar los conocimientos de
química orgánica y los vamos a aplicar el
análisis de los fármacos como tal.
Además de caracterizar, es posible establecer la identidad absoluta.
También es posible establecer la identidad absoluta de un compuesto, pero para esto se
necesitan otras técnicas como por ejemplo mediante Técnicas de infrarrojo o mediante el
espectrómetro de masas que se verán en detalle más adelante.

Análisis Funcional
Requisitos de la reacción :
Elevada Constante de Equilibrio
Alto Rendimiento
*Tenemos el análisis funcional en que tenemos un
compuesto, una muestra que posee un grupo funcional,
se le va a aplicar un reactivo especifico bajo condiciones
adecuadas y se va a obtener un producto, el cual nos dará
una coloración, un precipitado y así vamos a poder
identificar mediante una reacción química. Los requisitos
que necesita esta reacción es una elevada constante de equilibrio y un alto rendimiento
para que se desplace la reacción hacia la derecha.
 • Reacciones de Identificación Hidrocarburos
• Reacciones Generales Hidroxilo
• Reacciones Específicas o Alcoholes
• Derivados de Caracterización o Polialcoholes

• Métodos de Determinación Cuantitativa o Fenoles

*Lo que vamos a ver en el análisis funcional es primero Carbonilo

reacciones de identificación generales por ejemplo o Aldehídos
para todos los alcoholes, luego vamos a ver reacciones
o Cetonas
especificas como por ejemplo reacciones en alcoholes
secundarios. Entonces cuando se les pide tipificar Carbohidratos
completamente una función quiere decir que den una Aminas
reacción específica, por ejemplo, no solamente que se
Acidos Carboxílicos
identifique el alcohol sino que ese alcohol se diga que
es secundario. Amidas
*Lo que vamos a ver después son los derivados de
caracterización que no los vamos a ver en estas clases, pero si están en el modulo y también
en ellos están los métodos de determinación cuantitativa al final del modulo porque no son
muy utilizados en la actualidad. Estos no serán preguntados en las pruebas, pero si es
importante que comprendan que es lo que es un derivado de caracterización. Ademas
podemos apreciar al lado derecho cuales son las funciones que vamos a ver desde los
hidrocarburos hasta las amidas.
Derivados de Caracterización
*Un derivado de caracterización es un
producto solido que tiene un punto de fusión
característico que se puede comparar con
tablas y así saber a qué corresponde. Para
esto el medicamento se hace reaccionar con
un reactivo de derivatizacion y así se obtiene
este producto solido de punto de fusión característico.
Hidrocarburos Alifáticos
*Vamos a comenzar con la
primera función que
corresponde a los
hidrocarburos alifáticos, la
primera reacción que
vamos a ver es la adición
de Halógenos, en este caso
el halógeno se adiciona al
doble enlace mediante una trans-adición en medio orgánico y lo que se va a observar es
una decoloración del bromo, esa es la reacción que se indica como positiva. Aquí como hay
una adición los dadores de electrones van a facilitar la reacción y los atractores de
electrones la van a retardar. En la guía hay una serie de interferentes que también producen
este tipo de reacción. Ahora cuando se nos pregunta en la prueba quien produce la reacción
positiva no se consideran los interferentes, a veces los interferentes hacen que la reacción
no se produzca, a veces los interferentes también reaccionan con el reactivo, pero por
ejemplo se forma otro color por lo tanto no vamos a considerar a los interferentes como
positivos en este caso.
*La segunda reacción es la oxidación con permanganato de potasio (KMnO4) en un medio
acuoso, se va a formar un diol y se va a reconocer la reacción por un precipitado pardo. Esta
es una oxidación muy intensa, incluso puede generarse acido carboxílico, esta es una
reacción general de oxidación por lo tanto compuestos fácilmente oxidables pueden dar
una respuesta positiva.
*En la guía se mencionan los interferentes.
Hidrocarburos Aromáticos
Reacción General de Identificación
*Luego pasamos a los hidrocarburos
aromáticos, los cuales tienen una
reacción general de identificación
que es la reacción de Le Rosen o
Marquis y que es una reacción que
se realiza con formaldehido más
acido sulfurico, no es necesario
aprenderse las etapas sino que solo
la aplicación. Aqui se ve la reacción
positiva por una coloración intensa.
La reacción si el hidrocarburo aromático tuviera algún sustituyente se va a producir primero
en para y luego en orto, en meta no se producirá.
Alcoholes R-OH

• Reacciones Generales de Identificación

*Ahora en los alcoholes por
tener este grupo OH esto le da
una alta polaridad a la
molécula y así sus constantes
físicas son mas altas que las de
los hidrocarburos con igual
número de átomos de
carbono. Las dos reacciones
mas generales de los alcoholes son la de Hexanitrato de cerio y amonio que se forma un
complejo rojo super característico de los alcoholes, pero solo lo dan los alcoholes con pocos
átomos de carbono (10 C), luego hay otra reacción que es para todos los alcoholes sin
importar su numero de carbonos que es una reacción con Oxinato de vanado y calor que se
va a formar un complejo rojo bien característico.

• Reacciones de Diferenciación
*Luego las reacciones de diferenciación
de los alcoholes que nos va a permitir
diferenciar si tenemos un alcohol 1rio,
2rio o 3ri. Un test clásico que debemos
recordar de Orgánica es el test de Lucas
en que se forma una suspensión o
turbidez y que el tiempo de aparición de
suspensión o turbidez va a determinar si
es un alcohol 1rio, 2rio o 3rio. Luego
tenemos reacciones de oxidación, ya que los alcoholes se oxidan, los primarios se van a
oxidar a un aldehído y si se oxida más todavía puede oxidarse a un ácido carboxílico, los
secundarios se van a oxidar a una cetona y los terciarios no se van a oxidar.
*Si un alcohol primario pasa a aldehído o un alcohol secundario pasa a cetona se puede
realizar una reacción de reconocimiento para estos grupos carbonílicos (Reacción
especifica) y así saber si tengo un alcohol primario o un alcohol secundario
 *Con permanganato en
medio acido y frio se
produce un precipitado
pardo que impidiria ver un
aldehído o cetona que se
formo por lo que se hace en
la practica es agregar un
exceso de ácido oxálico que
lo que hace es disolver este
precipitado y luego se
puede reconocer ese
aldehído o cetona que se formo con reactivo especifico para grupo carbonilo y así saber si
tengo un alcohol primario o alcohol secundario.
*Otra reacción de oxidación es con dicromato de potasio, aquí la presencia del producto se
detecta de manera diferente ya que se calienta y se destila el aldehído o cetona a un tubo
con agua y ahí en el tubo con agua se hace la reacción para aldehído con Schiff y la cetona
con Deniges.
*Luego tenemos una oxidación que es mas fuerte que es con anhidrido crómico y el alcohol
primario pasa directamente a un ácido carboxílico porque es una oxidación más fuerte y el
alcohol secundario pasa a una cetona. El reactivo es de color amarillo y al reducirse el cromo
pasa a verde y con esta coloración verde se puede hacer la identificación.
Polialcoholes
*Luego tenemos los
polialcoholes que son
cuando tenemos dos o
mas OH en carbonos
alifáticos vecinos. Las
reacciones químicas
generales tienen que ser
iguales a los alcoholes y
las reacciones de
diferenciación que solo
las dan los polialcoholes
son con ácido peryodico, este acido lo que hace es oxidar al polialcohol y se produce una
ruptura de la molécula y así se van a producir dos compuestos carbonílicos y ácido yódico.
Este acido yódico después se reconoce formando un yodato de plata que es un precipitado
y así se reconoce la reacción.
 *La segunda reacción especifica para
polialcoholes es la reacción con ácido
bórico, aquí tenemos que al agregar
piroxido disodio con indicador de
fenolftaleína el ácido bórico da una
coloración rojiza. Ahora a ese tubito de
color rojo le va agregando gotas del
polialcohol y se va observando en la
superficie donde se agrega el polialcohol
que se va decolorando el reactivo porque lo que hace el polialcohol es ir liberando un protón
acidificándola y volviéndola incolora.
Fenoles
*Luego pasamos a los fenoles en que
tenemos un OH unido a un grupo
aromático. Aquí los fenoles tienen un
carácter de ácido débil, ya que libera
parcialmente el protón del OH y así
pueden tener esta característica de
ácido débil. Los grupos activantes
disminuyen la acidez y los grupos
desactivantes la aumentan.
*Una de las reacciones mas generales de los fenoles es con cloruro férrico que puede ser
en medio acuoso o en medio anhidro y eso va a depender de la solubilidad del fenol lo que
producirá un color que es característico de la reacción (Azul).
*La segunda reacción general de los
fenoles es la sustitución electrofílica
con bromo que puede ser en medio
acuoso o en medio anhidro que va a
depender de la solubilidad del fenol. La
reacción en medio anhidro se reconoce
por una decoloración del reactivo y
también se puede reconocer por el
desprendimiento de ácido bromhídrico
por lo cual uno introduce en el tubo donde está haciendo la reacción una baqueta con
nitrato de plata y ahí se va a producir el precipitado. Aquí esta reacción ocurre de
preferencia en Para, luego en Orto y en meta no ocurre.
*El bromo en medio acuoso, se va a producir un precipitado con coloración y también se
puede ver el desprendimiento de ácido bromhídrico.
 *Otra reacción general de los fenoles
es la diazocopulacion, la cual es una
reacción que se hace en dos etapas
porque primero hay que producir el
reactivo que se hace la diazotacion, la
que se realiza con una amina en
medio acido y asi se va a formar la sal
de diazonio.

*Luego hay una copulación de la sal de diazonio que se formó con el fenol en medio alcalino
y se va a producir un producto conjugado que es coloreado. La copulación ocurre de
preferencia en Para, luego en orto y en meta no ocurre la reacción. La reacción va a ser
favorecida con grupos activantes en fenol y desactivantes en la amina.
*Luego hay otra reacción que es solamente
para los fenoles que tienen la posición para
desocupada por lo tanto ahí uno puede
hacer una diferenciación entre los fenoles y
se produce un producto coloreado que es
característico.

Carbonilo
*Ahora vamos a pasar a los
carbonilos, los aldehídos y cetonas.
Su reacción general de identificación
una de ellas es la adición nucleofílica
de aminas, acá se forma una base de
Schiff que se va a identificar por una
coloración o por un precipitado
colorado.
*Va a depender del reactivo que se
utiliza, si se utilizan aminas
simétricas y activadas como la p-
toluidina, bencidina o la
dimetoxibencidina se va a producir un producto coloreado, ahora si se utiliza la 2,4-
dinitrofenilhidrozina se va a producir un precipitado que es super característico con los
carbonilos. Si el carbonilo es alifático ese precipitado será amarillo y si es aromático ese
precipitado va a ser anaranjado.
*Aqui tenemos una reacción
general de identificación de
aldehídos, muy pocas cetonas la
dan. Se hace una reacción con un
reactivo fenólico como la
resorcina, la orcina o la
floroglucina y se va a producir un
producto coloreado.

*Luego entre las reacciones

generales de identificación para
los aldehídos tenemos la
reacción de tollens, la cual es
una reacción específica para
aldehídos y se forma el clásico
espejo de plata que es
fácilmente reconocible el grupo
aldehído.
*Luego tenemos otra reacción que es específica para aldehídos alifáticos, por lo que si por
ejemplo si uno identifica que es un aldehído le puede hacer una prueba de Fehling para
saber si ese aldehído es alifático o aromático, si da positivo va a ser un aldehído alifático.
Esta reacción se hace mezclando dos reactivos que es el Fehling A y B, con lo cual se va a
producir un precipitado que es característico para los aldehídos alifáticos.
*Esta reacción es una reacción
especifica para cetonas y se
denomina reacción de
Deniges, en la cual se produce
un precipitado blanco que es
característico entonces para
identificar a las cetonas.
 *Luego hay una reacción especifica para
la metilcetona que es la formación del
yodoformo, aquí se forma un derivado
halogenado que es un producto
intermedio que luego con hidróxido de
sodio forma el yodoformo que es un
precipitado de un color característico
*La sustitución del bromo es una reacción para carbonilos en general.
Carbohidratos
*La última función que veremos en esta
clase son los carbohidratos. A los
carbohidratos previo a las reacciones hay
que hacerles una deshidratación, asi se
obtiene el furfural que es el que reacciona
con los distintos reactivos para producir las
reacciones típicas de los carbohidratos.
*Esta deshidratación se hace calentando al
carbohidrato en un medio fuertemente
acido. Por ejemplo, si tenemos una pentosa se va a formar el furfural y si tenemos una
hexosa se va a formar el hidroximetilfurfural.
*La reacción mas general de los
carbohidratos es la reacción con antrona
que es con 9,10-dioxoantraceno y se va a
formar un producto que tiene una
coloración verde intensa que es muy
característica de los carbohidratos.

*Otra reacción general es la reacción

con la p-toluidina. Aqui se calienta el
carbohidrato solito en un tubo y va a
empezar a destilar furfural hacia arriba,
entonces arriba se pone un papel filtro
impregnado con la p-toluidina y ahi
cuando uno tiene un carbohidrato en el
papel se produce una coloración roja
característica de los carbohidratos.
 *Luego tenemos la reacción con alfa
naftol o reacción de Molisch que es una
reacción general pero no las dan los
polímeros grandes. Aquí se produce un
color violeta intenso que reconoce al
carbohidrato.

*Luego tenemos algunas reacciones de

diferenciación con diferentes reactivos y
se van a producir diferentes coloraciones
por ejemplo si es una aldosa o cetosa,
etc.

*Finalmente una reacción de

diferenciación que permite
diferenciar entre monosacáridos y
disacáridos que es con la reacción de
Barfoed.
*Recalcar que los colores no son
necesario que se aprendan sino que
como reconocer una función con las
reacciones que vimos hoy.
 DETERMINACIÓN DE AGUA
*Vamos a comenzar el último capítulo del segundo modulo que corresponde a la
determinación de agua.
Introducción
Análisis Cuantitativo
o Materias Primas
o Productos en Proceso
o Productos terminados.
Este es un análisis de rutina que se realiza en la industria farmacéutica, está dentro de los
controles de calidad que se hacen a una materia prima antes de ser elaborada como un
producto farmacéutico, a un excipiente que va a acompañar una forma farmacéutica, a un
producto en proceso o a un producto terminado antes que salga al mercado.
En la farmacopea salen los límites de agua que deben tener cada uno de los compuestos, si
esos límites no se cumplen obviamente no se puede utilizar ese producto farmacéutico o
esa materia prima para elaborar un producto farmacéutico.
Tipos de Agua
✓ Agua Libre o Humedad:
o Adsorbida
o Cantidad Variable
o Impureza
✓ Agua unida o de Cristalización:
o Estructura química
o Cantidad Fija
Dentro de los tipos de agua que pueden tener un compuesto, existen dos, una se le
denomina el agua libre o humedad que es un agua de tipo absorbido sobre la superficie del
compuesto, la composición que va a tener va a ser variable, la cual va a depender de la
condición de almacenamiento del compuesto. Por ejemplo, podemos tener la muestra
dentro de un desecador cerrado entonces no va a captar agua, pero si lo tenemos fuera del
desecador va a captar más agua. Por lo tanto, la cantidad de agua que va a tener de este
tipo de agua un compuesto va a ser variable, va a depender de las condiciones en que la
tengamos, y se le va a considerar una impureza, por esto es muy importante determinar en
qué porcentaje está esta impureza. Hay otra agua que es un agua que se denomina unida o
de cristalización y que forma parte de la estructura química del compuesto y por lo tanto su
cantidad es fija.
 *Por ejemplo aquí tenemos el ácido oxálico
anhidro, sin agua, con su peso molecular y
el que tiene dos moléculas de agua con su
correspondiente peso molecular, va a ser
siempre una cantidad fija de dos moléculas de agua que va a tener el ácido oxálico
dihidratado.
Métodos para Determinación de Agua
❖ Método Gravimétrico
❖ Método Azeotrópico
❖ Método Químico (Karl Fischer)
*Ahora vamos a ver los métodos que se utilizan para determinar el agua, los cuales son el
método gravimétrico, el método azeotrópico y el método químico o también denominado
de Karl Fischer.
Método Gravimétrico

T° mayor que la *En este método la sustancia en

ambiental estudio se somete a desecación en
(estufas) condiciones adecuadas en un pesa
filtro, lo que se va a perder entonces
Temperatura va a ser agua y otras sustancias
Desecación ambiental volátiles que contiene la muestra, por
(desecador) lo tanto, no es específico para agua.
Este es el típico test que se hace de
Termogravimetría perdida por secado.
(Termobalanza)
¿Que condiciones pueden ser de
desecación?
R: A temperatura mayor que la ambiental en estufas que va a ser para sustancias estables
para el calor, a temperatura ambiental en un desecador, se aplica a sustancias que se
pueden alterar sobre cierta temperatura y la termogravimetría que son unas termobalanzas
que tienen un haz de luz infrarrojo que va secando la muestra y uno puede ir registrando el
peso directamente en la balanza.

Estufa Desecador
*Acá tenemos las fotos de una estufa y desecador, en la cual es importante mantener la
tapa cerrada.
*Cuando se hace a temperatura mayor que
la ambiental en una estufa, generalmente
se realiza a la temperatura de 100° a 105° C 100° a 150° C, presión normal:
a presión normal para sustancias Termoestables, PF>110°C

termoestables con un punto de fusión T° mayor que la

ambiental
mayor que 110°C porque no podemos <100°C, presión reducida:
fundir el compuesto y menor a 100°C a Termoinestables, PF<100°C
presión reducida para sustancias que son
termoinestables con un punto de fusión
menor a 100°C, ¿Que se gana con disminuir
la presión? Se gana el disminuir el punto de ebullición del agua.

*La temperatura ambiental se puede

Presión normal
realizar a presión normal y a presión
Temperatura
reducida, esas son para sustancias
ambiental alterables al calor (Termoinestables).
Presión reducida
Termoinestables

*Cuando estamos trabajando a temperatura

ambiental en un desecador, hay distintos
desecantes, el mas utilizado es la Sílica gel, acá lo
importante siempre es tener la precaución de
tener la Silica gel este seca para que no vaya a
pasar agua de la Silica al compuesto.

*Las desventajas del método

Método Largo gravimétrico son que es un método
largo, a veces hay que tener la
Desventajas
muestra de un día para otro y que no
No específico es especifico ya que como nos dijo al
comienzo, determina agua y otras
sustancias volátiles que puede tener
la muestra.
Método Azeotrópico
✓ Mezclas Azeotropicas
▪ Proporción fija.
▪ T° ebullición diferente.
*La base del método azeotropico se encuentra que al mezclar dos líquidos de diferente
punto de ebullición en algunos casos pueden llegar a formar las denominadas mezclas
azeotrópicas, las características de estas mezclas son que siempre la proporción en la cual
se mezclan estas dos líquidos es fija y la temperatura de ebullición resultante de la mezcla
es diferente de cada uno de sus constituyentes.
*Esto es lo que se realiza
en el método
azeotrópico, tenemos los
dos líquidos que en este
caso sería el agua que es
el agua que se está determinando al compuesto y se le va a agregar el solvente tolueno.
Entre el agua y el tolueno se forma una mezcla azeotrópica en un 20% aproximadamente
de agua y un 80% de tolueno, ahí se ve que el punto de ebullición resultante de la mezcla
es diferente y es más baja que el agua y que el tolueno.
*¿Cual es el procedimiento de este método?
Se mezcla una cantidad de muestra que
tenga aproximados entre 3 a 4 mL de agua y
sí estoy trabajando con un producto
farmacéutico, los limites salen especificados
en la farmacopea, entonces con estos limites
uno puede calcular mas o menos cuanto
tiene que pesar de muestra para que tenga
ese porcentaje de agua y se le agrega bastante tolueno (entre 300 a 500 mL) para que se
forme la mezcla azeotrópica. Vamos a tener los dos líquidos, se empieza a aplicar calor y al
aplicar el calor se empieza a formar esta mezcla azeotrópica y esta va a tener un punto de
ebullición de 84°C y esto va a estar destilando (Típico aparato de destilación). Cuando se
acabe el agua de la muestra lo que va a suceder es que empieza a destilar tolueno y vamos
a ver en nuestro aparato de destilación que la temperatura subió por lo tanto vamos a saber
que sacamos todo el agua de la muestra y simplemente se para el proceso. Luego dejo que
se enfríe y como son dos líquidos inmiscibles se van a separar y ahí vamos a poder medir el
volumen de agua y como se sabe la cantidad de muestra que se agrego vamos a poder
calcular el porcentaje de agua que tiene la muestra.
 *Esta foto en la que sale el aparato de destilación donde
está el tubo receptor donde uno va recibiendo todo el
destilado.

*¿En que se usa principalmente el método

azeotrópico?
Mayoritariamente es aplicada para
productos vegetales, en productos
farmacéuticos prácticamente no se usa, se
podría usar en algún producto como una
emulsión, un ungüento, pero
principalmente en el área de productos
vegetales se utilizan estos métodos
azeotrópicos.
*Las desventajas del método
azeotrópico son que es un método
Método Largo
largo porque tiene que ser todo un
Desventajas proceso de destilación, se utiliza
Gran cantidad de bastante cantidad de muestra y otra
muestra desventaja es que se utiliza bastante
tolueno.
Método Químico, Karl Fischer
➢ Características:
• Corto
• Sencillo
• Específico
➢ Reactivos:
• SO2
• I2
• Piridina
• Metanol
*El ultimo método es el método químico, hay una reacción química aquí que se denomina
de Karl Fischer, las características mas importantes de este método es que es corto, muy
sencillo y es especifico, es decir, solo determina agua. Aquí se emplean reactivos como el
dióxido de azufre, el yodo, la piridina y el metanol. Es una mezcla entonces que componen
el reactivo de Karl Fischer y con esto se produce la reacción química.
Karl Fischer
Reacción:
I2 + SO2 + H2 O ⇌ 2HI + SO3
Piridina:
Estabiliza el reactivo
Exceso piridina estabiliza el producto
*¿Cual es la base de este método? En presencia de agua, el yodo se reduce y el dióxido de
azufre se oxida, eso solo ocurre en presencia de agua.
*¿Para qué se agrega piridina? Para estabilizar el reactivo y además el exceso de piridina
estabiliza el producto.
*Se tira la reacción hacia la
derecha y además se ve el
metanol que aparte de ser
el solvente de la reacción
también participa en
desplazar la reacción hacia
la derecha.

*El punto final de la reacción se puede ver de dos

maneras, por un cambio de color y un punto final Cambio de Color
de tipo amperométrico que es lo que nosotros
vamos a ver aquí. Punto Final

Amperométrico
Punto final Amperométrico:
I2 + 2 e− ⇌ 2I −
Cuando se encuentren las dos especies existirá paso de corriente.
*En el punto de final amperométrico cuando se encuentren las dos especies, es decir, el
yodo y el yoduro, va a existir lo que genera el paso de corriente y esto origina las diferentes
modalidades de valoración.
*La más importante es la titulación
Titulación directa.

directa
Valoración
Titulación
Indirecta
*¿La titulación directa como se realiza?
La muestra se disuelve en metanol, un
metanol que primero uno lo deja anhidro,
porque siempre tiene un poquito de agua,
entonces uno lo pone en el vaso de titulación,
lo titula con el Reactivo de Karl Fischer, lo
dejamos anhidro y luego procedemos a
disolver la muestra en él, titulamos con el
reactivo de Karl Fischer, entonces vamos a ir agregando yodo del reactivo y como la muestra
tiene agua eso pasa altiro a yoduro. Todo el rato yoduro por lo tanto no hay paso de
corriente, pero con el primer exceso de Reactivo de Karl Fischer también vamos a tener la
presencia de yodo, por lo tanto, vamos a tener la presencia de yodo y yoduro, va a haber
un paso de corriente eléctrica que lo detectara el equipo y eso determina el punto final de
la reacción.
*Luego tenemos la titulación indirecta que es
mucho menos común, en que tenemos la
muestra disuelta en metanol y le agregamos un
exceso de reactivo de Karl Fischer, como tenemos
un exceso vamos a tener la presencia de Yodo y
yoduro por lo tanto vamos a tener paso de
corriente, luego como es una titulación indirecta
vamos a realizar una re titulación con una mezcla
de titulo conocido metanol/agua y en el punto
final por lo tanto va a desaparecer el yodo y por lo tanto no va a haber paso de corriente y
eso determinara el equipo.

*Aquí nos muestra un típico equipo de Karl

Fischer donde tenemos el vaso de titulación
donde se agrega la muestra, ahí se va
produciendo toda la titulación y ahí esta un
pequeño par de electrodos que van a
reconocer el paso de la corriente eléctrica.

