Primera edición 2001

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2001. CORPORACIÓN HERAION

Ciencia e Ingeniería Agroindustrial
Personería Jurídica N° 659
Registro Notarial N°
Cra 4 C # 40 A 20 Macarena, Ibagué
E-mail: heraion@latinmail.com
heraion@ uol.com .co

Printed in Colombia
________________________
 Director
Edberto Quintero García
Bacteriólogo.
Universidad de los Andes
Profesor de Microbiología
Universidad del Tolima

Autores

Departamento de Ciencia e Ingeniería Agroindustrial

Corporación Heraion

Edwin Leonardo Cortazar Cifuentes* Oscar Alberto Quiñones Mora *

Cesar Augusto Cortés Molina *
Johann Giovanny Gómez Zuluaga*
Kathryn Yadira Guzmán Pacheco*
Mauricio Javier Herran Novoa*
Jorge Andrés Ortiz Correa*
Jorge Enrique Palomino Andrade*
Melanie Teresa Ramírez Jaramillo*
Diana Carolina Rincón Téllez*
Iván Darío Rubio Fandiño*
Yesid Fernando Torres Ramos*
Henry Alexander Vaquiro Herrera*

* Estudiantes de Ingeniería Agroindustrial en el 2001.

Universidad del Tolima.

________________________
 PRÓLOGO
En el ámbito industrial se requiere de la gran
capacidad de cada uno de los entes activos
dentro de los procesos, tanto así de los
operarios como de lo supervisores
encargados de la producción. En todo el
prospecto ingenieril de los procesos químicos
e industriales se deben optimizar los
resultados con base en un correcto manejo de
las variables presentes, permitiendo de esta
manera el constante cambio de los factores de
producción en la afanada búsqueda de
controlar todo lo que a nuestro alrededor
interactúa y obtener el máximo beneficio que
la naturaleza nos ofrece.
Para todo aquel que deba involucrarse con
la transformación de la materia total o
parcial, es necesario que conozca con
profundidad los conceptos y principios de
tales procesos, de los agentes que intervienen
en ellos y de sus posibles variables, con el
propósito de controlarles y canalizarles hacia
un objetivo en particular. Se debe
comprender que la marcha del proceso
depende solo de los factores físicos que
intervienen en él, así como de las
condiciones en las cuales se encuentra el
sistema.
Quien desee tener la capacidad de controlar
todos los factores de producción dentro de
un proceso determinado, debe empezar por
conocer con cierta profundidad los conceptos
básicos de todo lo que involucra un proceso
agroindustrial.
Es así como surge la necesidad de abarcar los
conceptos primarios de las ramas que
intervienen dentro del contexto
________________________
agroindustrial. Las áreas del conocimiento
que integran un concepto profundo sobre
agroindustria son considerables en número,
pero se derivan fundamentalmente de las
ramas aplicadas como la Biología, las
Matemáticas, la Física y la Química,
incluyendo dentro del concepto integral de la
agroindustria las ramas de la Sociología y la
Economía. Cada una tiene una incidencia
importante dentro de este contexto y
extienden sus ramas dentro de nuestro
estudio agroindustrial.
Para este caso en particular emprenderemos
un viaje a través de la Biología,
adentrándonos en la aplicación palpable de
tal ciencia como eje del control orgánico
dentro de un proceso productivo. Quizá el
estudiante que inicia esta empresa al
conocimiento, no tenga claro el concepto de
vida dentro de este marco, sin embargo el
objetivo de este manual es proyectar al
estudiante hacia una visión objetiva del
dominio de un proceso, con la ayuda que nos
ofrece la naturaleza y la ciencia.
La Microbiología es una de las ramas
extendidas de la Biología, de fundamental
importancia dentro de este proceso
cognoscitivo, es el vehículo por el cual el
estudiante podrá comprender muchos de los
procesos biológicos que suceden a voluntad
o inherentemente dentro del mundo de la
transformación de la materia.. Conocerla nos
permitirá ganarle espacio a la naturaleza y
potencializar los beneficios que ella nos
brinda. Unas buenas bases de Microbiología
permitirán al estudiante dominar nuevos
conceptos que se avecinan en el desarrollo
de su conocimiento. Por lo cual dependerá describen el procedimiento de los
del empeño con que el estudiante aborde los laboratorios, finalizando con unos
temas y decida profundizar de acuerdo a su interrogantes que buscan incentivar a los
conciencia de aprendizaje y dominio del estudiantes a la investigación y a la
contenido. retroalimentación de los temas.

Como se ha enunciado anteriormente, el Este manual de Microbiología está diseñado

objetivo es enfocar al estudiante hacia la no solo como una guía de laboratorio en la
apreciación objetiva de la intervención de los asignatura en particular, sino que facilita al
microorganismos en los diferentes procesos, profesional una orientación en su ejercicio
así mismo el conocimiento de los mismos laboral. Fue diseñado por estudiantes de
como agentes causantes de la contaminación Ingeniería Agroindustrial, asesorados por
en los alimentos, el manejo de muestras, su profesionales expertos en el área, con el
previa identificación y posterior eliminación. animo de unificar el criterio de la
Microbiología dentro de los procesos
Para la Agroindustria es importante agroindustriales.
conocerlos no solo por la anterior afirmación,
sino además por su gran utilidad y eficiencia Esperamos que el manual cumpla con su
en el desarrollo de algunas funciones dentro objetivo y sea de válida ayuda para quien lo
del organismo y fuera de este, de su papel en utilice.
los alimentos y de su utilización bioquímica
para el beneficio del hombre. Todo ingeniero
Agroindustrial ha de tener que enfrentarse en
algún momento de su carrera con dichos
microorganismos y para aquel momento ha
de conocer el procedimiento correcto de
control, buscando beneficiar su empresa y el
bienestar del consumidor.

Por tal motivo, se decidió crear el presente

manual, que consta de una serie de guías
que enseñan brevemente el tema de trabajo,
hacen una pequeña introducción del
contenido, identifican los objetivos y Los Autores

________________________
 1. BIOSEGURIDAD
“Cualquier persona que trabaje en un laboratorio, debe cumplir con las mínimas
normas que le aseguren su buen estado de salud. Debe contar con las garantías
suficientes que le permitan un trabajo en optimas condiciones.”

Bioseguridad es un termino nuevo en nuestro Bioquímica y otras áreas del

léxico, debemos partir entonces por definir
este interesante concepto. Bioseguridad
proviene de la unión del prefijo griego Bíos
que significa “vida” y el latinismo securitate
que significa “calidad de estar exento o libre
de riesgo”. Podemos entonces interpretar el
término de Bioseguridad como la garantía
de mantenernos fuera de todo peligro que
atenté contra nuestra vida.
Históricamente el principio como tal, se
empezó a aplicar a mediados del siglo XX,
con las rudimentarias formas de manipular a
los enfermos terminales y por las oleadas de
las enfermedades infecciosas que empezaron
a azotar el mundo al iniciar el siglo.
Alarmados por la cantidad de personas
contagiadas con enfermedades infecciosas
en el laboratorio, se decidió implementar
hacia 1972 lo que hoy conocemos como
normas de Bioseguridad, buscando proteger
en primera instancia a los trabajadores de la
salud y por consiguiente los desarrollos
científicos de la Microbiología, la
conocimiento; pronto se implantaron en
todos los laboratorios que manipulaban
muestras con riesgo biológico.
Las normas de Bioseguridad hacen referencia
al conjunto de procedimientos y medidas de
Bio-protección que deben ser conocidas y
practicadas por todo tipo de persona que
tenga contacto con muestras potencialmente
contagiosas en el desempeño de su trabajo en
los laboratorios a nivel universal.
Es de vital importancia que conozcamos las
normas de Bioseguridad más elementales
cuando trabajemos en el laboratorio, porque
estas nos darán las pautas que necesitamos
para el desarrollo de toda practica de ahora
en adelante.
Los Ingenieros Agroindustriales podemos
estar en capacidad de trabajar en el futuro en
un laboratorio, haciendo un control de
calidad, verificando las condiciones sanitarias
de un producto, de un proceso productivo o
de una empresa, como parte de nuestro
ejercicio profesional.

OBJETIVOS

1. Identificar las normas de Bioseguridad para aplicarlas en el desarrollo de los procesos que se
realizan en cualquier laboratorio, como base fundamental de la formación del Ingeniero
Agroindustrial, promotor de una empresa segura e higiénicamente responsable.
2. Identificar los riesgos a los que se expone el personal que labora en un laboratorio.
3. Sensibilizar al estudiante en formación, de la importancia que tiene el aplicar las normas de
Bioseguridad en el laboratorio, por su bienestar y el de sus semejantes, conservando tal actitud
en su profesión como promotor de la seguridad de su empresa.
4. Crear un ambiente de seguridad al interior del laboratorio con la constante aplicación de las
normas de Bioseguridad dentro de este.
MATERIALES
 Textos bibliográficos
 Videocintas
 Documentos sobre el tema
________________________
FUNDAMENTO
Las normas de Bioseguridad son aplicadas
universalmente en todos los laboratorios;
en particular hablaremos de aquellas que
tienen mayor incidencia en el desarrollo de
nuestro proyecto educativo de Microbiologia
Fundamental.
Conozcamos las normas generales que se
deben aplicar cuando trabajamos en nuestro
laboratorio de Microbiologia:
 Mantener el lugar de trabajo en optimas
condiciones de higiene y aseo.
 Se prohíbe fumar, beber y comer
cualquier alimento en el sitio de trabajo.
 Utilizar mecheros cuando el
procedimiento lo requiera, estableciendo
una zona de asepsia para que el material a
procesar se mantenga libre de contaminación.
 Descontaminar con desinfectante la zona
de trabajo al empezar y terminar el proceso
de manipulación de las muestras, y así
mismo cuando sucedan salpicaduras o
derramamiento de estas.
 Emplear la cámara de Bioseguridad
cuando se realicen procedimientos de alto
potencial infeccioso como la manipulación de
muestras o el uso de reactivos que requieran
condiciones asépticas.
 Descontaminar las asas bacteriológicas
directamente en la llama del mechero, o
colocarlas previamente en solución de
hipoclorito de sodio al 5.0% en caso de no
tener incinerador.
 Utilizar pipetas automáticas. Nunca se
debe pipetear con la boca, si es necesario se
debe hacer manualmente. No se debe
expulsar a la fuerza material infeccioso de
una pipeta, pues puede crear el efecto de
aerosol o salpicaduras que pueden
contaminar el ambiente.
 Hacer buen uso de la bata, cofia,
guantes y tapabocas. Si es necesario salir del
recinto, tales elementos de protección se
deben dejar dentro del laboratorio.
________________________
 No barrer, ni encerar los pisos del
laboratorio, solo se trapearán con una
solución de hipoclorito de sodio al 1.0%.
 Dar cumplimiento a una de las normas
más importantes de la prevención, que es el
lavado cuidadoso de las manos, antes y
después de cada procedimiento, así no se
tenga contacto con el material patógeno.
 Utilizar el protocolo correcto en la
realización de cada uno de los
procedimientos.
 Ser cuidadosos en caso de ruptura de
material de vidrio contaminado, el cual se
debe recolectar con escoba y recogedor,
nunca con las manos.
 Reportar inmediatamente a la persona a
cargo del laboratorio en caso de accidente de
trabajo sea por: heridas con material corto
punzante, inhalación o consumo de material
toxico o contaminado y salpicaduras en los
ojos o cualquier parte de la piel.
A parte de lo anterior, tengamos en cuenta
las siguientes recomendaciones:
 Llevar siempre puesta la bata dentro del
laboratorio, pues esta protege su ropa.
 No empezar a trabajar hasta que haya
recibido las instrucciones.
 Preguntar cuando no entienda el
método o la finalidad del procedimiento.
 Mantener en los mesones lo esencial y
al final de la sesión dejarlos limpios y libres
de material y equipo.
 Poner todo el material sólido usado en
los recipientes destinados para este fin y el
material de vidrio en las bandejas.
 Aplicar las principales normas de asepsia
para evitar el riesgo cuando se trabaja
con microorganismos contaminantes;
preservando su manejo y transferencia sin
ningún inconveniente.
 Evitar el contacto de sus manos con la
cara o cualquier otra parte del cuerpo durante
la practica, así evitara reacciones alérgicas o
dermatitis por contacto.
El beneficio que obtengamos del desarrollo
de la practica dependerá de la metodología
que apliquemos y de nuestro orden y  Concepto de residuo y clases de residuos
limpieza.  Riesgo
 Reservorio-
PROCEDIMIENTO  Sensibilidad
 Epidemiología
 Asepsia
 Identificar los riesgos para prevenir
 Antisepsia
futuros accidentes.
 Colonización
 Verificar las técnicas de prevención y de
 Descontaminación
seguridad operativa.
 Limpieza
 Revisar las técnicas e instrumentos de
 Microbiostasis
protección.
 Microbicida.
 Comprobar que los elementos básicos de
 Bactericida
protección para el desarrollo de las
 Viricida
practicas del laboratorio se encuentren
 Fungicida
disponibles.
3. ¿Cómo se relaciona la Bioseguridad con
 Reconocer y asimilar la importancia de
la Salud Ocupacional; y que papel
las normas de Bioseguridad en el
desempeña el Ingeniero Agroindustrial en
laboratorio.
dicha interrelación?.

TRABAJO COMPLEMENTARIO MÁS INFORMACIÓN . . .

1. ¿Por qué son importantes las Técnicas de
Bioseguridad en el desarrollo de la  Díaz R, Gamazo C, Goñi-López I
Ingeniería Agroindustrial? :Manual práctico de Microbiología, 2ª. Ed.
2. Definir y aprender los siguientes Masson S.A., España, 1999; 1-3.
términos utilizados en Microbiología:  Barkley, W.E., y Richardson J. H.:
 Accidente de trabajo Laboratory safety. Methods for general and
 Basura molecular Bacteriology, Gerhardt P., ed.1ª,
 Contaminación American Society for Microbiology,
 Desechos patógenos o infectocontagiosos Washington, 1994.; 715-734.
 Desinfección  Escobar M, Moncada L, Ortega M,
 Desgerminación Montoya F, ESTERIL J.: Micología. Manual de
 Decontaminación laboratorio, ed.1ª, ESTERILIZAC de
 Desperdicio ESTERILIZ, ESTERILI, 1995, 8.
 Disposición final de basuras
 Enfermedad profesional
 Enterramiento de basuras
 Posición ergonómica
 Esterilización
 Factor de riesgo
 Huésped
 Infección
 Inmunidad
 Inmunidad activa
 Inmunidad pasiva
 Inoculación
 Medidas universales de seguridad
 Normas de Bioseguridad.
 Patógeno
 Relleno sanitario de basuras
________________________
 2. ESTERILIZACIÓN

“La superación de la teoría de la generación espontánea condujo al desarrollo de

procedimientos eficaces en la eliminación de todos los microorganismos de un
objeto en un proceso que ahora denominamos esterilización”

En la Agroindustria y en otras actividades, el Existe una serie de métodos para el control de

control del crecimiento microbiano es una de microorganismos basados en el empleo de
las obligaciones actuales; debido a la agentes físicos dañinos para ellos (el calor, las
importancia adquirida en los procesos de radiaciones, etc.) o en retirarlos de las
obtención de productos inocuos y el muestras (la filtración, la sedimentación, etc.).
deterioro de los mismos; al igual, que por las Otras se basan en agentes químicos como los
normas y la legislación existente que desinfectantes y los antisépticos.
restringe el número de microorganismos
contaminantes. En el presente laboratorio consideraremos
las técnicas de esterilización básicas,
Por “control” de los microorganismos aplicadas inicialmente a procesos sencillos,
entendemos tanto la inhibición del que sirven de fundamento a operaciones
crecimiento o multiplicación microbiana sofisticadas utilizadas en procesos
como la destrucción de éstos. En este agroindustriales como son: la esterilización a
contexto los términos desinfección, asepsia, gran escala, la pasteurización, la filtración, la
antisepsia, microbiostasis y microbicida que sedimentación, la tindalización y la
trabajamos en el capitulo anterior toman utilización de agentes químicos.
relevancia.
OBJETIVOS
1. Conocer los principales métodos de esterilización que se trabajan a nivel del laboratorio de
2. Microbiologia y sus aplicaciones en la Agroindustria.
3. Aplicar los principales métodos de esterilización en el laboratorio.
4. Identificar y evidenciar las condiciones y practicas fundamentales de asepsia en el
5. laboratorio.
6. Familiarizar al estudiante con el control sanitario en el laboratorio.

