EXPOSICIÓN

MEDICIÓN DEL CRECIMIENTO A) MEDIDAS DE MASA BACTERIANA y Determinación Del Peso Húmedo  Se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es pesada luego de la separación de las células por filtración o centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes de muestra.  La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa.  La cantidad de líquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de células bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformación celular. Para corregir el peso húmedo se determina la cantidad de líquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugación, para ello se utilizan soluciones de polímeros no iónicos (como el Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas.  Se utiliza una centrífuga; se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante; se determina el peso del sedimento.  Inconvenientes: grandes errores, debido al líquido intercelular retenido, cuya cuantía depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc. y Determinación Del Peso Seco  El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se encuentran en una suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105°C hasta peso constante.  Esta técnica es útil para grandes volúmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran número de bacterias.  Método de cuantificación utilizado en cultivos de gran densidad sobre todo para hongos y levaduras, como los cultivos se someten a varios procesos (filtración, lavado, secado) se pueden causar pérdidas importantes de biomasa y errores en la cuantificación.  La desventaja de éste método es que componentes volátiles de la célula pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradación. También la muestra seca puede

y por lo tanto mayor será la turbidez. toda la noche). La densidad de partículas es entonces una función de la luz reflejada por las partículas a la fotocelda. mayor será la luz dispersada. la cual se relaciona con un número de células/ mL. color y reflectividad. Cuanta más luz se refleje en una determinada muestra mayor será la densidad de partículas. NTU o UTN. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso húmedo.  Escala de MacFarland: Se trata de una serie de patrones de turbidez previamente calibrados. por lo tanto en cada tubo se origina un precipitado de Ba SO4.  2) Determinación del peso seco: como el anterior.  Un método muy rápido y útil de obtener estimaciones del número de células son las medidas de turbidez. La unidad de turbidez para un nefelómetro calibrado se llama Unidad de Turbidez Nefelométrica. La densidad de partículas depende de las propiedades de las partículas como su forma. hasta peso constante. Esto lo hace empleando una fotocelda colocada en un ángulo de 90° con respecto a una fuente luminosa.  La dispersión de la luz es proporcional a la masa del cultivo. Consiste en varios tubos de vidrio herméticamente cerrados que contienen 1% de BaCl2 + cantidades crecientes de H2 SO4al 1%. . La turbidez puede medirse con aparatos como el nefelómetro. pero el sedimento se seca antes de ser pesado (105ºC.  Inconvenientes: método tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es difícil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. el que da origen a la turbidez. y Método Turbidimétrico  La base común de estos métodos consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivo bacteriano. principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta.  Cuantas más células estén presentes.  Nefelómetro: Es un instrumento para medir partículas suspendidas en un líquido. 1 mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias.recobrar humedad durante el pesado.

Ha sido desplazado por los métodos espectrofotométricos.7x109 3.2 0.5 0.2x109 1.4x109 2. que sólo se emplea cuando no hace falta exactitud.3 0.5 9. Inconveniente: es un método poco preciso.0x108 6.6 0.0x108 9.0x109 MEDICIÓN DE LA TURBIDEZ: MÉTODOS ESPECTOFOTOMÉTRICOS .5x109 1.f.3 9.9 9.c/ml 3.9 1.4 0.0 u.0 SO4H2 1% 9.7 9.8 9.1 0.2 9.4 9.0x108 1. TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Cl2Ba 1% 0.8 0.1x109 2.8x109 2.6 9.7 0.1 9.

Cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados pequeños. como la Cámara De Recuento De Petroff-Hauser. dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes. que son portas excavadas modificados. la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas (cuadros pequeños). Area Tipo de cuadro Cuadrado total Cuadrado grande Cuadrado pequeño [cm2] 1.B) MEDIDA DEL NÚMERO DE INDIVIDUOS 1.50 x 10-5 Volumen [ml] 2.02 mm de profundidad Área de 1 mm2. sobre cuya superficie de vidrio está marcada una rejilla con pequeños cuadrados de área conocida. el cual se puede hacer de dos formas: - En muestras secas sobre el porta o En muestras líquidas.00 x 10-8 Factor [1/Volumen] 5.00 x 104 1.25 x 106 2.00 x 10-7 5. O sea. Cámara De Recuento De Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial con una graduación en superficie y unas medidas muy concretas: y - Excavación con 0.00 x 10-5 8.00 x 10-2 4. Recuento Total De Células El número de células de una población se puede determinar contando una muestra con el microscopio mediante el método de recuento directo.00 x 107 .00 x 10-4 2. Con las muestras se deben usar cámaras de conteo especiales.