*Ahora el reactivo de Karl Fischer necesita Título empírico 3 a 5 mg

una estandarización, viene con un título agua / mL RKF Estandares Primarios:
empírico que se expresa en mg de agua/mL
<1% de agua
de reactivo, pero es un titulo que cada vez
Estandarización
que uno va a utilizarlo debe volver a
determinarlo, es como cuando uno realiza Estandares Secundarios:

una titulación acido-base que tiene que >1% de agua

determinar la normalidad exacta del

titulante, la única diferencia es que acá hay
que hacerlo cada vez que uno lo utiliza, no es que uno estandariza un litro y hasta que se
acabe lo tiene así, esto es porque el reactivo se humedece y por lo tanto varia el titulo que
el tiene. Por eso si nos fijamos en la foto del equipo, todas las conexiones con el medio
ambiente están con Silica Gel porque el reactivo es muy inestable y puede captar la
humedad del medio ambiente. Ahora ¿Como se hace esta estandarización? Si el compuesto
a determinar tiene menos de 1% de agua se va a hacer con estándares primarios y si tiene
mas de 1% de agua se va a hacer con estándares secundarios.
*Los estándares primarios son
compuestos con agua de
cristalización como tartrato disódico
y acido oxálico que tienen dos
moléculas de agua asociadas en su
estructura química.
Tartrato disódico dihidrato
2 𝑥 18,02 𝑚𝑔 𝑠𝑎𝑙 𝑚𝑔 𝑠𝑎𝑙
Factor = 𝑥 Factor = 0,15664 𝑥
230,08 𝑚𝐿 𝑅𝐾𝐹 𝑚𝐿 𝑅𝐾𝐹

*Aquí tenemos la fórmula para hacer el calculo del factor cuando utilizo tartrato disódico
que corresponde a 2 por el peso molecular del agua partido el peso molecular del tartrato
por los miligramos que pesamos de tartrato y agregamos al equipo de titulación partido por
los mL de reactivo de Karl Fischer que se utilizan para realizar esta titulación. Ósea pesamos
una cantidad de tartrato, lo agregamos al vaso de titulación y procedemos a titular y así se
llega al punto final y así vamos a tener los miligramos que seria lo que agregamos al vaso
de titulación partido por los mL que nos los da directamente el equipo que es lo que se
utilizo para hacer la estandarización del reactivo. Ahí también esta la forma resumida para
hacer el cálculo.
Ácido Oxálico Dihidrato

2 𝑥 18,02 𝑚𝑔 𝑠𝑎𝑙 𝑚𝑔 𝑠𝑎𝑙

Factor = 𝑥 Factor = 0,28587 𝑥
126,07 𝑚𝐿 𝑅𝐾𝐹 𝑚𝐿 𝑅𝐾𝐹

*Luego con ácido oxálico es exactamente lo mismo, lo único que varia es su peso molecular.

*Acá tenemos cuando se utiliza un estándar secundario que corresponde al agua destilada
y el factor se calcula dividiendo los miligramos de agua partido por los mL del reactivo que
se va a utilizar para esa titulación. El agua que generalmente se agrega por volumen por lo
tanto uno lo agrega en microlitros porque miligramos equivalen a microlitros y según lo que
se gaste en titular esos microlitros de agua se va a calcular el factor.
Cálculo de cantidad de agua

mg agua = 𝑚𝐿 𝑅𝐾𝐹 𝑥 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟

*Así el cálculo de la cantidad de agua al final se hace por los mL del reactivo de Karl Fischer
que uno gasta en titular la muestra multiplicado por el factor que fue obtenido
anteriormente.
 Procedimiento:
El procedimiento final se realiza
primero uno agrega metanol al
vaso de titulación y lo titula para
dejarlo anhidro, el volumen que
uno gaste titulando el metanol no
interesa porque solo se utiliza
para dejarlo anhidro, luego se
agrega el reactivo para estandarizar que va a ser agua o uno de los estándares con agua de
cristalización, agregamos ese reactivo, lo titulamos y sacamos el factor de este reactivo.
Luego agregamos la muestra también por peso y la titulamos y vamos a tener los mL de
reactivo gastado en titular la muestra, tenemos el factor y vamos a poder calcular los
miligramos de agua en la muestra. Como sabemos la cantidad de muestra que tomamos
podemos calcular el porcentaje de agua que tiene la muestra.
*El uso del método de Karl Fischer es super amplio
desde productos de área química, productos
alimenticios hasta productos farmacéuticos, en el cual
es el método que mas se utiliza en materias primas,
semielaborados, terminados, solidos, líquidos e
incluso se puede hacer con gases con unos aparatos
especiales que se agregan en el equipo.

*Las desventajas de este método

es que es incompatibles con
oxidantes y reductores por ser un
proceso redox y hay interferentes
como los ácidos y los álcalis fuertes
y los aldehídos y cetonas que con el
metanol reaccionan y forman
acetales.
Módulo 3
 PARAMETROS CROMATOGRAFICOS
CROMATOGRAFÍA
Hoy comenzaremos el tercer modulo de la asignatura que corresponde a la
cromatografía, la cual es la técnica analítica principal que se realiza en la actualidad
para diversas tipos de muestra, no solamente muestra farmacéutica. Es por esto que
es super importante que comprendamos este modulo bien y lo sepamos integrar porque
lo usaremos de aquí en adelante en la carrera.
En el área farmacéutica es el principal técnica de análisis, ya que si nos vamos a
farmacopea la mayoría de los análisis cualitativos y cuantitativos se realizan por
cromatografía. Recordaremos de análisis instrumental que la cromatografía es una
técnica analítica de separación, ya que permite separar los constituyentes de una
muestra en distintos analitos y así podemos realizar un análisis de tipo cualitativo y
cuantitativo. Esta separación se debe a la migración diferencial que tienen estos
componentes dentro de la fase estacionaria y la fase móvil que fluye por esta fase
estacionaria. Según su afinidad se van a retener mas o menos y así se va a lograr
separarlos y lograr un análisis cualitativo o cuantitativo. En el área de investigación que
se desarrolla en el Laboratorio de la Universidad es la técnica que más se utiliza en los
tesistas, los cuales trabajan desarrollando y validando algún método cromatográfico
como por ejemplo para algún estudio de estabilidad del medicamento, para un análisis
de un medicamento en un fluido biológico, etc.
Clasificación de Métodos Cromatográficos
1. Según FE y FM
*Los métodos
cromatográficos se

FE FM Denominación pueden clasificar

según la fase
estacionaria y la
fase móvil. La fase
Sólido Líquido Sólido-Líquido estacionaria puede
ser un Solido o un
Líquido Líquido Líquido-Líquido Líquido, mientras
que la fase móvil
puede ser un
Sólido Gas Sólido-Gas Liquido o un Gas y
así van a tener
Líquido Gas Líquido-Gas distinta
denominación.
 *Según el tipo de
2. Según tipo cromatografía 3. Según objetivo cromatografía puede ser
planar, en la que se
realizan estas placas en
Planar Analítica donde se deposita la fase
estacionaria o en
Columna Preparativa columnas como la típica
HPLC o GC.
*Según el objetivo puede ser un objetivo Analítico Cualitativo o Cuantitativo o un objetivo
denominado preparativo que consiste en ir aislando fracciones que contengan el analito,
en donde vamos pasando mayores cantidades de muestra sobre una columna y así se
puede ir aislando un analito del resto de sus constituyente. Esto se realiza mucho en
análisis de productos vegetales.

4. Según mecanismo de separación

*Tambien según el mecanismo de
separación, estos cuatro son los
Adsorción principales mecanismos, no son los únicos
Reparto y se verán en detalle en las próximas
clases.
Exclusión
Intercambio iónico
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
La cromatografía liquida tambien tiene una
clasificación que puede ser cromatografía Plana Columna
liquida planar o en columna. La planar se
realiza sobre una placa, sobre la cual está
-Clásica Clásica (LC)
depositada la fase estacionaria. Esta se puede
subdividir en clásica y en instrumental, la Papel (PC) Instrumental
primera partió en inicios en papel y lo que se (HPLC)
Capa fina (TLC)
hace ahora es con una capa fina que es como
una placa o una hoja o rectángulo de vidrio -Instrumental
donde está depositada esta fase estacionaria. (HPTLC)
Tambien ahora en la actualidad hay una
cromatografía planar que se llama instrumental,
la cual es denominada HPTLC. La ventaja de esta sobre la clásica es que permite hacer
un análisis cuantitativo. Este equipo se encuentra en el departamento de Ciencia y
Tecnología de los alimentos, ellos lo ocupan para diversos fines, principalmente para
investigación. En el área farmacéutica tambien se puede aplicar, se han hecho
bastantes trabajos y se han publicado en cromatografía en capa fina instrumental pero
no es una técnica que esté en farmacopea por lo tanto no está en laboratorios
farmacéuticos porque mientras no este en farmacopea no se considera una técnica
oficial, entonces no sirve para controlar la calidad de medicamentos, aunque esta si se
usa en el área de investigación para los productos farmacéuticos.
La cromatografía en columna, como su nombre lo indica, se realiza en una columna
cromatográfica. Sus orígenes tambien partieron en una cromatografía clásica y
evoluciono después a la instrumental que se denomina HPLC.
CROMATOGRAFÍA DE GAS
La cromatografía de gas que se realiza siempre en
Columna una columna y puede ser gas solido o gas líquido
según la fase estacionaria que se utilice
Gas-Sólido (GSC)
Gas-Líquido (GLC)

PARAMETROS CROMATOGRAFÍCOS
Vamos a comenzar con los parámetros cromatográficos, debemos recordar de nuestras
clases de análisis instrumental que debemos haber hecho determinación de parámetros
cromatográficos, los cuales tienen como objetivo determinar la calidad del sistema
cromatográfico. Para poder realizar un análisis cualitativo y cuantitativo nosotros
necesitamos un sistema que sea adecuado por lo cual uno determina estos parámetros
y ve realmente si nuestro sistema está bien o sí necesita ser optimizado para que
nuestro análisis cuantitativo y cualitativo sea el mejor posible.
RETENCIÓN
*El primero de los parámetros es el tiempo de
retención que simplemente es lo que demora en salir
de la columna un analito luego de su inyección.
Tambien tenemos el tiempo de retención corregido,
al cual se le resta el tiempo muerto, este ultimo se
define como lo que demora en salir un analito que
no se retiene por la columna. El tiempo de retención
va a variar según los compuestos obviamente, es
por eso que no existe un valor que sea optimo, pero
obviamente si tenemos un solo analito en una
muestra no requiero un tiempo de retención largo
porque o sino vamos a gastar solvente, vamos a gastar tiempo. Entonces así uno
adecua el tiempo de retención para que el análisis no sea muy largo.
CAPACIDAD
Luego tenemos el factor de
capacidad que tiene
relación entre el tiempo de
retención del analito y el
tiempo muerto. Acá se ve
un cromatograma de una
mezcla de dos analitos, el
primero que tiene un factor
de capacidad mas
pequeño que el segundo
porque solamente hay una
relación entre su tiempo de
retención y el tiempo
muerto. Los valores
ideales del factor de capacidad son de entre 2 y 10, lo que quiere decir que se retenga
por la columna cromatográfica pero tampoco que se retenga tanto para no alargar el
análisis. ¿Como podemos hacer una variación en este factor de capacidad? Esto se
puede realizar modificando la fuerza de la Fase móvil, nos referimos a la fuerza de la
fase móvil al porcentaje de un modificador orgánico, por ejemplo, una fase móvil que
tenga un 70% de metanol y un 30 % de agua tiene una mayor fuerza que tenga un 60%
de metanol. Es así que la fuerza se visualiza por el porcentaje de modificador orgánico.
SELECTIVIDAD
Luego tenemos el factor de selectividad que
tiene relación entre el tiempo de retención de dos
analitos vecinos. Aquí tenemos un
cromatograma en donde tenemos dos peaks
cromatográficos y de ahí podemos calcular el
factor de selectividad. Los valores ideales son
entre 1,1 y 2, es decir que los dos analitos se
separen, tengan una adecuada separación en la
base, pero tampoco que uno salga al minuto 5 y
el otro al minuto 30 porque obviamente se alarga
el análisis sin ninguna justificación, este se
puede variar cambiando el tipo de fase
estacionaria
EFICIENCIA
Otro parámetro
cromatográfico que es muy
importante es la eficiencia,
está eficiencia se mide en
función del número de
platos teóricos que tiene el
sistema. Para que dos
analitos se separen bien, debe ser pequeño el ancho de base de los picos. Mientras
menor el ancho de base va a ser mayor el numero de platos teóricos, por lo tanto se
necesita un alto número de platos teóricos para tener una buena eficiencia
cromatográfica y esta se puede medir por la altura equivalente del plato teórico que va
a ser el largo de la columna partido por el número de platos teóricos, mientras que el
número de platos teóricos tienen dos ecuaciones, la primera se utiliza para picos que
sean simétricos ósea que tengan una forma de una campana de Gauss en que se mide
el ancho de la base. En cambio si el pico por ejemplo es un poco asimétrico,
generalmente en cromatografía se produce un efecto de cola derecha, así entonces si
partimos el peak por la mitad, la parte derecha en la parte de abajo generalmente se
puede ver un poco más ancho, así entonces cuando se producen estas asimetrías es
mejor medir el ancho de base a menor altura porque obviamente va a haber mucho
menos error que si medimos el ancho de base abajo donde hay un efecto de la
asimetría.
*La ecuación de Van Deemter es la que
nos rige la eficiencia cromatográfica.
Debemos recordar tambien la Ecuación de
Van Deemter, la cual se utiliza
principalmente para obtener el flujo optimo,
aquí tenemos en relación 3 Variables que
están en la formula. Así con la resultante
de estos tres factores nosotros podemos
calcular el flujo óptimo. Por esto es
necesario que hagamos una variación en el
flujo y así iremos viendo si estamos en el
flujo optimo o no y si es necesario
optimizarlo o no.
Factor de Tortuosidad

El primer factor es el factor de Tortuosidad, el cual se relaciona

con el tipo de empaque que tenga la columna. Por lo tanto, va a
depender netamente de la columna cromatográfica, es decir, si
nosotros aumentamos o disminuimos el flujo, esto no va a
mejorar la eficiencia sino que la va a mejorar cambiando la
columna, teniendo una columna más homogénea, con un tamaño
de poro mas pequeñito se va a lograr mejorar la eficiencia. Es por
esto que cuando uno desarrolla un método es muy importante comprar una columna
que sea buena, las diferencias de precio a veces son importantes, pero si uno tiene que
analizar la muestra de un solo analito no es tan relevante tener una columna tan buena
pero si tenemos una mezcla de varios analitos es super importante que cada uno de
estos peaks cromatográficos tengan un ancho de base pequeño para que así los
podamos separar todos porque si el ancho de base es grande va a ser dificil obtener
una buena separación. Aquí en el esquema de la izquierda se ve un esquema de un
relleno donde se ve como las moléculas van viajando por este relleno. Así vemos como
algunas toman el camino azul, otras toman el camino fucsia y otras toman el camino
amarillo. Así se obtiene un pico cromatográfico con la típica forma gaussiana. Entonces
si esa moléculas de relleno son más dispares, los caminos son más tortuosos, aquí se
va a producir un mayor ensanchamiento de peaks. Es como siempre les dice a los
alumnos, que, si nos vamos por la carretera como la ruta del Itata, vamos a ir rapidito y
no se mueve mucho el auto, pero si vamos por una carretera llena de piedras, tenemos
que ir con el auto lento, se nos va para el lado, entonces es el mismo efecto el que se
produce. En la Imagen de la derecha vemos la comparación entre la columna de arriba
que tiene un tamaño de poros muy uniforme y todas las partículas pequeñitas, se va a
obtener una gran eficiencia con respecto a la columna de abajo en que hay más
disparidad del tamaño de poros donde se va a obtener una menor eficiencia. TENEMOS
QUE CAMBIAR LA COLUMNA CROMATOGRAFICA SIN IMPORTAR EL FLUJO.
Factor de Difusión Longitudinal

Luego tenemos el factor de difusión longitudinal

que tiene que ver con la difusión longitudinal del
analito en la fase móvil, por lo tanto, se va a relacionar
con la densidad y viscosidad de la fase móvil y así va a
ser más importante en la cromatografía de gases que en
la de líquidos porque la difusión en los gases es mayor a
los líquidos. Entonces en la izquierda cuando uno recién
introduce la muestra en la columna es un pequeño
puntito, pero a medida que va avanzando en la columna
comienza a difundir longitudinalmente y así se va a
producir ensanchamiento del peak, por lo tanto si
dejamos mucho rato el analito en la columna a un flujo
lento, vamos a producir un ensanchamiento del peak y se va a disminuir la eficiencia
por lo tanto en el factor de difusión longitudinal conviene trabajar con flujos más rápidos
para disminuir está difusión y así mejorar la eficiencia.
Factor de Resistencia a la Transferencia de Masa
Finalmente tenemos el factor de resistencia a la
transferencia de masa, para que haya un equilibrio
del analito entre la fase móvil y la fase estacionaria
se requiere de un tiempo, sí la velocidad de flujo es
muy alta, es menos el tiempo que dispone el analito
para que se cumpla esta transferencia o constante
de equilibrio, por lo tanto, aquí se favorece el
ensanchamiento del pico a velocidades altas. Así
entonces conviene darle un tiempo al analito para
que pueda interaccionar bien con la columna
cromatográfica. Aquí es más importante en
cromatografía de líquidos que en cromatografía de gases. Entonces acá hay que darle
tiempo al analito para que se produzca una buena interacción.
 *Por lo tanto lo que se obtiene a partir de estos
tres factores es una resultante que está marcada
con color verde. En que, en esa zona, es decir,
la zona del circulo verde es donde tenemos la
mayor eficiencia y en ese flujo debemos trabajar.
Si vemos el circulo abarca una zona grande de
intervalo, pero obviamente si estamos en valores
muy altos o muy bajos vamos a perjudicar la
eficiencia y ahí tendríamos que hacer una
optimización del flujo para mejorar la eficiencia.
Así entonces esto es para obtener el flujo optimo
para trabajar con la mayor eficiencia cromatográfica.
*En esta diapositiva nos
muestra una comparación
entre dos cromatogramas
donde se calcula el factor de
capacidad y selectividad, como
el factor de capacidad y
selectividad tienen que ver con
la retención del analito. Si
comparamos el A con el B, las
retenciones y las selectividades
van a ser exactamente iguales,
por lo tanto, calcular el factor de
capacidad y de selectividad no me da mucha información acerca de como está mi
sistema cromatográfico porque en los dos cromatogramas vamos a tener un valor de K
y del factor de selectividad iguales, en cambio si calculamos la eficiencia en números
de platos teóricos obviamente es mucho mayor en B y nos vamos a quedar con ese
sistema para seguir trabajando. Es lo que se obtiene en el grafico de la derecha.
RESOLUCIÓN
Otro de los parámetros
cromatográficos más
importantes es la resolución. La
resolución es una medida de la
calidad de la separación. La
resolución mide como se
separan dos picos vecinos. Se
calcula a partir de la ecuación de
arriba que tiene relación con el
tiempo de retención entre dos analitos vecinos y su ancho de base. Los valores ideales
se encuentran entre 1,5 y 2, esto quiere decir que tienen que estar totalmente
separados, pero tampoco que se separen tanto porque eso aumentaría el tiempo de
análisis. Si nos fijamos en la ecuación de abajo, engloba el factor de selectividad,
capacidad y eficiencia. Esto quiere decir que, si la resolución es adecuada, los otros 3
factores van a ser adecuados. En la práctica medimos los parámetros cromatográficos
para ver si lo necesitamos optimizar o no. Los parámetros que se miden son la
resolución, la eficiencia y el factor de cola. El factor de capacidad y selectividad no se
miden porque no dan mucha información. A la derecha se muestra un cromatograma
de dos analitos donde no se encuentran tan separados, la resolución es baja por lo
tanto difícilmente se hará una buena cuantificación, mientras que el de la derecha
muestra un cromatograma justito en 1,5, pero en este caso se trata de que sea más
grande para que haya una buena separación.
Modificación:
-FM : naturaleza y flujo
- FE: largo y tipo relleno
- Temperatura
*La resolución se puede modificar mediante la fase móvil cambiando la naturaleza
cambiando el tipo de solvente orgánico, agregar un tampón y además cambiar el flujo.
En la fase estacionaria se puede cambiar el largo de la columna poniendo una mas
larga como por ejemplo si tenemos 3 analitos que se separan, pero están muy cerca,
entonces se cambia por una columna mas larga para que se separen más, además se
puede cambiar el tipo de relleno y tambien la temperatura que es muy importante en la
cromatografía de gases porque es el principal mecanismo en que uno puede modificar
la separación. En cromatografía liquida tambien ahora los equipos de ahora tienen
hornos para la columna, pero es más importante para la cromatografía de gases
*Aquí tenemos otro ejemplo, en el
primero tenemos dos analitos que
están prácticamente superpuestos,
después vamos aumentando la
resolución hasta que los logramos
separar, por eso es importante medir
los parámetros cromatográficos para
lograr optimizar la separación de los
analitos y así hacer una buena
cuantificación.
ASIMETRÍA
*El ultimo parámetro es el factor de asimetría o el
factor de cola, que tiene relación con la forma del
pico cromatográfico. La idea es que el peak sea de
la forma mas gaussiana posible, es decir, que si
cortamos el peak por la mitad que el lado izquierdo
sea igual al lado derecho. Aquí hay un efecto de
cola derecha.
El factor de cola se mide al 5% de la altura, ahí se
mide la fracción A+B/2A, entonces si el peak es
totalmente simétrico eso va a valer 1 y si no va a
empezar a valer un poco más, lo ideal es que no
hay un factor de cola mayor a 1,5 porque ya sería demasiado la cola y tendríamos que
mejorarla.
Acá tenemos algunos
ejemplos de factor de cola.
En el laboratorio lo que mas
cuesta es el factor de cola,
uno desarrolla un método,
mide parámetros teniendo
una buena eficiencia, buena
resolución pero a veces el
factor de cola anda un poco
justo llegando a 1,4 llegando
demasiado cercano al límite,
Cuando uno empieza con un
método en una columna
nueva da mejor pero
después de que uno la va
usando, la columna se va
gastando, perdiendo
eficiencia y entonces se
empieza a ensanchar por lo
que va a aumentar la cola,
entonces al inicio uno tiene
que tener los parámetros
super bien optimizados
porque después de cierto
tiempo esto va a ir
deteriorándose. Una manera bastante practica de mejorar el factor de cola es con el pH
de la fase móvil en donde uno puede jugar un poco y mejorar este factor de cola.
Recordar de las clases de solubilidad el efecto que hace la variación del pH en un
compuesto, es decir, si tenemos un ácido débil y le subimos el pH, lo ionizamos, por lo
tanto, lo dejamos mas hidrosoluble y por lo tanto si tenemos una columna con un relleno
apolar se va a retener menos, así entonces, uno jugando con el pH vamos a producir
una gran variación en la retención de un compuesto en la columna cromatográfica. Así
entonces todos los conocimientos de los parámetros fisicoquímicos los vamos a utilizar
para lo que es un análisis cromatográfico.
CROMATOGRAMA
Información
-Complejidad de la muestra
- Identidad de los analitos
- Cantidad de los analitos
- Características y calidad del sistema cromatográfico:
• resolución
• factor de cola
• inyecciones consecutivas de un estándar (CV)
Finalmente, lo que uno obtiene es el cromatograma, el cual es un registro grafico de la
inyección de la muestra. Este cromatograma nos entregará la complejidad de la muestra
ya que, si tenemos un cromatograma de dos peaks versus uno de tres peaks, entonces
tendremos que el segundo va a ser una muestra más compleja que el primero. Con el
cromatograma se puede conocer la identidad de un analito o puedo hacer un análisis
de tipo cuantitativo comparándolo con un estándar para así lograr cuantificarlo. Ahora
las características y calidad del sistema cromatográfico se va a medir a través de los
parámetros cromatográficos anteriormente mencionados, específicamente, la
resolución, el factor de cola y tambien se mide bastante la eficiencia, además una cosa
muy importante son las inyecciones consecutivas de un estándar. Los métodos que son
de farmacopea son métodos que vienen validados, es decir, no tenemos que hacer una
validación ni tenemos que hacer un desarrollo en el laboratorio porque nos dice que se
usa tal columna, tal fase móvil y se eleva a tal longitud. Entonces lo que se realiza es
reproducir lo que dice la farmacopea en el laboratorio. Ahora si la columna que tenemos
no es exactamente la que tenemos, entonces lo que realizamos es montar el sistema
cromatográfico y medimos la resolución, el factor de cola y lo comparamos al valor que
dice en farmacopea. Así veremos si cumple o no cumple los valores de la farmacopea.
Tambien la farmacopea nos va a dar el coeficiente de variación para inyecciones
consecutivas del estándar que no deben ser mayor normalmente a un 2%, entonces lo
que uno hace es preparar el estándar, lo inyectamos 5 veces consecutivas, calculamos
el promedio, luego la desviación estándar para sacar el coeficiente de variación y así
vemos si cumple con lo indicado en la farmacopea. El coeficiente de variación es
simplemente la desviación estándar partida por el promedio y multiplicada por 100. Así
entonces para determinar la característica y calidad del sistema cromatográfico se
utiliza la resolución, el factor de cola, la eficiencia y las inyecciones consecutivas de un
estándar.
Acá tenemos dos cromatogramas, en el de la
izquierda tenemos el extracto de una planta,
las cuales tienen muchos constituyentes que
normalmente dan cromatogramas complejos y
el de la derecha un cromatograma de un
medicamento con dos PA que nos da un
cromatograma más simple. Los productos
farmacéuticos en general se consideran
muestras simples porque no tienen una gran cantidad de componentes y la matriz que
lo acompaña tampoco es tan complicada ya que son los excipientes farmacéuticos. En
cambio si estamos trabajando con una muestra de origen animal, si necesitamos saber
la cantidad de residuos de antibióticos que hay en una carne de cerdo porque tenemos
que certificar que no sobrepase ciertos limites para poder utilizarlos en consumo
humano, obviamente esa carne de cerdo tiene una complejidad mucho más grande que
un comprimido de aspirina. Los extractos de plantas tambien, ya que hay que hacer
extracciones mucho más largas y más complejas que hacer una extracción de un
principio activo de un producto farmacéutico. Imaginemos que tenemos un jarabe super
simple de analizar, el cual sacamos una alícuota, hacemos una dilución, llevamos al
bortex, realizamos una filtración y sería todo. En un comprimido trituramos, disolvemos,
según propiedades fisicoquímicas en que solvente va a ser soluble, lo llevamos al
bortex, al ultrasonido, hacemos una filtración o lo llevamos a la centrifuga, entonces las
etapas son mucho más simples que por ejemplo un extracto de una planta o un
alimento. Así para concluir tenemos que los parámetros cromatográficos nos dan una
indicación de la calidad de el sistema cromatográfico, realizamos un método en el
laboratorio, calculamos los parámetros cromatográficos, si vemos que la resolución no
es muy buena, entonces realizaremos acciones para mejorar la resolución, si vemos
que el factor de cola sobrepasa los límites tengo que hacer acciones para mejorar ese
factor de cola hasta optimizarlo y una vez optimizado lo podemos utilizar para hacer
análisis cualitativo y cuantitativo.
 MECANISMOS CROMATOGRAFICOS