MATERIALES

 Autoclave
 Estufa
 Hornos de Pasteur
 Papel craft
 Mechero
 Material de Vidrio (cajas de petri, tubos de ensayo, pipetas, erlenmeyer, etc.)
 Bioindicadores de esterilización
 Cinta de Enmascarar

________________________
FUNDAMENTO
Para llevar a cabo una técnica de
esterilización debemos conocer los
principios en los que se basa para cumplir
con su objetivo.
El objetivo de la esterilización es destruir
todos los microorganismos que hay en un
objeto o preparado, o sobre él, y asegurar
que esté libre de riesgos infecciosos.
Para cumplir con lo anterior debemos
fundamentarnos en los principios
fisiológicos de los microorganismos, por lo
cual tenemos en cuenta la relación constante
del microorganismo con su entorno para su
supervivencia. Los microorganismos
necesitan del medio en donde habitan para
vivir y de las condiciones allí reinantes, por
lo tanto si de alguna manera alteramos
cualquier condición el microorganismo se
vera en grandes aprietos para poder subsistir.
Algunos cambios en su entorno son tan
fatales que el microorganismo termina
pereciendo, como hay otros menos graves
que inducen al microorganismo a adaptarse
al medio por mutaciones genéticas,
permitiendo que este resista tal condición,
este ultimo aspecto debemos tenerlo en
cuenta, pues una esterilización inadecuada
puede ser una complicación seria más
adelante.
Luego la esterilización se basa principalmente
en la alteración brusca y repentina de las
condiciones ambientales que favorecen la
existencia del microorganismo. Las
condiciones más importantes que debemos
tener presente son: la temperatura, el nivel
de oxigeno disuelto, el pH y la existencia de
los nutrientes necesarios para que subsista,
además de otras condiciones físico-químicas
especializadas de cada especie a las que son
más vulnerables.
Los métodos de esterilización más eficaces en
el ámbito industrial son los que trabajan con
cambios de temperatura bruscos, la
tecnología se ha desarrollado mas hacia este
tipo de esterilización, tal es el caso de los
equipos que trabajan con calor.
________________________
ESTERILIZACIÓN POR CALOR
El calor puede ser aplicado para la esteriliza-
ción de tres maneras diferentes:
1. Calor húmedo. El vapor de agua es uno
de los métodos más eficaces para destruir
microorganismos y en condiciones iguales de
temperatura, es mucho más eficaz que el
calor seco (aire). Hay varias formas de
emplear el calor húmedo. El agua hirviendo
(100 °C) tiene una acción desinfectante, pero
no elimina las endosporas de ciertas bacterias
Gram positivas. Para que el calor alcance una
temperatura superior a los 100 °C,
empleamos el autoclave, pero una simple
olla a presión puede ser útil en ciertas
circunstancias. En el autoclave calentamos el
agua por encima de su temperatura de
ebullición mediante la regulación de su salida
con una válvula manométrica. A presiones
por encima de la atmosférica corresponden
temperaturas de vapor por encima de los
100 °C. Por ejemplo, 120 °C de vapor de agua
(1.1 atm) durante 15 a 20 minutos son
suficientes para esterilizar la mayoría de los
materiales y medios no termolábiles. Para
una temperatura o presión de vapor fija el
tiempo de funcionamiento del autoclave para
lograr la esterilización depende de:
a) Naturaleza del material que vayamos
esterilizar.
b) Tipo de envase utilizado para la
esterilización.
c) Volumen del material que vayamos
esterilizar. A mayor volumen es necesario
mantener el material durante períodos de
tiempos más prolongados.
Las limitaciones del autoclave están en fun-
ción de la termolabilidad de ciertos
materiales y componentes de medios de
cultivo. Igualmente, es inadecuado para
sustancias que no son miscibles en agua,
como las grasas, en las que la penetración del
vapor es muy limitada. Si lo que deseamos
esterilizar son medios líquidos, la boca del
envase la debemos taponar con algodón o
algún tipo de tapón sin realizar cierre
hermético. Sin embargo, es posible emplear el
calor para esterilizar ingredientes de medios
de cultivo o reactivos líquidos o en solución,
que no resistan ser sometidos al autoclave,
pero sí a los 100 °C. En este caso es posible
recurrir a la esterilización fraccionada.
Esta se realiza por lo común en un recipiente
donde podamos obtener vapor de agua a
la presión atmosférica normal, ya que
nunca alcanzaremos más de 100 °C.
Sometemos la muestra a varios ciclos de
calentamiento a 100 °C, con intervalos de
incubación entre los ciclos de uno o varios
días. De esta forma destruimos las formas
vegetativas, y las endosporas termo
resistentes, si están presentes, germinan
durante los intervalos de incubación y son
destruidas en el siguiente ciclo.
Uno de los usos más corrientes del calor es
la Pasteurización. Muchos líquidos
termolábiles como la leche, las natas, el
mosto y las bebidas alcohólicas entre otros
no pueden someterse a elevadas
temperaturas que desnaturalizarían sus
componentes. Para reducir el número de
microorganismos que deteriorarían estos
líquidos, o para eliminar los posibles
microorganismos patógenos, se tratan a
temperaturas que no causan una
esterilización, pero si reducen la población
microbiana a los niveles deseados. Para
efectos sanitarios, la temperatura y el tiempo
de pasteurización dependen de los
microorganismos contaminantes y patógenos
más resistente que vayamos a destruir.
2. Calor seco. El aire a temperatura elevada
podemos emplearlo también para lograr
una auténtica esterilización. El aparato más
utilizado es el horno Pasteur. que a
temperaturas de 160 a 180 °C, durante 2
horas, lo podemos emplear para esterilizar
el material de vidrio u otros materiales que
sean termo resistentes y nos interese
mantenerlos secos. Todo el material que
vayamos a esterilizar debe estar debidamente
empaquetado. Si son pipetas, en el extremo
del que se va a succionar se colocará un
pequeño tapón de algodón hidrófobo como
medida de seguridad y las envolvemos en
paquetes de papel craft o las incluiremos en
cajas metálicas.
3. Incineración. Es una de las formas más
comunes que podemos utilizar para
esterilizar los objetos empleados durante la
manipulación aséptica de los
microorganismos. En las llamas de los
mecheros Bunsen se alcanzan temperaturas
superiores a los 2500 °C, por lo que una breve
________________________
exposición es suficiente. Sin embargo, cuando
las asas de siembra están muy cargadas con
microorganismos, la aplicación directa de la
llama provoca la dispersión irregular del
contenido de aquéllas, con el consiguiente
peligro de contaminación. Un sistema
alternativo a los mecheros son los
incineradores eléctricos bacterianos, en los
que el riesgo de contaminación no existe, ya
que la dispersión es recogida en el tubo del
aparato.
La incineración en hornos crematorios tam-
bién se emplea cuando queremos destruir
material plástico contaminado o animales
muertos infectados.
ESTERILIZACIÓN POR RADIACIONES
Algunas radiaciones electromagnéticas son
letales para las células microbianas. Las
radiaciones de longitud de onda más larga
que la luz visible (ondas de radio,
microondas e infrarrojos) son de bajo poder
energético y por sí mismas no son letales para
los microorganismos, pero generan calor que,
indirectamente y según la dosis, puede tener
un efecto bactericida. Las radiaciones de
longitud de onda más corta que la luz visible
son muy germicidas. Incluyen la luz
ultravioleta y las radiaciones ionizantes (ra-
yos X, gamma y cósmicos). Por razones técni-
cas y de seguridad, es mucho más fácil
emplear la radiación ultravioleta que las
radiaciones ionizantes. La mayor limitación
de la luz ultravioleta es su baja penetración,
por lo cual se aplica sólo a la esterilización de
ambientes y superficies.
MANEJO DEL AUTOCLAVE
Principio: en un recipiente cerrado
calentamos agua. Esto produce una
saturación de vapor a presión, con una
temperatura superior a 100ºC. Todos los
gérmenes mueren al calentar los utensilios
durante 20 minutos a 120ºC en este vapor a
15 libras presión.
COMPONENTES DEL AUTOCLAVE
(Figura 1):
1. Caldera: consiste en un cilindro amplio y
profundo en el que se colocan los utensilios a
esterilizar.
2. Canasta: es una estructura amplia de
alambre donde se colocan los materiales a
esterilizar.
3. Soporte de la Canasta: se encuentra en el
fondo de la autoclave y sostiene la canasta
por encima del nivel del agua.
4. Drenaje: Espita colocada en la base de
la de la caldera, por donde sale el exceso
de agua.
5. Tapa : La tapa cubre y cierra
herméticamente la caldera; se ajusta
mediante una arandela de goma.
6. Sujetadores de la tapa: Estos sujetadores
junto con la arandela de goma, cierran
herméticamente la tapa e impiden que escape
el vapor.
7. Válvula de salida de aire: Esta válvula
que se encuentra en la parte superior de la
cadera o en la tapa se emplea para dejar que
salga el aire cuando empieza el agua a
calentarse.
Figura 1. Diagrama de los componentes del
Autoclave
8. Válvula de seguridad: Se halla en la parte
superior de la caldera ó en la tapa, y deja
escapar el vapor cuando la presión se eleva
demasiado, evitando así que ocurra una
explosión.
________________________
9. Instrumento indicador de la temperatura
ó de la presión: Se encuentra en la parte
superior de la caldera ó en la tapa e indica la
presión y la temperatura.
PROCEDIMIENTO
COMO USAMOS EL AUTOCLAVE
Preparación de los materiales para la
esterilización:
 Cristalería : Los tubos para muestras, las
cajas de petri, etc., se envuelven en papel
craft y se fijan con cinta de enmascarar.
 Pipetas : Se envuelven con hojas de papel
craft.
PROCEDIMIENTO PARA LA
ESTERILIZACIÓN
1. Llenamos el fondo del autoclave (hasta
el soporte de la canasta. Cerciorándonos de
que el agua no toque la canasta. Si es
necesario, eliminamos el exceso del agua
abriendo la espita de drenaje
2. Introducimos en el autoclave la canasta
con los materiales que se van a esterilizar, (se
pueden añadir indicadores de la
esterilización, como ciertas piezas de papel
especial que ennegrecen al lograrse la
temperatura adecuada).
3. Cerramos la tapa del autoclave,
cerciorándonos de que la arandela de goma
se encuentra en su surco. Atornillamos a
niveles iguales los sujetadores de la tapa con
firmeza pero sin apretar demasiado.
4. Abrimos la válvula de salida del aire.
5. Iniciamos el calentamiento del autoclave.
6. Vigilamos la válvula de salida del aire
hasta que aparezca un chorro de vapor.
Aguardamos tres a cuatro minutos hasta que
el chorro de vapor sea uniforme y continuo.
Esto indicará que todo el aire se ha
expulsado del autoclave.
7. Cerramos a continuación la válvula de
salida del aire. Apretamos los sujetadores de
la tapa del autoclave y reducimos la
temperatura ligeramente.
8. Observamos el indicador. Cuando se
obtenga la temperatura deseada debemos
regular el calor para conservarla. Reducimos
el calor hasta que la aguja del indicador
permanezca en el grado de temperatura
escogido.
9. Reducimos completamente el calor tan
pronto como se cumpla el tiempo de
calentamiento.
10. Cuando la temperatura descienda a
menos de 100ºC abrimos la válvula de salida
del aire para igualar las presiones en el
interior y el exterior del autoclave.
11. Cuando cese el silbido aflojamos los
sujetadores de la tapa del autoclave,
quitamos la tapa, dejamos enfriar el auto
clave y finalmente retiramos muy
cuidadosamente la canasta con los utensilios
estériles; si se han formado gotas de agua
y se dispone de una incubadora debemos
secar los utensilios en ella a 37ºC.
RECOMENDACIONES
1. Nunca debemos maniobrar la espita de
drenaje ni la válvula de salida del aire,
mientras se esta efectuando el calentamiento
a presión.
2. Nunca debemos maniobrar la válvula
de seguridad mientras se esta efectuando el
calentamiento a presión.
3. Nunca debemos hacer un calentamiento
demasiado rápido para aumentar la presión
una vez que la válvula de salida se ha
cerrado.
4. Nunca debemos descuidar el autoclave
mientras la presión este aumentando.
5. Nunca debemos permitir que el
autoclave se enfrié demasiado tiempo. Si
dejamos la válvula de salida varias horas sin
abrir, se formara un vacío y podemos romper
utensilios esterilizados.
TRABAJO COMPLEMENTARIO
________________________
1. ¿Por qué la esterilización por calor es
efectiva?
2. ¿Qué ventajas y desventajas tiene el calor
para la conservación de los alimentos?
3. ¿Qué pasos son necesarios para esterilizar
un material que puede contener endosporas
bacterianas?
4. ¿Por qué la radiación ionizante es más
efectiva que la radiación ultravioleta para la
esterilización de productos alimenticios?
5. En el mundo comercial encontramos
muchos dispositivos para verificar la
esterilización completa, consulte, que
dispositivos permiten evaluar el control de
calidad del funcionamiento del autoclave?
6. Consultar otras técnicas de esterilización
aparte de las ya mencionadas.
7. Indagar sobre las siguientes técnicas de
control de crecimiento microbiano y su
aplicación en la Agroindustria: la
Pasteurización, la Filtración, la
Sedimentación y la Tindalización.
8. Consultar los agentes químicos más
utilizados para el control de
microorganismos en las empresas
Agroindustriales.
9. Cual es el concepto y la importancia de:
el P.M.T. y el T.M.T.
MAS INFORMACIÓN...
 Díaz R, Gamazo C, Goñi-López I
:Manual práctico de Microbiología, 2ª. Ed.
Masson S.A., España, 1999; 18-20.
 Organización Panamericana de la Salud.
Manual de Técnicas básicas para un
laboratorio de salud, 2ª Ed. PALTEX, 1983;
33-38.
 Madigan M.T., Martinko J.M., Parker J.
Biología de los Microorganismos. 8a ed.
Prentice Hall Iberia. Madrid, 1997.
 3. MICROSCOPIA

“El ojo humano tiene un poder de resolucion de aproximadamente 0.1 mm, la

mayoria de los microorganismos tienen diámetros inferiores a este y para
poderlos observar se hace indispensable el uso del microscopio.”

El microscopio ha sido durante mucho imprescindible en muchos de los estudios de

tiempo el principal instrumento de la la Biología celular. El microscopio es un
Microbiología, gracias a el descubrimos los instrumento delicado que debemos conocer y
primeros secretos de la estructura celular, manejar con cuidado para obtener
convirtiéndose en una herramienta rendimientos satisfactorios.

OBJETIVOS

1. Reconocer las clases de Microscopios y Técnicas de manejo utilizadas en el campo de la

Microbiología.
2. Identificar las partes individuales del Microscopio y sus funciones.
3. Conocer la importancia y el manejo de los diferentes sistemas que componen el Microscopio.
4. Realizar el montaje de placas microscópicas a partir de muestras para la observación.
5. Reconocer las características de las muestras mediante el examen microscopio.

MATERIALES

 Microscopio.
 Portaobjetos.
 Cubreobjetos.
 Agua destilada.
 Asa bacteriológica.
 Muestras para observación.

FUNDAMENTO amplificación focal se indica por una “x”