El recuento directo por microscopia es un método rápido para conocer el número de células. Recuento De Células Viables y y Una célula viable es aquella capaz de dividirse y dar lugar a una descendencia. Entonces. Las células que son pequeñas son difíciles de ver en el microscopio y algunas se pueden perder en el microscopio. una vez dispensada entre el porta y el cubre. En el método de extensión en placa .La muestra. 2. la concentración celular es fácil de establecer: n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml y y Este método tiene la ventaja de ser muy rápido y económico. y En este recuento se supone que cada célula viable puede formar una colonia. Hay dos maneras de realizar un recuento en placa para células viables: el método de extensión en placa y el método de vertido en placa. . Se anota el número n de células observadas en esas 16 celdillas. y Por esta razón el recuento de células viables también se llama ³Recuento en placa o recuento de colonias´.Para esto es importante que la superficie del medio este seca. de modo que el líquido de la muestra se pueda absorber. se deja reposar sobre la plataforma del microscopio durante unos minutos.La placa se incuba después hasta que aparecen las colonias y se cuenta su número. pero presenta ciertas limitaciones: y y No se distinguen células vivas de las muertas. y se cuenta el número de células en varias celdillas. . se extiende sobre la superficie de una placa con medio sólido utilizando una asa estéril de extensión.1 ml. . que no suele ser superior a 0.Un cierto volumen de cultivo diluido. El método que usualmente se utiliza para realizar una determinación de células viables se basa en contar el número de células de la muestra que es capaz de formar colonias sobre un medio sólido adecuado. y Si una suspensión tiene menos de 106 células bacterianas por mililitro es posible que no se vean bacterias en el campo del microscopio.

En la práctica. . - Sin embargo. y Para obtener el número apropiado de colonias casi siempre se diluye la muestra.No se suelen usar volúmenes mayores de 0. es importante que el numero de colonias que aparezcan en las placas no sea demasiado grande. Dilución De Las Suspensiones Celulares Antes De La Siembra En La Placa En los métodos anteriormente mencionados..1-1. el número de colonias por placa oscila entre 30 y 300. También es importante que el numero de colonias no sea demasiado bajo para que el cálculo sea estadísticamente significativo. antes de dejar que se solidifique. sin perder su viabilidad. 3. y puede ser la causa de que las colonias se unan al formarse. el organismo que se cuenta debe ser capaz de resistir brevemente la temperatura del agar fundido a 45ºC. para poder hacer uso de este método.1 ml porque el exceso de líquido no es absorbido. En el método del vertido en placa o método de vaciado en placa - Se pipetea un volumen conocido (normalmente 0. ya que en placas muy atestadas algunas colonias se podrían fusionar. se pueden usar volúmenes de inoculo mayores que en el método de recuento por extensión. provocando cálculos erróneos.0 ml) de cultivo en una placa petri estéril - Sobre la que se añade el medio con agar fundido y se mezcla bien mediante un suave movimiento giratorio de la placa sobre la superficie de la mesa. - Como la muestra se mezcla con el medio fundido. dificultando su recuento.

y En la mayoría de casos se realizan dichas diluciones seriadas para alcanzar la dilución final que se desea. Si se necesita una dilución de 10-2. normalmente se hace más de una dilución.5 ml de diluyente o 1 ml de la muestra con 9 ml del diluyente. se puede lograr haciendo tres -2 diluciones sucesivas de 10 seis sucesivas de 10-1. es posible usar soluciones estériles de sales inorgánicas o un amortiguador de fosfatos. y Cuando se hacen diluciones es importante que se utilice una pipeta diferente para cada dilución. Para hacer una dilución de 10-1 se mezclan 0. utilizando un microscopio y un porta especial denominado cámara de recuento. El recuento directo puede hacerse visualmente. Existen muchos tipos de cámaras de recuento. y o El líquido usado para hacer las diluciones es importante y lo mejor es que sea idéntico al líquido utilizado para preparar el medio solidificado. llamada así .4 Recuento directo Un recuento directo es un recuento de las células individuales de una población microbiana. 8. y Por otra parte. aunque por economía.y Como raramente se sabe de antemano el número de células viables. pero la cámara de Petroff-Hauser. una dilución 10-2 se puede hacer de modo seriado haciendo sucesivamente dos diluciones de tipo 10-1. Es común usar varias diluciones decimales de la muestra.9 ml.95 ml del diluyente o 0. aun cuando sea de la misma muestra. por ejemplo si se requiere una dilución 10-6.1 ml con 9.4.5 ml de la muestra con 4.05 ml de la muestra con 4. se puede y mezclar 0.