En está clase vamos a ver los mecanismos de separación cromatográfica, el objetivo

es que nosotros comprendamos cuales son los mecanismos más importantes,
entendemos las diferencias de ellos y para que tipo de muestras son útiles.
- Adsorción
- Reparto
- Exclusión
- Intercambio Iónico
*Los mecanismos mas importantes que veremos en está clase son la adsorción, el
reparto, la exclusión y el intercambio iónico.
ADSORCIÓN
Características
- Fenómeno de Superficie
- FM gas o líquido
- FE sólido, principalmente silicona gel
- Principalmente para compuestos polares
- Competencia por la FE entre la FM y el analito
*Vamos a comenzar con la adsorción, este se caracteriza por ser un fenómeno de
superficie, ocurre en la superficie de la fase estacionaria, la fase móvil puede ser un gas
o un líquido, la fase estacionaria es un sólido, principalmente la Silica gel, la cual tiene
características de ser altamente polar por lo tanto este tipo de mecanismos es para
compuestos polares, y ocurre una competencia por la fase
estacionaria entre la fase móvil y el analito.
Interacciones
- Puente hidrogeno
- Dipolo-Dipolo
- Complejos de transferencia de carga
*Las interacciones que se producen en esta superficie
pueden ser puente hidrogeno, dipolo-dipolo o pueden ser complejos
de transferencia de carga. Abajo podemos ver la figura de este
soluto que se adsorbe en la superficie de la Silica gel y se ve
tambien la competencia entre la fase móvil y el analito por la fase
estacionaria.
Fases estacionarias
- Silica Gel
- Alúmina
- Carbonato de Calcio Polares
- Silicato de Magnesio
*Acá vemos las fases estacionarias que se pueden utilizar en cromatografía de
adsorción y la más importante de todas es la Silica Gel. Ahora cual es la característica
de todas estas fases estacionarias, es su polaridad, por lo tanto, se utilizan para
separación de analitos polares.
Silica Gel
- Silanoles (Si-OH)
- Siloxano (Si-O-Si) Activación
- Uniones Puente de Hidrogeno.

*Ahora la Silica gel tiene en su superficie grupos

silanoles, uniones puente de hidrogeno y uniones tipo
siloxano. Estos grupos presentan diferente fuerza de
interacción con el analito y los más activos son los
silanoles. Esos como son tan activos van a atraer agua,
humedad del ambiente, por lo tanto, la Silica gel siempre
cuando uno la va a utilizar debe activarla y eso quiere
decir que debe secarla para eliminar esas capas de agua que captan los grupos
silanoles y que la harían inactiva. Esto se hace principalmente en cromatografía en capa
fina, en las placas de Silica gel que uno las pone en la estufa y después las utiliza para
hacer la separación cromatográfica. Arriba tenemos un esquema en que tiene el relleno
Silica gel con los grupos que interaccionan con el analito.
Fases Moviles
-GS: Nitrógeno, Helio, Argón, hidrogeno.
-LS: Mezcla de solventes, serie elutrópica
*Las fases móviles en cromatografía de adsorción puede ser un gas en cromatografía
de gases o líquidos en cromatografía de líquidos, ahí va a depender el gas del tipo de
detector y en el liquido va a depender del solvente que utilicemos según los analitos
que se están analizando.
REPARTO
Características
- Separación por Solubilidad
- FE Liquido, principalmente fases enlazadas o unidas por HPLC
- FM gas o liquido (Mezclas solventes polares o apolares)
*El segundo mecanismo de separación es el reparto, en que sus características están
que la separación se debe a la solubilidad de los analíticos. La fase estacionario es un
liquido y lo que se utiliza principalmente son las fases enlazadas o unidas que a
continuación van a explicar lo que quieren decir. La fase movil puede ser un gas o un
líquido, por lo tanto puede ser en cromatografía de gases o de líquidos.
Fases Estacionarias
- Líquidos inmiscibles con la FM
- Fase enlazadas o unidas: unión
química de la Silica gel (Soporte
solido) con la FE (Liquido)
*Las fases estacionares en este caso
corresponden a líquidos que son
inmiscibles con la fase móvil, lo que se usa
en la actualidad son las fases enlazadas o
unidas en que hay una unión química de la
Silica gel que participa como un soporte con la fase
estacionaria que es un líquido. Ósea lo que pasa es que
en principio estas columnas se rellenaban con un relleno
solido que son pequeñas esferitas y se recubría con esta
fase estacionaria, porque no puede ser el relleno
completo de la fase estacionaria, es por eso que se
ponían estas esferas recubiertas con la fase estacionaria
que eran las que interaccionaban con el analito. Ahora
estas fases así no eran muy estables, se perdían
fácilmente, entonces lo que se hizo es poner un relleno sólido, un soporte y para esto
se utilizó la Silica gel para recubrir el interior de la columna y sobre esta Silica gel se
hace una reacción química con la fase estacionaria y así se crean estas fases enlazadas
o unidas, que son obviamente mucho más estables que las otras fases. Acá tenemos
esquemáticamente como esta el soluto disuelto en la fase móvil que es liquida y que
esta unida a un soporte solido que generalmente es la Silica gel
Fases Unidas
- Unión Éter: Si-OR Apolar: C-8, C-18
- Union Amino: Si-NR2 Polar : Ciano, amino
- Union Carbono: Si-CR3 Diol, nitrofenil
- Unión Siloxano: Si-O-Si-R3
R
Si O Si R

R
*Estas fases unidas pueden ser una unión de tipo Eter, amino, carbono o siloxano. La
mas utilizada es la Siloxano.
Aquí tenemos esquematizado una unión de tipo Siloxano y el R corresponde a
diferentes cadenas que se introducen al sistema, logrando así una fase estacionaria de
mayor o menor polaridad. Así estas fases enlazadas se pueden clasificar en apolares
por ejemplo si este R son una cadena hidrocarbonada de 8 o 18 carbonos que se
esquematiza en el dibujo o pueden ser polares por ejemplo si tenemos una unión de
tipo Ciano, amino, diol o nitrofenol. Entonces hay cromatografía de reparto que pueden
ser de tipo polar o tipo apolar, cual usaremos va dependiendo de las características de
mi analito, el analito siempre debe tener características similar a la fase estacionaria
para que se pueda retener.
Fases móviles
- Solventes Polares (Fase Reversa): Agua y tampones, más modificador orgánico.
- Solventes Apolares (Fase Normal): Hexano, más modificadores orgánicos.
*Como fase movil se pueden utilizar solventes polares y solventes apolares. Si estamos
trabajando en cromatografía de reparto en fase reversa en que la fase estacionaria va
a ser apolar, el disolvente obviamente tiene que ser más polar, así en este caso se usa
una mezcla de agua o un tampón que seria una fase acuosa más algún modificador
orgánico como metanol o acetonitrilo. En caso de que estemos trabajando en
cromatografía de reparto en fase normal por ejemplo con una fase estacionaria amino,
Ciano o diol, se utilizara un solvente más apolar y que puede ser por ejemplo el hexano
con algún modificador orgánico como el metanol o el acetonitrilo para darle más
selectividad al sistema.
Tipo Cromatografía de Reparto
- Fase Normal: FE polar, FM menos polar
- Fase Reversa: FE apolar, FM más polar
*La cromatografía de reparto de fase normal se va a utilizar para analitos obviamente
que tengan polaridad para que puedan interaccionar con la fase estacionaria y la fase
reversa se va a utilizar para los semi polares y los no polares.
EXCLUSIÓN
Características
- Separación por diferencia de tamaño
- FE solido, geles
- FM líquido, solventes orgánicos o
tampones.
*Luego pasamos al mecanismo por
exclusión donde esté se utiliza para
separación de moléculas grandes. Es una
separación por diferencia de tamaño, la fase
estacionaria es un sólido, son partículas
formadas por geles de mayor o menor grado de entrecruzamiento, el cual les dará las
características a las fases estacionarias. Las partículas de las fases estacionaria son
esféricas, son porosas, entonces cuando se humectan con la fase móvil pierden su
forma rígida y se transforman en un gel. Estos geles mantienen los poros como una
esponjita y del diámetro de este poro va a depender la exclusión de los solutos. Si el
analito es capaz de entrar en el poro, va a depender del tamaño si entra más o menos
quedándose más retenido. Así entonces según el tamaño y lo que logre entrar va a
hacer la separación. La fase estacionaria son geles, mientras
que la fase móvil van a ser líquidos que vamos a tener un
solvente orgánico o un tampón.
Fases Estacionarias
- Geles blandos, semirrígidos o rígidos.
*Aqui tenemos que la fase estacionaria son los geles que
pueden ser blandos, semirrígidos y rígidos. Los más utilizados
son los semirrígidos porque resisten las altas presiones de un
sistema como por ejemplo de HPLC y tienen una buena
calidad de separación. Aca se ve un esquema de como los
analitos van pasando por esta fase estacionaria, metiéndose a
estos poritos y ahí separándose. Si el analito tiene un tamaño de
particula muy grande y no es capaz de entrar a los poros
obviamente va a eludir con el tiempo muerto y por el contrario si
se mete muy adentro del poro va a quedar totalmente retenido,
por lo tanto, la separación efectiva va a ser entre los que quedan
como entre medio de estos poritos que entran un poco, no hasta el fondo total porque
esos no van a salir y así se va produciendo su separación.
Fases Móviles
- Solventes Orgánicos (Apolar): Tetrahidrofurano
- Tampones (Polar)
*Las fases móviles pueden ser un solvente orgánico cuando el analito es soluble en un
solvente apolar o pueden ser un tampón cuando el analito es soluble en un medio
acuoso.
Tipos de Cromatografía de Exclusión
Permeación de Geles: Analitos solubles en solventes orgánicos
Filtración de Geles: Analitos solubles en solventes acuosos.
*Así existe la cromatografía de permeación en geles para analitos solubles en solventes
orgánicos y filtración en geles para analitos solubles en solventes acuosos. Entonces
depende de las características fisicoquímicas del analito, cual de estos dos tipos de
cromatografía de exclusión va a ser. Ahora la cromatografía de exclusión es para
compuestos con pesos moleculares grandes, es decir, no es para compuestos que tiene
3 nucleos aromáticos porque ese no es un compuesto con un peso molecular grande.
Un ejemplo podría ser una proteína, ese es un compuesto grande que se puede realizar
por este mecanismo.
INTERCAMBIO IONICO
Características:
- Separación por interacción iónica entre FE iónica y analito iónico de signo
opuesto
- FE sólida, resinas de intercambio iónico
- FM liquida (iónica), tampones.
- Competencia por la FE entre la FM y el analito.
El ultimo mecanismo es el intercambio iónico, como su nombre lo indica es para
moléculas con cargas. Aca se produce una separación por una interacción iónica entre
la fase estacionaria que tambien es iónica y el analito que va a tener una carga opuesta
a la FE y así puede producirse esta retención. La fase estacionaria es solida y van a
hacer resinas de intercambio iónico que van a tener estos grupos con carga iónica para
interaccionar con el analito de carga opuesta y la FM tambien es iónica, que se utiliza
en este caso tampones. Se va a producir una competencia por la FE entre la FM y el
Analito.
Fases Estacionarias
Resinas de intercambio iónico:
- Matriz (Sílice o Polímeros)
- Grupos funcionales con carga aniónica
o catiónica

*Aquí se ve la fase estacionaria, las cuales son

resinas de intercambio iónico, en que hay una
matriz adherida a su superficie estos grupos funcionales que
pueden tener carga aniónica o catiónica. Acá se ve un ejemplo
esquemático en que una separación cromatográfica de un
analito cargado va a interaccionar con la FE con carga opuesta
y así se va a producir está separación.

Fases Móviles
- Tampones con modificadores Orgánicos
*La fase móvil tambien es un tampón porque el tampón va a tener la carga, va a tener
tambien modificador orgánico para poder mejorar y darle selectividad al proceso.

Tipos Cromatografía I.O

- Aniónico
- Catiónico
*Así tenemos cromatografía de
intercambio iónico de tipo aniónico y de
tipo catiónico. Acá vemos un ejemplo de
como se va separando una mezcla de
analitos que tienen carga en una columna
que tiene carga.
 *Aquí para concluir al final
tenemos los 4 tipos de
mecanismos
cromatográficos, tenemos
el primero de analito
adsorbido en la superficie,
el segundo el que va a ser
un fenómeno de tipo
solubilidad, el tercero es
donde hay interacción
iónica para analitos
netamente con carga y el
ultimo es para analitos de
tamaños moleculares
grandes. Entonces acá es
fácil seleccionar
dependiendo del tipo de muestra cual va a ser el tipo de separación que se va a producir.
Hay analitos que pueden hacerse por cromatografía de reparto, que son polares en fase
normal o que se pueden hacer por cromatografía de adsorción, los dos mecanismos
serian adecuados.
ELECCIÓN DEL SISTEMA CROMATOGRÁFICO
*Cuando uno tiene que elegir un sistema
cromatográfico que es lo que le vamos a pedir al
final de este módulo, nosotros tenemos que a partir
del ejemplo de una muestra y nosotros vamos a
tener que seleccionar un sistema cromatográfico y
tenemos que fijarnos en que tipo de muestras hay,
cuales son los analitos que tienen y ver por
ejemplo, si son volátiles, volátiles no es que sean
volátiles netamente a temperatura ambiente
porque en cromatografía de gases se usa la temperatura, pero que se puedan volatilizar
con temperatura. Entonces si se pueden volatilizar vamos a utilizar cromatografía de
gas, esto también es para analitos con pesos moleculares no muy grandes, analitos que
no son ionizados, no sirve para sales, por ejemplo. Si no son volátiles vamos a utilizar
cromatografía de líquidos. Si tienen un peso molecular mayor 30.000 daltons voy a
utilizar cromatografía de permeación o filtración en gel y si tiene un peso menor se va a
utilizar cromatografía de líquidos. Entonces dependiendo de las características vamos
a ir primero seleccionando si es cromatografía de gas o liquido y de ahi viendo que
sistema elegir.
 CROMATOGRAFIA PLANAR (TLC)
*La cromatografía planar (TLC) es otro método de separación por migración diferencial
de los analitos que se separan o se reparten entre una fase móvil y una fase
estacionaria.
Definición
1. Tipo de Cromatografía
2. La fase estacionaria se encuentra esparcida sobre una superficie plana y
delgada
3. La separación ocurre por migración diferencial de los analitos de una mezcla
entre la fase móvil y la fase estacionaria.
4. Técnica cromatográfica ampliamente usada como método costo-efectivo para
análisis rápidos de mezclas simples (test de sustancias relacionadas, prueba de
identidad).
La característica principal de la cromatografía planar es que se trata de una técnica
analítica bastante rápida, sencilla, en la cual la fase estacionaria esta distribuida como
una película sobre una superficie plana con un determinado espesor y que puede ser
soportada sobre esta superficie constituida de vidrio o papel. Permite por lo tanto el
análisis tanto cualitativo de los compuestos determinando el grado de pureza de una
mezcla de compuestos principalmente. El mecanismo cromatográfico predominante en
este tipo de cromatografía es la adsorción, debido a que la fase estacionaria, es una
fase estacionaria polar de Silica y que por lo tanto entonces va a permitir la verificación
de la separación a través de esta adsorción sobre esta capa de fase estacionaria polar.
Es una técnica que en general es bastante utilizada porque permite análisis rápidos,
permitiendo que se analice tanto la muestra como los estándares. Es por eso que en
las farmacopeas cuando se solicita el test de sustancias relacionadas o pruebas de
identidad se llevan a cabo a través de esta técnica analítica cromatográfica.
Mecanismo Cromatografico: Adsorción
TIPOS
TLC: Cromatografía Plana clásica
v/s
HPTLC: Cromatografía Plana Instrumental
1. Poder de separación superior
2. Uso material de recubrimiento optimizado
3. Modernos procedimientos para alimentación de la fase móvil
4. Acondicionamiento de la FE
5. Aplicación de muestra optimizada
*Tenemos dos tipos de cromatografía planar, la clásica o TLC y la planar instrumental
o HPTLC. Respecto a sus características, es un poder de separación superior, se utiliza
un material de recubrimiento que es optimizado, esta Silica que se deposita sobre la
superficie de vidrio o de papel puede hacerse por métodos automatizados que permiten
una autoiniciación de este recubrimiento y por otro lado tambien modernos metodos
para el suministro de la fase móvil, acondicionamiento de la FE y aplicación de muestra
optimizado, en este caso como ejemplo con ayuda de un gas como nitrógeno, eso es
en el caso de la HPTLC.
ETAPAS
1. Siembra: Introducción de la muestra
2. Desarrollo: Separación de los analitos
3. Revelado: Corresponde a la Detección
4. Tratamiento de Datos:
• A. Cualitativo
• A. Cuantitativo
*El proceso cromatográfico en cromatografía planar tiene 3 etapas. La primera etapa de
siembra que corresponde a la introducción de la muestra, una etapa de desarrollo donde
ocurre la separación de los analitos o cromatografía propiamente tal y una etapa de
revelado que corresponde a la detección de estos analitos. De tal manera que una vez
concluida la etapa de detección o todo el proceso cromatográfico, vamos a poder hacer
una interpretación de estos datos a través de un análisis que puede ser cualitativo o
cuantitativo.
SIEMBRA
*Se puede apreciar el TLC donde se
muestra la placa que con ayuda de un
aplicador se van depositando cantidades
muy pequeñas disueltas de la muestra en
un solvente volátil sobre esta capa de
fase estacionaria, en este caso una
clásica placa cromatográfica de Silica
gel. Lo mismo hay en la segunda foto de
TLC donde en medio de la foto se ve separada o se han
trazado distintos carriles para la placa y para cada muestra
entonces va a tener su propio carril donde se va a generar está
separación de los analitos que están contenidos en la muestra.
Del mismo modo podemos ver fotografías respecto del
sistema de aplicación neumático ayudado con gas como
nitrógeno que permite que a través de esa presión de gas de nitrógeno se vaya
empujando esta jeringa en forma automática que va a ir depositando mililitros
exactamente medidos de la muestra y de los estándares sobre las distintas posiciones
de está placa. Lo ideal es que al ser aplicadas las muestras o depositadas las muestras
sobre la placa, se encuentren todas mas menos a la misma distancia, que se depositen
simultáneamente tanto la muestra como el estándar y que por lo tanto se pueda realizar
un barrido simultaneo de muestra y estándar y de esa manera optimizar el tiempo de la
separación cromatográfica. Obviamente la cantidad de muestra depositada debe ser
muy pequeña para que no se produzcan deformaciones del analito cuando se verifique
la separación. Por eso entonces entre cada punto de aplicación hay que dejar un
pequeño espacio como el de la foto.
*Otra representación de la aplicación de la muestra
nos deja ver la placa representada ahi con su capa
de Silica, una zona de concentración que es donde
se depositan las muestras, en ese lugar están
aplicadas deliberadamente, es decir, al azar. Se
trato de hacer de alguna manera un poco mas
ordenada en la imagen superior derecha pero no se
nota. Luego que se desarrolla la cromatografía
vemos como los distintos analitos que se sembraron
fueron separados entonces de acuerdo a su afinidad
o no por esta capa de Silica presente.
Desarrollo
Respecto a la segunda etapa de la
cromatografía o el desarrollo cromatográfico
propiamente tal, este desarrollo se realiza tal
como lo vemos en la fotografía en cámaras de
desarrollo que pueden ser verticales como la
que aparece en la imagen o bien cámaras
horizontales, en cualquiera de los dos casos
son cámaras herméticas donde se produce
entonces el deposito de la fase móvil abajo de
la cámara de desarrollo. Hay una delgada
fase móvil que se ha introducido en esta
cámara de desarrollo que permite entonces
que una vez que se inserta dentro de la cámara de desarrollo comienza a producirse la
ascensión por capilaridad de esta fase móvil a través de la capa y por lo tanto va a ir
separando entonces los distintos analitos según su afinidad con la fase estacionaria.
CARACTERÍSTICAS
Coexistencia de tres fases:
1.Líquida
2.Sólida (FE)
3.Gas
*De manera que dentro de esta cámara de desarrollo vamos a tener la
coexistencia de 3 tipos de fases o estados. En general para la fase móvil,
vamos a tener la fase móvil liquida en el fondo de la cámara de desarrollo o
gas de esta fase móvil (Mas correcto es decir vapores de la fase móvil). La
tercera fase solida corresponde a la fase estacionaria
Desarrollo
(vertical u horizontal)
Tres tipos:
1.Ascendente (capilaridad)
2.Descendente (gravedad)
3.Circular (capilaridad radial)
*El desarrollo cromatográfico puede ser en forma vertical u horizontal y los tipos de
desarrollo pueden ser ascendente por capilaridad que es el más ampliamente utilizado,
descendente, en ese caso la fase móvil está arriba de la cámara de desarrollo y por
gravedad entonces desciende a través de está capa de Silica dispuesta sobre el vidrio
y otra posibilidad es que sea un desarrollo circular o por capilaridad radial. Eso se
verifica generalmente sobre placas o cámaras de desarrollo de tipo horizontales
*Acá tenemos otra representación de la cámara
de desarrollo donde vemos la placa
cromatográfica dispuesta en forma diagonal
sumergida en la zona de concentración o borde
inferior en la fase móvil o eluyente. La diferencia
entre ambos sistemas, ambos son herméticos y
podemos ver puntos amarillos que representan
los vapores del solventes. Si nos fijamos en el
lado B existe el papel filtro azul que está adherido
a las paredes de la cámara de desarrollo de
manera de permitir que ese mismo papel filtro se
empape en la fase móvil, permitiendo una mayor
saturación con los vapores de la fase móvil, eso
permite a su vez una cromatografía mas
eficiente, porque mayor saturación con fase móvil
y tambien mayor rapidez en un análisis.
*En este desarrollo lo que se espera siempre es que la fase móvil ascienda por
capilaridad hasta ¾ de la capa. Entonces cuando vemos que se ha humedecido la capa
de Silica hasta las ¾ partes, lo retiramos y lo dejamos debajo de una campana de
extracción para que se volatilicen nuevamente los restos de solventes.
Revelado Químico
1. Inmersión
2. Aspersión
*Una vez que se ha extraído entonces, viene la etapa de revelado o
de detección propiamente tal. Para esta detección se puede realizar
por métodos químicos, metodos físicos y metodos biológicos.
Clásicamente dentro de los métodos químicos se utilizan ya sea por
inmersión como la de arriba donde se coloca la placa en el dispositivo
que desciende y es introducida en una solución que contiene el
reactivo de revelado. La otra alternativa es por aspersión con ayuda
de un motor de aire comprimido, lo que se hace es aspersar, es decir,
genera un spray del reactivo que esta contenido dentro de este matraz
y se aspersa o rocía toda la placa cromatográfica para que se
produzca la reacción química y se puedan observar la separación de los distintos
analitos contenidos en la muestra.
Revelado Físico
- TLC
- HPTLC
*En el revelado Físico puede haber dos alternativas,
en que las placas cromatográficas contengan la
propia Silica gel, un indicador fluorescente que
permite entonces, observar aquellos analitos que
son activos a la luz ultravioleta cuando se observa
esta placa en estas cámaras que se encuentran en la imagen. De manera que se
observa el visor donde se selecciona la longitud de onda, 254 nm, y entonces se va a
producir la emisión de luz ultravioleta y vamos a evidenciar la posición en donde se
encuentra cada uno de los analitos. La otra alternativa es que los propios analitos
puedan ser asperzados con un reactivo que generé fluorescencia desde el propio
analito y en ese caso lo podemos observar al visible sin necesidad de utilizar una
cámara ultravioleta para observar la separación de los compuestos.