CLASES DE MICROSCOPIO
1. Microscopios Ópticos
a) Compuesto o de campo claro: incluye dos
sistemas de lentes (un objetivo y un ocular).
El objetivo produce una imagen amplificada
del objeto que a su vez es amplificada por el
ocular. La amplificación total es el producto
de los aumentos de los sistemas de lentes. La
________________________
colocada después del número del ocular u
objetivo correspondiente, así: 10x, 45x, 100x
en los objetivos y 8x, 10x, 12x en los oculares.
b) De luz ultravioleta: fue usado en épocas
anteriores y se basa en el empleo de luz
ultravioleta en un microscopio compuesto,
equipado con lentes de cuarzo. Con él se
obtiene una ampliación mayor que con luz
visible y se duplica la resolución, permitiendo
distinguir en forma precisa e independiente
objetos de 0.01 micras.
c) De campo oscuro o de contraste: el aspecto
de las imágenes producidas, es el de cuerpos
luminosos en un medio oscuro y negro.
Permite estudiar bacterias muy finas con
poco índice de refracción como las
espiroquetas.
d) De Fluorescencia: en este microscopio el
contraste se aumenta por medio de
fluorescencia (capacidad de una muestra
para emitir luz a una determinada longitud
de onda cuando se ha iluminado previamente
con luz de menor longitud de onda).
Normalmente, en estos microscopios la
muestra fluorescente se ilumina con luz
ultravioleta (longitud de onda corta), emite
luz visible y aparece intensamente brillante
sobre un fondo oscuro. Pocos
microorganismos son fluorescentes (algunas
bacterias fotosintéticas y algas), por lo que en
esta técnica se suelen emplear colorantes
fluorescentes (fluorocromos) o anticuerpos
fluorescentes (inmunofluorescencia). Se
emplea sobre todo en el diagnóstico
microbiológico y en estudios de ecología
microbiana.
e) De Inmunofluorescencia: es una
modificación y refinamiento del microscopio
de fluorescencia. Se utiliza un colorante como
fluoresceína, rodamina u otro colorante
fluorescente que se une a un anticuerpo y
que puede ser observado microscópicamente
al reaccionar con el antígeno. La sustancia
química o colorante absorbe la longitud de
onda del rayo ultravioleta y emite una onda
visible de mayor longitud observándose una
fluorescencia. Es útil para precisar la
identidad y localización de ciertos
microorganismos.
2. Microscopio Electrónico
Emplea ondas de electrones y campos
magnéticos para producir la imagen. Tiene
tres o más electromagnetos en forma de anillo
que funcionan como lentes. El primero de
ellos es un condensador que enfoca la
corriente de electrones al objeto. El segundo,
es el objetivo, que produce una imagen de
amplificación intermedia por el objeto. Por
último el proyector amplía parte de la imagen
________________________
intermedia para producir la imagen final que
es fotografiada o se observa visualmente en
una pantalla fluorescente. La amplificación
directa obtenida desde el punto de vista
teórico puede llegar hasta 200.000 aumentos.
El Microscopio electrónico se utiliza para el
estudio detallado de las estructuras celulares;
para el estudio de las estructuras internas de
las células se emplea el Microscopio
Electrónico de Transmisión (TEM); cuando
solo se pretende estudiar las estructuras
externas de una muestra no son necesarios
los cortes ultrafinos, pudiéndose realizar la
observación directa en TEM, después de
aplicar una técnica denominada tinción
negativa. También se puede utilizar el
Microscopio Electrónico de Barrido (SEM)
obteniéndose mejores imágenes.
COMPONENTES DEL MICROSCOPIO
1. Sistema de soporte:
a) Base: parte inferior en la cual se apoya el
microscopio.
b) Brazo o columna: es la porción central de
la cual se debe coger el microscopio.
c) Revólver: es la parte donde van
montados los objetivos. Está constituido de
manera que su sistema rotatorio engrane
automáticamente. Se pueden rotar los
objetivos simplemente girando el revólver.
d) Platina: de forma cuadrada. Está
firmemente montada sobre el microscopio en
forma horizontal. Presenta un orificio central
para permitir el paso de la luz. En ella se
halla el carro mecánico provisto de dos
ganchos para fijar el portaobjetos.
2. Sistema de aumento
a) Ocular (8x, 10x, 12x): el papel de los
oculares consiste en aumentar, a manera de
lupa, la imagen real proyectada por el
objetivo. Posee dos lentes, la que queda cerca
del ojo se llama ocular, y la que queda en el
extremo inferior se llama colectora. Hay
oculares de aumentos diferentes a los
mencionados.
b) Tubo del microscopio: situado en la parte
superior del microscopio y que recibe los
oculares; en su parte inferior está situado el
revólver.
c) Objetivo (10x, 40x, 100x): consta de dos
lentes, la que queda más próximo a la
preparación se llama frontal, y la otra en la
parte superior se llama lente posterior. La
denominación de los objetivos se efectúa
indicando su aumento propio el cual se halla
grabado en cada pieza.
3. Sistema de iluminación:
a) Fuente lumínica: puede proporcionarla
un bombillo ubicado en el microscopio por
debajo de la platina o colocado en el exterior
y de frente que se refleje mediante un espejo.
b) Condensador: es un sistema de lentes
convergentes entre la fuente de luz y la
platina.
c) Diafragma: está formado por un conjunto
de láminas falciformes, las cuales por medio
de una palanca lateral se pueden cerrar
concéntricamente variando el haz de rayos
luminosos. El diafragma se estrecha en
preparaciones no coloreadas para aumentar
la profundidad de enfoque, en tanto que en
las preparaciones coloreadas que absorben
luz, tiene que dilatarse.
d) Filtro: en la parte inferior del diafragma
se encuentra un anillo trasportable en el que
puede colocarse un disco de vidrio mate o
coloreado.
4. Sistema de ajuste:
a) Tornillo macrométrico: sirve para
localizar la imagen. Se acciona por un tornillo
de cremallera.
b) Tornillo micrométrico: se utiliza para dar
el enfoque adecuado a la imagen localizada
con el tornillo macrométrico. Es de mucha
precisión, y por lo tanto muy delicado.
c) Elevador del diafragma: es un pequeño
elevador que se encuentra fijo al
condensador. Se puede mover para cerrar o
abrir el diafragma, reduciendo o aumentando
así el ángulo y la intensidad de la luz.
________________________
d) Reguladores de la platina: se utilizan
para desplazar el portaobjetos sobre la
platina; un tornillo lo desplaza hacia atrás o
hacia delante y el otro hacia la izquierda o la
derecha.
PODERES DEL MICROSCOPIO
1. El Poder de aumento o amplificación: Nos
proporciona una imagen mayor de la que
percibimos a simple vista de cualquier objeto,
es decir, nos permite magnificar la imagen. El
aumento (A) está dado por la relación:
tamaño de la imágen
A
tamaño del objeto
En el microscopio compuesto, la
amplificación es igual al producto del
aumento del objetivo por el aumento del
ocular:
Atotal  Aobjetivo  Aocular
2. El Poder de resolución: Nos permite
definir los más finos detalles de la estructura
del objeto. Se refiere a la capacidad de un
sistema óptico para diferenciar dos puntos
que a simple vista parecen uno solo debido a
la pequeña distancia que hay entre ellos; es
característico de cada instrumento óptico y
depende en gran parte de las lentes
utilizadas. En el hombre el poder de
resolución es de 0.1 mm a la distancia mínima
de visión clara de 25 cm. Este poder depende
a su vez de la longitud de onda (λ) y de la
apertura numérica del objetivo (NA). Esta
última, relaciona el ángulo de apertura de los
rayos luminosos que provienen de la fuente
con el índice de refracción. En el caso del
objetivo de inmersión, se coloca entre el
preparado y la lente aceite de inmersión, que
tiene un índice de refracción igual al de la
lente y evita la refracción de los rayos
luminosos. El poder de resolución (P.R.) es
igual a:

P.R. 
2  NA
Por lo tanto si se tiene un objetivo de 100x capacidad binocular del observador,
con una apertura numérica (NA) de 1.3 y una haciendo girar el anillo de enfoque hasta
longitud de onda promedio (λ) de 520 nm obtener nitidez en la imagen.
(nanómetros), el poder de resolución será: 9. Utilizamos el objetivo de menor poder
(10x), descendiendo por medio del tornillo
520 nm macrométrico, hasta encontrarnos
P.R.   200 nm  0.2um inmediatamente por encima de la
2  1.30
preparación, apareciendo una imagen clara,
3. El Poder de definición: nos permite la cual definimos por medio del tornillo
formar imágenes claras con contornos nítidos micrométrico.
y definidos. 10. Una vez ubicado el campo que vamos a
4. El Poder de penetración o profundidad de observar, cambiamos el objetivo a uno de
foco: con el poder de profundidad de foco gran poder (40x), que nos permita realizar la
podemos observar varios planos de una correspondiente observación.
preparación con una misma posición de 11. Cuando observamos al microscopio,
enfoque del objeto. debemos tener en cuenta el calor desprendido
por el foco luminoso que va secando
PROCEDIMIENTO progresivamente la preparación. Como
consecuencia los microorganismos se irán
paralizando y además, pueden aparecer
1. Verificamos la limpieza de cada uno de
corrientes de liquido que dificultan la
los componentes del microscopio (el ocular,
observación de la muestra. Cuando
los objetivos, el condensador, la fuente
observamos estos efectos, tenemos que
lumínica y la platina).
levantar el cubreobjetos y añadir mas liquido.
2. Colocamos el microscopio sobre un
12. Dibujamos detalladamente los
mesón de nivel uniforme y lo ajustamos a
diferentes tipos morfológicos observados y
una altura adecuada para el observador.
describimos sus movimientos.
3. Comprobamos que los componentes
13. Terminadas las observaciones, bajamos
del microscopio se encuentran en buen
el portaobjetos y nos aseguramos de limpiar
estado y bien colocados.
el material utilizado.
4. Revisamos que al conectar el
microscopio a la fuente lumínica, la bombilla
RECOMENDACIONES.
se encuentre apagada para evitar su daño; así
mismo, nos aseguramos de apagarlo cuando
1. Nunca limpiemos las lentes de los
no se esté utilizando.
objetivos o de los oculares con etanol.
5. Ajustamos la distancia entre los ojos
2. Nunca empleemos papel ordinario o
según la conveniencia del observador si
algodón para limpiar las lentes.
disponemos de microscopios binoculares.
3. Nunca toquemos los objetivos con los
6. Realizamos la observación en fresco de
dedos.
la preparación que contiene
4. Nunca dejemos el microscopio sin los
microorganismos, tomando el portaobjetos y
oculares, a menos que los orificios se tapen.
colocando sobre el una gota de la muestra a
5. Nunca llevemos el microscopio
analizar.
cogiéndolo por el brazo o columna con una
7. Colocamos el cubreobjetos por uno de
mano; utilicemos ambas manos, una en la
sus bordes formando un ángulo de 45° y
base y la otra en el brazo o columna.
luego lo dejamos caer libremente sobre la
preparación para evitar burbujas y lograr que
el montaje quede homogéneo. TRABAJO COMPLEMENTARIO
8. Observamos al microscopio la
preparación. Para enfocar la imagen, 1. Señale las ventajas e inconvenientes del
ajustamos los oculares de acuerdo a la examen en fresco.
________________________
2. ¿ Por que cubrimos la muestra con un  Louis Pasteur
cubreobjetos o laminilla?  Robert Koch
3. ¿Cuáles son las diferencias morfológicas  Robert Lister
y estructurales, mas importantes, que se  Christian Gram
pueden apreciar en los microorganismos
observados? MÁS INFORMACIÓN . . .
4. ¿Cómo funciona un Microscopio
Electrónico de Barrido (SEM de Scanning  Díaz R, Gamazo C, Goñi-López I :Manual
Electrón Microscope)? práctico de Microbiología, 2ª.Ed. Masson S.A.,
5. ¿ Cuál es la función del Filtro colocado en España, 1999; 1-3.
la parte inferior del diafragma?  Madigan M.T., Martinko J.M., Parker J.
6. Haga una revisión biográfica de los Biología de los Microorganismos. 8ª Ed. 3ra
siguientes investigadores e indique sus reimpresión. Prentice Hall Iberia. Madrid,
aportes a la Microbiologia: 2000.
 Antonie Van Leeuwenhoek

MICROSCOPIO OPTICO COMPUESTO: PARTES PRINCIPALES

A. Base
B. Fuente de iluminación
C. Diafragma
D. Brazo
E. Platina
F. Macro y micrométrico
G. Condensador
H. Objetivos
I. Ocular

________________________
 4. COLORACIONES Y TINCIONES

“Leeuwenhoek en su siglo, y otros microbiologos de la segunda mitad del siglo

XlX tuvieron que observar los microorganismos sin teñir; su estudio
microscopico se facilito notablemente al tratarlos con colorantes.”

La preparación de un frotis o extensión sobre observar por medio de los siguientes

un portaobjetos es imprescindible para poder
aplicar los métodos habituales de tinción que
permiten la observación al microscopio de las
bacterias. Se realiza tomando una pequeña
cantidad de cultivo bacteriano, extendiéndola
sobre un portaobjetos limpio y fijándola.
Puesto que la mayoría de las bacterias
carecen de coloración, resulta indispensable
teñirlas para poder observarlas al
microscopio y determinar su tamaño,
morfología y disposición relativa. Para ello
se puede emplear un único colorante.
La observación al microscopio de las
bacterias nos permite diferenciar tres formas
típicas que son: cocos, bacilos y espirales.
Los cocos son células esféricas que se pueden
agrupar en parejas (Diplococos), racimos
(Estafilococos), cadenas (Estreptococos), de
a cuatro (Tétradas) o en cubos (Sarcinas).
Los bacilos son células en forma de bastón
que pueden presentarse individualmente, en
cadenas o empalizada.
Las espirales son células que presentan forma
helicoidal y generalmente no se agrupan.
Las anteriores formas bacterianas se pueden
métodos:
1. Preparaciones no coloreadas
Preparación en fresco: Con este método se
observan las bacterias vivas, lo cual permite
visualizar la forma y el movimiento en las
que lo poseen.
2. Preparaciones coloreadas
Como las bacterias son incoloras y tienen el
mismo índice de refracción del agua, es
necesario utilizar colorantes para poderlas
visualizar. Las técnicas para observar las
bacterias, proporcionan las siguientes
ventajas: un contraste entre la bacteria y el
medio que la rodea, permitiendo diferenciar
los tipos morfológicos bacterianos; una
visualización de las estructuras internas y
externas, tales como las esporas, el
equivalente nuclear, los gránulos
citoplasmáticos, la pared celular, la cápsula
y el o los flagelos.
Ciertas estructuras adicionales que podemos
hacer evidentes al microscopio con la ayuda
de técnicas especiales de tinción nos
dan la información adicional sobre la
estructura, tamaño y forma.

OBJETIVOS

 Conocer y estudiar la morfología de las bacterias (tamaño, forma, arreglo y estructura) que
constituye una de las características más importantes para su determinación y clasificación.
 Definir los métodos de tinción para identificar la morfología de las células bacterianas y
distinguir los distintos tipos de agrupaciones que existen.
 Practicar la observación con el microscopio al máximo aumento (objetivo de inmersión) y
aprender el uso correcto del aceite de inmersión.

MATERIALES

 Mecheros
 Asas
________________________
  Portaobjetos
 Cultivos bacterianos
 Colorantes para las tinciones simples, compuestas y/o diferenciales
 Microscopio
 Aceite de inmersión
 Solución salina y/o agua destilada

bacterias se encuentran resuspendidas en

PRACTICA 4A
PREPARACION DE UN FROTIS
BACTERIANO
FUNDAMENTO
La fijación de una extensión bacteriana es
imprescindible para que las bacterias queden
inactivadas y adheridas al vidrio. De esta
manera, no se pierden en los pasos de lavado
necesarios para la tinción. Se debe procurar,
además, que este proceso altere lo menos
posible la morfología bacteriana. Si las
agua, la fijación puede hacerse por
calentamiento de la muestra sobre el
portaobjetos. Es sumamente importante no
excederse en este proceso para que las
bacterias no se deformen o se rompan. La
fijación de bacterias que se hallan en su
propio medio de cultivo debe hacerse
empleando un procedimiento alternativo
como la fijación con metanol. La fijación al
calor no da en este caso buen resultado pues
la capa de material orgánica que contiene las
bacterias, una vez realizada la extensión
tiende a despegarse con facilidad en los
lavados posteriores.

PROCEDIMIENTO

Cuando la muestra se encuentra en un medio solución salina sobre el portaobjetos, luego

líquido, se debe proceder con un asa estéril arrastrar las colonias con el asa,
depositando una gota del cultivo bacteriano suspendiéndolas homogéneamente sobre la
en el portaobjetos limpio, extendiéndolo gota de solución y dejándolas secar a
homogéneamente y dejándolo secar a temperatura ambiente.
temperatura ambiente.
Si la muestra a analizar se encuentra en un El procedimiento a seguir para cualquier tipo
medio sólido, se debe colocar una gota de de muestra es el siguiente:

1. Flameamos el asa para la siembra hasta

que se ponga de color rojo vivo:
 Sostenemos el asa inmediatamente
arriba de la porción azul de la llama
 Ponemos el asa tan cerca de la posición
vertical como sea posible, dejándola enfriar
por 15 segundos.

________________________
 2. Tomamos una porción de la muestra
que se va a examinar, colocando el asa en
posición plana en la superficie del líquido.

3. Colocamos el asa sobre el portaobjetos y

aplanamos ligeramente en el centro de este
teniendo en cuenta que el portaobjetos este
marcado.

4. Sosteniendo todavía el asa aplanada

sobre el portaobjetos la movemos trazando
una espiral del centro a la periferia.
Dejando cierto espacio entre la muestra y cada
uno de los cuatro lados del portaobjeto.
Dejamos secar completamente la muestra al
aire.

5. Flameamos nuevamente el asa hasta que

este al rojo vivo para destruir cualquier
bacteria que se encuentre en ella.

6. Cuando recibamos en el laboratorio

muestras de procedencia externa sin las
marcas correspondientes en los portaobjetos,
debemos proceder así, para saber en cual lado
se encuentra la muestra:
 Colocamos el portaobjetos de manera
que refleje la luz que entra por la ventana.
 El lado donde no se halla la muestra
brillará.
 El lado donde esta la muestra no
reflejara la luz.

