Universidad Nacional de Loja

Facultad Agropecuaria y de Recursos Naturales Renovables

Carrera de Ingeniería Agronómica
IX Ciclo

El efecto de diferentes fuentes de fosfato del suelo sobre la

microbiota bacteriana activa es mayor en la rizosfera que
en la endorriza de la cebada (Hordeum vulgare L.)

Integrantes: Damary Carpio, Luis Jaramillo, Andrea Muñoz, Jessenia Quinche,

Andersson Romero, Michael Tucto.
INTRODUCCIÓN

• El fosfato es un macronutriente y, a menudo, el factor limitante de

crecimiento de muchos ecosistemas.
• El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de diversas fuentes de
fosfato sobre la microbiota bacteriana activa de la rizosfera y endorriza de la
cebada. La cebada se cultivó en un suelo pobre suplementado con Ca
(H2PO4) 2 (CaP), fosfato de roca de Gafsa (Gafsa), hexaftato de sodio
(NaHex) o sin enmendar (P0).
• Este estudio demostró la complejidad de las intrincadas interacciones suelo-
raíz-microbioma bajo diferentes regímenes de P, como se muestra también
para los hongos y el maíz, donde el efecto del P del suelo depende del nicho
de las raíces.
MATERIALES

Suelo empobrecido en nutrientes modificado con diferentes fuentes de

fosfato.

Tecnología de secuenciación basada en ARNr

Análisis de redes de co-ocurrencia para estudiar las interacciones

bacterianas, dentro y entre hábitats.

Correlacionamos las actividades de la fosfatasa del suelo con las

diversidades alfa y beta del microbioma en la rizosfera y con el patrón de
ocurrencia de las OTU.
MÉTODOS: Experimento vegetal y sustrato

• Diseño completamente al azar con los siguientes tratamientos:

• CaP (enmienda de suelo con Ca (H2PO4) 2, cuatro repeticiones)

• Gafsa (enmienda de suelo con fosfato de roca Gafsa, cuatro repeticiones)

• NaHex (enmienda de suelo con C6H6O24P6Na12, cuatro repeticiones)

• P0 (sin enmienda fosfatada del suelo, tres repeticiones).

• DANOVA seguido de la prueba post-hoc de Duncan (ap = 0,05).

Extracción de ARN, transcriptasa inversa-PCR y secuenciación Ion Torrent

Antes de la extracción del

Se añadieron 20 ARN, las raíces se molieron
mililitros de H2O estéril con un mortero estéril y libre
y la bolsa se de ARN bajo nitrógeno líquido
homogeneizó a alta
velocidad durante 120 s
con el stomacher
(Modelo 80,Seward).

El ARN extraído se resolvió en agua con ADN,

ARNse y sin ADNse (AppliChem, Darmstadt,
Alemania), y el ADN coextraído se digirió con
DNAse I libre de RNasa
 Análisis bioinformático de las secuencias

Los datos de las secuencias de la rizosfera y la endorhiza se fusionaron para luego ser analizados con Qiime 1.9

Tras la identificación taxonómica de las OTU se eliminaron las secuencias de origen plastidial o mitocondrial.

La comparación estadística de las métricas de diversidad alfa entre las fuentes de fosfato se realizó por separado para
la rizosfera y la endorhiza Con el software SPSS 20 ,utilizando ANOVA y prueba post-hoc de Duncan (a p = 0,05).

Para comparar las métricas de alfa diversidad entre la rizosfera y la endorhiza, se utilizó la prueba T de Student.

La diversidad beta se calculó por medio de distancias ponderadas por pares jackknifed-UniFrac y el efecto del factor
Bphosphate source^ se evaluó estadísticamente mediante el método de Adonis
Para el análisis de la red de co-ocurrencia, las OTU con una abundancia relativa > 0,05% del microbioma se sometieron
a un análisis de correlación de Spearman de sus patrones de aparición .Sólo las correlaciones fuertes se visualizaron
mediante el análisis de redes con software Cytoscape 3.6
El análisis filogenético de la OTU 3834 se realizó con el software Mega 7.
Actividad de la fosfatasa del suelo