CUALITATIVA: cálculo de RF

*Respecto al tratamiento de datos, obviamente hay un

tratamiento de datos o análisis cualitativo y acá lo que se
realiza es calcular los factores de retardo o Rf.
Si graficamos tal como indica la diapositiva, la placa
cromatográfica acá a la izquierda, observamos el punto
de partida que está en el borde inferior y vemos el trazo
a que corresponde al avance del solvente que se le llama
frente del solvente. Esto se marca una vez que termine el
desarrollo. Se marca en la placa cromatográfica hasta
donde sube el solvente y por otra parte se marca hasta
donde sube la sustancia (Cuanto avanza la sustancia).
De manera que el factor de retardo se calcula por la relación entre la distancia que
recorre la sustancia partido por la distancia que recorre el solvente. Típicamente los
valores van a fluctuar entre cero y uno. Cuando es un sector cercano a 0 indica que el
analito no migra porque queda en el punto de partida y cuando el factor de retardo es
muy cercano o igual a uno indica que el analito no se retuvo, es decir, no quedo en el
desarrollo cromatográfico, no hubo interacción del analito con la fase estacionaria y por
lo tanto eluyo al mismo tiempo que el solvente. Ahora como en la placa se inyectan o
se siembran analitos en muestra simultáneamente lo que se hace entonces es calcular
sus factores de retardo y luego comparar. De esa forma vamos a poder identificar si se
trata o no del estándar que estamos sembrando simultáneamente para llegar a la
identificación del compuesto.
Tratamiento datos: cuantitativo
✓ Extracción de la capa fina con la mancha por medios mecánicos
✓ Elución del analitocon solvente adecuado
✓ Aplicación de técnica analítica cuantitativa:
-interpolación en curva de calibración
-comparación con estándar de (c) conocida
*En cuanto al análisis cuantitativo, lo que se hace normalmente es que se extrae de la
capa fina la mancha por medios mecánicos como es la gran etapa del Silica gel que
puede extraer entonces este punto donde está el analito, se extrae a través de un
solvente adecuado y luego se cuantifica a través de una técnica analítica cuantitativa
apropiada a través de la interpolación en una curva de calibración o bien comparando
con un estándar de concentración conocida.
Análisis cuantitativo
*Otra alternativa es que utilicemos métodos
automatizados, en que podemos tener
inmediatamente el despliegue de lo que es el
cromatograma donde está la intensidad de
fluorescencia versus el tiempo y tambien
podemos ver por ejemplo un arreglo de diodos,
utilizar un detector de arreglo de diodos para
observar si es que hay otros compuestos en cada
pico cromatográfico, si solamente son
compuestos puros o mezclas de compuestos o
quizá compuestos y sus impurezas. Nos permiten tambien los metodos automatizados
trazar la curva de calibración correspondiente y aquí si es señal versus concentración y
obtenemos de esa manera la cuantitativa o cantidad del analito que estamos
investigando.
Optimización
Uso de mezclas de solventes.
Gradientes de solventes (programas)
Fases estacionarias menor tamaño
Cámaras pequeñas, mejor equilibrio
*¿Como se puede optimizar esta cromatografía? A través del uso de solventes, mezclas
de solventes, a través del uso de gradientes de solventes donde se pueden elaborar
programas de elución, cambiando por fases estacionarias de menor tamaño que
permitan mayor eficiencia o bien utilizando cámaras mas pequeñas de desarrollo que
permitan mejores equilibrios.
Ventajas
▪ Análisis simultáneo de muestras y patrones
▪ Pocos problemas de matriz, la placa se usa solo una vez
▪ Optimización selectiva para componentes específicos
▪ Mínima cantidad de solventes
▪ Detección flexible y múltiple
*Existe tambien la posibilidad del desarrollo bidimensional, pero consiste en que cuando
tenemos analitos difíciles de separar, hacemos un primer desarrollo con un tipo de
solvente y luego ese mismo desarrollo cromatográfico, invertimos o giramos la placa en
90°, esa primera separación o separación preliminar nos sirve como punto de siembra
y utilizamos un nuevo solvente obviamente en otra nueva cámara de desarrollo y
hacemos una segunda cromatografía sin necesidad de hacer una nueva siembra o
aplicación. De esa manera podemos discriminar y separar mezclas que son a priori
mucho más complejas de determinar
HPTLC: Cromatografía Planar Instrumental
Ventajas:
1. Promueve alta eficiencia de separación.
2. Tiempos de análisis más breves.
3. Menores cantidades de fase móvil.
4. Adquisición y procesamiento de datos más eficiente.
*La siembra es mucho más automatizada, no se requiere tanta operación
manual de parte del usuario, se le llama tambien cromatografía en capa fina
de alto rendimiento. En el fondo se trata de una mejora o adaptación de la
TLC con la automatización de las 3 distintas etapas que vimos. Esto permite
mayor reproducibilidad de los análisis, mayor resolución, mayor eficiencia y
un análisis cuantitativo mucho mas preciso y exacto, por otra parte, tiempos
de análisis mas breves en que si uno calcula la aplicación de la siembra podría
eventualmente barrer hasta 35 muestras en una placa de 20x20.
*Acá vemos un ejemplo
donde podemos apreciar una
separación de antraquinona
donde tienen dos tipos de
fase estacionaria que se
utilizaron. Una es ADAMANT y
la otra Nano-ADAMANT, la
diferencia es el tamaño de
partícula de la fase
estacionaria es mucho más
pequeña, del tamaño del nm.
Al ser más pequeño el tamaño
de partículas, los picos son
más eficientes. Observamos una mejor separación entre 3-4, 5-6 y el
compuesto 7 que está mucho mejor definido.
*La desventaje de la TLC es que es muy afectada por las condiciones
ambientales, es decir, si tenemos un día muy húmedo y estamos haciendo un
análisis en el laboratorio, si lo realizamos en otro día mejor vamos a tener un
resultado mas real. En cambio el HPTLC todo es en sistema cerrado por tanto
no hay influencia de los factores ambientales.
 ANALISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO EN CROMATOGRAFÍA
*En está clase veremos cómo realizar un análisis cualitativo y cuantitativo, la idea es que al finalizar
esta sección debemos ser capaces de comprender como hacer un análisis cualitativo, es decir, como
identificar un compuesto por medio de la cromatografía y tambien hacer el análisis cuantitativo, por
ejemplo, de un principio activo en un producto farmacéutico determinar la cantidad que hay en mg que
hay en un comprimido que es la concentración de un medicamento en un líquido biológico como puede
ser la sangre. Vamos a ver distintos métodos y lo importante es que seamos capaces de seleccionar
según el objetivo del análisis, cual sería el método mas adecuado y tambien en un ejercicio aplicar
todos estos conocimientos para poder llegar a un calculo final. Aquí tambien vamos a utilizar los
conocimientos que ya adquirimos en análisis instrumental relativos a aplicar los factores de dilución
para poder obtener los contenidos o una concentración final.
ANALISIS CUALITATIVO
Retención
- tR - t R´
- Correlación con la estructura (series homólogas)
- Datos bibliográficos
*En relación con el análisis cualitativo, lo principal que se
realiza es hacer una comparación del tiempo de retención del
analito que estamos identificando con el tiempo de retención
de un estándar de referencia certificado de ese analito. Ahora hay que tener en consideración que
cuando uno hace este tipo de identificaciones es porque ya mas o menos sabemos que tenemos, por
ejemplo, cuando hacemos un análisis de farmacopea de un excipiente o un principio activo para la
fabricación de un comprimido estoy haciendo un control de calidad, obviamente compramos un lote
de ese producto y ya sabemos lo que tenemos y luego realizamos un análisis cromatográfico para
comprobar identidad y composición y así podemos hacer esa comparación con el tiempo de retención.
Pero supongamos que tenemos una orina de un deportista y tenemos que ver si el deportista se tomó
alguna sustancia ilícita para mejorar su rendimiento deportivo, hay que considerar que hay muchos
compuestos que tienen el mismo tiempo de retención, por lo tanto, de un compuesto desconocido
solamente por comparación del tiempo de retención es muy dificil hacer una identificación. Para este
tipo de análisis uno tiene que incorporar otras técnicas como la espectrometría de masas que sí me
va a permitir hacer una identidad del compuesto. Ahora en el análisis farmacéutico propiamente tal en
que uno sabe lo que tiene, pero tiene que comprobar la calidad y la identidad es más fácil y si se puede
hacer por estos métodos de comparación de los tiempos de retención. En el segundo punto en cuanto
a la correlación con la estructura, esto se puede hacer para series homologas y bueno comparar con
datos bibliográficos es un poco más riesgoso porque hay que tener en cuenta que hay que tener
exactamente las mismas condiciones cromatográficas, pero en ciertos casos tambien se puede
realizar.
Recarga
Principalmente para mezclas complejas
*Otra forma de comprobar la identidad que es
super simple y se denomina recarga. Esto
generalmente se hace para muestras
complejas de muchos componentes, en el
grafico de la izquierda, en que tenemos la
muestra sola y tenemos el segundo peak,
nosotros creemos que es x compuesto. Entonces lo que se hace es a esa muestra se le agrega una
alícuota de un estándar del compuesto que creemos que es. Se pueden producir dos fenómenos, uno
es el primero, que es donde el peak del analito que creíamos que tenia aumenta en altura, entonces
ahí podemos decir que probablemente la muestra es el compuesto que creíamos, pero si aparece otro
pico pegado al peak que teníamos, demostramos que el compuesto no es lo que pensábamos que
tenia porque sale otro peak que eluye a la derecha del que teníamos y que puede estar un poco
superpuesto dejándonos claro que el compuesto que creíamos que tenía no era.
Identidad Post Elución
- Espectroscopía IR
- Espectrometría de masas
- HPLC-MS
- GC-MS
*Para realizar una identificación certera, se pueden asociar técnicas a la cromatografía luego que se
ha producido la separación cromatográfica. Entonces uno puede poner un detector acoplado a un
cromatógrafo y asi obtener una identidad absoluta del compuesto, por ejemplo, podemos utilizar una
técnica como el Infrarrojo o la espectrometría de masas, las cuales dan espectros que tienen bastante
información con varias señales, por lo tanto, eso te permite hacer una identificación del compuesto.
En la actualidad da espectrometría de masa acoplada a la cromatografía es una de las herramientas
analíticas principales para la identificación de analitos. Por ejemplo, en el servicio medico legal, se
utiliza este espectrómetro de masas para determinar causas de muerte, causas de intoxicaciones, en
el caso de los deportistas debemos tener una identificación certera del analito y para esto se puede
utilizar esta técnica. El Infrarrojo y Espectrometría de masas serán vistas en el modulo final de este
ramo.
Análisis Cuantitativo
- Altura del Pico
- Área del Pico
*Para el análisis cuantitativo lo que se hace es medir la altura del peak o el área del peak y así realizar
la cuantificación.
Métodos
- Normalización Interna
- Estándar externo
- Estándar interno
*Hay tres métodos que son los que se utilizan para hacer este análisis cuantitativo por cromatografía,
los cuales son la normalización interna, el estándar externo y el estándar interno. Es muy importante
comprender bien estos tres métodos, los sepamos utilizar, entendamos para que tipo de muestras se
usan y cual es la base de cada uno de ellos porque esto será muy aplicado en la carrera.
Normalización Interna
Fundamento:
La cantidad total de un compuesto es el porcentaje de área de él relativo al área total
Requisitos:
- Cada analito origina un pico
- Todos los analitos son eluidos
- Detector da igual respuesta a todos los analitos
*El primer método es la normalización interna, se fundamente en que la cantidad total de un compuesto
es el porcentaje del área de el relativo al área total, supongamos que tenemos una muestra que tiene
3 compuestos y para saber el porcentaje de uno de esos compuestos en la muestra lo que se hace es
sumar el área o la altura de los 3 compuestos y eso correspondería al 100% y el área del compuesto
que yo estoy determinando es el x% y ese porcentaje final seria el porcentaje de ese analito en la
muestra. Ahora para poder aplicar este método se deben cumplir ciertos requisitos, uno es que cada
analito origine un peak, es decir, no puedo tener coelución ósea que dos analitos eluyan en el mismo
tiempo de retención, otro requisito es que todos los analitos deben ser eluidos, no me puede quedar
ningún compuesto retenido en la columna y otro requisito muy importante es que el detector debe dar
una igual respuesta a todos los analitos. Esto no es muy fácil de obtener, supongamos un detector
ultravioleta, cuando uno hace un análisis por cromatografía selecciona la longitud de onda de máxima
absorción del compuesto, donde tenemos una zona de meseta para poder trabajar, obviamente todos
los compuestos no tienen la misma longitud de onda de máxima absorción, por lo tanto, el detector no
me va a dar una respuesta igual a todos los analitos, por eso este método de normalización interna se
usa principalmente en cromatografía de gases por ejemplo, con detector de ionización de llama, de
conductividad térmica y en cromatografía liquida es dificil utilizar este método.
Procedimiento
*En la ecuación vemos que el porcentaje del
compuesto es el área del compuesto dividido por
la sumatoria de las áreas y multiplicado por cien
y esto es cuando el detector da una respuesta
igual para todos los analitos. Ahora si yo aun así
necesito utilizar este método pero el detector no
me da una respuesta igual para todos los
analitos, lo que hay que hacer es incluir en la
ecuación un factor de respuesta, ese factor se
calcula haciendo una mezcla de todos los
componentes que tiene esta muestra y ahí
calculando el valor F que seria el porcentaje del compuesto en la mezcla porque yo se cuanto agregar
dividido por el área, obviamente hacer este factor de respuesta dificulta un poco el análisis y una de
las características de este método es la facilidad que tiene para hacerlo porque simplemente se aplica
una sumatoria de todas las áreas y puedo sacar el porcentaje de un compuesto en esa muestra. Otra
ventaja es que no requiere un estándar de referencia porque no comparamos con un estándar sino
que solo se aplica una sumatoria como se ve en el cromatograma y ahí podemos estimar cual es el
porcentaje de cada uno de esos compuestos en esta muestra. Como ya habíamos visto obviamente
deben cumplirse los requisitos porque si no se cumplen no se pueden usar.
Estándar Externo
Fundamento:
Comparación de área o altura de analito y estándar obtenidas por separado
Requisitos:
✓ Requiere estándar referencia
✓ Inyección reproducible
✓ Condiciones cromatográficas estables
✓ Respuesta lineal amplia del detector
✓ Matriz del estándar similar al analito
Características: Se aplica principalmente para análisis de muestras simples.
El segundo método es el estándar externo, el que se fundamenta en la comparación del área o altura
del analito y el estándar obtenidos por separado. Se realiza la inyección del estándar, luego la
inyección de la muestra y por comparación de las áreas o las alturas pueden obtener la concentración.
Una característica de este método es que se aplica principalmente para muestras principalmente
simples, eso quiere decir que no requiere un tratamiento de muestra de muchas etapas. Los requisitos
son se requiere un estándar de referencia para poder comparar lo que estamos cuantificando, otra
cosa es que necesitamos una inyección reproducible, si la inyección no es reproducible no se puede
utilizar un estándar externo. Ahora los equipos modernos por ejemplo de cromatografía de líquidos
con las válvulas de inyección, la verdad es que la inyección es bastante reproducible, de hecho el
método del estándar externo se usa más en cromatografía de líquidos que en cromatografía de gases,
además se necesitan condiciones cromatográficas estables, una respuesta lineal amplia del detector
y una matriz del estándar similar a la del analito.
Procedimiento:
*Se aplica la formula en que la concentración de la muestra va a
ser el área o la altura de la muestra partido por el área o altura del
estándar multiplicado por la concentración del estándar.
Obviamente cuando uno aplica este procedimiento, el estándar lo
inyecta según la norma de la farmacopea 5 veces y saca el
promedio y eso es lo que pone en la ecuación en la parte de abajo.
La muestra generalmente se inyecta el duplicado y luego se
multiplica por la concentración del estándar porque uno sabe a la
concentración a la cual lo preparo. Tambien se puede hacer una
interpolación en una curva de calibración que se realiza con el
estándar a concentraciones crecientes y uno ahí puede hacer la
interpolación de la muestra y obtener la concentración.
*Aquí tenemos un cromatograma realizado por el método del
estándar externo en que se ve la inyección de la muestra y la
inyección del estándar y aparece un pico cromatográfico y ahí luego
uno realiza la comparación y así puede obtener la concentración
Estándar Interno
Fundamento: Comparación de área o altura de muestra y estándar relativos a un estándar interno
Requisitos EI:
Puro
Eluir bien resuelto
No contenido en la muestra
Nivel de concentración similar al analito
Características fisicoquímicas similares al analito
Características
▪ Muy preciso
▪ Independiente del volumen inyectado
▪ Matrices complejas
Requiere estándar de referencia y estándar interno
*El tercer método corresponde al estándar interno, este método se fundamente en que la comparación
del área o altura del analito de la muestra y el estándar se hace en relativo a un estándar interno. Este
compuesto se agrega a la misma concentración tanto a la muestra como el estándar y luego se calcula
una relación o una razón de áreas y con esto lo que se hace es disminuir el error. Una de las
características de este método es que es muy preciso, al agregar este estándar interno lo que hacemos
es disminuir el error de la medición porque supongamos que estamos analizando un compuesto en
una matriz que es compleja como por ejemplo una leche materna, necesitamos saber que
concentraciones de cierto medicamento hay en esa leche materna para evitar los riesgos en el
lactante. La leche materna es un compuesto que tiene muchas grasas, proteínas, etc, ósea tiene varios
compuestos por lo tanto, yo necesito extraer mi analito de toda esta mezcla de compuestos, para lo
cual voy a tener que hacer un tratamiento de muestra de varias etapas, en cada una de las etapas del
tratamiento de muestra se puede producir una pequeña perdida de muestra y eso me va a inducir un
error en el análisis porque yo puedo partir con 100 pero puedo terminar con 90. Entonces cuando
agrego un estándar interno, lo que hago es agregarlo al inicio del tratamiento de muestra, por lo tanto,
en todas las etapas del tratamiento de muestra tambien va a estar el estándar interno y como
calculamos una razón de áreas, lo que yo pierda de estándar interno también lo voy a perder del
analito que estoy determinando por lo tanto esta razón de áreas se va a mantener, supongamos que
partimos con 100 y terminamos con 90 pero al estándar interno le va a pasar lo mismo, ya que tambien
va a producirse perdida en el. Por lo tanto como estamos calculando una relación, este error va a
disminuir y por eso este método es muy preciso, entonces el coeficiente de variacion que mide el error,
el análisis va a ser muy pequeño, va a ser independiente del volumen inyectado, por ejemplo, en
cromatografía de gas en que yo no tengo a veces una válvula de inyección a veces tenemos que
inyectar volúmenes muy chicos del orden de 1 micro litro, entonces si hacemos 5 inyecciones no
siempre vamos a inyectar 1 micro litro si lo hacemos a mano, en cromatografía de líquidos como
tenemos válvulas de inyección adosadas al sistema es mas preciso, pero en una muestra de
cromatografía de gases lo más probable es que se utilice un estándar interno principalmente para
matrices complejas. Los requisitos de los compuestos que deben cumplir para poder utilizarse como
estándar interno, lo primero es que deben estar puros, no pueden ser una mezcla de compuestos,
tienen que eluir bien resuelto, esto quiere decir que tiene que eluir separado del resto de los
componentes de la muestra, esto ingresa una dificultad analítica a mi análisis porque tenemos que ser
capaces de separar todos los componentes de la muestra y además el estándar interno. No puede
estar contenido en la muestra, esto quiere decir que no podemos tener una muestra que tenga este
estándar interno porque si no se va a sumar lo que tengo en la muestra más el estándar interno y esto
nos va a dar un error, entonces tenemos que seleccionar un analito que estemos seguros de que en
ninguna de las muestras que analicemos lo vaya a contener. El nivel de concentración tiene que ser
similar al analito que estemos analizando, no puede ser que yo ponga un estándar interno 10 veces
mas concentrado que el analito que estemos analizando, el peak nos tiene que dar con una altura
similar y el ultimo punto es el más importante, el cual es las características fisicoquímicas deben ser
similares al analito, cuando seleccionemos un analito para utilizarlo como estándar interno tenemos
que fijarnos que la solubilidad sea similar, ya vimos propiedades fisicoquímicas por lo tanto podemos
determinar la similitud fisicoquímica entre un analito y otro. Tienen que ser similares porque como nos
decía este se agrega al inicio del tratamiento de muestra, por lo tanto, todo lo que le pase al analito le
debe pasar al estándar interno, si estamos haciendo una extracción liquido-liquido no podemos poner
un estándar interno que no quede en la misma fase que mi analito, es por eso que las características
deben ser similares. Este método requiere un estándar de referencia y además un estándar interno,
eso carece el análisis pero bueno la principal característica de este método es que disminuye el error
y la variabilidad del análisis.
En el procedimiento se utiliza la formula y tambien
la curva de calibración al igual que lo vimos en el
estándar externo. Aquí en las fórmulas, vamos a
tener que la concentración de la muestra es el
área de la muestra partido por el área del estándar
interno del cromatograma de la muestra dividido
por el área del estándar partido por el área del
estándar interno que se agrega para el estándar.
Entonces acá en este procedimiento vamos a obtener al menos dos peaks correspondientes al analito
que estamos determinando y al estándar interno, entonces como se puede apreciar en la ecuación
como se calcula una relación entre el analito y el estándar interno, así entonces se disminuye el error
de la medición. Tambien se puede hacer una interpolación de una curva de calibración, en la curva de
calibración se va a graficar el área o la altura del estándar partido por el estándar interno versus la
concentración del estándar. La concentración del estándar interno no entra en los cálculos, uno
solamente sabe la concentración que lo prepara para que cumpla los requisitos del análisis pero no
entra en el cálculo.
Aqui nos muestra la explicación de esto para entenderlo mejor. Al lado
izquierdo tenemos una cuantificación sin estándar interno, supongamos
que inyectamos la muestra 5 veces y ahi tenemos los 5 valores, tenemos
el promedio, la desviación estándar y tenemos el coeficiente de variacion.
Vemos que tenemos el coeficiente de variacion cercano al 10%, si vemos
los datos apreciamos que hay bastante variabilidad. Ahora si esta misma
cuantificación la realizamos con estándar interno, hacemos todo el
tratamiento de la muestra y obtenemos la altura, son los mismos valores
y tambien obtenemos la altura del estándar interno. Si nos fijamos por
ejemplo en la primera inyección tenemos una altura de muestra de 25 y
una altura de estándar de 30 y la razón entre estos dos nos da 0,83, luego realizamos la segunda
inyección en que nos da una altura un poco superior pero el estándar interno nos da superior, entonces
tenemos un valor de 0,84 que es muy similar al anterior, entonces si sacamos el coeficiente de
variación de este conjunto de valores es bastante menor que el que obtuvimos anteriormente. Así
entonces la precisión de este método con estándar interno es bastante superior a la sin estándar
interno porque disminuyo la variabilidad disminuyendo el error del análisis.
*Aquí tenemos un ejemplo en que estamos cuantificando un
analito en una muestra, entonces realizamos la inyección 1 de la
muestra y la inyección 2, entonces lo que se hace es sacar la
división entre el área de la muestra 1 y su estándar interno y de la
inyección 2 y su estándar interno. Vamos a tener en este caso dos
valores y se trabaja con el promedio de estos dos valores, se
promedia al final. Luego tenemos el estándar y hacemos lo mismo,
en este caso estamos mostrando solo dos inyecciones, sacamos
la razón de la inyección 1 y la inyección 2 y estos son los valores
que se ponen en la ecuación. Así la concentración de la muestra
va a ser la razón de áreas de los peaks de la muestra partido por la razón de área del peak del estándar
multiplicado por la concentración del estándar que en este caso era de 1 mg/mL, así nos dará la
concentración de la muestra. Obviamente si tenemos factores de dilución involucrados los vamos a
tener que aplicar para sacar el cálculo final.
Aqui tenemos un ejemplo de una muestra que tiene dos compuestos a
analizar. A la izquierda tiene los datos de la altura de la muestra, en que
vamos a tener los datos de la inyección 1 y 2 del analito 1, luego para el
analito 2 y luego para el estándar interno. Aquí cada uno de los analitos
se procesan por separado porque son compuestos diferentes, entonces
se saca la razón de áreas del analito 1 versus el estándar interno y luego
el analito 2 versus el estándar interno. El estándar interno es el mismo,
se utiliza un estándar interno que se agrega a la muestra. Luego se
inyecta el estándar y es lo mismo, tenemos un estándar para cada uno
de los analitos con sus datos de inyecciones por separados, estos
tambien se procesan por separada, se dividen por el dato del estándar
interno y se obtiene la razón de las áreas. Abajo se ve que por ejemplo la concentración del analito 1
va a ser la razón de áreas del analito 1 del promedio de las dos inyecciones partido por la razón de
áreas del estándar de ese analito multiplicado por la concentración del estándar de ese analito
multiplicado por la concentración de ese estándar, luego el analito 2 se calcula por separado.
*Aquí se ve un cromatograma realizado por el
metodo del estandar interno, aca tenemos dos
peaks que se están analizando que seria el 1 y
el 2 y entre medio de los dos eluye en forma
separada de los dos analitos el estandar
interno que tiene una concentración similar a
esos compuestos.