________________________
 7. Fijación : Una vez el frotis se ha secado,
pasamos el portaobjetos tres veces a través de
la llama del mechero con la muestra
hacia arriba. Dejándolo enfriar antes de
aplicar la técnica de coloración.
PRACTICA 4B
TINCIONES
FUNDAMENTO
RELACIÓN ENTRE EL COLOR Y LA
ESTRUCTURA
Todos los compuestos orgánicos absorben
luz, pero lo hacen en la región ultravioleta;
como esta parte no es visible, aparecen ante
nuestros ojos incoloros o blancos. Algunas
sustancias absorben longitudes de onda de la
región visible, por lo cual aparecen al ojo
humano en respuesta al color
complementario al absorbido, tales
compuestos son coloreados.
COLORANTES
Son sustancias capaces de comunicar a otra
un color determinado. Se deben diferenciar
de los pigmentos, en que estos últimos
quedan en la superficie, en tanto que los
colorantes penetran al cuerpo o estructura
tratada.
Los colorantes según su origen se dividen en
naturales y artificiales.
Los colorantes naturales se pueden obtener a
partir de: sustancias minerales ( los óxidos y
las sales), extractos de vegetales (el índigo,
la hematoxilina, la orcina, el tornasol, el
azafrán etc) y de origen animal ( el carmín
extraído de la cochinilla, el rojo púrpura
extraído de los moluscos).
________________________
Los colorantes artificiales se derivan
generalmente de la hulla como la anilina, el
ácido pícrico, la alizarina, etc.
El objeto de toda coloración es fijar el
colorante sobre la materia a teñir, con tal
intensidad que al lavar no se decolore.
Algunas coloraciones se llevan a cabo con el
simple contacto con el colorante (coloración
directa), mientras que otras necesitan un
tratamiento previo con una sustancia que
actúa como mordiente y lo prepara para
recibir el colorante (coloración indirecta).
1. Clasificación de los Colorantes
a) Según su origen:
 Naturales: contienen probablemente
un radical cetónico o carbonilo (CO).
 Artificiales o Sintéticos: extraídos del
alquitrán de hulla y derivados del benceno.
b) Según su constitución molecular:
 Simples
 Compuestos
c) Según su afinidad tintorial:
 Básicos o Nucleares: son aquellos que
colorean estructuras ácidas, son sales donde
la base es colorante y la porción ácida
incolora. Ejemplos:
 Grupo de las tiazinas: son colorantes
de acción progresiva.
Tionina: (clorhidrato de
aminofeniltiazina), muy soluble en
alcohol del 60º
Azul de tolvidina (clorhidrato de
dimetiltionina), metacromático tras la
acción del alcohol.
Azul de metileno puro (clorhidrato de
tetrametiltionina), se emplea para
 coloraciones vitales es soluble en agua y
mucho más en alcohol.
 Grupo de las rosalininas
(trifenilmetano), colorante potente de
acción regresiva.
Fucsina (clorhidrato acetato ó sulfato de
rosanilina), muy soluble en agua o
alcohol. Colorante nuclear.
Cristal violeta (clorhidrato de rosanilina
hexametilado).
Verde de metilo
Verde de malaquita
Rojo neutro (clorhidrato de rojo de
tolvileno)
 Ácidos o Citoplasmáticos: son
empleados como colorantes de contraste. Son
sales en donde el ácido es colorante y la base
incolora. Ejemplos: Naranja G (sal sódica de
ácido sulfónico de benceno azunaftol), Ácido
pícrico (trinitrofenol), Fucsina ácida.
 Neutros: Son colorantes compuestos,
donde la base y el ácido tienen carácter
colorante. Ejemplos: Eosinato de azul de
metileno, Eosinato de azul de tolvidina y
Eosinato de violeta de metilo
2. Clases De Coloraciones
Las coloraciones pueden ser:
 Directa: Basta poner en contacto la
solución colorante con el objeto a colorear.
 Indirecta: Se necesita la acción de una
solución intermediaria llamada mordiente,
puede actuar antes del colorante o hacer
parte de éste.
 Simple: Cuando se emplea una sola
sustancia colorante.
 Combinada: Si se hace actuar
simultáneamente o sucesivamente varias
sustancias.
 Progresiva: El colorante impregna
lentamente el cuerpo o estructura y termina
por colorearlo intensamente.
 Regresiva: Tras la solución colorante,
se aplica un agente de diferenciación que
actúa sobre la preparación.
Las coloraciones pueden modificarse por la
acción de:
________________________
 Mordientes: Ácido fénico, ácido
acético, sulfato de hierro, tanino, formol,
solución de lugol, etc.
 Agentes de diferenciación: alcohol,
acetona, alcohol de 95º, ácido sulfúrico,
ácido clorhídrico, etc.
TINCIÓN SIMPLE
Los colorantes básicos mas utilizados son: el
azul de metileno, el cristal violeta, la
safranina, la fucsina y el verde de malaquita.
El procedimiento para la tinción con azul de
metileno es el siguiente:
 Colocamos la muestra del cultivo en el
portaobjetos de acuerdo con su estado
natural (líquida, sólida o semisólida).
 Extendemos la gota sobre el portaobjetos
dejando una película fina (casi
transparente).
 Secamos la preparación al aire o la
pasamos rápidamente por el mechero.
 Colocamos el portaobjetos en un puente
de coloración por 30 segundos.
 Cubrimos el extendido con una pequeña
cantidad de azul de metileno y lo
dejamos actuar por un minuto.
 Lavamos con agua hasta eliminar el
exceso de colorante.
 Secamos la preparación al aire libre o al
mechero.
 Observamos al microscopio, inicialmente
con el objetivo de 10x, para visualizar el
campo microscópico y luego agregamos
una gota de aceite de inmersión y
pasamos al objetivo de 100x ( objetivo de
inmersión).
COLORACIÓN DE GRAM
Las bacterias teñidas con el método de
coloración de Gram se clasifican en dos
grupos: 1. Bacterias Gram Positivas,
conservan el colorante cristal violeta y se
tiñen de color violeta oscuro. 2. Bacterias
Gram Negativas, pierden el cristal violeta al
ser lavadas con el alcohol y al teñirse con el
colorante de contraste (safranina) toman el
color rojo.
El mecanismo de tinción de Gram se basa en
la estructura y composición de la pared
celular bacteriana. Las bacterias Gram
negativas contiene un porcentaje más elevado
de lípidos que las bacterias Gram positivas.
Las bacterias Gram negativas presentan
paredes celulares más delgadas que las
Gram positivas. Las pruebas experimentales
sugieren que durante el procedimiento de
tinción, en las bacterias Gram negativas se
extraen los lípidos al ser tratadas con etanol
(alcohol), dando como resultado un aumento
de la porosidad o permeabilidad de dicha
pared celular . Así, el complejo cristal
violeta-yodo (CV-I) que ha pasado a través
de la pared celular, durante el paso anterior,
del proceso de tinción, puede ser extraído.
De este modo, el organismo Gram negativo
queda decolorado. Las paredes celulares de
las bacterias Gram positivas, debido a su bajo
contenido lipídico, se deshidratan durante el
tratamiento con etanol. El tamaño de sus
poros disminuye, se reduce su
permeabilidad y no es posible extraer su
complejo CV-I.
Las paredes celulares bacterianas Gram
negativas tienen una cantidad menor de
peptidoglicano y este tiene menos uniones
transversales que el de las paredes celulares
de las bacterias Gram positivas.
Por consiguiente los poros del peptidoglicano
de las bacterias Gram negativas permanecen
suficientemente grandes, aún después del
tratamiento con etanol, como para permitir
que sea extraído el complejo CV-I. En
las bacterias Gram positivas, el complejo
CV-I queda atrapado en la pared después
del tratamiento con etanol, que
presumiblemente disminuye el diámetro de
los poros del peptidoglicano de la pared
celular.
Todas estas pruebas indican que la pared
celular de las bacterias Gram positivas es el
sitio de retención del colorante cristal violeta.
________________________
Las bacterias Gram negativas son más
susceptibles a antibióticos como la
estreptomicina. Las bacterias Gram positivas
son generalmente más susceptibles al
antibiótico penicilina y menos susceptibles
a la desintegración por tratamiento mecánico
(tal como la exposición a muy altas presiones
o a vibraciones ultrasónicas), o por
exposición a ciertas enzimas.
REACTIVOS PARA LA TINCION DE GRAM
Cristal violeta modificado de Hucker
Solución de yodo de Gram
Etanol al 95%.
Solución de safranina
Agua corriente.
PRINCIPIO DE REACCION DE LA TINCION
 El cristal violeta tiñe todas las bacterias
de color violeta intenso.
 La solución de yodo fija el color violeta a
las bacterias.
 El etanol al 95%:
- Decolora ciertas bacterias cuando la
solución de yodo no ha fijado firmemente
la tinción violeta.
- No decolora otras bacterias si la solución
de yodo ha fijado firmemente la tinción
violeta.
 La solución de safranina:
- Tiñe nuevamente de color de rosa las
bacterias que han sido decoloradas por el
etanol.
-- No tiene efecto sobre las demás bacterias,
que quedan de color violeta oscuro.
CAUSAS DE ERROR
Puede ocurrir una reacción Gram positiva falsa
porque:
- El frotis fue fijado antes de que estuviera
seco.
- El frotis ha sido demasiado grueso.
- Quedaron sedimentos de cristal de violeta
en el frasco (filtrar antes de usar).
- La solución de yodo de Gram, no se
escurrió completamente.
- No se dejó que el etanol actuara suficiente
tiempo
- La solución de safranina fue demasiado
fuerte o se dejó demasiado tiempo en el
portaobjetos.
Puede ocurrir una reacción Gram negativa
falsa porque:
- No se dejó actuar suficiente tiempo la
solución de yodo de Gram.
- El etanol se dejó demasiado tiempo en el
portaobjetos y no se lavó adecuadamente.

PROCEDIMIENTO

Fije el frotis y déjelo enfriar.

1. Cristal violeta 1 minuto. Vierta el cristal

violeta sobre el portaobjetos y extiéndalo
completamente.
Déjelo reposar por 1 minuto.
Enjuáguelo con agua corriente y déjelo escurrir.

2. Solución de yodo de Gram: 1 minuto.

Bañe el Portaobjetos con solución de yodo de Gram y
déjelo reposar un minuto.
Escurra la solución y enjuague el portaobjetos con
agua corriente.

3. Etanol al 95%: 1 minuto.

Bañe completamente el portaobjetos.
Déjelo reposar un minuto
Enjuague con agua corriente y déjelo escurrir.
Examine el frotis:
- Si quedan algunas zonas de color violeta aplique
nuevamente etanol durante 15 – 30 segundos.
Enjuague bien con agua y escurra.

4. Solución de safranina: 10 segundos

Vierta la solución de safranina en el portaobjetos y
déjela reposar 10 segundos.
Enseguida lávela con agua, brevemente.
Póngala a escurrir y déjala secar al aire libre.

________________________
En el desarrollo de las observaciones
microscópicas identifique:
Bacterias teñidas de violeta oscuro, que son
las Gram positivas, ejemplos: Estafilococos,
Neumococos, Enterococos, Bacilos del
Carbunco, Bacilos del Ántrax, Bacilos del
Clostridium, Bacilos Lácteos, etc.
Bacterias teñidas de color rosa, que son las
Gram negativas, ejemplos: Gonococos,
Meningococos, Bacilos Coliformes, Shigellas,
Salmonellas o Vibriones del Cólera.
COLORACIÓN DE ZIEHL
NEELSEN
Algunas Bacterias Gram positivas poseen una
propiedad llamada ácido-resistencia, dicha
propiedad se demuestra con la coloración de
Ziehl Neelsen llamada también
ácidorresistente debido a la naturaleza ácida
del decolorante. El colorante primario
utilizado es la Fucsina, el cual para que
penetre en la célula, requiere un agente
intensificador que puede ser el fenol, un
detergente o el calor; este procedimiento es
necesario debido a que las bacterias
ácidorresistentes presentan ceras como
constituyentes de la pared, dentro de las
cuales se destaca el ácido micólico. Este
compuesto es ácidorresistente y debido a esta
propiedad se cree que el agente decolorante
no actúa sobre estas células.
Las muestras de Mycobacterium se deben
colocar en una solución de albúmina al 1% y
luego llevarlas al autoclave para matar las
células (sin destruirlas) y evitar así una
posible contaminación.
PROCEDIMIENTO
1. Preparamos el extendido y lo dejamos
secar a temperatura ambiente.
2. Lo cubrimos con fucsina durante cinco
minutos. Durante este tiempo debemos
calentar la preparación en el mechero, sin
dejar que hierva, hasta que empiece a
desprender vapores, si los bordes del frotis se
________________________
empiezan a secar, añadimos más colorante.
El calor actúa como un agente intensificador.
3. Lavamos con agua.
4. Decoloramos con el alcohol ácido al 3%
hasta que el extendido no destiña más.
5. Lavamos con agua.
6. Cubrimos el extendido con azul de
metileno durante un minuto.
7. Lavamos con agua y dejamos secar la
preparación al aire libre.
8. Observamos al microscopio con objetivo
de inmersión.
COLORACION DE LAS ESPORAS
BACTERIANAS
La formación de esporas es una característica
principalmente de los géneros Bacillus y
Clostridium, sin embargo, se ha encontrado
esporulación en Esporusarcina.
Debido a la dificultad que presenta las
esporas para ser coloreadas por las técnicas
normales de coloración es necesario aplicar
una técnica específica.
PROCEDIMIENTO
 Método de Scheaffer - Fulton
1. Hagamos un extendido del cultivo y lo
fijamos.
2. Cubrimos con verde malaquita.
3. Calentamos hasta la expulsión de los
primeros vapores, retirando el fuego.
Repetimos la operación aproximadamente
durante 5 minutos. Es importante no dejar
secar el colorante.
4. Dejamos que la preparación se enfríe por
5 minutos.
5. Lavamos con agua.
6. Agregamos safranina y dejamos por un
minuto.
7. Lavamos con agua, secamos y
observamos con objetivo de inmersión.
 Método Dorner modificado.
1. Adicionamos 0.5 ml de solución salina a
una cantidad de la muestra del cultivo en
estudio, hasta quedar una solución turbia.
Adicionamos 0.5 ml de verde malaquita y
calentamos al baño María durante 10
minutos.
2. Hacemos un extendido de la preparación
y lo fijamos.
3. Lavamos con agua el exceso de
colorante.
4. Adicionamos safranina durante un
minuto.
5. Lavamos con agua, secamos y interior de la célula. Bacillus anthracis,
observamos al microscopio con objetivo de
inmersión.
COLORACIÓN DE CÁPSULAS
(Coloración negativa, indirecta, nigrocina o
tinta china).
La cápsula bacteriana es una estructura
extracelular presente en algunos grupos de
bacterias, su composición es básicamente
polisacáridos solubles en agua, por lo cual su
tinción se hace más difícil.
La nigrocina o tinta china es uno de los
colorantes mas utilizados. La cual no tiñe
directamente la célula sino que se deposita
alrededor de ella facilitando su observación al
microscopio.
PROCEDIMIIENTO
1. Colocamos una gota de nigrocina sobre el
extremo del portaobjetos.
2. Mezclamos dos asadas de la muestra
bacteriana, sobre la gota de nigrocina sin
extender la muestra.
3. Con el borde de otro portaobjetos
realizamos un extendido desde el lugar
donde se ubica la muestra hacia fuera.
4. Dejamos secar el extendido al aire libre.
5. Observamos al microscopio con objetivo
de inmersión.
DIVERSOS GRUPOS DE BACTERIAS
QUE PODEMOS OBSERVAR CON EL
MICROSCOPIO
Podemos observar los microorganismos en
muestras provenientes del hombre o de los
animales (pus, orina, garganta, sangre,
secreciones etc.) o a partir de muestras
________________________
provenientes de la Agroindustria (leche,
agua, carne, frutas, productos enlatados etc.).
1. Diplococos Gram negativos: semejando
granos de café (Neisserias), se encuentran en
secreciones purulentas.
2. Bacilos Gram positivos: En forma de
bastón.
a) Esporulados: Son largos y gruesos, la
espora es una amplia zona incolora en el
Clostridium sp. .
b) Sin esporas: Son pequeños, de formas
variables, se agrupan en hileras o formando
letras chinas. (Empalizadas). Se pueden
observar en faringe, pus, sangre, piel.
Corinebacterias, Listerias, etc.
3. Bacilos Gram negativos: Son de tamaño
variable, con extremos redondeados o
agudos. Pueden ser largos y rectos (bacilos
Coliformes), con forma de coma (Vibriones) o
cortos y gruesos (Proteus). En este grupo
figuran numerosas especies.
4. Cocobacilos Gram negativos: Su forma
es muy variable y no son tan redondos como
los cocos, ni tan largos como los bacilos
normales.
5. Helicoidales o en espiral: Tienen varias
ondulaciones, como el cabello ensortijado o
los sacacorchos (Treponemas, Borrelias,
Leptospiras).
TRABAJO COMPLEMENTARIO
1.¿Existe alguna relación entre el tipo de
morfología y la Tinción de Gram?.
2.¿Qué diferencias estructurales hay entre
las Bacterias Gram Positivas y las Gram
Negativas?.
3.¿Qué son las estructuras teñidas con verde
de malaquita que aparecen en el medio
circundante?.
4.¿Todas las endosporas aparecen igual en las
bacterias de la misma especie? ¿a que se
debe esta diferencia?.
5.¿Por qué es necesario que la muestra no cationicos como agentes generales de
hierba durante la tinción con carbofucsina?. tinción?.

6.Otras bacterias que poseen en su pared 13.¿Frente a la tinción de Gram como se

celular estructuras que proporcionan alta observan las levaduras en cuanto a tamaño,
hidrofobilidad, ¿Serian resistentes a la morfología y coloración?.
decoloración por ácidos y alcoholes con la
tinción de Ziehl Neelsen?. 14.Los colorantes como compuestos
orgánicos contienen radicales cromóforos y
7.¿Qué fin tiene la fijación de las muestras grupos de auxocromos, ¿Cuál es la función
al realizar un frotis bacteriano?. de dichos radicales y grupos?.

8.Las bacterias que usted observó 15.La coloración de células y tejidos es una
sometidas a las diferentes tinciones, combinación de fenómenos físicos y
¿Estaban vivas?. químicos. ¿Explique cuales son esos
fenómenos?.
9.¿Qué papel cumple el mordiente?.
MÁS INFORMACIÓN . . .
10.¿Cuál es la importancia de las tinciones
de Gram , Ziehl Neelsen y Sheafer - Fulton  Díaz R, Gamazo C, Goñi-López I: Manual
en la Taxonomia Bacteriana?. práctico de Microbiología, 2ª.Ed. Masson S.A.,
España, 1999; 1-3.
11.¿Si usted necesitara tener una idea clara y  Organización Panamericana de la Salud.
bien ajustada a la realidad sobre la forma Manual de Técnicas básicas para un
de una especie bacteriana cual de las laboratorio de salud, 2ª Ed. PALTEX, 1983;
tinciones realizadas en la presente practica 33-38.
escogería usted?.  Carpenter Philip L. Microbiologia, sexta
reimpresión, Ed. Interamericana, México
12.¿Para que sirve la tinción en microscopia 1978.
óptica? ¿Por qué se utilizan los colorantes

________________________
 5. MEDIOS DE CULTIVO
“Los primeros microbiólogos desconocían que los requerimientos nutricionales de
los microorganismos son variables, empleaban como medio de cultivo, jugos,
caldos, infusiones de carne y sopas .”

En la naturaleza las bacterias están son las sustancias donde los

distribuidas de tal forma que hacen parte de
los diferentes ecosistemas. Estas, como los
demás seres vivos, necesitan para su
desarrollo nutrientes apropiados y multiplicación.
condiciones ambientales óptimas, como son:
el pH, la presión osmótica, la concentración
de oxigeno, la temperatura, la humedad,
entre otras. En la Ingeniería Bioquímica
estas condiciones son un requisito de vital
importancia para el crecimiento de
microorganismos en el proceso de la
fermentación.
En el laboratorio de Microbiología en
condiciones in vitro, los medios de cultivo
microorganismos encuentran los sustratos
necesarios para realizar sus funciones
metabólicas que favorecen su
El crecimiento de los
microorganismos se manifiesta por la
aparición de colonias sobre los medios
sólidos y la presencia de turbidez o
formación de grumos en los medios líquidos.
Un medio de cultivo debe contener sustratos
con altas fuentes de Carbono y Nitrógeno;
sales inorgánicas como Fósforo, Calcio,
Magnesio, Sodio; Agua y en ciertos casos
Vitaminas, Aminoácidos y otras sustancias
promotoras de crecimiento.