001 µl). Todas las cámaras de recuento poseen una profundidad conocida y tienen marcados unos cuadrados de dimensiones también conocidas. El poro forma parte de un circuito eléctrico. contando las células de varios cuadrados y haciendo la media. Por el contrario. pero se usan en situaciones muy diferentes. el recuento directo es un recuento total de células. además del microscopio óptico que existe en cualquier laboratorio de microbiología. mediante una bomba de vacío. un microlitro (0.microscópico y recuento electrónico . por ejemplo. la conductividad del circuito disminuye y la presencia de la célula es detectada electrónicamente en el contador. tal vez sea la más utilizada en los laboratorios de microbiología (Figura 8. el recuento electrónico requiere un equipo caro. Los dos métodos principales de recuento directo .dan resultados semejantes. tan sólo se necesita una cámara de recuento.en honor de los que la desarrollaron. El recuento microscópico no requiere de un equipo caro. no muy cara. El recuento directo también puede hacerse electrónicamente. pero es muy rápido y preciso. Se puede calcular cuántas células están presentes en 1 ml o en cualquier otro volumen del cultivo.8). Se coloca en una cámara del contador un volumen determinado del cultivo y se hace pasar a través de un pequeño poro (de unos 15 µm de diámetro) a otra cámara. con un instrumento denominado contador Coulter. De esta manera. cada cuadrado que observamos al microscopio representa un volumen determinado de líquido. de manera que cada vez que pasa una célula a través del mismo. El recuento electrónico es posible porque las células microbianas no conducen la electricidad tan bien como el medio en el que están suspendidas. Puesto que las células vivas y las muertas tienen un aspecto parecido observadas al microscopio. si las células son las únicas . Pero es un proceso tedioso y lento.

La cámara de recuento de Petroff-Hauser se usa. Consta de un porta que tiene unos pocillos superíiciales (de 0.8 Recuento microscópico directo.4. puede detectarse incluso una única célula viva. cuando se siembre en una placa de agar. Figura 8. El recuento microscópico es necesario si la muestra contiene partículas extrañas. generalmente después de un día. el contador electrónico las contará como células. porque la precisión depende del recuento de un número elevado de .5 Recuento en placa Para realizar un recuento en placa se utilizan los métodos de extensión o de vertido en placa. junto con la dilución de la muestra que se inoculó en ella. que se describieron en el Capítulo 3. Un inconveniente es que el recuento en placa es lento y tedioso y no es muy preciso. Ademas. y cada cuadrado grande es un veinticincoavo de esta cantidad. junto a un microscopio. A continuación. cada uno de los cuales está dividido en 16 cuadrados más pequeños. pero si tienen aproximadamente el mismo tamaño.9). una muestra del cultivo y luego sembrar una pequeña cantidad de cada dilución en una placa o bien mezclarla con el medio a sobrefusión. De esta manera.02 mm de profundidad).partículas presentes (el recuento electrónico también se usa en los laboratorios clínicos para contar las células sanguíneas). El número de colonias de una placa. empleados para cultivar los microorganismos. generalmente diez veces por cada dilución. nos permite calcular la concentración de células presente en la muestra original (Figura 8. como células sanguíneas o fragmentos de suelo. para realizar un recuento directo de células. El recuento en placa es un recuento de viables. Se basa en el principio de que una única célula viable originará una colonia visible. La técnica consiste en diluir de manera seriada. Una vez que se han formado colonias visibles. la placa debe ser incubada en las condiciones adecuadas. el volumen total de la rejilla es de 0. se seleccionan para el recuento de colonias las placas en las que éstas están bien separadas. Una persona que realiza un recuento microscópico puede discriminar entre las células microbianas y las partículas extrañas. Si se utiliza un medio y unas condiciones de incubación adecuadas. 8. Las placas que tienen entre 30 y 300 colonias ofrecen una buena relación entre la rapidez del recuento y la precisión en el resultado obtenido. el recuento en placa no requiere un equipo complicado. En el fondo del porta hay grabada una rejilla de 1 mm2.02 (un quinceavo) mm3. La ventaja del método de recuento en placa es su gran sensibilidad. dividida en 25 cuadrados grandes.

En primer lugar.9 Un recuento en placa es una medida directa y proporciona un recuento de viables. transfiriendo 1 ml de la muestra a 9 ml de medio estéril y se mezclan adecuadamente. la muestra se diluye seriadamente. bien extendiéndolo en la superficie de la misma (método de extensión en placa) o mezclándolo con el medio (método de vertido en placa). La precisión aumenta con el número de colonias que se recuentan. Figura 8. .colonias. la placa tiene 225 colonias. Posteriormente se añade 0.1 ml a una placa de agar nutritivo. En este ejemplo. Las placas se incuban y se recuentan las colonias que se desarrollan. Este proceso se repite basta obtener una dilución apropiada en este ejemplo. ya que disminuye el error debido al muestreo. las placas deben contener entre 30 y 300 colonias. 1:100000 (10-5). Debido a razones estadísticas.

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