CURVA DE CALIBRACIÓN
 Curva Calibración Aquí nos muestra el ejemplo de una curva de
R
calibración, en este caso es una curva con 8
9,00 valores porque esta se realizo en un líquido
y = 0,1363x + 0,0719
r2 = 0,9988
biológico. Aquí esta en el eje de las x la
6,00 concentración del estándar y en eje de las y va la
razón de áreas del estándar con su estándar
3,00 interno. Así se construye la curva de calibración y
luego se inyecta la muestra y por la ecuación de
,00
la recta se hace la interpolación y se puede
0 10 20 30 40 50 60
Concentración ug/mL obtener el calculo final.
 Cromatografía liquida
Columna: sistema cerrado.
Planar: sistema abierto.
Definición
Separación por migración diferencial de los analitos de una mezcla entre la FM y FE.
Se retienen de menor o mayor
medida según afinidad, se
produce separación.
Clásica: cómo se inició la
cromatografía liquida,
prácticamente no se usa.
HPLC: tiene picos de ancho de
base más angostos, aumenta
eficiencia de sistema.
Tamaño de partículas en relleno de FE disminuyó considerablemente. Al disminuir tamaño
de poro y al hacerlo más uniforme, se disminuye el ancho de base de los picos por aumento
de eficiencia cromatográfica.
Cromatografía líquida clásica
Clásica en la actualidad prácticamente no se usa,
se usa cuando se requiere separación
cromatográfica por intercambio iónico y exclusión.
Columnas más grandes abiertas arriba, se hace
por pipeta o micropipeta.

Separación se realiza en columnas para lo cual se

hace fluir FM percolando la columna a un flujo
controlado, se usan bombas para este propósito.
A medida que avanza FM se va produciendo
interacción de analito y su separación. En parte
baja se recibe eluyente, se separa en fracciones
según donde van saliendo analitos que se
requieren.
Continua: conectar un detector a la salida de la columna, no todos sirven, serviría un UV.
Discontinua: recolecta una de las fracciones positivas del analito y luego se hace un análisis
cuanti como una absorciometría al UV.
Cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC)
Aplicamos presión a FM para que pueda eluir por columnas con
tamaño de poro pequeño.
Dependiendo si tenemos analitos grandes o con carga, se usa
exclusión o intercambio iónico.

Sistema cromatográfico
Componentes de sistema cromatográfico.
Bomba le da presión.
Introducción de muestra son válvulas.

Esquema de equipo y foto de equipo.

Sistemas modulares, hacia arriba,
para ahorrar espacio.

Introducción de muestra
En la jeringa se toma la muestra, se introduce jeringa a válvula,
se ingresa la muestra, con la válvula se produce la inyección, se
hace un giro con válvula y muestra pasa al sistema.
Válvula tiene en su cabeza un tubo de acero inoxidable llamado
bucle o loop y que tiene un diámetro interno definido, por eso
introducción de muestra en cromatografía de liquido tiene alta
precisión, ya que tienen un volumen interno fijo, y así siempre inyecto la misma cantidad de
muestra.
Para poder introducirse en sistema, la muestra debe tener ciertas
características. Solución libre de partículas.
Error: disuelve muestra en solvente que sea soluble, ejemplo soluble en
metanol, uso metanol. Si mi FM tiene 30% de metanol, y lo disuelvo en
un 100% de metanol, se produce una competencia de interacción entre
solvente de muestra de FM y la muestra, se produce ensanchamiento de
pico. Por lo tanto, el % de modificador orgánico o del solvente de la muestra, no puede ser
mayor al % de solvente orgánico de la FM.
No puede precipitar muestra con la FM.
Se adosan los loops, hay de distinto tamaño, de 5,
10, 50, 100 microlitros, depende del análisis que
requiero. Tienen diámetro definido, siempre
inyectare lo mismo, no habrá error. Tengo que llenar
completamente volumen interno del loop, por eso se
recomienda siempre agregar una cantidad de
muestra del doble de volumen interno del loop, para
llenarlo completamente, porque lo que sobra se
elimina por tubo de deshecho, y así me aseguro de
que lleno completamente, y así estos sistemas de
inyección de válvulas de loop tienen gran precisión de introducción de muestra.
Sistema de separación
Se realiza en columnas en donde tenemos FE.
Diámetro variable, al igual que el largo.
En la actualidad hay varias columnas pequeñas, que permiten
análisis rápido con una muy buena separación.
En algunos casos es importante el punto de ebullición, cuando
aplico temperatura para optimizar
el sistema. En los sistemas
modernos las columnas vienen en
un sistema en una cajita donde hay
un horno, entonces programo la temperatura a la cual se hará
el análisis, y así puedo optimizar mediante este sistema.
Viscosidad, si FM es muy viscosa, aumenta presión del
sistema.
Viene en frasco completamente cerrado,
FM tiene solventes orgánicos que son volátiles, debe haber equilibrio
entre la fase gas y fase liquida de la FM.
Antes de poner en sistema cromatográfico, FM debe estar filtrada y
desgasificada, porque si no se puede dañar el sistema cromatográfico
con una burbuja o partícula que entre al sistema.
Ultrasonido, ebullición para desgasificarla, o filtrarla por filtros
pequeños por filtración al vacío, donde se usan unas bombas
especiales que dan presión al sistema, y así la FM puede pasar por filtros con poros de
tamaño pequeño.
 Encargadas de darle presión al sistema, y lograr que FM eluya por FE.
Hay de diferentes tipos.
Válvulas son caras, un requisito fundamental de las bombas es su
lavado después de usarlo. Cada vez que hago un análisis por
cromatografía, al terminar de lavar la bomba con agua destilada, se
usa generalmente FM como tampón, que tienen sales, y si no se lavan
pueden precipitar y tapar el sistema, y es complicado volver a destaparlo. Por eso se hace
un lavado al terminar la cromatografía de por lo menos unos 30 minutos con agua destilada
y filtrada para así mantener las válvulas en buen estado.
También son caras las columnas. Al lavar el equipo, lavo
bombas y columnas.
Se debe utilizar una pre-columna. Cuando muestras provienen
de matrices complejas, es conveniente usar pre-columnas,
que son columnas pequeñas que se ponen al inicio de las
columnas, así, cuando inyecto muestra pasa primero por pre-
columna, y luego por la columna, y si hay una partícula que
me hubiera quedado retenida irreversiblemente en columna,
me quedaría retenida de forma irreversible en la pre-columna,
porque relleno de la pre-columna es similar al de la columna
cromatográfica. Así, logro cuidar mi columna de estos analitos que se unen de forma
irreversible.
En fase normal, para reparto, tenemos FE amino, ciano y
diol. Cromatografías de partición o reparto. Análisis de
moléculas polares.
En reparto, también
están fases estacionarias
de tipo reversa, es decir,
apolares. Son para
analitos semipolares, que
son la mayoría de los
medicamentos, y analitos
apolares. La anterior, la de partición en fase normal, es
netamente para polar. Cuando son semipolares se usa
reparto en fase reversa. Las que mas se usan son C8 y
C18.
Si se requiere hacer análisis de moléculas polares se
puede usar cromatografía de adsorción, y se usa sílica
gel. Si tengo analito polar, puedo usar esta o la de
reparto en fase normal.
 FE modernas, que se usan bastante en
la actualidad, cuando se requiere
mejorar eficiencia de separación.
Una es el núcleo sólido, que tiene un
núcleo sólido, que tiene como un
soporte, y recubriendo a este va la FE.
Así, la FE cubre un diámetro bastante
mas pequeño que en una columna
microparticulada normal.
En la derecha, se ve micro sólido de color
amarillo que no interacciona con
moléculas de analito, ya que la FE va
solamente sobre la superficie del núcleo,
y esa es la que interacciona con el analito, a diferencia en microparticulada normal, donde
todo es FE, entonces hay una interacción completa del analito hasta el fondo de estas
partículas.
Otras columnas más modernas son las
monolíticas, que salieron antes del núcleo
sólido, y que también permiten aumentar la
eficiencia del sistema.
Estas columnas tienen unas barras en su
interior, todo eso es relleno. Ese relleno tiene
unos poros, en donde se va produciendo
separación cromatográfica.
En la derecha se ve una comparación del
relleno, parte superior es una monolítica, e
inferior es micropartícula normal, en la de
arriba factor de tortuosidad disminuye y se
produce un aumento de la separación cromatográfica.
Comparación de las 3 columnas, izquierda es
micropartícula normal, al centro es núcleo sólido, derecha
es una monolítica.
Abajo se ve el efecto del núcleo sólido, que como
interacción se produce en la pared, donde está la FE, se
produce una disminución del ancho de base del pico,
comparado con la derecha, la interacción se puede
producir hasta el interior, aumentando el factor de
tortuosidad.
Columnas aumentan eficiencia, son útiles cuando se
quieren separar varios analitos difíciles de separar,
entonces se requiere que el ancho de base de cada uno
de ellos sea menor para poder hacer separación.
Permiten trabajar con flujo más alto, lo que permite disminuir tiempo y costo de los análisis.
Sistema de detección
Detectores que se pueden usar. Hay detectores que son
solo para cromatografía liquida, y hay otros que son solo
para cromatografía de gas.

Índice de refracción
Primer detector. Dentro de sus características es universal,
porque índice de refracción es propiedad de todos los líquidos.
No es muy sensible, no me permite medir concentraciones
bajas.
Elución en gradiente: en una misma corrida cambio % de
modificador orgánico. Se tiene cubeta, en una parte pasa a FM
puro, y en otra es FM más analito. Cuando detector pasa la FM
con analito, habrá diferencia en índice de refracción y marca
señal. Si uso el gradiente de FM en que cambia % de FM, como
habrá cambio de modificador orgánico, detector también lo
detecta y también me da señal, por lo que no se puede usar
como elución en gradiente.
Ultravioleta
Detector más usado para análisis de productos
farmacéuticos, porque la mayoría de las estructuras
químicas de los productos farmacéuticos tienen grupos
cromóforos que son los responsables de la absorción en
UV.
Los primeros detectores de UV que aparecieron tenían
longitud de onda fija de 254 nm para hacer determinación.
En actualidad se usan con longitud de onda variable, que
tienen un monocromador donde se puede hacer selección
de longitud de onda para detección. Siempre se debe usar longitud de onda de máxima
absorción donde haya una meseta, y así se disminuye error de determinación.
 Dentro de los detectores UV hay uno con características
especiales que es el DAD. Posee una red de fotodiodos
que permite trabajar con diferentes longitudes de onda en
una misma corrida cromatográfica. En cada corrida trabajo
de 200 a 300 nm, y así me permite determinar la pureza
de los picos, no de la muestra. Pureza de los picos, si veo
espectrograma y cromatograma, puedo ver
espectrograma con longitudes diferentes de onda, puedo
determinar si en un pick hay otro pick superpuesto. Esto
es importante en estudios de estabilidad de p.a. en que
muestras se someten a degradaciones forzadas y se crean
productos de degradación con estructuras qcas similares
al compuesto original, y quizás no se separan por lo que
se ve un solo pick, y con este detector me permite ver si
hay colusión, es decir, si hay otro pick debajo. Por eso, me
permite ver pureza de los picos, es decir, que no haya co-
elución de picos.
Se puede determinar cromatograma y
espectrograma, determino longitud de onda de
máxima absorción a la cual hacer la medición. Si
tengo dos analitos, puedo decir que hasta el
tiempo 5 del primer analito lo detecta a una
longitud de onda, y luego para otro analito que
tiene otra longitud de onda de máxima absorción
lo detecte a esa longitud de onda de máxima
absorción.
Entonces, este DAD permite determinar pureza
de los picos y me entrega espectrograma con
cromatograma.
Electroquímico
Es uno de los más sensibles que hay, solo para compuestos que
se oxidan o que se reduzcan.

Fluorescencia
Otro detector que se usa bastante en análisis de productos
farmacéuticos.
Puede ser para compuestos que fluorescen por sí solos, que
son los fluorogenos, o haciendo reacción química con
reactivo fluorescente para que compuesto fluorezca.
Alta sensibilidad, 3 veces más sensibles que el UV. Puede ser que en un análisis de un
medicamento en un líquido biológico a concentraciones bajas, y no puedo usar el detector
UV, uso fluorescencia.
Es muy selectivo, porque solo detecta analitos que fluorecen, esto es útil en mezcla de
compuestos que no puedo separar, pero analito que quiero medir es el único que fluorece,
por lo tanto, aunque no lo separe del resto no importa, porque detector solo detecta aquellos
que fluorescen.
Masa
Se puede usar en cromatografía de líquidos y
gases, a diferencia del resto que era solo para
líquidos.
Se usa más para identificación de compuestos.

Optimización de la separación
Distintas formas de optimizar.
Separación se puede optimizar variando
proporción de FM, es la más común que se hace.
Varía % de modificador orgánico, tipo de
modificador orgánico, etc., cambio tampón, ajusto
pH de tampón, entre otros.

Parto con una cromatografía, la pruebo,

hago metanol- agua 50-50. Los dos
primeros picos me salen superpuestos y el
ultimo sale muy tarde. Por lo tanto, si hago
una modificación en proporción de FM,
podría lograr que los 2 primeros se separen,
pero el ultimo se retendrá más todavía, por
lo tanto, no podría hacer una buena
optimización. En ese caso se hace una
elución en gradiente, se parte al principio con una FM que me permita separar los dos
primeros analitos, y después cambio la proporción de la FM para que el ultimo analito se
me acerque. Por ejemplo, si estoy trabajando en fase reversa, FE apolar, y aumento el %
de modificador orgánico, por ejemplo, metanol, se disminuye tiempo de retención de los
analitos.
Los dos primeros analitos se juntaban, se bajo % de metanol, se separaron, y luego se
aumento % de metanol para que el ultimo analito salga más rápido. Entonces, programo
los primeros minutos a 30-70%, y luego digo que suba la proporción de FM, que cambie
durante cierto tiempo, y luego que se mantenga en esa nueva proporción.
Ejemplo de elución en gradiente. En amarillo es
como fue el gradiente, primero partió en una
proporción determinada que parte en tandas, por
ejemplo, parto 50-50 metanol agua, y después se
hace 70-30 metanol agua, pero para llegar a 70
debo hacerlo llegar en ciertos minutos, es decir,
puedo aumentar 5% el equis tiempo, hasta llegar a
la nueva proporción que quiero. La dejo ahí, y
después debe volver a bajar y llegar a condición
inicial, así se logran separar analitos.
Al hacer elución en gradiente se demora más,
porque debo hacer pendiente para subir y bajar, y luego que se equilibre nuevamente a
condición original. Elución en gradiente no es lo primero que uno prueba, pero en caso de
que no se pueda hacer una elución isocrática, es decir, sin gradiente, no queda otra
alternativa más que hacer elución en gradiente que me permite una buena optimización,
pero que hace que análisis sea más largo.
En imagen se ve efecto de solvente en
muestra. Agente tiende a disolver
muestra en solvente que sea soluble, lo
ideal es siempre inyectar muestra en
FM para que no se produzcan
deformamientos del pico. Tenemos
cromatograma a la izquierda de FM que
es muy eficiente, pico muy agudo con
ancho de base pequeño y buena forma.
Luego el de la derecha, se forma en
tanda el % de acetonitrilo, sobrepasa el
% de acetonitrilo la FM, el del solvente
de la muestra, por lo que se enancha el
pick. En la parte de abajo se ve como si tuviera picks superpuestos porque se ven como
dos cabecitas, pero en verdad es solo un pick, que al usar el 100% de solvente se empieza
a deformar y se tiene este cromatograma en donde pareciera que tengo más analito cuando
no es así. Por eso lo ideal es usar FM como solvente de la muestra.
 Otras formas, columna conectada no es tan común.

Optimización de la detección
Aunque no es muy común, uniendo detectores en
serie.
Derivados se pueden preparar antes de inyectar
columna, por ejemplo, mezclo muestra con reactivo
para hacer que muestra presente fluorescencia, y
luego la inyecto en la columna, o puede ser
postcolumna una vez que se ha producido la
separación en reactor especial llega la muestra ya
separada se agrega reactivo derivatizante y luego eso
va al detector, y se detecta según reacción de derivatización que se hizo.
Listado de reactivos con los cuales se
pueden preparar derivatizaciones.

No aprendérselos. Sirve para ver que tipo

de reactivos y que tipo de reacciones se
pueden hacer.
 Cromatografía de gas parte 1
Definición
Principal mecanismo es la adsorción, FE
polares, y cuando FE es apolar líquida,
mecanismo de separación
predominante es reparto o partición.
Mecanismo mas utilizado es el de
reparto.

Si aumentamos volatilidad, disminuyen

tiempos de retención. A diferencia de
otras cromatografías, en este caso FM
no interactúa con analitos.

FM gaseosa en rosado, celeste fase liquida FE.

Punto de inyección hay dos analitos que se
reparten de acuerdo a su afinidad por FE.
Si avanzamos en el tiempo analitos van siendo
transportados por FM a través de la FE. Se van
produciendo interacciones de acuerdo a polaridad y afinidad por FE.
En la tercera imagen se observa cromatograma
donde ya ha eluido. Compuesto A respecto a B
fue más rápido. B sigue retenido. Forma del
pico, por la forma que tiene, por eluir más
rápido es más eficiente, por la forma del pico
que es más fina.
En la cuarta foto no hay ni A ni B. forma del pico
cromatográfico para el compuesto B es mucho
más achatado, por lo que analito está siendo
mayor tiempo retenido, eficiencia con que
ocurre separación (resolución es menor).
Según afinidad se ve si quedan más o menos retenidos. Señal proporcional a
concentración.
Izquierda esta entrada de gas
hidrogeno y aire. Detector de
ionización de llama de hidrogeno,
que funciona por la combustión de
estos gases. Carrier o gas de
arrastre es FM.
Horno de columna donde tenemos
enrollada la columna
cromatográfica que contiene a la
FE, y como está dentro del horno
tenemos diferenciales de
temperaturas y generar gradientes de temperatura para optimizar separación.
A la salida de columna cromatográfica está el detector, todo conectado a un sistema de
adquisición de datos que nos permite tener el cromatograma y por lo tanto determinar cuali
y cuanti compuestos de la muestra.
Se produce la inyección, micro jeringa vacía, a través de la columna viajan los analitos, lo
hacen más o menos rápido dependiendo de afinidad o retención por FE.
Se llega al detector donde se ve que solo queda el amarillo, ya ha eluido rosado y azul, se
ve el pick cromatográfico del compuesto rosado y el comienzo del azul, y cuando llega el
amarillo tenemos los 3 picks.
suministro de FM, donde está el gas
portador.
Introducción de muestra: micro jeringa o
inyector.

FM puede ser suministrada a través de lo que

esta en la imagen. Cilindros a partir de la entrada
del gas existan reguladores de presión dentro de
cilindro y del flujo de salida, para definir flujo de
FM que necesitamos.
En CG no se modifica mucho suministro, es como
estándar.
Gases que más se usan son los que están ahí. Se prefieren porque cumplen con las
características requeridas para esta cromatografía. No debe haber interacción entre FM y
columna, por lo tanto, gas debe ser inerte a la muestra y al sistema, debe ser puro, pq o si
no se verán contaminaciones, compatible con el detector, e idealmente de bajo costo, pero
debido a la alta pureza que tienen los gases, esta última característica es compleja porque
gases no son tan baratas.
Se podrá medir y presión interna es lo
que está ahí.
Presiones estarán dadas por las
características térmicas del propio
cromatográfico, por ejemplo, diámetro
de toda la tubería del cromatógrafo
genera más o menos presión.
Existen flujómetros que miden a la
salida del cilindro, y verificar cual es el
flujo que realmente esta saliendo o
llegando al cromatógrafo.
Gráfico de Van Deemter. Azul alcanza
platos teóricos mucho menos bajos
que helio e hidrogeno, pero margen de
velocidad que podemos regular con nitrógeno es más limitado, porque llega mas abajo pero
inmediatamente comienza a subir con pendiente más empinada. En cambio, en las otras
dos curva no es tan empinada, zona más estable de velocidades de flujo de gas que se
pueden regular, mantenemos la misma eficiencia de 0,3 platos teóricos.
Se pueden usar distintas velocidades de helio y h sin perder eficiencia.
Generalmente con micro jeringas, en dos
modalidades.
Cámara de vaporización o inyector
propiamente tal, micro jeringa y cámara
de vaporización, la que conecta un liner
de vidrio calentado, conecta con cabeza
de columna cromatográfica.
A la derecha esta la inyección directa o en
la columna, al introducir jeringa, aguja
llega directamente a la cabeza de la
columna cromatográfica.
Diferencia está en que inyección en
columna usamos columna capilar, es
decir, mas delgada y sin relleno, y en cámara de vaporización va empacada, soporte y sobre
este FE.
Lo importante es poder vaporizar la muestra instantáneamente sin discriminación, se
volatilizan todos los componentes de la muestra y una vez hecho esto son arrastrados hacia
columna cromatográfica.
Soluciones de compuestos solidos disueltos en
solvente adecuado.
Cantidad depende del tipo de columna que se esté
utilizando. Capilares como son más delgados,
requieren de menos volúmenes, en cambio
empacadas necesitan un volumen más elevado.

No tiene que ser retenido por FE, inerte

químicamente al sistema cromatográfico,
no contaminar al detector.
Existe otra modalidad que es lo que se
conoce como espacio de cabeza, se
introduce al sistema la muestra, pero ya
volatilizada en fase vapor, generar un
sistema de introducción especial, determinad e forma indirecta aquellos compuestos
volátiles. Imagen, vial tiene un tapón, que tiene en centro algo de caucho, que hace que
escape el gas y que exista el equilibrio entre gas y líquido. Atraviesa septa de caucho, toma
volumen de fase gaseosa, por eso es espacio de cabeza, jeringa no toma líquido, toma fase
gaseosa donde están compuestos volátiles. Luego eso se inyecta en cromatograma.
Tenemos el inyector más clásico, el que mas
encontramos en CG. Split: división, splitless: sin
división.
Septa de caucho que da hermeticidad al sistema.
Entrada a gas portador, liner de vidrio que es un
capilar de vidrio, dispuesto dentro de bloque metálico
calefactor, salida del Split, conectado en celeste o
calipso. Cabeza de columna cromatográfica:
entrada.
Si sabemos que la muestra tiene muy poca cantidad,
se trabaja sin división de flujo, es decir, toda la
cantidad de muestra que se inyecta llega a la
columna, para asegurarnos de una determinación
exacta y precisa. Si muestra es importante o
considerable, para no saturar sistema
cromatográfico, se fija una división del flujo de gas de arrastre, que genera que una vez que
se inyecta y se comienza a producir vaporización en line, empujado por gas portador, existe
un flujo, donde una parte se elimina, y así no se contamina columna cromatográfica.
Poca muestra: splitless. Harta muestra: Split.
Coeficiente de variación es relativo a la reproducibilidad de
porta muestras.
Reproducibilidad es aprox de 1% en caso de jeringas
herméticas.
Automáticos o automuestradores nos permiten censar
gran numero de muestra, con dispositivos neumáticos,
controlados por gas y eléctricamente.
Empacadas tienen dimensiones un poco más pequeñas. Son
anchas, generalmente de vidrio o metal.
largo y diámetro cambia
dependiendo si es capilar o
empacada.
clásicamente, la mayor parte
de las columnas de CG
alcanzan los 30 m en
promedio, ese es el estándar
para tener una precisión
eficiente.
Relleno es de empacadas. FE debe estar recubriendo
cada granulo de soporte, para que no haya interacción de
analito con soporte, sino que sea con la FE.
Gran superficie para aumentar eficiencia.

Más de un 90% de aplicaciones se usa de derivados de

tierra de diatomeas o esta propiamente tal.
Mayor eficiencia se logra cuando tenemos el menor tamaño posible del granulo de soporte,
de esa manera aumentamos el área de la superficie de contacto entre analitos y FE.
 Sin relleno.
Tiene una película de FE. Se
enrolla porque alcanza longitudes
bastante considerables, de
aproximadamente 30 metros para
fases capilares.
Gran eficiencia se debe porque no
existe relleno, no hay soporte, el
factor A de ecuación de van
Veemter será cero, por lo que altura
de plato equivalente dependerá de
B y C, alcanzan números de plato
teórico muy elevados, por lo que picos son muy finos.
Factor A está asociado a soporte o relleno de
columna.