OBJETIVOS

1. Identificar los pasos a seguir en la preparación de un medio de cultivo.

2. Conocer la forma y la presentación comercial de los diferentes Medios de Cultivo.
3. Identificar los estados de agregación de los medios de cultivo y el uso practico de cada uno.

MATERIALES

 Medios de Cultivo comerciales.

 Medios de Cultivo preparados en sus estados de agregación clásicos: sólido y líquido.
 Balanza.
 Espátula.
 Agua destilada
 Estufa y mecheros.
 Erlenmeyer
 Autoclave
 Cajas de Petri, Tubos de ensayo tapa rosca y Cinta de enmascarar.

FUNDAMENTO

Antes de preparar los Medios de Cultivo en clasificación de los medios de cultivo. El

el desarrollo de la presente practica, es de siguiente cuadro nos ilustra al respecto,
vital importancia que tengamos presente la siguiendo algunos parámetros:
________________________
PARAMETRO CLASES PROPIEDADES EJEMPLOS
Su solidificación se consigue agregando al elemento nutritivo - Agár Nutritivo
Sólidos 1.5 % de Agar por cada 100 ml. En estos medios se observa la - Agar Tripticasa
formación de las colonias. Soya
Según - Caldo Nutritivo
No poseen Agár. Las bacterias crecen sin formar colonias,
consistencia Líquidos - Caldo de
dando turbidez al medio ó formando grumos.
Tioglicolato
Poseen una concentración menor de 1.5% de Agar, su
Semisólidos - SIM
consistencia es intermedia. Permiten observar la Motilidad.
Poseen pocos requerimientos nutricionales, se emplean para - Agár nutritivo
Simples
el crecimiento de las bacterias poco exigentes. - Caldo Nutritivo
De Contienen proteínas, carbohidratos y otros requerimientos - Agár Sangre
enriquecimiento nutritivos que permiten el alto crecimiento de las bacterias. - Agár Suero
- Agár S.S.
Contienen sustancias que inhiben el crecimiento de unos
Según Selectivos Salmonella
microorganismos y permite el de otros.
composición Shiguella
química Permiten el crecimiento diferencial de las bacterias a partir de - Agar de Mac
Diferenciales
una mezcla de ellas. Conkey
- Agar Citrato de
Para clasificación Permiten la identificación de las bacterias, basándose en Simmons
Bioquímica sus propiedades y comportamiento bioquímico. - Agar T.S.I.
- Agar L.I.A
Para Permiten el reconocimiento de la susceptibilidad de las - Agar de
Antibiogramas bacterias a los antibióticos. Mueller Hinton
Se utilizan para mantener viables los microorganismos
- Agar ó Medio
De transporte presentes en las muestras mientras son procesadas o
Según su Stuart
trasladadas a Laboratorios de Referencia.
utilidad
Son empleados para mantener cepas en el Laboratorio, para
práctica De conservación - Agar Nutritivo
estudios posteriores.
Para esterilidad Usados para chequear la pureza de ciertos productos. - Agar Sangre
Para recuentos Medios específicos para determinar el conteo bacteriano (U.F.C) - Agar Plate
bacterianos de muestras como agua, leche y otros alimentos en general. Count

PROCEDIMIENTO agua destilada y desionizada; luego

En la actualidad usamos medios de cultivo
deshidratados y pulverizados ó gránulos
desecados, empacados en envases de plástico
opaco para protegerlos de la acción de la luz.
Estos Medios de Cultivo están listos para
ser preparados como medios líquidos,
sólidos ó semisólidos, con solo restaurar la
humedad agregando agua estéril, destilada,
desionizada y manteniendo la relación
“Peso/Volumen”, según las instrucciones de
la casa comercial que usualmente se
encuentran en las etiquetas adjuntas a los
envases. También podemos preparar los
Medios de Cultivo pesando cada uno de sus
componentes por separado, adicionando el
________________________
hervimos hasta alcanzar el punto de
ebullición y esterilizamos cuando el Medio
de Cultivo lo requiera.
Los siguientes son los pasos a seguir en la
preparación de un medio de cultivo:
1. Calculamos el volumen total del medio a
preparar, teniendo en cuenta si su envase
final será una caja de petri cuyo volumen
aproximado es de 15 a 20 ml, por caja; o si
es un tubo de ensayo tapa rosca,
dependiendo del tamaño del tubo y del
tipo de prueba, el volumen puede variar
des de 2 hasta 10 ml por tubo.
2. Medimos en una probeta el volumen total 4. ¿Cuál es el origen, la función química e
de agua necesario, según los cálculos importancia del Agar en la preparación de los
obtenidos. medios de cultivo?.
3. Pesamos los gramos de Agar 5. ¿Cuáles son los Macronutrientes y
calculados según las instrucciones de la casa Micronutrientes que son necesarios como
comercial. requerimientos nutricionales para el
4. Hidratamos o agregamos el agua crecimiento de los microorganismos?.
destilada. 6. ¿Cuales son los medios de cultivo más
5. Homogenizamos el medio agitando empleados en la Agroindustria?. Justifique
periódicamente y colocando al calor hasta su respuesta.
alcanzar el punto de ebullición, retirándolo
al primer hervor. MAS INFORMACION...
6. Si es necesario ajustamos el pH.
7. Colocamos el medio homogenizado en  Profesores de Microbiología. Manual de
el autoclave hasta alcanzar una temperatura Laboratorio de Microbiología General.
de 121 °C y una presión de 15 libras (PSI) Universidad de Antioquia, Facultad de
por un tiempo de 15 a 20 minutos para Ciencias Exactas y Naturales. Medellín, 1986.
esterilizar.  González V. Gloria, Martínez H. Gloria.
8. Servimos el Medio en las cajas de petri Manual Sobre Técnicas Microbiológicas.
o en los tubos de ensayo tapa rosca. Universidad de Antioquia. Facultad de
9. Dejamos enfriar a temperatura Química Farmacéutica. Medellín, 1990.
ambiente y guardamos en la nevera a una  Díaz R, Gamazo C, Goñi-López I.
temperatura de refrigeración de 4 a 8 °C. Manual práctico de Microbiología. 2ª Ed.
Masson S.A. España, 1999.
TRABAJO COMPLEMENTARIO  Martínez M. María. Microbiologia.
Universidad Sur Colombiana. Facultad de
1. Realizar el Diagrama de Flujo de la Ciencias Básicas e Ingeniería. Santafé de
Presente Práctica. Bogotá. 1995.
2. ¿Cuales son las ventajas y desventajas de  Payne William J., Brown Dean R.
la utilización de los medios Sólidos y Microbiologia, Una presentación
Líquidos?. programada. Traducción de Editorial
3. ¿Qué significa U.F.C. y cual es su Panamericana. México 1974.
importancia en la Industria de Alimentos?.

________________________
 6. SISTEMAS DE SIEMBRA
“Koch encontró que, si los cultivos mixtos eran extendidos en forma de rayas
sobre la superficie de nutrientes sólidos, los diferentes microorganismos se
diseminaban y quedaban separados para producir colonias que no se mezclaban.”

La base del correcto diagnóstico pequeños. Si se desea conocer la identidad

microbiológico depende del manejo y
procesamiento de la muestra una vez llegada
al laboratorio, la técnica más usada en el
laboratorio de Microbiología es
transferencia de microorganismos de un
ambiente a otro, con el propósito de
cultivarlos.
En la naturaleza los microorganismos se
encuentran en grupos mixtos o con alta
diversidad ocupando espacios demasiado
de cada uno de las especies que componen
determinado nicho microbiano se hace
necesario obtener cultivos puros.
la
Existen varios métodos para conseguir una
población pura y evaluar sus características,
igualmente una gran variedad de técnicas,
por medio de las cuales a partir de una
muestra natural se pueden aislar e identificar
microorganismos específicos.

OBJETIVOS

1. Conocer las diferentes técnicas de siembra y aislamiento de los microorganismos a partir de

muestras, cultivos puros y mixtos.
2. Adquirir destreza en la manipulación y siembra de los microorganismos.
3. Conocer los métodos de recuento de los microorganismos.
4. Aplicar adecuadamente las técnicas de siembra y aislamiento en el análisis de las diferentes
muestras.

MATERIALES

 Asas: redonda y recta.

 Mechero.
 Láminas portaobjetos para coloración de Gram .
 Marcadores de punta fina.
 Reactivos de coloración de Gram.
 Cinta de enmascarar.
 1 Tubo con caldo nutritivo inoculado con Escherichia coli de 24 horas.
 1 Tubo con caldo nutritivo inoculado con Staphylococcus aureus de 24 horas.
 1 Tubo con Agar nutritivo inclinado inoculado con Klebsiella sp., de 24 horas.
 1 Tubo con Agar nutritivo inclinado inoculado con Bacillus sp., de 24 horas.
 4 tubos con caldo nutritivo estéril.
 4 cajas de petri con Agar nutritivo estéril.
 4 cajas de petri con Agar de Mac Conkey
 4 cajas de petri con Agar Sangre
 Otros medios selectivos

________________________
FUNDAMENTO
El éxito de un sistema apropiado de siembra
depende de la calidad de la muestra como
parte representativa de un todo susceptible
de ser analizada con un fin determinado. La
muestra debe cumplir estrictamente con tres
condiciones para que sea válida:
representatividad, homogeneidad y asepsia.
Es muy importante ser cuidadosos en la
colección de las muestras para análisis
microbiológicos en el campo de la Ingeniería
Agroindustrial como son : muestras de aguas,
suelos, medio ambiente, plantaciones,
animales y alimentos, entre otros. En la
colección de la muestra debemos tener en
cuenta:
 Las condiciones físicas: cantidad, color,
olor, pH, etc.
 Rapidez en su análisis, teniendo en
cuenta que mientras menos tiempo corra
desde el momento de la toma de la
muestra hasta su análisis, los resultados
serán más reales.
 La identificación de cada muestra para
evitar confusiones.
 Realización de la siembra en los medios
pertinentes según el propósito.
El sistema de siembras nos permite
determinar el tipo de microorganismos
presentes en una muestra, reconocer las
características de un determinado
microorganismo o mantenerlo en cultivo
puro el cual es la base de todos los análisis
para identificar a los microorganismos.
CLASES DE SIEMBRA EN TUBO
1.Siembra en estrías.
Se realiza en un tubo con medio sólido
inclinado con bisel, deslizando el asa sobre la
superficie y marcando surcos o estrías.
2.Siembra en picadura.
Se designa con este nombre a la siembra que
se realiza con asa recta en tubos de medios
sólidos o semisólidos generalmente sin
inclinar; se introduce el asa cargada con la
bacteria al medio de cultivo por el centro de
la superficie al fondo.
________________________
3.Siembra Mixta.
Igualmente se realizan siembras mixtas en
picadura en el fondo del tubo y luego se
desliza el asa por la superficie en bisel
marcando estrías.
4.Siembra en Medio liquido.
Para transferir un producto contenido en un
medio liquido o sólido a otros medios
líquidos se puede usar pipetas estériles o asa;
si se hace con pipeta, unas pocas gotas (2 a 3
gotas, equivalente a 100 a 150 microlitos) son
suficientes para el desarrollo bacteriano, si se
practica con asa redonda una o dos asadas.
PRÁCTICA 6A
PROCEDIMIENTO
Marcamos adecuadamente los tubos y las
cajas de petri con los Medios de Cultivo
estériles, con su nombre o identificación del
grupo, fecha, medio de cultivo y nombre
de la muestra.
SIEMBRA EN MEDIO LIQUIDO
La siembra en medios contenidos en tubos
requiere mayor cuidado, ya que un solo
microorganismo contaminante del aire puede
superar en crecimiento el microorganismo
presente en la muestra en estudio. Por tanto,
debemos tener las siguientes precauciones:
 Mantener inclinado el tubo que contiene
el medio de cultivo de modo que los
contaminantes del aire caigan en las
paredes externas del tubo y no en la
boca.
 Los tapones de los tubos deben
mantenerse en la mano derecha
sostenidos entre el meñique y el anular.
Nunca deben colocarse sobre la mesa de
trabajo o algún otro lugar.
A continuación seguimos el siguiente
procedimiento:
1. Calentamos el asa al rojo vivo y la
dejamos enfriar en las paredes del tubo.
2. Tomamos el medio de cultivo líquido
previamente inoculado con la mano
izquierda y quitamos el tapón de algodón con
la mano derecha.
3. Con el asa redonda sacamos una gota y
tapamos el tubo con su tapón después de
haber flameado su boca en el mechero.
4. Tomamos el tubo que vamos a sembrar
con la mano izquierda, quitamos el tapón,
flameamos la boca y depositamos el asa en el
medio líquido, agitándola cuidadosamente
dentro del líquido.
5. Retiramos el asa, flameamos la boca del
tubo y colocamos el tapón.
6. Calentamos el asa al rojo vivo.
7. Incubamos los tubos a 37°C por 24 horas.
8. Realizamos el mismo procedimiento para
los demás cultivos de la práctica.
SIEMBRA EN MEDIO SÓLIDO
Si realizamos la siembra en un medio sólido
contenido en un tubo de ensayo, seguimos
los pasos de la siembra en medio líquido pero
teniendo cuidado de utilizar el asa recta y
sembramos haciendo punción y/o estrías en
superficie del medio.
Si vamos a sembrar en un medio sólido en
caja de petri, realizamos los pasos anteriores,
con asa redonda haciendo estrías y/o rejillas.
También podemos realizar siembras
homogéneas o masivas con el fin de realizar
antibiogramas o conseguir altas poblaciones.
Las cajas de petri las debemos incubar
invertidas para impedir que el agua de
condensación que se deposita en la tapa caiga
sobre el medio y disperse las colonias.
SIEMBRA EN CAJA DE PETRI POR
AGOTAMIENTO.
Se toma la caja de petri en la palma de la
mano izquierda ligeramente inclinada; con la
mano derecha se maneja el asa previamente
esterilizada y con ella se recoge el material de
cultivo o en el caso de utilizar escobillón se
inocula en una pequeña área de la caja y se
trazan estrías paralelas hasta la mitad o
tercera parte de la caja; se quema el asa; se
hace girar la caja y se hacen estrías en la
misma forma hasta la mitad de la superficie
libre; se quema nuevamente el asa y se hace
________________________
girar la caja; se trazan estrías
perpendiculares a las anteriormente
practicadas en el cuadrante libre: se esteriliza
el asa antes de descartarla.
PRÁCTICA 6B
MÉTODO DE SIEMBRAS POR DILUCIÓN
El método que más usamos para determinar
el número de células microbianas en un
análisis, es el recuento en placa o recuento de
colonias. Este método se basa en la relación
teórica donde una célula bacteriana da lugar
a una colonia y en la presunción que el
número de colonias que se desarrollan sobre
una placa de agar, corresponde al número
original de bacterias.
En la caja de petri podemos sembrar en placa
profunda para el recuento de
microorganismos, o realizar siembras en
superficie tomando de la muestra analizada
con pipeta estéril 0.1 ml y distribuyéndolos
homogéneamente sobre la superficie del
medio.
MATERIALES
 Tubos de ensayo con solución salina
peptonada (SSP) para diluciones.
 Cajas de petri estériles.
 Pipetas de 1.0 ml estériles.
 Agar Plate Count.
 Solución salina peptonada.
 Muestras a analizar.
PROCEDIMIENTO
1. Tomamos cuatro tubos de ensayo con 9.0
ml de SSP, debidamente marcados del 1 al 4.
2. Después de homogenizar la muestra
tomamos 1.0 ml con una pipeta estéril y
añadimos al tubo número 1 (dilución 10 -1 o
1/10).
3. Con otra pipeta estéril, mezclamos y
tomamos 1.0 ml del tubo número 1 y lo
añadimos al tubo número 2 (dilución 10-2 o
1/100).
4. Con otra pipeta estéril mezclamos la
suspensión del tubo número 2 y añadimos 1.0
ml de esta al tubo número 3 (dilución 10-3 o
1/1000).
5. Con otra pipeta estéril mezclamos la
suspensión del tubo número 3, tomamos 1.0
ml y la pasamos al tubo número 4 (dilución
10-4 o 1/10000).
6. Con otra pipeta estéril mezclamos la
suspensión del número 4, tomamos 1.0 ml y
lo pasamos a una caja de petri estéril.
7. Con otra pipeta estéril mezclamos la
suspensión del número 3, tomamos 1.0 ml y
lo pasamos a una caja de petri estéril.
8. Con otra pipeta estéril mezclamos la
suspensión del número 2, tomamos 1.0 ml y
lo pasamos a una caja de petri estéril.
9. Con otra pipeta estéril mezclamos la
suspensión del número 1, tomamos 1.0 ml y
lo pasamos a una caja de petri estéril.
10. Después de haber agregado el inoculo a
la caja de petri, añadimos el Agar Plate Count
estéril, fundido y enfriado a 45 °C, a cada una
de las cajas, mezclamos con movimientos
circulares suaves en la dirección de las agujas
del reloj y luego en sentido contrario (tres
movimientos en cada dirección).
11. Dejamos enfriar el agar hasta que se
solidifique e incubamos a 37 °C por 24
horas.
12. Contamos las colonias y damos
resultados de la siguiente manera:
a. Seleccionamos las cajas que contengan
entre 30 y 300 colonias.
b. Empezamos a contar las colonias desde la
parte superior de la caja, evitando contar la
misma colonia dos veces.
c. Calculamos el número de microorganismo
por ml., de muestra, multiplicando el número
de colonias por el factor de dilución:
RTG = No. de colonias x factor de dilución
d. Los resultados se dan en número de
microorganismos por ml. Si tomamos 0.1 ml
de la muestra debemos multiplicar por 10 el
número final de microorganismos obtenidos.
Por ejemplo: Si contamos 250 colonias en la
dilución 1:10.000, reportamos así:
RTG = 250 x 10000 = 2.500.000 microorg./ml.
NOTA
Para llevar a cabo los pasos del 6 al 9 del
procedimiento anterior podemos utilizar una
________________________
sola pipeta, realizando la siembra en orden
descendente, es decir, con la pipeta que se
realizo la dilución del tubo número 4
realizamos las otras siembras; con esta pipeta
tomamos 1.0 ml del tubo número 3 y lo
dispensamos a su correspondiente caja de
petri, y así sucesivamente hasta llegar a la
dilución del tubo número 1.
PRÁCTICA 6C
MULTIPLICACIÓN BACTERIANA Y
FORMACION DE COLONIAS
Despues de practicada una siembra y dada
las condiciones requeridas de nutrientes,
temperatura, tiempo de incubación,
presencia o ausencia de oxigeno, segun el
tipo de bacteria investigada, observamos la
aparición macroscopica de las bacterias en
poblaciones, originadas a partir de una
célula y que denominamos Colonias.
En los Medios de cultivo sólidos las colonias
se desarrollan sobre la superficie del medio
presentando una morfologia con
caracteristicas comunes y particularres según
los grupos bacterianos y que constituyen uno
de los primeros pasos en la identificación de
bacterias.
Estas caracteristicas pueden presentar
variaciones dependiendo de la composicón
quimica del medio empleado co tambien de
las condiciones ambientales. En los Medios
Liquidos el crecimiento se hace aparente por
turbidez en el medio.
Las caracteristicas macroscopicas de las
colonias bacterianas que debemos tener en
cuenta para su descripción son:
 Tamaño: grande, mediana, pequeña y
puntiforme.
 Forma de borde: regular (continuo) ó
irregular (festonado, dentado, lobulado,
ondulado, filamentoso, arborescente).
 Forma de elevación: elevada ( convexa,
umbilicada, mamelonada, papilar).
 Superficie: lisa ó rugosa.
 Consistencia: blanda, dura, mucoide,
seca, grasosa, granulosa, viscosa.
 Aspecto: billante u opaco, mate ó
translucida.
 Color ó pigmento: amarillo, rojo, verde,
blanco, ocre, etc.
 Olor: sui-generis, nauseabundos,
fecaloides, a frutas, etc.
 Hemolisis: Total (beta), parcial (alfa), no
hemolisis (gama).
Ver gráficos anexos para complementar la
información del presente laboratorio.
TRABAJO COMPLEMENTARIO
1.¿Qué diferencia existe entre los
procedimientos de siembra y repique?
2.¿Que ventajas tiene la siembra en Medios
sólidos sobre la siembra en Medios líquidos?
3.¿Escriba tres posibles causas de
contaminación de un cultivo?
4. ¿Qué es un cultivo microbiano?
5. ¿Qué es un cultivo mixto?
6. ¿Qué es un cultivo puro?
7. ¿Qué es un cultivo contaminado?
8. ¿Qué es un inóculo microbiano?
9. Describa las características morfológicas de
las colonias de los siguientes géneros
microbianos: Escherichia, Lactobacillus,
Estafilococos, Clostridium, Salmonella.
10. ¿Se obtendría el mismo resultado si
cuantificáramos las bacterias de una muestra
por turbidimetría o por diluciones seriadas?
¿ Por qué?
11. Se sembraron dos placas de medios de
cultivo a partir de las diluciones 1/10.000 y
1/100.000. Tras la incubación de las placas a
37° C, no apareció ninguna colonia. ¿Significa
________________________
esto que no había ninguna bacteria en la
muestra problema? Explique este resultado.
12. Se toman 2.5 gramos de tierra y se
resuspenden en solución salina estéril hasta
un volumen final de 50ml. A continuación se
hacen diluciones decimales y se siembran
0.2ml de cada una sobre un medio adecuado.
Tras la incubación en la placa de la dilución
1/1.000.000 crecen 200 colonias, calcule el
número probable de UFC por gramo de tierra
y el RTG de la resuspensión.
13.¿Desde su punto de vista cual es la
importancia de aplicar correctamente las
técnicas de siembra para el futuro desempeño
de su profesión?
MAS INFORMACION...
 Profesores de Microbiología. Manual de
Laboratorio de Microbiología General.
Universidad de Antioquia, Facultad de
Ciencias Exactas y Naturales. Medellín, 1986.
 González V. Gloria, Martínez H. Gloria.
Manual Sobre Técnicas Microbiológicas.
Universidad de Antioquia. Facultad de
Química Farmacéutica. Medellín, 1990.
 Díaz R, Gamazo C, Goñi-López I.
Manual práctico de Microbiología. 2ª Ed.
Masson S.A. España, 1999.
 Martínez M. María. Microbiologia.
Universidad Sur Colombiana. Facultad de
Ciencias Básicas e Ingeniería. Santafé de
Bogotá. 1995.
 Pulido P. Rosalba, Ramirez C. Carlos.
Elementos del método en Microbiología.
Departamento de Biología. Catedra de
Microbiología. Universidad Pedagógica
Nacional.
 7. REACCIONES BIOQUIMICAS
“El conjunto de todas las reacciones bioquímicas de un organismo vivo se conoce
como Metabolismo. En condiciones in- vitro se pueden realizar pruebas
bioquímicas estandarizadas que permiten ver el comportamiento metabólico de
los microorganismo y a la vez contribuyen en su identificación ”