Los valores se expresaron como micro moles de p-nitrofenol liberado por

gramo de suelo por hora, para la fosfomonoesterasa y la fosfodiesterasa, y
como miligramos de ortofosfato liberados por gramo de suelo (peso seco) por
24 horas, para el pirofosfato
Enmienda de fósforo y crecimiento de las plantas
La aplicación de las distintas formas de P dio como resultado
4,5, 5,1, 8,5, y 80,4 mg de P extraíble por CAL [kg de suelo]-1 en
el P0, NaHex,Gafsa y CaP, respectivamente.
Sin embargo, la disponibilidad de hexaftato de sodio aplicado
podría ser subestimado por el método CAL.
Después de la esterilización superficial de las semillas de
cebada, no hay colonias bacterianas
-Plantas cultivadas en suelo modificado con CaP acumulado
más biomasa, seguido de Gafsa, NaHex y, por último, el
planta sin la enmienda de P.
Análisis Bioinformático de las Secuencias
De la rizosfera y la endorhiza de la cebada.
Se obtuvieron 468. 657 y 457. 615 secuencias, respectivamente.
Después de la extracción del cebador y filtrado longitud/calidad, se
agruparon secuencias en OTU con un umbral de similitud del 97%.
Después eliminación de OTU contaminantes,
OTU con menos de 10 lecturas,CaP-E4 153. 804.
las secuencias permanecieron (99. 036 de la rizosfera y 54. 768
de endorhiza, con una media de 5304 ± 2845 lecturas por muestra),
agrupados en 524 OTU bacterianas (513 y 461 en el
rizosfera y endorhiza, respectivamente).
 Composición Taxonómica

La asignación taxonómica de las OTU reveló 12 phyla, 26

clases, 51 órdenes, 86 familias y 141 géneros.

La mayoría phylum dominante era Proteobacteria con una

media abundancia relativa del 92,55%, seguida de
Actinobacteria (4,41%), Acidobacterias (1,31%), Firmicutes
(0,41%) y Bacteroidetes (0,40%). Deinococcus-Thermus,
Cloroflexi, Cianobacterias, Gemmatimonadetes,
Verrucomicrobia, Nitrospirae, y Saccharibacteria,

En su conjunto el 0,89%. Se detectaron Nitrospirae y

Saccharibacteria sólo en la rizosfera. Sólo el 0,033% de las
secuencias permanecieron sin identificar a nivel de filo.
Betaproteobacterias y Gammaproteobacteria fueron las clases
dominantes (47,84% y 31,47%, respectivamente)
 Diversidad Alfa
Para análisis de diversidad alfa y beta, y para la
evaluación de OTU significativamente
diferentes datos enrarecidos con una
secuencia, se utilizó una profundidad de 2125
lecturas por muestra.

En el hábitat de la rizosfera, la fuente de

fosfato afectó significativamente a Shannon,
Equitability, Dominance, Chao 1 y no. de OTU
(p <0.05), pero no Phylogenetic Diversity (Fig.
3a-f).

En el hábitat de Endorhiza, claramente hubo la

misma tendencia (Fig. 3a-f)

Solo aparecieron pequeñas diferencias entre la

rizosfera y la endorriza (p> 0.05), a excepción
del índice de diversidad filogenética que fue
significativamente mayor en la rizosfera. (15,66
frente a 13,70, p <0,001).
 Diversidad Beta
La fuente de fosfato afectó significativamente las distancias
UniFrac (diversidad beta) en la rizosfera (R2 = 0.55, p =
0.004) pero no en la endorriza (R2 = 0,28, p = 0,26).

CaP apareció como la única fuente de fosfato

significativamente diferente de los demás (Fig. 3g).

La fuente de fosfato afectó la abundancia relativa de 22 OTU en la rizosfera (4,64% del total
de la rizosfera OTU), que representaron el 77% del total de lecturas (p <0,05 corregido por
FDR) (Tabla S2).

Catorce OTU fueron más abundantes en suelo modificado con CaP, mientras que sólo dos OTU fueron
enriquecido por cada Gafsa y NaHex: esto refleja muy bien la resultados de diversidad alfa (Fig. 3a-f).
Análisis de correlación
DISCUSIÓN