FE se someten a un estrés térmico,

podemos regular temperatura
utilizada para optimizar separación,
hacer analitos volátiles para acelerar o
disminuir velocidad de separación.
Mecanismo principal reparto o partición, FE liquida capaz de interactuar con analito
transportado en FM.
Para que no existan contaminaciones ni picos fantasmas (picos contaminados): alto grado
de pureza.
Escualano es la más apolar de todas.
Carbowax es la más polar.
Lo que más se usan son las columnas semipolares en CG, en
caso de medicamentos. Generalmente se usa fenil metil
silicona, permite polares y apolar. Es como el comodín.
 en ambos se intentaron separar los mismos
componentes. Por eso la de abajo es menos
selectiva, afecta la cuantificación.
Es importante que FE que se use para trabajar nos
permita selectividad.

Detectores que se usan sirven para medir

concentración o masa, a mayor
concentración, mayor señal eléctrica, por
eso podemos cuantificarlos.
Selectivo: discriminar entre dos o más
compuestos de una mezcla.
Especifico. Solo responde a un tipo de compuestos.
CMD se relaciona con LEC y LED.
Intervalo lineal muy corto, nos permite poca aplicación
para uno o varios analitos.
 Cromatografía de gas, parte 2
Alta sensibilidad del detector, que pueda detectar
bajas cantidades de analito. Diferenciar también
inequívocamente la señal del analito del ruido
instrumental. CMD, mientras mas baja esta cantidad
o el LED, mucho mejor. Respuesta idealmente en
intervalo lineal amplio, existe proporción entre
cantidad y señal en intervalo amplio de
concentraciones, de manera de determinar analito a
distintos niveles.

Detector de conductividad térmica (TCD)

Bloque térmico
representado en
color azul, zona
achurada, par de filamentos, izquierda es el
de referencia, derecha el de la muestra. Por
ambos filamentos pasa el gas de arrastre,
todo el sistema está termostatizado con
ayuda del bloque térmico, tenemos la salida
del gas de arrastre que lleva el sistema de
procesamiento de datos, se transforma lo
que se detecta en señal eléctrica, se obtiene
en computador el pico o cromatograma de lo
que se analiza.
Se basa en que cuerpo caliente pierde calor
a una velocidad dependiente de la
composición del gas que lo rodea. Cuando esta pasando solo gas de arrastre por ambos
filamentos, no hay diferencia de conductividad térmica. Cuando por filamento de la derecha
pasa el gas de arrastre con analito o muestra, se perciben diferencias en conductividad
térmica, se reproduce en señal eléctrica, un pick cromatográfico, de manera de poder
visualizar el componente de la muestra que se está analizando.
Dos pares de filamentos de tungsteno que se calientan por medio de corriente eléctrica.
Características
Casi dos nanogramos de CMD.
Universal, responde a casi todos los compuestos que se pueden analizar.
Linealidad un poco estrecha.
Gases arrastre (FM) helio e hidrogeno.
Límite superior de 400°C.
Moderadamente estable, señal bastante reproducible.

Precauciones
Si no se mantiene
constante de gas de
arrastre tendremos variaciones entre ambos filamentos
por variaciones del flujo del gas.
Filamentos de tungsteno se dañan irreversiblemente en
soluciones con halógenos o haluros de alquilo o fluoruros
orgánicos.

Detector de ionización de llama de hidrogeno (FID)

Pequeño mechero donde se produce
pirolisis de compuestos. Mechero funciona
con gas combustible de hidrogeno y aire, se
produce mezcla y llama que ioniza o pirolizar
compuestos orgánicos de la muestra.
Tenemos gas de arrastre con conductividad
eléctrica determinada, pasa por micro
mechero y eso da señal línea base. Si va
acompañado de analito, se produce pirolisis
de analito en llama, se ioniza, tenemos
partículas cargadas positivas, negativas,
electrones, con electrones polarizados se
produce una corriente eléctrica. Al existir analito cargado dentro del gas conductividad varía.
Variaciones son las que luego se transforman en señal cromatográfica en cromatograma
propiamente tal.
Características
Compuestos orgánicos, que tengan C-H-O.
Detector semiuniversal o casi universal, es
menos que el anterior.
Mucho más bajo el CMD que el de
conductividad térmica.
Linealidad también es más amplio.
Mayoría de cromatógrafos traen este detector por defecto en lugar del otro, por las
características propias del detector.
Detector de captura de electrones (ECD)
Mide disminución, no la generación de
señal eléctrica.
Dentro de dispositivos, gas viene de
columna. Lamina radioactiva que puede
ser de níquel 63 reactivo. Como es fuente
radioactiva, emite constantemente y
ioniza constantemente moléculas de gas
portador, de manera que genera corriente
de electrones. Electrones llegan hacia un
electrodo, y son detectados. Corriente
permanente de electrones mientras pasa
el gas. Cuando dentro del gas de arrastre
va un analito que posee átomos E.N.,
como moléculas que tengan dobles
enlaces C-halógeno o halógeno
propiamente tal, habrá disminución de señal eléctrica sin muestra. Cuando pasa muestra
con átomos E.N. se capturan los electrones que se están produciendo por ionización de
gas, por lo tanto, en vez de tener señal positiva, tenemos señal negativa en cromatograma.
Se invierte cromatograma para verlo como señales positivas o picos cromatográficos hacia
arriba.
Detector disminuye señal eléctrica, a medida que el gas nitrógeno pasa por detector por
lámina de níquel 63 radioactivo ioniza moléculas de gas y produce corriente constante, esa
es la línea base.
Perdida de corriente constante es la detección
del analito.
Características
Solo a átomos E.N, compuestos que tienen
estos átomos E.N.
Linealidad es mucho más estrecho que las
otras dos.
Principalmente se usa nitrógeno, aunque
también se puede usar argón con 10% de metano.
No es destructivo, a diferencia del de la llama de
hidrogeno.
Gas portador seco, sin presencia de agua o humedad.
Se contamina muy rápidamente la fuente radioactiva.
Se prefiere la de níquel porque tiene mayor temperatura máxima.
Sensibilidad de detectores
TCD se ve como segundo, con su respectivo
espectro de sensibilidad. Después va el FID,
cuyo intervalo lineal es más grande. Después
está el ECD, barra es un poco más estrecha,
pero llega a cantidades más bajas.
Al final está el de espectrometría de masas,
intervalo mucho más amplio. Sensibilidad
bastante baja.
Procesamiento de datos
Cada vez que se realiza cromatografía,
fundamento es la separación, se puede
discriminar entre distintos componentes de una
muestra, y
poder cuantificarlos

Optimización separación y detección

Control de
temperatura y flujo de
FM.
Lo más sencillo es
poder regular la
temperatura, más que
el flujo incluso, flujo en la practica casi nunca se
modifica. Se genera gradiente de temperatura con objeto de optimizar separación, de
manera que compuestos que son volátiles a menor temperatura, gradiente se baja
temperatura, y gradualmente se va aumentando el gradiente para volatilizar el resto de los
analitos, generando interacciones por FE. Así aumentamos retención de analitos, para que
se retengan menos, y cuando se va aumentando temperatura se disminuye tiempo de
retención de aquellos analitos que se quedan más tiempo retenidos. Se necesita que
cromatógrafo posea un horno para temperatura, y que detector e inyector estén bien
separados y que tengan su control de temperatura independiente del horno de la columna,
de manera que podamos hacer gradiente de temperatura en horno, y que temperatura de
inyector y detector sean diferentes e independientes.
preparación de derivados puede ser previo a la separación, antes de que analitos se
inyecten, o bien posterior a separación antes que analitos se detecten una vez salidos de
la columna cromatográfica. Preparación de derivado es bastante amplio dependiendo del
tipo de compuestos que se estén utilizando. Se generan derivados que consisten en que a
molécula original se le introduce un grupo funcional de manera de permitir que sean más
volátiles y que sean analizadas por CG. En general ácidos grasos son bien polares y no
volátiles, se le agrega un grupo alquílico, se hacen apolares y así se volatilizan y se analizan
por CG.
El tercero es mucho más radical, en este caso no es tan sencillo. Las longitudes de
columnas cromatográficas son de hasta
30 metros, por lo que no es sencillo
cambiar una columna en CG.
Efecto temperatura
Imagen izquierda salieron todos juntos
porque temperatura es muy elevada,
rápidamente se volatilizan y
prácticamente no son retenidos.
Imagen derecha, no se volatilizan, se
quedan retenidos en columna.
Ventajas y desventajas de CG
Rapidez, actuales equipos son muy efectivos para
enfriarse.
Longitud de columnas dan alta eficiencia, eso hace que
eficiencia y picks cromatográficos sean muy finos,
demostrando una alta eficiencia.
En general no destructivos, nos permite que podamos
acoplarlos con espectrometría de masas.
Si o si analitos deben ser volátiles y termoestables, no se
deben degradar por acción de temperatura aplicada.
Se requiere más instrumentación para hacer elucidación estructural al separar compuestos
que no sabemos que es, con CG sola no podemos saber que compuesto es.
Aplicaciones análisis de medicamentos

En industria farmacéutica, en síntesis de

medicamentos normalmente se obtienen
por aislamiento del detergente de una
planta vegetal, para aislarlo se usan
solvente, nunca es posible eliminar el
100% de solvente residual, para
determinar % de solvente residual es a
través de CG (o impurezas volátiles en
general).
Módulo 4
 ULTRAVIOLETA
MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS
*Hoy vamos a dar inicio a los métodos espectroscópicos comenzando con la
espectroscopia UV-Visible.
RAD. ELECTROMAGNETICA
REM: Medición de absorción de
radiación electromagnética por
- Onda parte de un compuesto
- Partícula
*Los métodos espectroscópicos se basan en la interacción en la radiación
electromagnética con átomos y moléculas. La radiación electromagnética tiene doble
naturaleza, posee un comportamiento ondulatorio, que es un comportamiento de onda,
y un comportamiento de partícula.
Estructura de la Luz
*Aquí se puede observar la
estructura de la luz, la cual es un
conjunto de relaciones
electromagnéticas de diferentes
longitudes de onda. Si
recordamos cada longitud de
onda lleva asociada un campo
eléctrico y uno magnético que
son perpendiculares entre si y a
la velocidad de propagación de la onda. Aquí podemos ver los colores desde el
Ultravioleta al Infrarrojo de la radiación electromagnética y con las longitudes de onda
asociadas.
Ultravioleta: *Aquí vemos asociada la longitud de onda
- UV de Vacío: 10 a 190 nm con el tipo de espectroscopia que se
- UV cercano: 190 a 380 nm produce.
Visible:
- 380 a 800 nm
Infrarrojo:
- IR cercano: 0,8 a 2,5 µm
- IR fundamental: 2,5 a 25 µm
- IR lejano: 25 a 400 µm
ULTRAVIOLETA
Niveles energéticos
• Electrónico (mayor energía) *
• Vibracional M + h → M
• Rotacional (menor energía)
*En las moléculas se distinguen
Electrones tres niveles energéticos. El de
 enlaces simples mayor energía es el electrónico,
luego viene el vibracional y el
 enlaces dobles rotacional que es el de menor
energía. Para poder producir
n no enlazantes alguna modificación en estos
niveles energéticos es
necesario que el fotón que incide sobre la molécula tenga una energía cuantizada, ósea
debe ser capaz de producir una transición de un nivel a otro y asi llevar una molécula
del estado fundamental al estado excitado como se representa en esa ecuación que
está en el cuadro morado. Ahora la vida media de esa especie en estado excitado es
muy corta. Los electrones que tenemos en las moléculas son los sigmas que forman
parte de enlaces simples, los pi que forman parte de enlaces dobles y los n que son no
enlazantes, ósea no forman parte de enlaces.

Transiciones
*
• n→
*
UV cercano
• →
*
• →
*
• n→ UV de vacío

*Aquí podemos ver el tipo

de transiciones que se
producen por absorción
de radiación electromagnética, las transiciones de tipo n a pi excitado y pi a pi excitado
ocurren en el UV cercano y son las que se utilizan con fines cuali y cuantitativos y ellas
requieren de menor energía para producir la transición. A diferencia de las sigma a
sigma excitado y n a sigma excitado que requieren de mayor energía para la transición
y esas por lo tanto ocurren en el UV de vacío.
Aplicaciones
• Asociada a transiciones en zona 190 a 380 nm.
• Absorción n →  *   = 10 a 100 L / cm*mol
• Absorción  →  *   = 1.000 a 10.000 L / cm*mol
 bajo : < 200
 mediano : 200 - 1.500
 alto : > 1.500
*Esto que sale aca es super importante porque la aplicación del UV está asociada a
transiciones en la zona de 190 a 380 nm y esto quiere decir que está asociada al UV
cercano y como lo vimos en la diapo anterior, eso se a con transiciones de n a pi
excitado y pi a pi excitado. Ahora hay que hacer una diferencia entre el coeficiente de
absorción, ya que hay algunos que se consideran bajos, otros que se consideran
mediano y alto. Para que nosotros podamos hacer un análisis al UV de tipo cuantitativo,
se requiere un coeficiente de absorción de mediano a alto, por lo tanto, van a haber
moléculas en las cuales vamos a poder hacer análisis cualitativos porque absorben
sobre los 190 nm, pero no lo podremos hacer cuantitativo. En cambio, hay otras
moléculas que vamos a poder realizar un análisis de tipo cualitativo y tambien de tipo
cuantitativo, por lo tanto, es importante que podamos diferenciar luego cuando veamos
los grupos funcionales y su absorción que tipo de moléculas se les puede hacer análisis
tipo cualitativo y a cuáles se les puede hacer cualitativo y cuantitativo.
Grupos Cromóforos
Poseen orbitales necesarios para las transiciones:
n→*y→*
Alquenos Alquinos Aldehídos
Cetonas Carboxilo Éster
Amida Azo (-N=N-) Hidrazo (-HN-NH-)
Nitro Nitroso Sulfónico (-SO3)
*Los grupos cromóforos son los responsables de la absorción al UV ya que son los que
poseen los orbitales necesarios para estas transiciones que van de n a pi excitado y de
pi a pi excitado. Acá entonces tenemos un conjunto de grupos funcionales que son los
que presentan está absorción al UV.
 Grupos Auxocromos
• No absorben por sí solos.
• Modifican absorción de cromóforos.
- OH - SH
- OR - NH2
-R - NHR
-X - NR2
*Tambien tenemos los grupos auxocromos que no absorben por si solos pero pueden
provocar una modificación en la absorción de los cromóforos.
Grupos Auxocromos
• Batocrómico: 
• Hipsocrómico: 
Efectos
• Hipercrómico: 
• Hipocrómico: 
*Los efectos que pueden producir estos grupos auxocromos, son los efectos
batocromicos que es un desplazamiento hacia longitudes de ondas mayores, un efecto
hipsocrómico que es un desplazamiento hacia longitudes de ondas menores, un efecto
hipercrómico que es aumentar el coeficiente de absorción y un efecto hipercrómico que
es disminuir el coeficiente de absorción. Lo que generalmente hacen los auxocromos
es un efecto de tipo batocrómico e hipsocrómico.

Factores que afectan la absorción

*Ahora entre los factores que
1.- Solvente
afectan la absorción tenemos al
* Polaridad: E° excitado > E° fundamental ( →  )
*
solvente y la polaridad del
solvente. Acá lo que ocurre es que
solventes polares estabilizan E° excitado
si el estado excitado es más polar
que el estado fundamental. Esto
disminución de energía necesaria es típico que ocurra entre la
transición de pi a pi excitado. Así
entonces los solventes polares
van a estabilizar el estado
BATOCRÓMICO
excitado y por tanto va a haber
una disminución de la energía que se requiere para realizar la transición electrónica y
así por tanto ocurrirá un efecto de tipo BATOCRÓMICO.
 *Aquí es todo lo contrario, si el
Factores que afectan la absorción estado fundamental es más
1.- Solvente polar que el estado excitado
típico de transición de tipo n a pi
*
* Polaridad: E° fundamental > E° excitado (n →  ) excitado. Un solvente polar va a
estabilizar el estado
fundamental y por lo tanto se va
solventes polares estabilizan E° fundamental
a requerir un aumento de la
energía para la transición y aquí
ocurriría un efecto
aumento de energía necesaria HIPSOCRÓMICO. Entonces en
este caso es mejor utilizar
Conviene usar solventes apolares.
solventes apolares
HIPSOCRÓMICO

1.- Solvente
* pH: para sustancias ionizables

*El pH del solvente tambien juega un factor en la absorción en el UV, especialmente

importante para sustancias ionizables, sabiendo que los ácidos y las bases débiles son
sustancias ionizables. Si el cromóforo está en una solución acuosa y se varía el pH la
extensión de la conjugación en la molécula puede variar y mientras más conjugada esta
la molécula va a tener un mayor épsilon y una mayor longitud de onda. Acá tenemos un
ejemplo del fenobarbital que es un medicamento en donde se ve la diferencia de la
conjugación desde un pH acido a un pH básico y con los diferentes espectrogramas
que se obtienen demostrando entonces como varía la absorción al variar el pH de esta
molécula.
 2.- Sustituyentes
Cromóforos no conjugados
Dos o más cromóforos iguales  aumenta , se mantiene 
Dos o más cromóforos diferentes  aumenta , o aparece otra banda
Cromóforos conjugados
aumenta  y 

*Otro factor que afecta la absorción UV son los sustituyentes, primero si tenemos
cromóforos, pero no conjugado. Si tenemos dos o más cromóforos iguales aumenta el
coeficiente de absorción aumenta casi al doble y se mantiene la longitud de onda, en el
caso en que sean cromóforos diferentes aumenta el épsilon o aparece otra banda.
Ahora cuando tenemos cromóforos conjugados aumenta el épsilon y tambien aumenta
la longitud de onda de absorción, ósea mientras mas conjugada este la molécula va a
tener mayor absorción al UV.
3.- Geometría de la molécula
Isómero trans, efecto hiper y batocrómico
*En la geometría de la
molécula para
compuestos con
isomería cis y trans, en
el cual el isómero trans
presenta un efecto
hipercrómico y
batocrómico porque en
el isómero cis el grado
de conjugación de
electrones pi es algo
menor que en el trans, por lo tanto para producir la transición se necesita de mayor
energía.
Absorción de grupos funcionales
*En la absorción de los grupos funcionales primero tenemos a los
ALCANOS alcanos, los cuales presentan transiciones de tipo sigma a sigma
• Transiciones  →  * excitado, eso quiere decir que necesitan una radiación altamente
energética para producir la transición por lo tanto se considera
ALQUENOS Y ALQUINOS
que no absorben al UV. Luego tenemos los alquenos y los
• Transiciones  →  * alquinos, aquí ya tenemos transiciones de tipo pi a pi excitado,
• Alto . por lo tanto, tenemos épsilon altos con una longitud de onda
cercana a los 200 nm y la absorción de los alquenos es un poco
mayor a los alquinos, por lo tanto, estos si absorben al UV.
BENCENO Y DERIVADOS
• Transiciones  →  *
•  mediano (en general)
• Substitución afecta fuertemente la absorción:
* monosubstitución (efecto bato e hipercrómico)
* disubstitución (efecto bato e hipercrómico)
* mayor simetría (efecto hipercrómico)
*El benceno y derivados absorben en el UV, tienen transiciones de tipo pi a pi excitado,
con un épsilon mediano generalmente, tienen dobles enlaces conjugados por lo tanto
estas moléculas absorben. Ahora si el benceno esta sustituido ya sea por una
monosustitución o una disustitución va a tener un efecto de tipo batocrómico e
hipercrómico, además si la molécula es más simétrica tambien va a tener un efecto
hipercrómico. Ósea el mayor efecto va a ser con disustitucion y con mayor simetría de
la molécula.
ALCOHOLES
• Transiciones  →  * y n →  *
• No absorben al UV útil
FENOLES
• Absorben al UV útil ( mediano - alto)
*Los alcoholes no absorben al UV útil, de hecho, se utilizan como solventes de las
muestra, el etanol y el metanol son muy utilizados para realizar análisis
espectroscópicos ya que son transparentes al UV y esto es porque tienen transiciones
de tipo sigma a sigma excitado y n a sigma excitado, y estas no son absorciones en el
UV útil, luego los fenoles tienen un hidrocarburo aromático, por lo tanto, absorben en el
UV con un épsilon mediano a alto.
CARBONILO
• Transición n →  * , alta  y bajo 
• Transición  →  * , baja  y alto  (debe conjugarse con auxocromo)
DERIVADOS CARBONILO
• Efecto hipsocrómico (desplazamiento n →  * )
•  bajo
*En los carbonilos hay dos tipos de transiciones, una de n a pi excitado que se produce
a una alta longitud de onda, pero a un bajo épsilon, por lo tanto, permite un análisis
solamente de tipo cualitativo y luego tenemos un doble enlace del pi al pi excitado que
tiene un alto épsilon, pero una baja longitud de onda. Ahora si está se asocia a un
cromóforo, ósea se conjuga a un cromóforo, se va a aumentar la longitud de onda y eso
va a hacer que la molécula tambien se pueda cuantificar. Por lo tanto, los aldehídos y
las cetonas que están conjugados por ejemplo con un doble enlace se puede hacer un
análisis cualitativo y tambien cuantitativo. En los derivados del carbonilo, por ejemplo,
en los ácidos carboxílicos, las amidas, los esteres hay un efecto de tipo hipsocrómico y
en general no se pueden cuantificar al UV útil porque tienen un épsilon de tipo bajo.
AMINAS
• Alifáticas → NO absorben al UV útil
• Aromáticas:
→ SI absorben (cromóforo + auxocromo)
→ Efecto bato e hipercrómico
*Las aminas alifáticas no absorben al UV útil porque las aminas son auxocromos y las
aromáticas si absorben por el grupo aromático, aquí se va a producir un efecto
batocrómico e hipercrómico.
RESUMEN
1.- No absorben al UV útil
HC saturados y derivados con grupos auxocromos (ROH-NH2-Heterociclos saturados)
2.- Absorben al UV útil con  bajo
Compuestos con un cromóforo (cetonas-aldehídos)
3.- Absorben al UV útil con  mediano a alto
Sistemas conjugados (doble enlace conj-cromóforo conj-aromáticos-heterociclo
insaturado)
*Aquí nos presenta una tabla resumen en donde nos presentan quienes absorben y
quienes además de absorber se pueden cuantificar. Primero los que no absorben al UV
útil son los HC saturados y derivados con grupos auxocromos, por ejemplo, los
alcoholes, las aminas y los heterociclos saturados. Quienes si absorben con un épsilon
bajo ósea lo podemos ver, pero no lo podemos cuantificar, podemos solamente un
análisis de tipo cualitativo, estos son compuestos con un grupo cromóforo, por ejemplo,
cetonas y aldehídos. Quienes absorben al UV útil con un épsilon mediano a alto ósea
que podemos realizar un análisis de tipo cualitativo y cuantitativo son los sistemas
conjugados, por ejemplo, dobles enlaces conjugados, cromóforos conjugados,
aromáticos y heterociclos insaturados.
ANÁLISIS CUALITATIVO
• Comparación de espectros
• Cálculos:
* Coef. Absorbilidad (c= g/L)
* Coef. extinción molar (c= mol/L)
* A11 (c= g%)
*La utilidad del UV mediante un análisis cualitativo es por comparación de espectros,
ahora hay que tener en cuenta que los espectrogramas dan muy poca información
porque tienen muy pocas bandas, por lo tanto, no podemos hacer una identificación de
un compuesto desconocido mediante el UV. Si me sirve para un compuesto que
sabemos lo que tiene, y simplemente estamos confirmando la identidad y ahí podemos
comparar el espectro de la muestra problema con el estándar, pero no podemos hacer
el análisis de un compuesto desconocido solamente con un UV.
ANÁLISIS CUANTITATIVO

Ley de Beer
A = a() * b * c
• Espectrofotometría directa
• Espectrofotometría indirecta 0.1<A<1.0

• Detector en HPLC
A=0.434

*En cuanto al análisis cuantitativo, este se basa en la ley de Beer que estudiamos en
análisis instrumental, en la cual tenemos que la absorbancia va a ser igual al coeficiente
de absorción por b y por c, ósea el ancho de cubeta y concentración. Aquí podemos
hacer una espectrofotometría de tipo directa, es decir, medir directamente la
absorbancia de una muestra y de un estándar en un espectrofotómetro y con la
ecuación correspondiente hacer el cálculo. Tambien se puede hacer la
espectrofotometría indirecta, agregando algún reactivo para que el compuesto absorba
y tambien lo que mas se usa es utilizar el UV como un detector en cromatografía de
líquidos, comenzando por una técnica de separación y luego tenemos la cuantificación
por el UV. Si medimos una muestra directamente en el UV está debe estar sin otros
compuestos que puedan absorber porque si no se puede producir un error, y siempre
debemos leer en una zona de meseta del espectrograma porque hay menor error
fotométrico y tiene que ser a la longitud de onda de máxima absorción para que haya
mayor sensibilidad. El rango adecuado para trabajar con la Ley de Beer es una
absorbancia entre 0,1 y 1 y la absorbancia optima donde hay un error fotométrica es
0,434 que es la que nosotros aplicábamos para calcular las concentraciones a la cual
debemos preparar las muestras.
 FLUORESCENCIA