En las agroindustrias alimenticias en donde insuficientes para diferenciar dos

se elaboran productos mediante cultivos de microorganismos; por esta razón existen otro
microorganismos es muy importante tener un tipo de técnicas basadas en el metabolismo de
amplio conocimiento de los microorganismos los microorganismos para su diferenciación.
de interés y de aquellos que puedan Estos se cultivan en sustratos en donde se
intervenir en el funcionamiento del mismo suceden transformaciones químicas por las
alterando el producto. Por esta razón es reacciones de las sustancias producidas por el
fundamental que el futuro ingeniero microorganismo y los componentes del
agroindustrial pueda en y un momento medio.
determinado identificar a cualquier En este laboratorio trataremos mas
microorganismo para prevenir futuras específicamente el grupo de las
alteraciones y tomar acciones correctivas. Enterobacterias ya que en un momento dado
En el proceso de identificación de los en las industrias alimenticias son estos tipos
microorganismos las técnicas de coloración e de microorganismos los principales
identificación morfológica resultan contaminantes.
OBJETIVOS
1. Reconocer y analizar algunas de las técnicas mas importantes empleadas para la
identificación de Enterobacterias.
2. Familiarizar al estudiante de Ingeniería Agroindustrial con las pruebas de identificación de
microorganismos, especialmente para las Enterobacterias.
3. Identificar, evidenciar y analizar las características principales de los medios de cultivo
empleados para las reacciones con el microorganismo.
4. Conocer otros sistemas de identificación más sistemáticos.
5. Reconocer por medio de las técnicas de identificación el microorganismo asignado, y así
evidenciar sus características principales y comportamiento metabólico el cual es único
para cada especie.

MATERIALES
 Medios de cultivo:
 Agar citrato de Simmons
 Agar Triple Azucar Hierro (TSI)
 Agar de SIM (Sulfuros Indol Motilidad)
 Agar Urea
 Agar Lisina Hierro (LIA)

 Tiras comerciales  Asas

 Reactivos para la coloración de Gram  Reactivo de Kovacs

________________________
PRACTICA 1: REACCIONES
BIOQUIMICAS CON MEDIOS DE
CULTIVO PARA ENTEROBACTERIAS
1. PRUEBA DE OXIDASA
Fundamento
Se emplea para la determinación de la enzima
Citocromo Oxidasa (Citrocomo C), por medio
del reactivo dehidrocloruro de tetrametil-
parafenilendiamina.
Este reactivo actúa como aceptor artificial de
electrones sustituyendo al oxigeno. En su
estado reducido es incoloro pero en la
presencia de la Citocromo Oxidasa del
microorganismo y el oxigeno atmosférico se
oxida formando el azul de indofenol. Para
esta prueba se pueden utilizan reactivos o
tiras.
Procedimiento
Tiras comerciales: Frote una colonia en la
superficie de uno de los extremos de la tira
Lectura
Positiva: color violeta
Negativa: no hay desarrollo de color
Se deben esperar unos minutos para estar
seguro del resultado.
2. COLORACION DE GRAM
Fundamento
Según la afinidad con la coloración de Gram
las bacterias se dividen en: Gram positivas
(se tiñen de color violeta) y en Gram
negativas (se tiñen de color rojo). La división
de las bacterias en Gram positivas y en Gram
negativas esta dada por las diferencias físicas
y químicas en la composición de la pared
celular.
La pared celular de las bacterias Gram
positivas, esta compuesta en un 50-60% por
peptidoglican y en un 40-50% por ácidos
teicoicos y polisacáridos. En las bacterias
Gram positivas el cristal violeta se fija a la
pared celular y con la adición del lugol
(mordiente), se produce el complejo cristal
violeta-yodo el cual es resistente a la
decoloración.
________________________
La pared celular de las bacterias Gram
negativas esta compuesta por una delgada
capa de peptidoglican que constituye del 5-
10%, fosfolípidos (20-30%), lipopolisacáridos
(30%) y proteína (40-50%). El decolorante en
las bacterias Gram negativas actúa como un
solvente de los lípidos presentes y el
complejo cristal violeta-yodo se libera,
tomando la bacteria el colorante secundario o
de contraste (safranina).
Procedimiento
Seguir la técnica descrita en el Laboratorio
No 4
Lectura
Gram positivas: bacterias teñidas de color
violeta
Gram negativas: bacterias teñidas de color
rojo
3. AGAR TRIPLE AZUCAR HIERRO (TSI)
Fundamento
Es un Agar diferencial basado en la
fermentación de azucares y la producción de
H2S y gas. Contiene glucosa, sacarosa y
lactosa; la lactosa y la sacarosa están
presentes en una concentración 10 veces
mayor a la glucosa; aquí se desarrollaran las
Bacterias que contengan la enzima Beta-
galactosidasa, la cual permite la degradación
de la lactosa en galactosa mas glucosa y estas
posteriormente en ácido, CO2 y gas; el
indicador de pH es el rojo de fenol, el cual
vira a amarillo por la formación de ácido a
partir del carbohidrato; el sulfato ferroso es
un detector de la producción de H2S.
Durante el proceso de fermentación, puede
producirse o no gas, que se detectara por la
formación de burbujas o desplazamiento del
medio.
Procedimiento
Con el asa recta tomar una colonia del
microorganismo y puncionar el medio por el
centro, una sola vez, hasta el fondo del tubo;
terminar la inoculación haciendo una estría
en la superficie del tendido. Incubar a 37C
por 24 a 48 horas con la tapa floja.
Lectura
Acido tendido/Acido fondo (A/A):
Fermentación de carbohidratos (+)
Alcalino tendido/Alcalino fondo (K/K):
Fermentación de carbohidratos (-)
Alcalino tendido/Acido fondo (K/A):
Fermentación de glucosa (+)
Fermentación de lactosa (-)
Producción de gas: Burbujas dentro del
medio o desplazamiento
Producción de H2S: Ennegrecimiento del
medio
4. AGAR CITRATO DE SIMMONS
Fundamento
Algunas Bacterias pueden obtener energía
utilizando el citrato como única fuente de
carbono; son aquellas que poseen la enzima
citrasa, que pueden degradar el citrato hasta
oxalacetato que finalmente se incorpora al
ciclo de krebs. El medio utilizado para este
fin no debe contener proteínas y
carbohidratos que sirvan como otra fuente de
carbono, por esta razón, es empleado el
Citrato de Simmons que contiene citrato de
sodio, sales de amonio y azul de bromotimol
como indicador del cambio de pH que ocurre
cuando se degradan las sales de amonio
produciendo hidróxido de amonio y
basidifican o alcaliniza el medio. El indicador
azul de bromotimol es amarillo a pH menor
de 6.0 y azul a pH mayor de 7.6
Procedimiento
Con el asa recta tomar una colonia del
microorganismo a estudiar, del agar de
MacConkey. Sembrar en la superficie del
tendido haciendo una estría, e incubar a 35
por 24 horas.
Lectura
POSITIVA: Crecimiento y cambio del medio
(verde) a color azul a las 24 horas de
incubación.
NEGATIVA: El medio no cambia de color.
________________________
5. AGAR DE SIM
Fundamento
Se emplea el medio SIM (Sulfuros Indol
Motilidad) que contiene triptófano
(aminoácido), azufre, sales de hierro y agar.
En esta prueba se pueden observar tres
reacciones:
 Producción de ácido sulfídrico (H2S) : ayuda
a diferenciar entre las especies de bacterias capaces
de producir ácido sulfídrico. El medio contiene
aminoácidos azufrados, que por acción enzimática
de las bacterias producen un gas incoloro (H2S),
que al reaccionar con una sal pesada de citrato
férrico de amonio produce un precipitado negro
insoluble (sulfuro ferroso).
Cistina Cisteina Desulfurasa
Cisteina Acido Pirúvico + H2S + NH3
H2S + citrato férrico de amonio Sulfuro
ferroso (precipitado negro)
 Prueba del Indol: Señala la capacidad de las
bacterias para oxidar el triptófano y utilizarlo
como fuente de nitrógeno, esta reacción es
detectada mediante la adición del Reactivo de
Kovac's al medio dando una coloración roja cereza
en forma de anillo en la superficie del medio. La
acción enzimática de la triptofanasa produce
varios metabolitos entre los cuales esta el Indol.
 Prueba de Motilidad: En este medio se puede
detectar la movilidad de las bacterias que la
poseen, siempre y cuando no haya producción de
H2S que dificulta la lectura. Cuando esto ocurre
la motilidad se observa en el medio Agar blando.
El desplazamiento se observa hacia las paredes del
tubo provocando turbidez.
Procedimiento
Tomar una superficie aislada del
microorganismo con el asa de punta recta y
puncionar el medio hasta el fondo del tubo
una vez suavemente. Después de incubar
agregar unas gotas del reactivo de Kovacs y
esperar unos minutos para la reacción.
Lectura
Producción de H2S: Aparición de pigmento
negro.
Producción de Indol: Produce anillo rojo (+)
No produce anillo (--)
MOTILIDAD:
Positivo: el microorganismo se difunde en el
medio provocando opacidad
Negativo: crecimiento bacteriano siguiendo
la linea de siembra
6. AGAR DE UREA
Fundamento
Este medio señala la capacidad de un
microorganismo para desdoblar la urea, por
acción de la enzima ureasa. Especialmente
sirve para identificar las especies del genero
Proteus también puede ser usado para otras
enterobacterias, que hidrolizan la urea mas
lentamente, incubando el medio por un
periodo mas largo de tiempo (48 horas). La
urea al ser hidrolizada produce amonio que
reacciona en solución formándose carbonato
de amonio, compuesto que alcaliniza el
medio, es decir, cambian el color amarillo
inicial del medio a un color rojo rosado o
fucsia. El indicador de pH es Rojo de Fenol.
Urea ureasa Amoniaco + CO2
Procedimiento
Tomar una colonia del microorganismo con
el asa de punta recta. Inocular el medio una
vez, hasta el fondo del tubo, suavemente.
Lectura
Positivo: color rojo fucsia (urea hidrolizada)
Negativo: color amarillo (urea no
hidrolizada)
7. AGAR LISINA HIERRO (LIA)
Fundamento
Los procesos de decarboxilación y Producción de gas: Burbujas dentro del
deaminación en el medio de cultivo, tienen
lugar con la previa fermentación del
carbohidrato que contiene el medio (glucosa)
y la acidez producida por esta reacción; si el
microorganismo posee las decarboxilasas
________________________
necesarias, se produce la decarboxilación
liberándose como producto final las aminas
que alcalinizan el medio de cultivo; si el
microorganismo posee las deaminasas se
efectúa la deaminacion y el producto final
son ácidos orgánicos que acidifican el medio
de cultivo. Los géneros Proteus, Providencia y
Morganella deaminan la lisina con una
característica especial y es la formación de un
complejo pardo-rojizo en la superficie del
medio, el cual se produce por la presencia de
oxigeno y de sales férricas. Este medio
además es útil en la identificación de algunas
especies de Salmonella, las cuales son lisina
decarboxilasa positivas en un 94.6%.
Salmonella paratyphi es lisina decarboxilasa
negativa. Ninguna de las especies del genero
Citrobacter que son lactosa negativa,
decarboxilan la lisina. La decarboxilacion de
la lisina se observa por la presencia de un
color púrpura, en todo el medio (K/K). Esto
se debe a la alcalinizacion del medio por la
amina liberada: cadaverina.
Procedimiento
Con el asa recta, tomar una colonia del
microorganismo y puncionar el medio por el
centro hasta el fondo dos veces. Terminar la
inoculación con una estría en el tendido,
luego cerrar el tubo e incubar a 37C por 24
horas.
Lectura
Color del tendido:
- Púrpura (decarboxilación) K
- Rojo (deaminacion) R
Color del fondo:
- Amarillo (ácido de glucosa) A
- Púrpura (decarboxilación) K
medio
Producción de H2S: Ennegrecimiento del
medio
 Figura x. Esquema simplificado a seguir para la inoculación de cada medio

TSI CITRATO
TSI CITRATO LIA
LIA SIM
SIM UREA
UREA
UREAURAAUREA
UREAURAAUREA
UADRO DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN LOS MEDIOS DE CULTIVO

RESULTAD
MEDIOS DE CULTIVO REACCIONES
O
Su Fuente Citrato
Agar citrato de Simmons
Su Fuente No Es Citrato
Agar LIA Tendido K (Decarboxilacion)
R (Deaminacion)
A (Acidez)
Fondo
K (decarboxilacion)
Fermenta Lactosa
Fermenta Glucosa
Agar TSI
H2S
Produccion de Gas
H2S
Agar SIM Indol
Motilidad
Hidroliza la urea
Agar Urea
No Hidroliza la urea

IDENTIFICACION DEL MICROORGANISMO POR EL DIAGRAMA TENIENDO EN

CUENTA LAS REACCIONES OBTENIDAS

LISINA + ORNITINA +
E. coli
E. aerogenes
H. alvei
S. marcescens
S. liquefaciens
E. gergoviae
S. odorifera
+ INDOL -

E. coli E. aerogenes
________________________
H. alvei
S. odorifera S. marcescens
S. liquefaciens
E. gergoviae
 + ARABINOSA -

+ GAS -

IDENTIFICACION DEL MICROORGANISMO TENIENDO EN CUENTA LOS MEDIOS DE

CULTIVO

AGAR CITRATO DE SIMMONS

CRECIMIENTO MICROORGANISMOS
Positivo: Citrato positivos:
Medio de cultivo Azul Citrobacter, Enterobacter, S. partyphi B, S
obscuro enteritidis, S. Typhimurium, Arizona, Klebsiella,
Serratia y otros
Negativo o inhibido Citrato negativos:
Escherichia, Shigella, S. typhi, S. paratyphi A, y otros

AGAR LIA
COLOR DEL MEDIO DE CULTIVO
PRODUCCION
MICROORGANISMO Columna Superficie
DE H2S
vertical Inclinada
Arizona Violeta Violeta +
Salmonella* Violeta Violeta +
Proteus mirabilis
Amarillo Pardo-rojizo +
Proteus vulgaris
Proteus morganii
Amarillo Pardo-rojizo -
Proteus rettgeri
Providencia Amarillo Pardo-rojizo -
Citrobacter Amarillo Violeta +
Escherichia Amarillo Violeta -
Shigella Amarillo Violeta -
________________________
 Klebsiella Violeta Violeta -

 Excepción: Salmonella paratyphi A (sin formación de lisina-descerboxilasa, columna vertical=

amarillo, Superficie inclinada=violeta)

MEDIO DE CULTIVO SIM

MICROORGANISMO H2S INDOL MOTILIDAD
Escherichia - + +/-
Enterobacter - - +
Citrobacter + - +
Klebsiella - - -
Salmonella + - +
Shigella - +/- -
Prot. Vulgaris + + +
Prot. Mirabilis + - +
Morganella - + +
Rettgerella - + +
Arizona + - +
Hafnia - - +
Serratia - - +
Providencia - + +
Edwardsiella + + +
Yers. enterocolitica - - (+) -

AGAR DE UREA

MEDIO DE CULTIVO MICROORGANISMOS

Rojo Urea – positivos:
Proteus, Klebsiella, algunos Enterobacter y
Citrobacter y otros
Amarillo Urea – negativos:
Shigella, Salmonella, Escherichia,
Citrobacter, Enterobacter, Serratia,
Providencia y otros

________________________
________________________
PRACTICA 2: REACCIONES
BIOQUIMICAS PARA
ENTEROBACTERIAS CON EL SISTEMA
API 20 E
API 20 E es un sistema para la identificación
de las Enterobacterias y otros bacilos Gram-
negativos no exigentes que utiliza 23 tests
bioquímicos estandarizados y 1.
miniaturizados, y una base de datos.
Cada galería del API 20 E consta de 20
microtubos conteniendo substratos
deshidratados. Estos tests se inoculan con
una suspensión bacteriana la cual hidrata el
medio. Durante la incubación, se producen
cambios de color espontáneos o revelados por
adición de reactivos. La lectura de las
reacciones se hace de acuerdo con la tabla de
lectura y la identificación mediante el API 20
E Index o el programa informático para
identificación.
PROCEDIMIENTO
Las muestras y cultivos bacterianos deben ser
considerados como potencialmente
infecciosos y deben ser manipulados de
manera adecuada (empleando lo aprendido
en bioseguridad). Las técnicas asépticas y las
precauciones habituales de manipulación
para el grupo bacteriano estudiado deben ser
respetadas durante toda la manipulación.
 Preparación del Inoculo: Realizar una
suspensión del microorganismo en 5 ml
de agua destilada; con la ayuda del asa
de punta redonda, arrastrar colonias del
medio de cultivo y suspender en el tubo
de ensayo que contiene el agua destilada,
homogenizar cuidadosamente las
bacterias en el medio; dejar reposar de 10
a 15 minutos hasta apreciar cierto grado
de turbidez.
 Preparación de la galeria:
1. Preparamos la cámara de incubación, con
su tapa correspondiente, y repartimos
________________________
agua destilada en los alvéolos para
proporcionar una atmósfera húmeda.
2. Anotamos el numero de la muestra
seleccionada en la lengüeta lateral.
3. Sacar la galería de su embalaje.
4. Colocar la galería, de forma inclinada, en
la cámara de incubación.
 Incoculacion de la galeria:
Con la ayuda de una micropipeta, llenar
todos los tubos con 200 m l de la
suspensión bacteriana.
2. Llenar tubos y cúpulas (parte
sobresaliente) de los tests I CIT I I VP I
Y I GEL I con la suspensión
bacteriana.
3. Llenar la cúpula de los tests ADH, LDC,
ODC, H2S, Y URE con aceite Mineral
(para obtener anaerobiosis).
4. Cerrar la cámara de incubacion
5. Incubar a 37ºC durante 18-24 horas
 LECTURA DE LA GALERIA
1. Después de 18-24 horas A 35-37°C, leer la
galería con la ayuda de la Tabla de
Lectura.
2. Anotar en la hoja de resultados las
reacciones espontaneas
3. Efectuar el revelado de los tests, que
requieran reactivos, de la siguiente
manera:
Tests TDA: Añadir 2 gotas de Cloruro
Férrico. Un color marrón oscuro indica una
reacción positiva. Anotar los resultados en la
hoja.
Tests IND: Añadir 2 gotas de reactivo de
KOVACS y esperar 2 minutos. La aparicion
de un anillo rojo indica que la reaccion es
positiva. Anotar los resultados.
Tests VP: Añadir una gota de solución A
(Hidróxido de Potasio) y una gota de
solución B (a-Naftol). Esperar como minimo
10 minutos. Un color rojo o rosa indica una
reacción positiva. La aparición de una
coloración rosa pálido en 10-12 minutos, debe
ser considerada como negativa.
 TABLA DE LECTURA
RESULTADOS
TEST SUBSTRATOS REACCIONES /ENZIMAS
NEGATIVO POSITIVO
Orto-nito-fenol-b-D
ONPG b-galactosidasa incoloro Amarillo(1)
Galactopiranosido
ADH Arginina Arginina dehidrolasa Amarillo Rojo / naranja(2)
LDC Lisina Lisina descarboxilasa Amarillo naranja
ODC Ornitina Ornitina descarboxilasa Amarillo Rojo / naranja(2)
Verde
I CITI Citrato sódico Utilización del Citrato Azul-verde / azul(3)
pálido/amarillo
H2S Tiosulfato sódico Producción de H2S Incoloro/grisáceo Deposito negro
URE Urea Ureasa amarillo Rojo / naranja
TDA / inmediato
TDA Triptofano Triptofano desaminasa
amarillo Marrón oscuro
JAMES / inmediato o IND / 2 min
JAMES
JAMES
Incoloro
Rosa
Verde
IND Triptofano Producción de indol claro/amarillo
IND
IND
Anillo rojo
amarillo
VP 1 más VP 2 / 10 minutos
I VP I Piruvato sódico Producción de acetoina
incoloro Rosado / rojo
No hay difusión Difusión de
IGELI Gelatina de Kohn Gelatinasa
de pigmento negro pigmento negro
Fermentación /
GLU Glucosa Azul / azul verdoso Amarillo
oxidación(4)
Fermentación /
MAN Manitol Azul / azul verdoso Amarillo
oxidación(4)
Fermentación /
INO Inositol Azul / azul verdoso Amarillo
oxidación(4)
Fermentación /
SOR Sorbitol Azul / azul verdoso Amarillo
oxidación(4)
Fermentación /
RHA Ramnosa Azul / azul verdoso Amarillo
oxidación(4)
Fermentación /
SAC Sacarosa Azul / azul verdoso Amarillo
oxidación(4)
Fermentación /
MEL Melibiosa Azul / azul verdoso Amarillo
oxidación(4)
Fermentación /
AMY Amigdalina Azul / azul verdoso Amarillo
oxidación(4)
Fermentación /
ARA Arabinosa Azul / azul verdoso Amarillo
oxidación(4)
OX / 1-2 minutos
OX Sobre papel filtro Citocromo oxidasa
Incoloro Violeta
1) Un amarillo muy pálido debe considerarse como positivo
2) Un color naranja después de 24 horas de incubación debe considerarse negativo
3) La lectura debe hacerse en la cúpula (aerobiosis)
4) La fermentación empieza en la parte inferior de los tubos, la oxidación empieza en la cúpula.
________________________
INTERPRETACION DE RESULTADOS
OBTENIDOS CON EL API 20 E
En la hoja de resultados los tests estan en
grupos de tres y cada uno tiene asignado un
valor: 1, 2 o 4. La galeria API 20 E consta de
20 test, los numeros en el interior de cada
grupo corresponden a las reacciones
positivas. Los tests que obtengan reaccion
positiva se le asigna el valor correspondiente.
Sumando los valores de los tests positivos
para cada grupo se obtiene un codigo de 7
cifras. Con este codigo empleamos un
sistema de identificacion que consiste en unas
tablas donde se busca el codigo exacto o un
numero aproximado. El formato utilizado
para la prueba se encuentra a continuacion:

ONPG ADH LDC ODC I CIT I H2S URE TDA IND I VP I IGEL I GLU
1
+ + + + + + + + - + + +

7 7 3 7

MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX

1 1
+ + -- + + + + + -

3 7 3

En el esquema de resultados del ejemplo anterior, el codigo obtenido es: 7737373 que corresponde a
una salmonella spp.

TRABAJO COMPLEMENTARIO MAS INFORMACIÓN

1. ¿Por qué es importante trabajar con
cultivos puros para la identificación
de microorganismos?
2. ¿cuáles son las diferencias más
significativas entre respiración y
fermentación?
3. ¿Qué otros medios de cultivo son
empleados para la identificación de
microorganismos?
 Frazier W.C. Microbiologia de los
alimentos. Ed Acribio. Zaragoza, España.
 Philip L. Carpenter. Microbiologia. Ed
Interamericana
 Burrows William. Microbiologia. Ed
Interamericana. México 1969
 Manual para el Diagnostico in vitro
 Medios de cultivo MERCK

________________________
 HONGOS Y LEVADURAS

Los hongos son organismos eucarióticos, hongos causan deterioro en textiles, ropas,
poseen un verdadero núcleo delimitado y madera, etc. Y, además enfermedades en
definido. Se encuentran ampliamente plantas, animales y el hombre.
distribuidos en el suelo, en el aire, en el agua,
como parásitos de plantas, animales y el Los hongos se clasifican en cuatro
hombre y como contaminantes de alimentos subdivisiones teniendo en cuenta la forma
y otras sustancias. como se reproducen, así:
 Zygomicotina, los que poseen
Estos microorganismos son muy ubicuos y esporangiosporas para la reproducción
tienen una profunda influencia en su medio asexual y zigosporas para la sexual.
ambiente, actúan sobre madera, hojas, tallos,  Ascomicotina, los que poseen ascosporas
etc. Para formar el humus que enriquece el para la reproducción sexual y
suelo: expelen CO2 a la atmósfera, el cual es conidiosporas para la asexual.
usado por las plantas; son empleados en la  Basidiomicotina, los que poseen
industria de fermentación para producir basidiospora para la reproducción sexual;
ácidos orgánicos,, alcoholes y otros y oidiosporas o artrosporas para la
compuestos; sirven como fuentes de algunos reproducción asexual.
antibióticos, son utilizados en la elaboración  Deuteromicotina, que solamente se les
de queso; si no se controlan, esos mismos conoce reproducción asexual por medio
de micro o macroconidias.

OBJETIVOS
 Adquirir destreza en al identificación de las estructuras de los hongos.
 Desarrollar destreza en el cultivo e identificación de los hongos contaminantes de áreas de
industria, productos agroindustriales etc.
 Familiarizarse con las técnicas tales como examen directo, siembra y repiques microbiológicos
necesarios para el correcto diagnóstico macro y microscópico.

MATERIALES

 Estériles
 Cubre y porta objetos
 H2O destilada estéril
 Lugol
 Azul de lactofenol
 Levaduras (Saccharomyces cerevisiae)
Ficomicetes Rhizopus sp. Ascomicetes: penicillium sp. Aspergillus sp.
Basidiomycetes (agaricales, poliporaceos, telephoraceos e hydnaceos).
Deutoromycetes (Mycrosporum canis – Trycophyton metagrophytes) etc.
 Medios (Sabouraund – Mycosel).
________________________
FUNDAMENTO
HONGOS Y LEVADURAS
Los hongos y levaduras constituyen un
amplio y diverso grupo.
Los hongos pueden definirse como
organismos nucleados, formadores de
esporas y carentes de clorofila, se reproducen
sexual y asexualmente. Los hongos y
levaduras son en su mayoría saprofitos, por
esto tienen gran importancia en la
descomposición de la materia orgánica
natural y los alimentos. Otras especies son
parásitas facultativas, dependiendo del
medio ambiente. Pueden causar
enfermedades en las plantas, animales y en el
hombre y son de gran importancia en los
procesos de fermentación industrial, ejemplo:
panes, cerveza, vinos. Algunos son usados en
la producción de queso, vitaminas, ácidos
orgánicos y antibióticos. En los últimos años
se han convertido en herramienta de trabajo
para la Ingeniería Agroindustrial debido a
sus ciclos de reproductividad únicos y su
metabolismo relativamente simple.
MOHOS
Se da el nombre de mohos a ciertos hongos
multicelulares, filamentosos, cuyo
crecimiento se conoce fácilmente por su
aspecto aterciopelado o algodonoso.
Caracteres Morfológicos:
La forma y estructura macro y microscópica
de los mohos es la base para su identificación
y clasificación.
1. Hifas y micelio. Los mohos están
constituidos por unos filamentos
ramificados y entrecortados llamados hifas,
cuyo conjunto forma el micelio.
2. Estructuras reproductoras. Generalmente
le reproducción se realiza por esporas
asexuadas, algunas formas esporas
________________________
sexuales. Las esporas asexuales se
diseminan fácilmente con la ayuda del
aire originando nuevos mohos en donde
se encuentres condiciones favorables.
Característica fisiológicas de los mohos:
1. Requerimientos de humedad.
La mayoría de los hongos requieren
menos humedad que las levaduras y las
bacterias crecen en un a w de 1.88.
2. Requerimientos de temperatura
La mayoría de los hongos deben ser
considerados mesófilos la temperatura
óptima para la mayoría es de 25 a 30ºC,
algunos crecen bien entre 35 y 37ºC.
Algunos pueden ser psicrófilos, crecen
bien a temperaturas de refrigeración y
otros a temperaturas bajas de congelación
pero de forma lenta. Unos pocos son
termófilos.
3. Requerimientos de O2 y pH
Los mohos son aeróbicos. La mayoría
puede crecer en amplio rango de pH 2.0–
8.5, pero la mayoría son favorecidos por
un pH ácido.
4. Requerimientos nutritivos
Los mohos en general pueden utilizar
muchos tipos de alimentos desde simples
hasta complejos.
Los requerimientos básicos incluyen una
fuente orgánica de carbono, en forma de
azúcar o almidón, y una fuente orgánica
o inorgánica de nitrógeno. Iones
inorgánicos, tales como potasio y
magnesio, ambos son sulfato y fosfato; y
trazas de zinc, cobre y magnesio. Factores
de crecimiento específicos pueden ser
necesitados por aquellas especies que no
pueden sintetizar sus propias vitaminas.
5. Inhibidores
Compuestos inhibidores de otros
microorganismos son producidos por
algunos mohos, tales como la penicilina
de Penicillium chrysogenin.
Clasificación e identificación de los
mohos:
Criterios:
1. Hifas septadas o no.
2. Que en micelio sea claro u obscuro. 6. Características de las cabezuelas de las
3. Que el micelio sea claro o incoloro. esporas.
4. Que se produzcan esporas o no y en caso a. Esporangio: tamaño, forma color
de que se produzcan, de que tipo: colocación.
cosporas, zigosporas, ascosporas. b. Conidios: simples o en cadenas, por
5. Clases de esporas asexuales: gemeción o en masa,forma y
esporangiosporas, conidios o disposición de los estigmas.
artrosporas.

IMPORTANCIA DE LOS HONGOS

INDUSTRIAL

PRODUCTOS ALIMENTICIOS
Quesos
FERMENTACIÓN
(P.roqueforti) ANTIBIÓTICOS

Cerveza – vino Penicilium sp.