*Continuaremos con los métodos

espectroscópicos con la Fluorescencia

Introducción
*Aquí tenemos en la parte superior una
molécula que fue irradiada con radiación
electromagnética que tiene la energía
necesaria para producir una transición
electrónica y así se produce una molécula en
estado excitado. Ahora como había dicho la
vida media de esta molécula es corta y esta
molécula puede liberar la energía de dos
formas, las cuales son de manera radiante y de
manera no radiante. De manera radiante puede ser como fluorescencia o
fosforescencia.
*Según la teoría del Espín electrónico, el
espín es el que describe el giro del electrón
en su propio eje en un movimiento de
rotación. Los electrones están apareados
con espines opuestos, y esto esta indicado
por las flechas que van en sentido contrario.
Ahora pueden pasar dos fenómenos, que al
absorber energía se puede pasar de un
estado de singlete fundamental a singlete
excitado que es el caso de la fluorescencia,
aquí no hay cambio del espín y tambien se
puede pasar a un estado de triplete excitado
en que el electrón pasa a un triplete excitado en que el electrón pasa a un nivel excitado
cambiando el espín y eso es lo que ocurre en la fosforescencia. Ahora este cambio de
singlete a triplete es menos probable que de singlete a singlete.
Fluorescencia:
- Emisión instantánea de la Luz
- Transiciones entre singlete excitado a singlete fundamental
- Vida media emisión corta. La emisión termina una vez terminada la excitación
de la molécula.
- Depende de la concentración (Cuantitativa). Hay una relación entre la
fluorescencia y la concentración y eso permite que se pueda utilizar como un
método de análisis cuantitativo.
Fosforescencia
- Emisión retardada de luz
- Transiciones entre triplete excitado a singlete fundamental
- Vida media mayor que fluorescencia
- No depende de la concentración (Cualitativa), por lo tanto, no se puede utilizar
en términos cuantitativos.
*Aquí vemos una comparación y las diferencias asociadas a la fluorescencia y la
fosforescencia.
*En esta clase nos vamos a referir a la fluorescencia ya que se puede utilizar con fines
cuantitativos y las transiciones que se producen en ella son mucho mas comunes que
las que se producen en la fosforescencia.
Absorción/Emisión
*Aquí nos presenta una comparación entre la absorción
de energía y la emisión de energía que se produce en la
fluorescencia. La absorción de energía generalmente
ocurre en longitudes de onda bajas, por lo que se requiere
una energía alta para producir esa transición, a diferencia
de la emisión que requiere menor energía y por lo tanto
se produce a longitudes de onda mayores. Entonces aquí
cuando uno trabaja con fluorescencia debe seleccionar
una longitud de onda en que el compuesto absorba y una
longitud de onda en que el compuesto emita la
fluorescencia. Absorbe por lo tanto debe cumplir los
requisitos de un compuesto en cuanto a su estructura química para absorben energía y
luego vamos a ver que además debe cumplir para poder emitir está energía a la forma
de fluorescencia.
Cuantificación
Efecto de la concentración en la intensidad de la fluorescencia
*Aquí vamos a ver como se
relaciona la concentración
con la intensidad de
fluorescencia. Hay que tener
en consideración que los
límites de detección de los
métodos luminiscentes son
mucho menores alrededor de
los 3 ordenes de magnitud
que los de espectroscopia
absorción UV. Tambien tienen un intervalo lineal mayor y son más selectivos, pero hay
menos compuestos que producen fluorescencia por lo tanto la aplicación no es tan
masiva, pero si son bastante mas sensibles, es por eso que nos decía que en
cromatografía cuando uno tiene un analito a una concentración muy baja que no se
puede detectar por el detector UV, una alternativa podría ser el de fluorescencia. Ahora
se relaciona la fluorescencia con la concentración a través de un parámetro de eficiencia
cuántica que es simplemente la relación entre el número de moléculas que emiten
fluorescencia respecto al número total de moléculas excitadas. Lo ideal sería que todas
las moléculas que se exciten emitan fluorescencia y eso implicaría una eficiencia
cuántica de 1, así una molécula que tiene esa eficiencia cuántica es una molécula
altamente fluorescente. Luego la fluorescencia se relaciona con la intensidad de la
radiación incidente y transmitida según la ecuación que esta más abajo y luego con el
objeto de relacionar la fluorescencia con la concentración, se escribe la ecuación de
Beer de la siguiente forma abajito a la izquierda que tiene la intensidad de lo transmitido
partido la intensidad de las incidentes y es igual a 10 elevado a todos los valores que
están en esa ecuación. Así esa ecuación se transforma y llegamos a que la
fluorescencia es igual a la eficiencia cuántica por un valor que es constante, luego por
el coeficiente de absorción que tambien es constante y luego por b que tambien es
constante y así por lo tanto todos esos valores serian una constante, luego por c que
sería la concentración y por la intensidad de las incidentes. Así de esta forma se llega
a la ecuación final en que la fluorescencia va a ser igual a K que es la constante que
esta representada arriba por la concentración y la intensidad de las incidentes. Por lo
tanto, podemos variar la intensidad de las incidentes para aumentar o disminuir la
fluorescencia por ejemplo si un compuesto fluórese poco, entonces como los valores
que tienen una constante que va a depender de cada compuesto, es fácil así de esta
forma hacer una relación entre la fluorescencia y la concentración y por eso se puede
utilizar con fines cuantitativos.
FACTORES QUE AFECTAN LA FLUORESCENCIA
*Aquí vamos a ver 3 factores que son importantes y
pueden producir un efecto en la fluorescencia, primero
está la temperatura, la cual a mayor temperatura menor
fluorescencia, esto se produce por aumentar las
colisiones entre las moléculas, ya que al aumentar la
temperatura aumentamos las colisiones entre las
moléculas hay mayor pérdida de energía por medios
de tipo no radiantes y por eso disminuye la
fluorescencia. En forma similar la viscosidad a mayor
viscosidad hay mayor fluorescencia porque en medios viscosos hay menos número de
colisiones entre las moléculas, luego los solventes solamente producen un efecto para
compuestos con uniones puente hidrogeno en el estado excitado que pudiera ser
afectado por solventes polares que disminuyen la fluorescencia.
*Tambien es importante el pH del solvente,
esto es especialmente para ácidos y bases
débiles, aquí tanto la longitud de onda como la
intensidad de la emisión son diferentes para la
forma ionizada y no ionizada, por lo tanto,
según el pH esto va a variar.
*Tambien hay un efecto de
fotodescomposicion, en donde las moléculas
que necesitan gran energía para ser excitadas
pueden producir un fenómeno de
fotodescomposición alterando su estructura y así disminuyendo su fluorescencia.
*El ultimo factor que afecta la
fluorescencia es la presencia de otros
solutos en la solución, aca tenemos dos
fenómenos, uno de filtro interno que
corresponde a la existencia en el medio
de otras moléculas capaces de
absorber la misma radiación que excita
a la molécula o capaces de absorber la
radiación de emisión. Tambien
tenemos un fenómeno denominado Quenching que significa atenuación y eso es una
inhibición de fluorescencia debido a la formación de complejos entre el analito y
sustancias presentes en el medio
 *Aquí se ve el efecto de la concentración y la
fluorescencia y se ve claramente que a soluciones
concentradas se empieza a disminuir la
fluorescencia y esto se debe a que las moléculas
se bloquean entre si absorbiendo la luz incidente y
la luz emitida, por lo tanto, se debe trabajar con
soluciones diluidas y aquí estudiar muy bien la
linealidad del método, trabajar en el rango que es
directamente proporcional a la concentración del
analito.

ESTRUCTURA Y FLUORESCENCIA
*Las moléculas que fluorescen son
compuestos principalmente con
transiciones de tipo pi a pi excitado,
ósea son compuestos de tipo aromático.
La fluorescencia más intensa y la que es
más útil es la que presentan estos
compuestos aromáticos ya que tienen
estas transiciones pi a pi excitado. Los
compuestos que tienen en su estructura
alifáticos con dobles enlaces muy
conjugados pudieran tambien presentar
fluorescencia, pero el número de sistemas alifáticos que presentan fluorescencia son
muy pocos en comparación a los aromáticos. Lo que tiene que tener en su estructura
química para que un compuesto florezca necesita compuestos altamente conjugados,
absorción sobre los 200 nm, ósea aquí debe cumplir lo mismo que el UV, un coeficiente
de absorción mediano a alto y aquí hace la diferencia con la UV es que deben ser
estructuras rígidas para que no pierdan energía por mecanismos de tipo no radiantes.
Acá abajo hay dos estructuras químicas, ambas presentan fluorescencia pero una
presenta mayor fluorescencia que la otra y es la que tiene mayor rigidez en su
estructura, la primera tiene una eficiencia cuántica de 0,2 y la segunda una eficiencia
cuántica de 1, en ambas tenemos dos núcleos aromáticos, ambas son rígidos pero la
de la derecha es bastante más rígida que la otra, por lo tanto, acá podemos observar y
definir que tipo de estructuras pueden o no pueden emitir fluorescencia y cuales pueden
emitir mayor fluorescencia que las otras.
 *En relación a los sustituyentes que
pudieran introducirse en las estructuras
químicas, tenemos que los dadores de
electrones aumentan la longitud de
onda de excitación y de emisión y
aumentan o mantienen la eficiencia
cuántica y los atractores de electrones
aumentan las longitudes de onda de
excitación y emisión, pero disminuyen los valores de eficiencia cuántica.
FLUOROGÉNOS
*Los fluorogenos son los compuestos que
pueden emitir fluorescencia, hay
fluorogenos directos que tienen
fluorescencia propia y hay otros
fluorogenos que son inducidos que se les
hace una reacción química con un
reactivo determinado y así puedo hacer
que esa molécula fluorezca, pueda ser
que uno esta utilizando un detector UV
asociado a cromatografía de líquidos y
tiene una mezcla de compuestos que es muy dificil de separar, pero pudiésemos hacer
una reacción química entre el compuesto que quiero determinar y alguno de los
reactivos para que emiten fluorescencia y así voy a hacer que solamente el compuesto
que nosotros queramos medir emita fluorescencia, considerando que los otros
compuestos no reaccionarían con el reactivo. Por ejemplo, los reactivos que podemos
usar son la fluorescamina que se utiliza para aminas primarias, secundarias y
aminoácidos, ahí tenemos su estructura química que es una estructura química
altamente conjugada y bastante rígida por lo tanto ese reactivo emite fluorescencia y al
hacer una reacción con una molécula que no emite fluorescencia ahí si la emitiría. Otro
reactivo muy común para hacer que una molécula fluorezca es el cloruro de dansilo que
tambien es para aminas y aminoácidos, en donde tenemos su estructura donde se
observa una estructura altamente conjugada y bastante rígida que emite fluorescencia.
Compuestos fluorescentes
*Aquí nos muestra varios ejemplos de
medicamentos que tienen fluorescencia
propia, esto es importante que podamos
determinar porque en las pruebas es muy
probable que nos ponga distintas moléculas y
nos pregunte si emite fluorescencia, absorbe
en el UV y si se puede cuantificar en el UV,
entonces tenemos que tener bien claro que
debe contener una estructura química de un
compuesto para cumplir este requisito. Acá
vemos cuatro moléculas altamente conjugadas y bastante rígidas por lo tanto todas
ellas emiten fluorescencia.
UTILIDAD FLUORESCENCIA
*La utilidad de la fluorescencia en el análisis
farmacéutico principalmente es como detector
asociado o acoplado a un cromatógrafo de líquidos
o a una cromatografía en capa fina instrumental en
que se puede hacer un análisis cualitativo y
cuantitativo, por ejemplo, análisis cuantitativo se
hacen mucho en el área farmacéutica para detectar metabolitos y medicamentos en
fluidos biológicos. Los medicamentos en un fluido biológico están a bajas
concentraciones y sus metabolitos están a mas bajas concentraciones aun, por lo tanto,
un detector UV es muy dificil que le de la sensibilidad para detectar estos compuestos,
pero un detector de fluorescencia si tiene la sensibilidad adecuada.
*La espectroscopia de fluorescencia directa es menos común pero igual se puede
hacer, pero en el laboratorio que hacen análisis farmacéutico, los detectores que tienen
son los detectores UV porque la mayoría de los medicamentos tienen en su estructura
química grupos funcionales que absorben en el UV y tambien tienen detectores de
fluorescencia en los casos en que la sensibilidad del UV no alcanza para determinar el
compuesto.
 *Así podemos hacer un análisis de tipo
cualitativo, identificar fluorogenos y
detectar compuestos directa o
indirectamente y un análisis de tipo
cuantitativo en el análisis de productos
farmacéuticos, fármacos y sus
metabolitos en líquidos biológicos.

FLUORESCENCIA / UV-VIS
*La ventaja de la fluorescencia frente a la
espectroscopia UV-VIS, ya lo comentamos ya que es
mas sensible y mas especifica porque solamente nos
va a determinar las especies fluorescentes, mientras
que entre las desventajas hay un gran numero de
variables a controlar, por ejemplo, tenemos que tener
longitudes de onda de absorción y emisión, y hay
mucho menos compuestos que emiten fluorescencia
comparados con los compuestos que absorben al
UV-VIS.
 ESPECTROSCOPÍA DE INFRARROJO
La espectroscopía de infrarrojo (IR) es una herramienta indispensable para conocer la estructura de
una sustancia orgánica. La mayor parte de la aplicación analítica se realiza en el IR medio o
fundamental, que corresponde a la zona de absorción del espectro de radiación electromagnética
donde podemos interpretar cada una de esas bandas y asociarlas a los distintos componentes de un
compuesto.
Se usa tanto en el análisis cualitativo como en el cuantitativo. Para el análisis de medicamentos, su
importancia radica en la identificación (Cualitativo).
Las moléculas poseen Energía Interna (Eint):
Eint= Ee+ Ev+ Er
Ee= E electrónica corresponde a la energía de los electrones en la molécula.
Absorben la REM en el visible y UV cercano.
EV= E vibracional se debe a vibraciones interatómicas de la molécula, de tensión y/o de flexión.
Absorben la REM del IR cercano y medio o fundamental.
Er= E rotacional es la energía asociada a la rotación de la molécula alrededor de su centro rotacional.
Absorbe la radiación del IR lejano y microondas.
INFRARROJO = ENERGÍA VIBRACIONAL + ROTACIONAL
*La energía interna está dada por la sumatoria de tres tipos de energía distinta, las cuales son la
energía electrónica, la vibracional y la rotacional. La energía electrónica corresponde a aquella
derivada desde los electrones en la molécula que pueden absorber la REM en el Visible y UV cercano.
Por su parte la energía vibracional se debe a vibraciones interatómicas de las molécula por vibraciones
de los átomos que componen una molécula. Si tomamos la energía vibracional y rotacional y vemos
que ambas absorben en la región del IR cercano, medio o lejano, de manera que entonces vamos a
decir que para que haya absorción en el IR vamos a disponer entonces de energía vibracional o
rotacional o existirá la sumatoria de energías tanto vibracional como rotacional.
RAD. ELECTROMAGNÉTICA
Fenómeno de onda  longitud de onda (λ ) y frecuencia (ν)
*Para recordar el concepto
de radiación
electromagnética se trata de
un fenómeno de onda que
como tal estará asociado a
una longitud de está onda
que vemos representada ahi
tanto en rojo como en azul y
a una cierta frecuencia a la
cual ocurre está longitud de
onda. Claramente en color
rojo vemos que la longitud de onda es mas larga, en cambio, en el color azul la longitud de onda que
se mide en cada uno de esos picos donde suben se aprecia que el trazo azul es más corto porque
además hay una mayor frecuencia. Para asociar esto a la cantidad de energía que contiene esa
radiación electromagnética se utiliza la ecuación de Planck donde el diferencial de energía o delta E
será proporcional a la constante y a la frecuencia, de tal manera que a mayor frecuencia mayor
cantidad de energía. Además, está el hecho de que la frecuencia es inversamente proporcional a la
longitud de onda, lo cual se puede apreciar en los trazos rojos y azules, ya que por ejemplo en el trazo
rojo la longitud de onda es más larga pero la frecuencia es menor por la cantidad de picos que
aparecen en el mismo tiempo con el azul. De acuerdo a la ecuación entonces a mayor frecuencia
tenemos mayor energía, es por eso que se dice que cuando vamos bajando la longitud de onda en el
espectro vamos aumentando la cantidad de energía asociada para la absorción.
*Acá
tenemos la
referencia
de donde
estamos
trabajando
en la zona
del
infrarrojo
donde
aparecen
todas las
otras
zonas de
absorción.

*Lo importante es que nos quede marcado que el IR cercano ocurre entre los 0,8 a 2,5 u, el IR
fundamental o medio entre 2,5 y 25 u y el IR lejano entre 25 y 400 u.
¿Cuándo absorbe radiación IR una molécula?
Las moléculas que presentan momento dipolar son capaces de absorber energía infrarroja cuando
son irradiadas
Una molécula absorberá radiación infrarroja cuando experimente un cambio neto en su
momento dipolar como consecuencia de su movimiento de vibración o rotación
A > diferencia de electronegatividad en los átomos > momento dipolar > intensidad de absorción.
Especies homonucleares(O2, N2, o Cl2) no poseen momento dipolar => no absorben al IR.
*Para que haya absorción IR necesita tener una conjunción de energías o una sumatoria de energías
vibracionales y rotacionales, mientras que esas vibraciones o rotaciones están dadas por el cambio
del momento dipolar de la molécula.
*Mientras más distintos son los átomos en electronegatividad va a haber mayor momento dipolar, es
decir, la molécula estará mucho mas polarizada y por lo tanto la intensidad de absorción va a ser
mayor, es decir, se van a verificar mayor cantidad de vibraciones o rotaciones interatómicas.
*Especies homonucleares que son aquellas moléculas que tienen dos átomos iguales no presentan
momento dipolar porque tienen átomos iguales y por tanto no absorben al IR.
MODOS DE VIBRACIÓN DE LAS MOLÉCULAS
En el mismo plano
*Los modos de vibración de las
moléculas pueden ser de tijera o de
flexión dentro del mismo plano, donde
vemos que los átomos que están en
rojo vemos a través de la flecha que se
mueven al centro simulando el
mecanismo en forma de tijera. Por otro
lado, tenemos el balanceo y oscilación,
el cual ocurre cuando dos átomos de la
molécula se mueven hacia el mismo
lado como está señalado con los
átomos de color rojo. Esto se da mucho a 720 cm-1 en el espectro.
Fuera del plano
*Tambien podemos tener
vibraciones fuera del plano, y aquí
hay que imaginarlo en 3D con
movimientos tanto de torsión o
aleteo, donde nos fijamos que en
el lado izquierdo que se llama
torsión está representado por la
unión carbono y dos hidrógenos
vemos que un átomo de
hidrogeno se acerca al lector y el
otro hacia el fondo si nos lo
imaginamos en 3D, es decir, se
mueven en sentido opuesto. En cambio, en el aleteo tenemos ambos átomos de hidrogeno donde
ambos van hacia la misma dirección tanto dentro del plano como hacia fuera del plano.
*Aquí tenemos representados los métodos
vibracionales que ocurren en el mismo
plan, fuera del plano y además abajo están
las definiciones de los tipos de flexión
donde en el caso de la izquierda que es
una flexión asimétrica que se da mucho en
el grupo metilo, mientras que la flexión
simétrica tambien donde tenemos los
átomos en azul que están flexionando el
enlace al mismo tiempo y por eso se
denomina asimétrica, mientras que el
izquierdo ocurre la flexión asimétrica de manera asincrónica, ósea uno primero y después el otro.
UTILIDAD PARA EL ANÁLISIS DE MEDICAMENTOS
ANÁLISIS CUALITATIVO
1.-Un medicamento puro producirá un espectro infrarrojo único
2.-Isómeros tienen igual espectro infrarrojo
3.-El número de bandas de absorción depende del número de átomos de la molécula
*Esencialmente la utilidad para el análisis de medicamentos será de tipo cualitativo, en los que hay
que tener en consideración que un medicamento puro producirá un espectro IR único, salvo que el
compuesto tenga algún isómero y en ese caso el espectro será exactamente el mismo. Debido a que
el número de bandas de absorción dependerá del número de átomos de la molécula tendremos que
a partir de la interpretación de cada una de esas bandas podemos llegar a la estructura de la molécula.
NÚMERO DE BANDAS DE ABSORCIÓN EN EL ESPECTRO IR
*En general se acostumbra a indicar que el número
de vibraciones para una molécula no lineal o lineal
puede calcularse a partir de la ecuación indicada,
donde N corresponde al número de átomos totales
que tiene una molécula. Así podríamos llegar al
numero de bandas que tendremos en el espectro
con los numero de vibraciones.
*El numero de bandas disminuye cuando la
molécula presenta un bajo momento dipolar que se
puede deber a que la diferencia de EN de los
átomos que conforman la molécula no es tan elevada y por lo tanto el momento dipolar no es tan alto,
en moléculas simétricas o con mucha rigidez estructural también disminuye el número de bandas o
bien tambien por degeneración de bandas.
*El número de bandas aumenta principalmente en los compuestos aromáticos por bandas armónicas
o de sobretonos, es decir, por ejemplo en la zona entre los 1650 y los 1450 cm-1 es donde ocurre la
absorción característica de las flexiones Carbono Hidrogeno de los aromáticos, pero esas mismas
bandas de absorción se repiten a valores más altos del espectro, por ejemplo pueden aparecer cerca
de los 2000 o 2200 pero ahí con menor intensidad, es como un espejo de bandas que puede ocurrir
más arriba tambien.
DIAGNOSIS ESTRUCTURAL
*La principal aplicación es el análisis cualitativo
y a eso le llamamos en general diagnosis
estructural, la cual consiste en que si podemos
predecir el numero de bandas de absorción
vamos a poder hacer el ejercicio inverso, es
decir, a partir de las bandas de absorción poder
conocer la estructura de la molécula, así
podemos calcular la frecuencia a la que se
producen y entonces se puede realizar el
análisis inverso.
ANÁLISIS CUANTITATIVO
Se basa en la Ley de Beer
Se selecciona una banda de absorción:
•Bien resuelta
•Específica
•Intensa
Para mayor especificidad seleccionar dos bandas
*Para el análisis cuantitativo, el cual es de menor aplicación tal como mencionaba al inicio se basa en
la ley de Beer. Ahí se selecciona una banda de absorción que tiene que estar bien resuelta, tiene que
ser especifica e intensa. Es por esto que es dificil cuantificar en IR ya que en general las bandas nunca
están bien resueltas porque siempre hay superposición de bandas o traslape de bandas de absorción,
es decir, no termina de aparecer una y hay una segunda banda asociada, es por esto que cuesta que
podamos aislar y hacer especifico el análisis cuantitativo.
*Otra posibilidad es seleccionar dos bandas para dar mayor especificidad al análisis, pero en esa
selección tenemos que tener en las características que sean ambas bandas bien resueltas, sean
especificas e intensas.
MUESTRAS
*Las muestras que se pueden probar son las que
aparecen en la izquierda, las cuales corresponden
a muestras liquidas, gases, solidos o solidos en
solución, para esto va a ir variando el tipo de
dispositivo en el cual depositemos la muestra y
pueda ser irradiada en el espectrofotómetro de
manera que puedan absorber al IR, entonces para
líquidos y gases se disponen de celdas herméticas
que permiten la irradiación de esa muestra y por
tanto la absorción de energía IR. En el caso de
solidos o solidos en solución, lo que se hace es
mezclar una cantidad de la muestra con una sal de KBr, esto en una proporción no más haya de un
2% de la muestra y un 98% de la sal de bromuro de potasio, donde se mezcla y se tritura todo esto y
luego se coloca en una prensa especial que genera una suerte de pastilla de bromuro de potasio que
va a tener dispersa a la muestra que está al 2% en ella. Luego de tener la pastilla se coloca en el
espacio óptico, se irradia con IR y se produce la absorción al IR. La consideración es que todo debe
estar libre de agua.
UTILIDAD EN ANALISIS DE MEDICAMENTOS
*La utilidad en el Análisis de
medicamentos es de análisis
cualitativo que puede realizarse de
dos formas, una puede ser
preparando las muestras, leyéndolas
en el espectrofotómetro y tambien
preparar el estándar de la muestra y
leerlos en el espectrofotómetro y luego
compararlos al espectro obtenido, de
esta manera podemos confirmar la identidad del compuesto que sospechamos. La otra alternativa es
que preparemos nuestra muestra, la leamos al espectrofotómetro, obtengamos nuestro
espectrograma y luego la comparamos con una biblioteca de espectros. Si lo realizamos con las
farmacopea de estados unidos, lo que se realiza es por comparación de estándares, en cambio en la
farmacopea británica y europea lo que se propone es que preparemos la muestra, tengamos el
espectro y luego lo comparemos con los que ya están almacenados en la misma biblioteca de
espectros que trae la farmacopea.
NO EXISTEN DOS COMPUESTOS CON EL MISMO ESPECTRO IR A NO SER QUE SEAN
ISOMEROS Y QUE EL ANALISIS CUALITATIVO TIENE UNA MENOR SENSIBILIDAD QUE EL UV.
INTERPRETACION DE ESPECTROS
*Para la interpretación de los espectros, si
nosotros planteamos acá en espectro de la
longitud de onda entre 4000 y 1000
tenemos vibraciones de flexión de CH entre
los 3000 y 2800 cm-1, eso es algo que
siempre tenemos que encontrar en las
moléculas por lo tanto siempre hay que
buscar en esa zona, ya sean carbonos de
alcanos, alquenos o alquinos esa banda puede ir desplazándose. Entre 3200 y 3500 aproximadamente
vamos a observar las vibraciones de tensión Oxigeno e hidrogeno provenientes de alcoholes, mientras
que entre 3500 y 3800 aproximadamente podemos encontrar vibraciones de tensión nitrógeno e
hidrogeno provenientes de compuestos aminados o aminas propiamente tales. Entre los 2100 y los
2300 cm-1 podemos encontrar los triples enlaces de acetileno o los triples enlaces de alquino, mientras
que los dobles enlaces C-C, C-N, C-O los vamos a encontrar entre la zona de 1500 y 1800. Lo más
importante de acá es la zona de la huella digital que se encuentra entre los 1460 y los 900 cm-1, la
cual es la zona en donde tenemos que interpretar las bandas que existen de manera que podemos
llegar a la estructura de la molécula completa complementado con las otras absorciones a números
de onda mayores.
 *Acá tenemos una tabla para
recordar la interpretación de
espectros.
*Para el OH que dice enlace
de hidrogeno significa si
puede o no formar puentes
de hidrogeno.
*En azul tenemos
compuestos que tienen
grupos carbonilos en general
en donde ocurre la vibración
general entre 1700 a 1780
dependiendo del tipo de
estructura.