(Especies levaduras)

Patógeno de plantas Herramientas de

investigación

Obligatorios facultativa
s Médica Biológica

Usualmente Tizón
especies fúnico
dependientes
ej. Roya Descomposición
natural de la
materia orgánica
Patógenos para (hongos saprofitos)
animales y humanos
Producción de
toxinas

Importancia Importancia
medica industrial

________________________
 HONGOS Y LEVADURAS

Los hongos son organismos eucarióticos, hongos causan deterioro en textiles, ropas,
poseen un verdadero núcleo delimitado y madera, etc. Y, además enfermedades en
definido. Se encuentran ampliamente plantas, animales y el hombre.
distribuidos en el suelo, en el aire, en el agua,
como parásitos de plantas, animales y el Los hongos se clasifican en cuatro
hombre y como contaminantes de alimentos subdivisiones teniendo en cuenta la forma
y otras sustancias. como se reproducen, así:
 Zygomicotina, los que poseen
Estos microorganismos son muy ubicuos y esporangiosporas para la reproducción
tienen una profunda influencia en su medio asexual y zigosporas para la sexual.
ambiente, actúan sobre madera, hojas, tallos,  Ascomicotina, los que poseen ascosporas
etc. Para formar el humus que enriquece el para la reproducción sexual y
suelo: expelen CO2 a la atmósfera, el cual es conidiosporas para la asexual.
usado por las plantas; son empleados en la  Basidiomicotina, los que poseen
industria de fermentación para producir basidiospora para la reproducción sexual;
ácidos orgánicos,, alcoholes y otros y oidiosporas o artrosporas para la
compuestos; sirven como fuentes de algunos reproducción asexual.
antibióticos, son utilizados en la elaboración  Deuteromicotina, que solamente se les
de queso; si no se controlan, esos mismos conoce reproducción asexual por medio
de micro o macroconidias.

OBJETIVOS

 Adquirir destreza en al identificación de las estructuras de los hongos.

 Desarrollar destreza en el cultivo e identificación de los hongos contaminantes de áreas de
industria, productos agroindustriales etc.
 Familiarizarse con las técnicas tales como examen directo, siembra y repiques microbiológicos
necesarios para el correcto diagnóstico macro y microscópico.

MATERIALES

 Estériles
 Cubre y porta objetos
 H2O destilada estéril
 Lugol
 Azul de lactofenol
 Levaduras (Saccharomyces cerevisiae)
Ficomicetes Rhizopus sp. Ascomicetes: penicillium sp. Aspergillus sp.
Basidiomycetes (agaricales, poliporaceos, telephoraceos e hydnaceos).
Deutoromycetes (Mycrosporum canis – Trycophyton metagrophytes) etc.
 Medios (Sabouraund – Mycosel).

________________________
FUNDAMENTO
HONGOS Y LEVADURAS
Los hongos y levaduras constituyen un
amplio y diverso grupo.
Los hongos pueden definirse como
organismos nucleados, formadores de
esporas y carentes de clorofila, se reproducen
sexual y asexualmente. Los hongos y
levaduras son en su mayoría saprofitos, por
esto tienen gran importancia en la
descomposición de la materia orgánica
natural y los alimentos. Otras especies son
parásitas facultativas, dependiendo del
medio ambiente. Pueden causar
enfermedades en las plantas, animales y en el
hombre y son de gran importancia en los
procesos de fermentación industrial, ejemplo:
panes, cerveza, vinos. Algunos son usados en
la producción de queso, vitaminas, ácidos
orgánicos y antibióticos. En los últimos años
se han convertido en herramienta de trabajo
para la Ingeniería Agroindustrial debido a
sus ciclos de reproductividad únicos y su
metabolismo relativamente simple.
MOHOS
Se da el nombre de mohos a ciertos hongos
multicelulares, filamentosos, cuyo
crecimiento se conoce fácilmente por su
aspecto aterciopelado o algodonoso.
Caracteres Morfológicos:
La forma y estructura macro y microscópica
de los mohos es la base para su identificación
y clasificación.
3. Hifas y micelio. Los mohos están
constituidos por unos filamentos
ramificados y entrecortados llamados hifas,
cuyo conjunto forma el micelio.
4. Estructuras reproductoras. Generalmente
le reproducción se realiza por esporas
asexuadas, algunas formas esporas
________________________
sexuales. Las esporas asexuales se
diseminan fácilmente con la ayuda del
aire originando nuevos mohos en donde
se encuentres condiciones favorables.
Característica fisiológicas de los mohos:
6. Requerimientos de humedad.
La mayoría de los hongos requieren
menos humedad que las levaduras y las
bacterias crecen en un a w de 1.88.
7. Requerimientos de temperatura
La mayoría de los hongos deben ser
considerados mesófilos la temperatura
óptima para la mayoría es de 25 a 30ºC,
algunos crecen bien entre 35 y 37ºC.
Algunos pueden ser psicrófilos, crecen
bien a temperaturas de refrigeración y
otros a temperaturas bajas de congelación
pero de forma lenta. Unos pocos son
termófilos.
8. Requerimientos de O2 y pH
Los mohos son aeróbicos. La mayoría
puede crecer en amplio rango de pH 2.0–
8.5, pero la mayoría son favorecidos por
un pH ácido.
9. Requerimientos nutritivos
Los mohos en general pueden utilizar
muchos tipos de alimentos desde simples
hasta complejos.
Los requerimientos básicos incluyen una
fuente orgánica de carbono, en forma de
azúcar o almidón, y una fuente orgánica
o inorgánica de nitrógeno. Iones
inorgánicos, tales como potasio y
magnesio, ambos son sulfato y fosfato; y
trazas de zinc, cobre y magnesio. Factores
de crecimiento específicos pueden ser
necesitados por aquellas especies que no
pueden sintetizar sus propias vitaminas.
10. Inhibidores
Compuestos inhibidores de otros
microorganismos son producidos por
algunos mohos, tales como la penicilina
de Penicillium chrysogenin.
Clasificación e identificación de los
mohos:
Criterios:
7. Hifas septadas o no.
8. Que en micelio sea claro u obscuro. 12. Características de las cabezuelas de las
9. Que el micelio sea claro o incoloro. esporas.
10. Que se produzcan esporas o no y en caso c. Esporangio: tamaño, forma color
de que se produzcan, de que tipo: colocación.
cosporas, zigosporas, ascosporas. d. Conidios: simples o en cadenas, por
11. Clases de esporas asexuales: gemeción o en masa,forma y
esporangiosporas, conidios o disposición de los estigmas.
artrosporas.

IMPORTANCIA DE LOS HONGOS

INDUSTRIAL

PRODUCTOS ALIMENTICIOS
Quesos
FERMENTACIÓN
(P.roqueforti) ANTIBIÓTICOS

Cerveza – vino Penicilium sp.

(Especies levaduras)

Patógeno de plantas Herramientas de

investigación

Obligatorios facultativa
s Médica Biológica

Usualmente Tizón
especies fúnico
dependientes
ej. Roya Descomposición
natural de la
materia orgánica
Patógenos para (hongos saprofitos)
animales y humanos
Producción de
toxinas

Importancia Importancia
medica industrial

________________________
 PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD A AGENTES
ANTIMICROBIANOS (ANTIBIOGRAMA)

Al hablar de sustancias antimicrobianas es preciso recordar el origen y la estructura de los seres

vivos mas primitivos: los virus, las bacterias y los hongos. Por ello cuando se busca una
sustancia que actue en contra de ellos es menester tener presente como es su pared, su
membrana y demás estructuras. El objetivo primordial de una droga es destruir los
microorganismos, y no las células huésped.

Los agentes quimioterapicos provienen de: minerales, animales, vegetales y aun de los mismos
protistas o seres más primitivos, como es el caso de la penicilina que destruye las bacterias,
aunque su origen es micotico. Dichos fármacos se clasifican según su mecanismo de acción o su
actividad especifica. Por ello se habla de drogas bactericidas o bacteriostáticas; el primer caso,
es cuando la destruye totalmente, y el segundo, cuando inactiva la multiplicación de la bacteria.
Cuando se emplea una droga antimicrobiana es preferible que esta actue específicamente
contra el germen causal de la infección o enfermedad, evitando así la destrucción de la flora
normal bacteriana. Por ello hoy en día en los tratamientos se prefiere al fármaco de espectro
reducido.

Desde 1929, en que Fleming aisló la penicilina a partir de un hongo. Penicilliun notatum, hasta
nuestros días han sido puestos a nuestra disposición para la lucha contra las enfermedades
bacterianas, gran cantidad de agentes antibacterianos, antibióticos o quimioterapicos. A
diferencia de los de los antibióticos, que son sustancias químicas producidas por
microorganismos o derivados semisinteticos de estas, los quimioterapicos son productos de
síntesis química, pero con la propiedad común de estar dotados de actividad antibacteriana.

Todas las bacterias no tienen la misma sensibilidad a los distintos antibacterianos.

La evaluación de esta sensibilidad nos va ayudar en la selección del compuesto mas
adecuado para el tratamiento de una infección bacteriana. Las pruebas mas utilizadas para
evaluar la sensibilidad de una bacteria a un agente antibacteriano están basadas en el
enfrentamiento in vitro de la bacteria con distintas concentraciones del agente. La sensibilidad
de una bacteria a un antibiótico determinado viene dada por la Concentración Mínima
Inhibitoria (CMI), que se define como la menor concentración de antimicrobiano capaz de
inhibir el desarrollo de una cepa bacteriana dada. Así, se logra alcanzar en el organismo la CMI
con dosis terapéutica, podremos afirmar que la cepa es sensible al antibiótico. En caso
contrario, tendremos que decir que la cepa es resistente. Una cepa es moderadamente sensible
cuando la CMI de ese antibiótico se alcanza en el organismo con una dosis mas elevada que la
dosis terapéutica habitual, sin llegar a ser toxica. A veces la CMI se suele encontrar en los
limites entre sensible y resistente, lo que se llama puntos de corte o concentraciones criticas;
en este caso se clasifica la cepa como intermedia y se aconseja repetir la prueba.

Algunos métodos permiten además determinar lo que se denomina Concentración Mínima

Bactericida (CMB), que es la menor concentración de antimicrobianos capaz de destruir una
cepa bacteriana dada. Los métodos mas utilizados para determinar la sensibilidad de una
bacteria a agentes antimicrobianos son: la difusión en agar (antibiograma) y la dilución en
caldo o agar.

________________________
OBJETIVOS
Determinar la sensibilidad bacteriana a distintos antibióticos utilizando una metodología sencilla y
asequible a cualquier laboratorio de Microbiologia.
MATERIAL NECESARIO
 Cepa bacteriana (Recomendables:
Gram positivos y /o Gram negativos).
 Caldo Triticasa Soya o Infusión Cerebro
Corazón.
 Placas de agar de Mueller Hinton
 Solucion Salina Estéril
 Estándar 0.5 de Mc Farland
 Discos comerciales de antibióticos
 Hisopos estériles
FUNDAMENTO
El antibiograma por el método de
difusión en agar es una prueba en la
que se enfrenta la bacteria inoculada
sobre la superficie de un medio de
agar a una Solucion antibiótica
absorbida en discos de papel de
filtro o en pastillas. Este método fue
estandarizado y los halos de
inhibición obtenidos,
correlacionados con la CMI por Bauer
y colaboradores en 1966. Este estudio
dio lugar al método de Kirby-
Bauer, que es recomendado por la
Food and Drug Administration
(FDA) y el National Committee for
Clinical Laboratory Standards
(NCCLS), aunque con ligeras
modificaciones. Varios factores
afectan el halo de inhibición: la carga
de antibióticos en los discos, la
difusión del antibiótico en el medio
de cultivo, el tamaño del inoculo
bacteriano, la composición y grosor
del medio de cultivo, la velocidad
del crecimiento bacteriano y el
tiempo de incubación.
________________________
 Pinzas de Laboratorio
 Asa de platino
 Portaobjetos.
 Estufa de Incubación a 37° C
 Regla o calibrador.
 Microscopio
 Mechero
El medio de cultivo mas
frecuentemente empleado es de
Mueller-Hinton, que permite el
crecimiento de casi todas las
bacterias. Este medio puede ser
suplementado con un 5% de sangre
desfibrinada de caballo, oveja u
otro animal, cuando la bacteria lo
requiere para su desarrollo. El pH
del medio debe estar entre 7.2 y 7.4,
y el grosor, entre 4 y 6 mm. Los
discos de antibiótico son adquiridos
comercialmente, aunque también
pueden ser preparados. Deben
contener la cantidad establecida de
antibiótico y ser conservados a 4 °C
protegidos de la humedad.
El inoculo bacteriano debe tener una
turbidez similar al 0.5 de la escala de
McFarland, Aproximadamente
1/100000000 UFC/ml, y se prepara
en Solucion salina estéril o caldo de
Cultivo. La inoculación se puede
efectuar con hisopo de algodón
estéril.
Las placas se deben incubar a 37°C
en atmósfera aerobia. Se debe evitar
en lo posible la incubación en
presencia de CO2, ya que modifica
 el pH del medio y esto puede
afectar la actividad de algunos
antibióticos.
La lectura se debe realizar entre 18 a
24 horas. Este método es adecuado
únicamente para bacterias patógenas
de crecimiento rápido. Una
incubación mas prolongada puede
dar lugar a interpretaciones
erróneas del halo de inhibición.
PROCEDIMIENTO.
1. Prepara cultivos de 18 horas de las
bacterias que hay que ensayar en
Agar Tripticasa Soya o Agar Infusión
Cerebro Corazón (BHIA).
2. Inocular 3 o 4 colonias de las
bacterias en 5ml de caldo
Tripticasa Soya Agar o Caldo de
Infusión cerebro corazón e incubar
a 37°C hasta que la turbidez sea
visible (2-5 horas). Ajustar la turbidez
con Solucion salina o Caldo de
cultivo estéril hasta una turbidez
equivalente al estándar 0.5 de
McFarland .
NOTA: alternativamente, como
método mas rápido, se puede
preparar directamente a partir del
cultivo en el medio de agar de 18
horas, suspendiendo las colonias en
Solucion salina o Caldo cultivo
estéril, hasta lograr la turbidez
equivalente al estándar 0.5 de
McFarland.
3. Utilizando un hisopo de algodón,
sumergirlo en el inoculo y eliminar el
exceso presionándolo sobre la pared
________________________
interna del tubo que lo contiene y por
encima del nivel del caldo de cultivo.
4. Inocular la superficie de una placa
de agar de Mueller-Hinton con el
hisopo pasándolo uniforme
uniformemente por toda la superficie
en tres direcciones. Por ultimo, pasar
el hisopo por el reborde de la placa
de agar. Dejar secar 5 minutos.
5. Colocar los discos de antibióticos
sobre la superficie del agar
utilizando unas pinzas estériles y
apretándolos suavemente sobre la
superficie del agar. Los discos no
deben estar a menos de 15 mm de los
bordes de la placa y lo bastante
separados entre ellos para que no se
superpongan las zonas de inhibición
de (aproximadamente 20 mm). Dejar las
placas 15 minutos a temperatura
ambiente para que comiencen a
difundir los antibióticos.
6. Incubar la placa en posición invertida
a 37 °C durante 18 – 24 horas.
7. Medir los diámetros de las zonas de
inhibición con una regla o un
calibrador utilizando luz refleja sobre
fondo negro.
INTERPRETACIÓN:
Los diámetros de los halos de inhibición
se traducen a las categorías de resistente
(R), intermedio (I), moderadamente
sensible (MS) o sensible (S), de acuerdo a
los criterios interpretativos.
 PRUEBA INMUNOLOGICAS

Las Pruebas Serologicas son usadas Fijación de Complemento y

ampliamente en el diagnostico de Neutralización.
Microbiologia; estas son altamente En esta practica se realiza la prueba de
sensibles y especificas. Entre las Reacción de Aglutinación para
principales pruebas Serologicas tenemos: determinar grupos sanguíneos
Aglutinación, Precipitación, Floculación, humanos y el factor Rh.

OBJETIVO.

Hacer que el estudiante adquiera destreza en la realización de estas pruebas.

Hacer que el estudiante adquiera capacidad de interpretar una reacción de grupo sanguíneo.

DETERMINACIÓN DE GRUPO SANGUÍNEO Y FACTOR RH

MATERIALES:

Lancetas estériles
Alcohol antiséptico
Algodón
Palillos
Placa de Aglutinación
Antisueros ( Anti A, Anti B, Anti Rh).
Gotas de sangre de los diferentes grupos Sanguíneos.

PROCEDIMIENTO:

1. Limpie la yema del dedo del marcado B y una gota de suero Anti
corazón con un algodón humedecido Rh en el circulo marcado Rh.
en alcohol y déjelo secar. 5. Parta un palillo en dos y use cada
2. Haga una punción con la lanceta parte para mezclar las gotas que en
estéril. el circulo y luego agite la placa
3. Aplique suficiente presión al dedo inclinándola suavemente.
para facilitar la obtención de una 6. Examine las muestras
gota gruesa de sangre y colóquela en microscópicamente para evidenciar
cada uno de los tres círculos de las el aglutamiento de los glóbulos
placas de aglutinación. rojos.
4. Agregue una gota de suero Anti A 7. De acuerdo a la tabla de
en el circulo marcado A, una gota interpretación determine el grupo
de suero anti B en el circulo sanguíneo y el factor Rh.

________________________
CLASIFICACION ANTIGENO EN ANTICUERPOS
INTERNACIONAL LOS GLÓBULOS EN EL SUERO
ROJOS

ANTI A - ANTI B
O NINGUNO
ANTI B
A A

B B ANTI A

AB AB NINGUNO

________________________
CLASIFICACION INTERNACIONAL

AB

ANTIGENO EN LOS GLÓBULOS ROJOS

NINGUNO

AB

ANTICUERPOS EN EL SUERO

ANTI A - ANTI B

ANTI B

ANTI A

NINGUNO

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