INTERPRETACIÓN DE ESPECTROS
*Esto es lo mismo que observamos en la tabla anterior pero
ordenado de otra manera que podremos ver en la tabla de
IR que suba a INFODA.
 *A modo de ejemplo incluyo estos 3 espectros de IR,
en donde todos ellos contienen la misma cantidad de
átomos de carbono e hidrogeno. La diferencia está
dada por la ramificación presente en la molécula. En el
primer caso encontramos el Hexano, el cual es una
cadena lineal donde encontramos la absorción
característica en la primera banda de la tensión
carbono hidrogeno que se encuentra entre 3800 a
3000, enseguida tenemos la banda del grupo metileno
que se encuentra en los 1460 y luego tenemos el peak
solitario que se encuentra ahí, el cual ocurre a los 1380
que es inequívocamente el grupo metilo simétrico.
*En el espectro de al medio se repite la banda de
intensidad grande entre los 3000 y 3800, luego viene
el metileno a los 1460 y enseguida tenemos un doble
peak que corresponde al iso o al grupo metilo de un
grupo iso, el cual es un doblete con exactamente la
misma intensidad.
*En el último caso nuevamente tenemos la banda entre
los 3000 y 3800 característica de la flexión de la
tensión carbono hidrogeno de los alcanos, el peak de
los 1460 de los metileno y enseguida tenemos un
doble peak con distinta proporción a diferencia del
caso de al medio, en este caso encontramos este
doblete en proporción 1:2, lo que significa que la
molécula esta estructurada con un grupo ter butilo,
entonces esa es la diferencia que encontramos en un espectro respecto a la ramificación, donde
vemos el mismo número de átomos de carbono, mismo número átomo de átomos de hidrogeno donde
vemos en la línea roja la diferencia que nos permite llegar a la conclusión de que en un caso está mas
ramificada que otro.
 VALIDACIÓN DE METODOS ANALÍTICOS
*Veremos un tema muy relevante que corresponde a la validación de métodos analíticos. Cuando uno
hace un análisis de un producto farmacéutico e informa un resultado, el método que utilizo para hacer
ese análisis debe estar validado.
INTRODUCCIÓN
Definición:
Proceso que establece, mediante estudios de laboratorio, que las características de desempeño del
método cumplen los requisitos para las aplicaciones analíticas previstas
*Que este validado significa que el método sirve para el propósito para el cual se utiliza. Ahora para
demostrar esto tenemos que hacer una serie de pruebas en el laboratorio, obtener evidencia de estas
pruebas y hacer un informe. Estas pruebas deben estar dentro de ciertos limites para que sean válidas.
Objetivo:
Obtener evidencia documentada que permita confirmar que los resultados obtenidos son confiables
*El objetivo final de realizar una validación de un método analítico es demostrar que los resultados
que uno informa con ese método son confiables.
PARÁMETROS
Los parámetros de una validación son los que se presentan a continuación:
1. Exactitud
2. Precisión
3. Especificidad
4. Límite de Detección
5. Límite de Cuantificación
6. Linealidad
7. Intervalo
8. Robustez
I: Cuantificación de componente activo de materias primas o de productos farmacéuticos
II: Cuantificación de impurezas y productos de degradación
III: Pruebas de identificación
*No todos estos parámetros es necesario
medirlo para todos los métodos, según la
farmacopea existen tres tipos de métodos
que aparecen señalados previamente.
En el primer caso los límites de
cuantificación y detección no es necesario
medirlos ya que las concentraciones en
una materia prima o en un producto farmacéutico son altas.
*En la segunda categoría si hay que medir el LOC, pero no es necesario medir el LOD.
*En una prueba de identificación solamente es necesario determinar la especificidad
EXACTITUD
Definición
Es la proximidad entre los resultados obtenidos por el método y el valor verdadero
Debe ser establecida a través del intervalo del método
*El primer parámetro corresponde a la exactitud que se define como la cercanía entre los resultados
obtenidos por el método y el valor verdadero, supongamos que el valor verdadero es 100, entonces lo
ideal es que el valor que obtengamos con el método analítico sea lo mas cercano posible a 100.
Determinación:
Recuperación del Analito
- Se agregan concentraciones conocidas de estándar del analito a una matriz blanco (Todo menos el
analito) a diferentes niveles de concentración y luego se calcula el porcentaje de recuperación.
- Se analizan 3 concentraciones (baja-media-alta) y 3 determinaciones en cada concentración.
(Finalmente se realiza en 9 mediciones).
- Se realiza tratamiento de muestra completo.
*Hay distintas maneras de medir la exactitud y una de las mas utilizadas se denomina recuperación
del analito, acá lo que se hace es lo explicitado anteriormente. Entonces agregamos el estándar a la
matriz, hacemos el tratamiento de muestra completo, medimos la muestra y comparamos el resultado
que está medido y comparamos el resultado que tenemos medido con el que sabemos que tiene y ahí
se calcula el porcentaje de recuperación.
RECUPERACIÓN
- Forma farmacéutica: la matriz es una mezcla de
todos los excipientes de la formulación.
- Valoración: el promedio de recuperación debe ser
100 ± 2 % en cada concentración, sobre un rango del 80 a 120 % de la concentración objetivo.
*Para calcular el porcentaje de recuperación vamos a tener la ecuación de arriba donde tenemos el
promedio del valor observado, ya que una medición cuantitativa se hace en duplicado, dividido el valor
real de la cantidad que sabemos que agregamos. Puede ser que nosotros agreguemos 100, hagamos
todo el tratamiento de muestra y finalmente obtengamos 98, por lo tanto, el porcentaje de recuperación
va a ser de un 98%. Ahora si esto se realiza en una forma farmacéutica como por ejemplo un
comprimido, la matriz en este caso es una mezcla de todos los excipientes de la formulación, si se
trata de otro tipo de muestras como por ejemplo un producto de origen animal o vegetal, la matriz
corresponde a otra cosa.
*En el caso de un producto farmacéutico, la norma exige que el porcentaje de recuperación debe estar
de entre un 98 a un 102% sobre un rango de un 80 al 120 % de la concentración objetivo, ósea
supongamos que tenemos una curva de calibración con 5 puntos de 25, 50, 75, 100 y 125, el punto
medio de la curva es 100 y esa generalmente es la concentración objetivo, entonces si tenemos que
el punto medio es 100 ese será nuestro 100%, lo vamos a hacer a un 80% y a 120%, entonces ese
es el rango que se emplea para un producto farmacéutico.
Ej. Se evaluó el porcentaje de recuperación de ácido acetilsalicílico en comprimidos de aspirina ,
obteniendo los siguientes resultados:
*Acá tenemos un ejemplo
en donde se determino el
porcentaje de
recuperación desde
comprimidos de ácido
acetilsalicílico, entonces
acá se hace una mezcla
con todos los excipientes,
a esta mezcla se le
agrega un cantidad
determinada de estándar
de ácido acetilsalicílico,
sabiendo lo que agregamos, hacemos todo el tratamiento de muestra y obtenemos una solución, por
lo tanto, tenemos una concentración agregada según la cantidad de ácido acetilsalicílico que
agregamos a nuestra mezcla blanco. Esto lo realizamos a tres niveles de concentración, por ejemplo,
al 80, al 100 y al 120%, se realiza todo el tratamiento de muestra y se realiza la medición, eso
correspondería a la concentración medida, por lo tanto, tenemos la concentración agregada,
concentración medida y así podemos obtener el porcentaje de recuperación.
Implica tratamiento de
muestra COMPLETO
Cuantificar contra un
estándar SIN tratamiento
muestra (REFERENCIA)
*Aquí nos esquematizan
para tener mas claro como
se realiza, donde tenemos
los 3 niveles, el 80, el 100
y el 120%, a esos 3 niveles de la curva de calibración se hace el estudio de la recuperación, en cada
uno de los niveles se hace triplicado, esto no significa inyectar 3 veces, sino que quiere decir que
hacemos 3 matraces distintos donde pesamos y hacemos todo el tratamiento de muestra de forma
independiente. Ahí tendremos nuestro triplicado y a cada concentración vamos a tener un promedio
más menos una desviación estándar porque vamos a tener 3 valores, entonces vamos a tener un
porcentaje de recuperación a cada uno de los 3 niveles de recuperación y cada porcentaje de
recuperación para un producto farmacéutico debe estar entre un 98 a un 102%, aquí la norma es bien
exigente ya que el porcentaje de recuperación es bien alto, ya que los productos farmacéuticos no
requieren un tratamiento de muestras muy complejos, si nos vamos al área de industria de alimentos
ahí generalmente se obtienen recuperaciones cercanas al 90%, bastantes mas bajas a un producto
farmacéutico ya que en un alimento las etapas de un tratamiento de muestras son mayores que en un
producto farmacéutico. Acá hay que recordar que el tratamiento de muestra es completo, ósea como
nos decía no basta inyectarlo 3 veces sino que hay que hacer la muestra 3 veces y obviamente si
estamos haciendo un análisis por absorciometría o por cromatografía tenemos que cuantificar contra
un estándar y así hacer un cálculo por interpolación en la curva de calibración o por la ecuación altura
o absorbancia de la muestra partido altura o absorbancia del estándar por la concentración del
estándar sería el resultado de la concentración de la muestra.
PRECISIÓN
Definición
Es el grado de concordancia entre ensayos individuales cuando el procedimiento se aplica
repetidamente a múltiples muestreos de una muestra homogénea
Se expresa en términos de la desviación estándar (S) o de la desviación estándar relativa (RS) de una
serie de mediciones
*La precisión corresponde a que si nosotros realizamos 5 veces un análisis las 5 veces
nos debe dar un resultado similar, esto se mide en función de la desviación estándar
que es un parámetro que mide la variabilidad de los resultados o de la desviación estándar relativa
que es simplemente la desviación estándar porcentual. Arriba tenemos la ecuación de la desviación
estándar relativa que es la desviación estándar dividida por el promedio multiplicada por 100.
Determinación
1. Precisión entre ensayos
Es la precisión del método bajo las mismas condiciones de operación (mismo analista, mismo
equipamiento) en un corto periodo de tiempo
- Se analizan 3 concentraciones (baja-media-alta) y 3 determinaciones en cada concentración, o se
realizan 6 determinaciones al 100% de la concentración objetivo.
- Se realiza tratamiento de muestra completo.
*En la precisión existen dos mediciones que son muy importantes, una es la precisión entre ensayos
que es la precisión del método bajo las mismas condiciones de operación, por ejemplo, el mismo
analista, el mismo equipamiento, en un corto periodo de tiempo.
*Aquí se hace al igual que la exactitud a 3 niveles de concentración en triplicado cada nivel o tambien
se pueden hacer 6 determinaciones al 100% de la concentración objetiva, ósea al punto medio de la
curva de calibración. Aquí al igual que en la exactitud tenemos que hacer el tratamiento de muestra
completo, inyectar y luego según los resultados que obtenemos calculamos el coeficiente de variación.
2. Precisión intermedia
- Expresa variaciones dentro de un laboratorio. Puede realizarse en diferentes días (3-5 días),
diferentes analistas o diferente equipamiento.
- Se realiza tratamiento de muestra completo.
*Otra medición que se hace es la precisión intermedia que es lo mismo que hacíamos antes, pero en
distintos días, con distintos analistas o con distintos equipos. Cuando uno lo hace en distintos días,
generalmente con 3 días es suficiente, diferentes analistas pueden ser 2 analistas, diferente
equipamiento pueden ser 2 equipos distintos. Aquí al igual que en la determinación anterior tambien
tenemos que realizar el tratamiento de muestra completo, si lo hacemos el día 1, no es que guardemos
nuestras soluciones refrigeradas y después la aplicamos otro día para decir que hacemos una
precisión intermedia, sino que tenemos que al segundo día tenemos que preparar toda la muestra de
nuevo, todo el tratamiento de muestra 1 después analizarlo.
Ej. Se evaluó la precisión entre ensayos en un estudio para determinar niveles de prednisona en
sangre.
*Aquí tenemos un ejemplo de la
determinación de la precisión en un estudio
que se hizo para determinar prednisona en
sangre, aquí vemos que hay 3 soluciones,
una concentración baja, media y alta, según
los puntos de la curva y cada una de estas
concentraciones se hizo 3 veces y ahí están
los valores medidos en unidades de
concentración y ahí se observa al final el promedio con la desviación estándar y el coeficiente de
variación. Ese coeficiente de variación en este caso es bastante bajo llegando a ser menor al 2%, la
norma para productos farmacéuticos exige que sea menor al 2% y en este caso se esta cumpliendo.
ESPECIFICIDAD
Definición
Es la capacidad de un método analítico para medir inequívocamente el analito que se quiere
determinar, en presencia de otros constituyentes que pudiera tener la muestra, como excipientes,
metabolitos e impurezas.
*La especificidad se refiere a que el método debe permitir medir el analito que estamos determinando
en presencia de otros compuestos que pudiera tener la muestra, por ejemplo, si tenemos un producto
farmacéutico, esa muestra va a tener excipientes, por lo tanto, debemos demostrar que esos
excipientes no interfieren en la determinación, si estamos midiendo un medicamento en un líquido
biológico y ese medicamento tiene metabolitos, debemos demostrar que esos metabolitos no
interfieren en la identificación del compuesto que estamos analizando.
Determinación
1. Interferencias
- Agregar niveles apropiados de los compuestos que potencialmente podrían interferir en la
determinación del analito de interés para demostrar que no interfieren.
- Método cromatográfico calcular resolución (Rs  1,5).
*Una manera de evaluar la especificidad es mediante el estudio de las interferencias, en que uno
agrega estos posibles compuestos que pudieran estar presentes en la muestra, lo agregamos a
nuestra muestra y vemos si produce o no produce una interferencia. Si estamos trabajando con un
método cromatográfico debemos demostrar una separación adecuada entre el pico del analito que
estamos determinando y de esa posible interferencia, por lo tanto, si analizamos una muestra que
tiene esta interferencia vamos a estar seguros de que no va a afectar el resultado.
2. Utilización de detectores específicos electroquímico, fila de diodos
*Otra forma es por ejemplo en cromatografía utilizando detectores específicos como el electroquímico
o arreglo de diodos que nos permite determinar la pureza de un pico y así demostrar que no hay
coelución de peaks.
Ej. Determinación prednisona en sangre
Interferencias: Ibuprofeno : Rs = 2,5
*Aquí tenemos un ejemplo en un método
cromatográfico en que se hizo el estudio de la
especificidad en el mismo ejemplo anterior de
la determinación de prednisona en sangre y en
este caso a los pacientes se les daba
ibuprofeno como antipirético y en este caso lo
que se hizo es demostrar que el pico del
ibuprofeno tiene una resolución adecuada con
el de la prednisona y así no interfiere con su
determinación.

LÍMITE DE DETECCIÓN
Definición
Es la menor concentración de analito en una muestra que puede ser detectado, pero no
necesariamente cuantificado, bajo las condiciones experimentales establecidas
*El límite de detección corresponde a la menor concentración de analito que puede ser detectado, no
necesariamente cuantificado, pero si detectado bajo las condiciones del análisis.
Determinación
1. Basado en la relación señal / ruido
Se realiza comparando las señales de muestras con concentraciones bajas del analito y muestras
blanco y estableciendo la concentración mínima en que el analito puede ser detectado con seguridad
Generalmente se acepta una relación señal/ruido
3:1 para la estimación del LD
*Una forma que es bastante antigua pero aun esta vigente en la farmacopea es la basada en la relación
señal/ruido, aquí lo que se hace es comparar la señal de una muestra que tenga una concentración
baja del analito y una muestra blanco que no tiene analito para que tengamos la línea base y así se
acepta que una relación señal ruido 3:1 es la adecuada para estimar el limite de detección.
RELACIÓN SEÑAL/RUIDO

*Por ejemplo acá tenemos la inyección de una muestra a

una concentración baja y se ve abajo el ruido que produce
el instrumento y por lo tanto una relación señal/ruido de 3:1
es adecuada para el límite de detección, para el límite de
cuantificación que vamos a ver a continuación es adecuada una relación señal ruido de 10:1.
2. Basado en la desviación estándar de la respuesta y la pendiente.
, se puede determinar sobre la base de la DS del
blanco (analizando un número apropiado de blancos)
o de la DS del intercepto de la curva de calibración
*Otra forma que es bastante utilizada para determinar el Limite de detección es basada en la
desviación estándar de la respuesta y la pendiente, acá tenemos la ecuación que se utiliza donde
sigma corresponde a la desviación estándar de la respuesta y se puede determinar por ejemplo si el
blanco en algunos métodos produce una señal se puede determinar la desviación estándar del blanco
y si no hay un blanco que mide una señal como por ejemplo en cromatografía el blanco no da una
señal, se puede hacer sobre la desviación estándar del intercepto de la curva de calibración y esto es
partido por la pendiente de la curva de calibración, este método es un poco mas complejo y no se
ahondara en él.
LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN
Definición
Es la menor concentración de analito en una muestra que puede ser cuantificada con precisión y
exactitud aceptables bajo las condiciones experimentales establecidas
*El límite de cuantificación a diferencia del límite de detección es la menor concentración del analito
que puede ser cuantificada con precisión y exactitud según las condiciones analíticas.
Determinación
1. Basado en la relación señal / ruido
Se realiza comparando las señales de muestras con concentraciones bajas del analito y muestras
blanco y estableciendo la concentración mínima en que el analito puede ser cuantificado con
seguridad. Generalmente se acepta una relación señal/ruido 10:1 para la estimación del LC
*Se puede determinar de la misma manera que el Límite de Detección basado en la relación señal
ruido utilizando una relación señal/ruido de 10:1.
2. Basado en la desviación estándar de la respuesta y la pendiente.
, se puede determinar sobre la base de la DS del
blanco (analizando un número apropiado de blancos) o
de la DS del intercepto de la curva de calibración
*Tambien por la desviación estándar de la respuesta y la pendiente, en este caso en la ecuación va
un 10 en vez de un 3,3. Ahora como estas son ecuaciones matemáticas, una vez que uno obtiene el
límite de cuantificación debe demostrarlo experimentalmente preparando muestras al valor que
determinamos del limite y viendo si realmente se pueden o no se pueden cuantificar.
LINEALIDAD
Definición
Es la capacidad de un método analítico de obtener resultados directamente proporcionales a la
concentración del analito en un determinado intervalo.
Determinación
- Se recomienda utilizar al menos 5 concentraciones del analito.
- Determinación de la recta de regresión lineal entre la respuesta y la concentración (nube de puntos).
- Ecuación de la recta: (y = mx + b), intercepto (b), pendiente (m) y coeficiente de determinación (r 2).
*Se determina utilizando a lo menos 5 concentraciones del analito para que sea estadísticamente
valida esa curva de calibración, y lo que se hace es determinar la recta de regresión lineal entre la
respuesta y la concentración. Aquí se utilizan los puntos individuales, no hay que promediar, es decir,
si medimos 3 veces la concentración 1 no hay que promediar los valores, sino que se trabaja con cada
uno de los valores individuales, eso es lo que se denomina la nube de puntos. Luego se obtiene la
ecuación de la recta en que se obtiene el intercepto, la pendiente y el coeficiente de determinación
(R^2) que varia entre 0 y 1, mientras mas cercano al 1 significa que la curva es más lineal.
*Aqui nos pone un ejemplo
de una curva de calibración,
donde si nos fijamos hay 5
niveles de concentración en
que cada nivel esta hecho
en triplicada y si
observamos en la tabla aquí
lo que se hace es repetir la
concentración con los
valores que se obtuvieron
en cada uno de los puntos y así se obtiene esta nube de puntos y curva de calibración en que se
obtiene la mejor recta con todos los puntos individuales. Las curvas siempre hay que hacerlas como
nube de puntos, nunca promediarlas ni comenzarlas con 0.
INTERVALO
Definición
Es el intervalo de concentraciones entre el nivel superior e inferior en que el método analítico ha
demostrado una adecuada precisión, exactitud y linealidad
*Ósea es el rango de concentraciones en que estamos trabajando.
Determinación
- Se recomienda utilizar un intervalo que abarque posibles concentraciones del analito en estudio, con
un exceso de al menos 50% sobre el límite superior y un defecto de 50% debajo del límite inferior: 50-
75-100-125-150%.
- Producto farmacéutico: 80 - 120 % de la concentración objetivo.
*Este intervalo para la mayoría de los métodos es desde un 50% bajo el limite inferior y un 50% sobre
el limite superior de lo esperado que obtendríamos en las muestras. Si es un producto farmacéutico,
en los productos farmacéuticos no nos vamos a encontrar con muestras con tan distintas
concentraciones, ya que se preparan por ejemplo los comprimidos de aspirina todos se van a preparar
a 500, no vamos a encontrar uno de 100 o uno de 1000, por lo tanto, los productos farmacéuticos los
intervalos son más acotados y lo que dice la norma es que tiene que ser de un 80 a un 120% de la
concentración objetivo
ROBUSTEZ
Definición
Es la medida de la capacidad de un método analítico de permanecer inalterado luego de realizar
pequeñas variaciones en parámetros del método. Proporciona información sobre la confiabilidad del
método durante su uso habitual en el laboratorio
*La robustez se refiere a que luego de realizar modificaciones pequeñas en algún parámetro del
método, demostremos que esa variación no afecta el resultado, porque puede ser que por ejemplo
preparemos la fase móvil en cromatografía, la preparemos una semana o la siguiente donde no
siempre nos va a quedar exactamente igual, quizá en algún momento la tengamos 50:50 metanol agua
y a veces tenemos 49:51 metanol agua y hay que demostrar que esa variación no va a alterar el
resultado del método.
Determinación
1. Cambios en el pH de la fase móvil
2. Cambios en la composición de la fase móvil
3. Diferentes columnas (lotes o proveedores)
4. Temperatura
5. Flujo
Medir eficiencia, resolución, tR
*Las variaciones más habituales por ejemplo en un método cromatográfico si estamos trabajando con
un tampón tenemos que variar el pH de la fase móvil, esta variación es pequeñita, por ejemplo, si
estamos con un pH 3,5 lo variare a 3,3 y a 3,7, una variación pequeña, luego tenemos cambios de
composición de la fase móvil, variando el porcentaje de modificador orgánico, por ejemplo, si lo
estamos usando en un 30%, probarlo en un 28 y en un 32%, diferentes columnas, la temperatura en
una cromatografía de gas, que pasa si subo y bajo 2°C, el flujo. Todos esos valores le podemos hacer
pequeñas variaciones y medir por ejemplo algún parámetro cromatográfico como la eficiencia, la
resolución o el tiempo de retención y compararlo con el valor que tenia sin hacer el cambio y ahí
determinar si influye o no influye, puede ser que encontremos que sobre alguna modificación que se
realice si se produce un cambio importante, pero eso no quiere decir que el método no sirve,
simplemente hay que decir que esa condición afecta la determinación por lo tanto hay que tener mucho
cuidado en la preparación de la fase móvil con el pH si encontramos que en la variación pequeña del
pH se produce algún efecto.
BIBLIOGRAFÍA
Farmacopea de los Estados Unidos de América, 41th ed; The United States Pharmacopeial
Convention, Rockville, USA. (2019)
International Conference on Harmonization, ICH guideline Q2 (R1), Validation of Analytical
Procedures: Text and Methodology, Step 4 Version. (2005).
*Eso sería todo, acá tenemos la bibliografía donde salen estos parámetros, la norma que está en la
farmacopea de los Estados Unidos y en otra norma que se denomina conferencia internacional de
harmonización que es una norma que hay de todo tipo de normas para los productos farmacéuticos.